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Rapport de stage de DEA de chimie de l’environnement marin

Année 2002-2003

Mise au point d’une méthode de dosage des complexes porphyrine-fer dans l’eau de mer

Marie-Anne Guglielmi

Laboratoire d’accueil : Laboratoire des sciences de l’environnement marin (Université de Bretagne Occidentale ) Responsable de stage : Stéphane Blain

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REMERCIEMENTS Je voudrais tout d’abord remercier Stéphane Blain d’avoir accepté de superviser mon stage, de m’avoir dirigée, conseillée et d’avoir mis a ma disposition le matériel nécessaire au bon fonctionnement de mon stage de DEA. Je remercie également Monsieur Paul Tréguer et Monsieur Jacques Clavier pour m’avoir accueillie au sein de l’IUEM et du LEMAR. Je voudrais remercier plus particulièrement Agathe Laes et Géraldine Sarthou pour leur aide tout au long de l’année. Petit coucou tout de même à mes collègues de DEA : Xav, Auré, JP, Manu et les autres et merci à Nico de m’avoir supportée ! Je voudrais enfin remercier l’ensemble des personnes qui m’ont aidé tout au long de mon stage.

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Sommaire I Introduction......................................................................................................................... 4 II Matériel et méthodes.......................................................................................................... 7

1 La méthode par injection de flux..................................................................................... 7 2 Protocole expérimental ................................................................................................... 8

III Résultats et discussion .....................................................................................................11 3.1 Optimisation de la méthode.............................................................................................11

1 Influence de la concentration en luminol........................................................................11 2 Influence du débit ..........................................................................................................12 3 Linéarité du signal .........................................................................................................13 4 Essais en eau de mer artificielle .....................................................................................13 5 Essais avec la peroxydase : ............................................................................................14

3.2 Interférences ...................................................................................................................15

1 La protoporphyrine IX ...................................................................................................15 2 Le fer.............................................................................................................................15 3 L’eau oxygénée..............................................................................................................16

3.3 Modifications en vue d’une automatisation .....................................................................16

1 Utilisation d’un tampon glycolate/acide glycolique ........................................................17 2 Essais sans tampon NH3/NH4

+ .......................................................................................18 IV Conclusion et perspectives...............................................................................................20 Bibliographie........................................................................................................................21 Annexe : Préparation de l’eau de mer artificielle...................................................................23

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I Introduction Le fer est un élément essentiel aux organismes phytoplanctoniques ; il intervient dans de nombreux processus métaboliques, ainsi que dans la structure de certaines enzymes et protéines. Au sein des cellules, il sert principalement à la catalyse de réactions d’oxydo-réduction et au transfert d’électrons. Il intervient également dans la photosynthèse, la respiration (Sunda 1988-1989), la protection contre les molécules et les radicaux libres super oxydant (H2O2, O2.), il contribue aussi à la fixation de l’azote,et à la réduction des nitrates en nitrites, puis en ammonium. Diverses expériences ont confirmé cette hypothèse du fer selon laquelle le fer peut être considéré comme un sel nutritif (Blain et al., 2001 ; Buccarelli et al., 2001 ; de Baar et al., 1995). En effet, lors de multiples fertilisations en fer de l’océan, une augmentation de la croissance phytoplanctonique a été observée (Martin et al., 1994 ; Boyd et al., 2000). Le fer dissous peut se trouver sous trois formes différentes dans l’eau de mer :

• Espèces inorganiques (Fe (II), Fe (III) ) • Espèces organiques (complexes de Fe (II) ou Fe (III))

Figure 1 : spéciation du fer dans les eaux de surface d’après Hutchins et al.(1993 ) La spéciation du fer dans l’océan est encore mal connue, on distingue cependant trois fractions. Les espèces mononucléaires hydrolysées, telles que Fe(OH)+, Fe(OH)3, et Fe(OH)4

-, regroupées sous le terme Fe’, la fraction particulaire comprenant du fer adsorbé sur des particules ou inclus dans des réseaux cristallins et la fraction complexée par des ligands organiques (Blain, 2000). Plus de 90% du fer dissous se trouve complexé à des ligands organiques dans les eaux de surface océaniques (Boye et al., 2003. ; Gledhill and Van den Berg., 1994 ; Rue and Bruland., 1995 ; Wu and Luther.,1995).

Solubilisation Désorption

Fe III Fe II

Fe L

Oxydation chimique ou biologique

Réduction photochimique, thermique , enzymatique

Formation de complexes organiques

Dissociation du complexe

Dissociation Du complexe

Adsorption, assimilation

Désorption régénération Bactéries, phytoplancton

Broutage

Zooplancton

Régénération

Détritus organiques

Pelotes fécales

Cellules sénescentes

Désorption

Adsorption

Colloïde

Agrégation

Précipitation Adsorption

Phase minérale

Phase dissoute

Désagrégation

Sources externes

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Les organismes phytoplanctoniques assimilent le fer de différentes façons, ainsi les diatomées assimilent plus efficacement le fer complexé à des porphyrines et les cyanobactéries celui associé aux sidérophores (Hutchins et al., 1999). Si les sidérophores sont actuellement les plus étudiées en océanographie, il n’existe cependant aucune méthode de dosage dans l’eau de mer pour l’une ou l’autre catégorie de ligands. Les porphyrines sont composées d’un noyau constitué de quatre motifs pyrroles rejoints entre eux par des ponts méthèniques pour former des macro cycles. Cette structure a été suggérée par Küster et Hoppe-Seyler’s, (1912), mais cette hypothèse fut rejetée, les macro cycles étant considérés comme instables à cette époque. Ce sont des molécules d’un grand intérêt biologique tant dans le domaine animal que végétal. En effet, elles constituent souvent les groupements prosthétiques essentiels de certaines protéines impliquées dans les processus d’oxydoréduction. Ainsi, on retrouve une porphyrine complexée au fer ( l’hème) dans les hémoglobines et les myoglobines, une porphyrine est associée au magnésium dans les molécules de chlorophylle et bactériochlorophylle (photosynthèse), la vitamine B12 comporte également une porphyrine mais combinée au cobalt. Les porphyrines présentes dans les organismes vivants doivent donc probablement être relarguées dans l’eau de mer par différents mécanismes : lyse virale, broutage (Hutchins & Bruland, 1994; Hutchins & Bruland, 1995), décomposition du phytoplancton (Frey & Small, 1979; Gobler et al., 1997)… La porphyrine étudiée dans notre sujet est la protoporphyrine IX (figure 2a). C’est elle qui constitue l’hème lorsqu’elle est complexée au fer II. Les porphyrines et la plupart de leurs dérivés peuvent se complexer avec une grande quantité de métaux différents (fer, magnésium, manganèse, cobalt….). La métallo-porphyrine utilisée pour la mise au point du dosage est l’hémine qui est également un complexe de la protoporphyrine IX mais cette fois avec du fer III (figure 2b).

HN

NNH

N

OH

O

HO

O

Figure2a : structure de la protoporhyrine IX

N

NN

N

O

O

O

O

Fe

Figure 2b : structure de l’hémine

2 Na+

Cl-

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La protoporphyrine IX (figure 2a) et l’hémine (figure 2b) sont utilisées parce qu’elles sont solubles dans l’eau et la forme complexée et decomplexée sont commercialisées. Le dosage des porphyrines a déjà été réalisé dans le cadre d’analyses médicales. En effet, l’augmentation du taux de porphyrine dans le sang peut causer des intoxications appelées porphyries. Ce dépistage se fait par analyse des porphyrines dans l’urine en utilisant une réaction de chimiluminescence (Motsenbocker et al.,1993). L’objectif de ce stage est d’adapter cette technique à l’eau de mer. La méthode analytique choisie est celle d’analyse par injection de flux (FIA) car elle présente de nombreux avantages. Elle requiert peu de manipulation de l’échantillon lui-même, ce qui permet d’éviter d’éventuelles contaminations, de plus c’est une méthode simple, peu onéreuse et bien adaptée à l’embarquement à bord des missions océanographique. La luminescence est le phénomène par lequel certaines molécules portées à un état excité retournent à l’état fondamental en restituant une partie de l’énergie sous forme d’émission de lumière. Lorsque l’énergie qui permet aux molécules d’atteindre l’état excité provient d’une réaction chimique il s’agit du phénomène de chimiluminescence. En milieu alcalin, l’oxydation du luminol (5-amino-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione) produit une émission lumineuse (figure 3). L’agent oxydant utilisé ici est le dioxygène de l’air. Cette réaction de chimiluminescence peut être catalysée par certaines métallo-porphyrines (Motsenbocker et al.,1993) et la quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de métallo-porphyrines utilisées. Cette réaction peut être également activée par l’utilisation d’un surfactant (Motsenbocker et al.,1994) en général, c’est un acide gras ou un de ces dérivés.

Figure 3 : réaction d’oxydation du luminol avec le dioxygène de l’air

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II Matériel et méthodes 1 La méthode par injection de flux

Figure 4a : schéma du montage FIA en élution

Figure 4b : photo du montage FIA Les échantillons et les réactifs sont stockés dans des récipients en polyéthylène. Les tubes utilisés dans le montage sont en téflon®, sauf les tuyaux de la pompe qui sont en tygon®. Les différents réactifs sont pompés dans leurs flacons respectifs, mélangés dans une boucle et ensuite acheminés vers la cellule du photomultiplicateur qui traduit le signal lumineux en signal électrique qui est ensuite transmis à l’enregistreur et à l’ordinateur.

Photomultiplicateur

Alimentation 12V

Boucle de mélange

Pompe péristaltique

L

enregistreur P

. . . . . .

S

E

L : luminol et acide linoléique S : soude E : échantillons P : poubelle

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Figure 5 : exemple d’enregistrement Débit : 0,84 mL/min ; [hémine]: de 45 à 90 nM ; vitesse de défilement : 2mm/min ; calibre : 1 V.

2 Protocole expérimental a Réactifs Préparation de la solution de soude : 4 g de soude(Fluka 99%) en pastilles sont dissous dans 1 litre d’eau Milli-Q (résistivité> 18,2 MΩ cm-1). Préparation des solutions de luminol : 0,0886 g de luminol (Merck 97%) est dissous dans 500 mL de soude 0,1M (Fluka). Afin d’améliorer la détection il est indispensable d’ajouter un surfactant. On ajoute donc 0,1% en volume d’acide linoléique (Fluka 99%)(Motsenboecker et al.,1994). Préparation des solutions d’hémine : Les solutions sont préparées à partir d’une solution mère de concentration .10-3M dans laquelle 0,0652 g d’hémine (Fluka) est dissous dans 100 ml de soude 0,1M (Fluka). Il est nécessaire de refaire les solutions filles d’hémine avant chaque utilisation car elles se dégradent. Les solutions filles sont préparées avec 75 μL de solution mère dilués dans 10 mL de soude 0,1M. La concentration finale est de 7,5 µM. Préparation des solutions de protoporphyrine IX : La solution mère est obtenue en mélangeant 0,0562 g de protoporphyrine (Merck) dans 100mL de soude 0,1M. Sa concentration finale est de10-3M. Tout comme pour l’hémine il est également nécessaire de refaire les solutions filles avant chaque utilisation. Préparation des solutions d’hémine : Les solutions sont préparées à partir d’une solution mère de concentration 1,25 µM dans laquelle 5mg de peroxydase est dissous dans 100 ml de soude 0,1M (Fluka). Les solutions filles sont préparées avec 1,2mL de solution mère dilués dans 10 mL de soude 0,1M. La concentration finale est de 15 nM. Préparation de l’eau de mer artificielle EMA :

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L’eau de mer réalisée ne contient que les sels anhydres, les sels hydratés et les éléments majeurs, elle ne contient pas les métaux traces, les nutriments ou les vitamines que l’on peut y ajouter (annexe I).

Préparation d’un tampon NH4

+ /NH3 : 250 mL de tampon 2M sont à préparer en mélangeant dans 122 mL d’eau Milli-Q (résistivité> 18,2 MΩ cm-1), 53 mL de HCl (Merck ultrapur 33%) et 75 mL de NH3 (Merck ultrapur 25%).

Préparation de la solution d’eau oxygénée : Une première solution est obtenue en mélangeant 10µl se solution d’H2O2 (Merck ultrapur 30%) dans 500mL d’eau Milli-Q, (résistivité> 18,2 MΩ cm-1). On prélève ensuite 10 mL de cette solution que l’on dilue dans 100mL d’eau Milli-Q (résistivité> 18,2 MΩ cm-1). La concentration finale est de 4 µM. Préparation de la solution d’ammoniaque 8M : 11,8 ml deNH3(Merck ultrapur 25%) sont ajoutés à 20 mL d’eau Milli-Q (résistivité> 18,2 MΩ cm-1), la concentration finale est de 8M. b Traitement des échantillons d’eau de mer L’eau de mer contient de nombreux cations tels que le magnésium (42,8 mM) et le calcium (10,9 mM) qui précipitent sous forme d’hydroxydes en présence de soude, il est donc indispensable de complexer ces ions afin de pouvoir réaliser le dosage. En effet l’hémine est adsorbée lors de la précipitation des hydroxydes de magnésium et de calcium. Pour cela nous utilisons comme complexant l’éthylène diamine tétraacétique acide (EDTA),(Fluka).Différents essais ont été réalisés soit avec une quantité d’EDTA correspondant à la quantité exacte d’ion Mg2+ et Ca2+ présents dans la solution soit avec une quantité en excès(2fois). De plus, pour une première approche, il est nécessaire de travailler dans de l’eau de mer artificielle car le risque d’interférences est limité, en effet l’eau utilisée ne contient que les cations majeurs et aucun métaux traces, ainsi le signal obtenu est donc bien représentatif de la quantité d’hémine. Les analyses se font sur des échantillons de 100 mL d’EMA. Lorsque l‘EDTA est ajouté le pH diminue car il y a libération de H+ lors de la complexation des cations, or l’hémine n’est pas stable en milieu acide. Il est alors indispensable de tamponner le milieu à pH=9,2. Lorsque le milieu est tamponné, il n’y a plus de dégradation de l’hémine. Il faut ensuite remonter le pH de 9,2 vers 13 en ajoutant à l’échantillon de la soude 1M, juste avant le dosage les conditions expérimentales optimales nécessitant un pH de tous les réactifs égal à 13. Le mode opératoire est donc le suivant : 100 mL d’EMA (auxquels la quantité voulue d’hémine est ajoutée), 7 mL de tampon NH4

+/NH3, 2,4g d’EDTA trisodique, quantité exacte 15 mL de soude 1M.

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c Préparation des solutions d’acide glycolique Tampon acide glycolique/glycolate 2M 3,04 g d’acide glycolique (Fluka) et 0,8 g de soude (Fluka) sont mélangés dans 10 mL d’eau Milli-Q. Le pH de cette solution est de 3,8. Solution de glycolate à pH=5,5 3,04 g d’acide glycolique et 1,55 g de soude sont mélangés dans 10 mL d’eau Milli-Q. La concentration finale est de 2M. Solution de glycolate à pH=6,5 Une solution à 8M d’acide glycolique soit 6,08 g dans 10 mL est neutralisée par une solution de soude 8M soit 4,8 g dans 15 mL. Le pH recherché est proche du point équivalent du dosage acide-base il faut donc un contrôle pH en continu lors de la préparation de la solution. Le volume de soude 8M à ajouter est entre 9,9 et 10,5 mL. La concentration finale en glycolate est 2M. Solution de glycolate et ammoniac à pH=7 Une solution à 8M d’acide glycolique soit 6,08 g dans 10 mL est neutralisée par une solution d’ammoniac 8M. Le pH recherché est également proche du point équivalent du dosage acide-base il faut donc un contrôle pH en continu lors de la préparation de la solution. Le volume d’ammoniac 8M à ajouter est entre 9,9 et 10,5 mL. La concentration finale en glycolate est 2M.

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III Résultats et discussion

3.1 Optimisation de la méthode Dans une première partie la mise au point de la méthode s’est faite avec des solutions d’hémine dans de la soude 0,1M . Cette étude préalable a permis de déterminer les conditions expérimentales optimales avant de commencer les analyses dans l’eau de mer. 1 Influence de la concentration en luminol La concentration en luminol idéale pour le dosage des porphyrines dans les urines est de 1mM (Motsenbocker et al., 1993), cependant notre méthode étant différente il faut rechercher la concentration optimale dans nos conditions.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5 6

Concentration en luminol en mM

Figure 6 : variation de la concentration en luminol Barres d’erreur :± σ Débit 1mL/min ; Concentration d’hémine : 15 nM

Le signal passe par un maximum qui correspond à la concentration optimale. La suite des manipulations se fera donc à la concentration de 0,1mM.

Signal En mV

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2 Influence du débit La figure 7 représente l’évolution du signal en fonction du débit.

200

250

300

350

400

450

0 2 4 6 8 10

Débit en RPM (rotations par minutes) diamètre des tuyaux : 1,3 mm

Figure 7 : variation du signal en fonction du débit Barres d’erreur :± σ [luminol] 1mM [hémine] 60 nM

L’intensité maximale du signal se situe dans les débits les plus faibles ce qui ne correspond pas à des conditions idéales de travail, en effet une analyse durerait trop longtemps(7 à 8 minutes). Afin d’améliorer cette sensibilité une bobine de mélange est insérée devant la cellule du photomultiplicateur. La même étude est alors réalisée avec et sans boucle (figure 8).

0

20

40

60

80

100

120

140

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Avec boucle

Sans boucle

Débit en RPM

Figure 8: variation du signal en fonction du débit avec et sans bobine de mélange Barres d’erreur :± σ

[luminol] 1mM [hémine] 60 nM Dans les deux cas on observe un palier entre 5 et 6 RPM cependant, lorsque la boucle est dans le circuit, le signal est plus important. L’intérêt de travailler sur un palier est d’affaiblir les variations de signal pouvant être dues aux variations de débit, de plus 6 RPM correspond à 0,84 mL/min ce qui représente un temps d’analyse d’environ 3 min par injection et une consommation en réactifs raisonnable.

Signal En mV

Signal En mV

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3 Linéarité du signal Afin de connaître la linéarité de la réponse de l’hémine dans ce montage une droite d’étalonnage est réalisée. L’hémine a été diluée dans de la soude 0,1M.

Concentration d’hémine en nM

Figure 9: gamme d’étalonnage dans de la soude 0,1M Barres d’erreur ± σ inférieures à la taille du signal [luminol] 1mM ; débit 0,84 ml/min

La gamme montre une réponse linéaire ce qui prouve que une calibration est possible à partir d’une gamme étalon . Ceci permet donc de passer à l’étude de l’hémine dans l’eau de mer. 4 Essais en eau de mer artificielle La gamme réalisée est identique à celle réalisée dans la soude.

y = 17,093x + 65,333R2 = 0,9899

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70

Concentration d’hémine en nM

Figure 10 : gamme d’étalonnage dans de l’eau de mer artificielle avec un excès d’EDTA B, avec la quantité

exacte d’EDTA nécessaire A. Barres d’erreur ± σ inférieures à la taille du signal [luminol] 1mM ; débit 0,84 ml/min

La courbe B représente l’évolution du signal en fonction de la concentration d’hémine lorsque l’EDTA est rajouté en excès avant l’hémine. La variation n’est pas linéaire et les signaux sont beaucoup plus bas que ceux obtenus dans la soude, ce qui montre que l’hémine est soit dégradée, soit en compétition avec l’EDTA, car sa concentration est nettement supérieure à celle de l’hémine. Les cations se complexent rapidement avec l’EDTA, par conséquent, la quantité exacte d’EDTA est ajoutée à l’eau de mer et le dosage est directement réalisé selon le

Signal En mV

Signal En mV

A B

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traitement décrit précédemment : les résultats sont représentés par la droite A. La linéarité est similaire à celle obtenue dans la soude. Ces résultats montrent donc que le dosage en eau de mer artificielle est possible pour l’hémine. 5 Essais avec la peroxydase : Il a été prouvé précédemment que le signal du photomultiplicateur variait linéairement avec les concentrations d’hémine dans l’EMA. Il existe probablement d’autre complexes fer-porphyrine dans l’eau de mer naturelle. L’intérêt de tels essais est de déterminer quelle sera la variation du signal imposée par la différence de structure de la porphyrine. Afin de comparer les réponses lors des mêmes conditions d’analyses, une gamme a été réalisée. L’autre porphyrine utilisée est la peroxydase car elle est soluble dans l’eau.

y = 16,51x + 24,01R2 = 0,98

y = 6,94x + 75,65R2 = 0,98

0100200300400500600700800900

0 10 20 30 40 50

Concentration en complexes en NM

Figure 11 : comparaison des gammes d’étalonnage dans de l’eau de mer artificielle A la peroxydase et B l’hémine Barres d’erreur ± σ inférieures à la taille.

[luminol] 1mM ; débit 0,84 ml/min Les pentes ne sont pas identiques(facteur 2,4). Chaque complexe a donc sa propre réponse en fonction de la structure du ligand et par conséquent sa propre pente. Lors des dosages réels les concentrations seront donc exprimées en équivalents d’hémine.

Signal En mV

B A

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3.2 Interférences Le but de cette étude étant de pouvoir déterminer des concentrations d’hémine dans des échantillons d’eau de mer naturelle, il faut évaluer les interférences éventuelles avec différents composés également présents dans cette eau de mer. Les interférences avec la protoporphyrine IX, le fer et l’eau oxygénée ont été étudiées. 1 La protoporphyrine IX Afin de déterminer les interférences avec la protoporphyrine IX une gamme est réalisée dans de l’EMA. Les résultats sont les suivants :

0510152025

0 20 40 60 80

Concentration de protoporphyrine IX en nM

Figure 12 : gamme de protoporphyrine IX dans de l’eau de mer artificielle Barres d’erreur :± σ

[luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min Quelques soient les concentrations de protoporphyrine ajoutées le signal est minimum et ne suit aucune variation significative. Il n’y a donc aucune interférence avec la protoporphyrine IX. 2 Le fer La figure 13 represente l’évolution du signal en fonction de la quantité en Fe III dans l’eau de mer artificielle.

200

220240

260280

300

0 200 400 600

Concentration en nM

Figure 13 : gamme de fer III dans de l’eau de mer artificielle,Barres d’erreur :± σ [luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min

Quelque soit la concentration en fer le signal est invariant et similaire à celui de l’eau de mer artificielle seule. Il n’y a donc pas d’interférence avec le fer III pour cette analyse.

Signal En mV

Signal En mV

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3 L’eau oxygénée L’eau oxygénée est un oxydant fréquemment utilisé lors d’analyse avec le luminol et détection par chimiluminescence des ions Fe III (Schroeder and Yeager, 1978). Dans la couche euphotique elle est présente à des concentrations allant de 25 à 186 nM (Jinchun et al 2001., Jinchun and Schiller,1999, Amouroux and Donard., 1995). Plus en profondeur, les concentrations sont généralement inférieures à 3nM (Amouroux and Donard., 1995). Il est donc important de verifier si l’eau oxygénée contenue dans l’eau de mer provoque une interférence lors de l’analyse de l’hémine. Une gamme de solution de peroxyde d’hydrogène en présence d’une concentration en hémine constante de 60 nM a été faite.

01002003004005006007008009001000

0 50 100 150 200 250

concentration d’H2O2en nM

Figure 14 : interférences avec l’eau oxygénée sur une solution d’hémine de 60 nM Barres d’erreur :± σ

[luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min

La gamme présente une interférence avec l’eau oxygénée. Si l’eau oxygénée est un interférentde type multiplicatif, un dosage par la méthode des ajouts dosés permettra de retrouver la concentration réelle. Si c’est un interférent de type additif, il sera nécessaire de déterminer systématiquement la concentration d’eau oxygénée dans l’échantillon et de soustraire le signal qu’elle génère (figure 14).

3.3 Modifications en vue d’une automatisation L’EDTA a été utilisé jusqu’ici comme agent masquant de la précipitation du calcium et magnésium, il existe plusieurs inconvénients à son utilisation. Tout d’abord d’un point de vue pratique, en effet cette technique doit pouvoir fonctionner en mission océanographique et l’idéal serait d’ajouter directement le complexant en ligne ce qui n’est pas possible avec l’EDTA car aucune solution suffisamment concentrée ne peut être réalisée. La variation du signal en fonction de la quantité d’EDTA est représentée par la courbe suivante.

Signal En mV

( )

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0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8

quantité d’EDTA en grammes

Figure 15 : variation du signal en fonction de la quantité d’EDTA sur une solution d’hémine de 60 nM Barres d’erreur :± σ

[luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min La quantité utilisée pour neutraliser le calcium et le magnésium est 2,1g or cette quantité ne se situe pas sur un plateau ce qui peut poser des problèmes de répétabilité d’une gamme à l’autre. Lorsque la quantité d’EDTA augmente, le signal augmente et atteint un plateau mais une précipitation due à l’insolubilité de l’EDTA est observable dès 3g de produit ajouté. Pour résoudre ces problèmes, l’acide glycolique est utilisé comme agent complexant du calcium et du magnésium car il a une très grande solubilité (0,1g/mL dans de l’eau) et ses complexes avec le calcium et le magnésium sont suffisamment stables en milieu basique. Le pKa de cet acide est de 3,83, par conséquent il est indispensable de trouver un moyen de l’ajouter dans l’eau de mer sans avoir une baisse de pH trop importante, ce qui dégraderait la porphyrine. Les échantillons sont donc tous préparés avec un contrôle pH à chaque étape. Les résultats sont comparés avec une gamme d’hémine dans de la soude 0,1M. 1 Utilisation d’un tampon glycolate/acide glycolique Lorsque l’on ajoute ce tampon à l’eau de mer artificielle, on observe une baisse de pH de 8,2 à 3,8 ce qui ne permet pas de conserver l’hémine il faut donc ajouter du tampon NH3/NH4

+ pour ralentir la baisse de pH. En utilisant le mode opératoire suivant les résultats sont plus satisfaisants :

- 10 mL d’EMA. - 3 mL de tampon NH3/NH4

+ → pH=9,2. - 3 mL de tampon glycolate/acide glycolique → pH=5,3. - 3 mL de soude 2 M → pH=9,2.

Le pH est maintenu suffisamment haut pour éviter une dégradation de l’hémine. Les résultats sont représentés par la courbe A, on remarque que la réponse est linéaire mais moins sensible que dans l’eau milliQ, (courbe B).

Signal En mV

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y = 10,89x - 21,67R2 = 0,97

y = 5,27x + 13,53R2 = 0,99

-200

0

200

400

600

800

1000

0 20 40 60 80

concentration d’hémine en nM

Figure 16 : comparaison des gammes d’étalonnage dans de l’eau de mer artificielle A et dans l’eau milliQ B.

Barres d’erreur :± σ [luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min

2 Essais sans tampon NH3/NH4

+ La multiplication des réactifs de traitement peut entraîner des contaminations, il est donc intéressant de supprimer le tampon ammoniaqual. Afin de ne pas dégrader l’hémine, le pH de la solution de glycolate/acide glycolique doit être relevé. Il faut donc préparer des solutions dont le pH est compris entre 5,5 et 7. Cette zone de pH se situant proche de l’équivalence il est nécessaire de réaliser le mélange sous contrôle pH.

y = 10,89x - 21,67R2 = 0,97

y = 1,07x - 3,05R2 = 0,98

y = 1,14x + 1,12R2 = 0,99

-200

0

200

400

600

800

1000

0 20 40 60 80 100

concentration d’hémine en nM

Figure 17 : comparaison des gammes d’étalonnage dans de l’eau de mer artificielle, triangles et croix, et dans

l’eau milliQ losanges Barres d’erreur :± σ [luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min

Une solution à pH=5,5 est tout d’abord préparée, les résultats sont représentés par les triangles, la réponse est linéaire mais beaucoup moins sensibles que dans l’eau milliQ (losanges). Cette baisse de sensibilité pouvant être due à un pH trop faible de la solution de glycolate le pH de la solution est donc élevé à pH=6,5, les résultats sont représentés par les croix. On s’aperçoit que la sensibilité n’a pas augmenté malgré la hausse de pH. Ces résultats permettent de penser que le tampon ammoniaqual joue également un rôle dans la sensibilité de la manipulation, pour vérifier cette hypothèse, une solution de glycolate d’ammonium est utilisée, le pH est ensuite remonté à 12,5 par un ajout de soude 1M.

Signal En mV

Signal En mV

B A

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y = 4,7241x - 15,575R2 = 0,9585

y = 11,8x - 7,6667R2 = 0,978

0

200

400

600

800

1000

1200

0 20 40 60 80 100

concentration d’hémine en nM

Figure 18 : comparaison des gammes d’étalonnage dans de l’eau de mer artificielle B et dans l’eau milliQ. A Barres d’erreur :± σ

[luminol]1mM ; débit 0,84 ml/min Le signal n’est pas aussi élevé que dans l’eau milliQ,courbe A, cependant, la sensibilité est suffisamment bonne pour pouvoir réaliser un étalonnage dans cette gamme de concentration.

A B

Signal En mV

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IV Conclusion et perspectives Les conditions expérimentales pour doser certains complexes fer porphyrine ont été établies pour l’eau de mer artificielle. La mise en évidence d’interférences avec l’eau oxygénée et les interférences éventuelles avec d’autres composés laissent à penser que le dosage par ajouts dosés est la méthode la mieux adaptée à cette technique. L’utilisation de l’acide glycolique comme agent complexant permet de penser à une automatisation future du montage, mais elle provoque une baisse de sensibilité par rapport à l’utilisation de l’EDTA. Afin d’optimiser la méthode avec l’acide glycolique les réactifs de traitements doivent être redéfinis. Les concentrations en complexes fer porphyrine n’étant pas connues dans l’eau de mer, une amélioration de la sensibilité est donc à prévoir. Il reste cependant d’autre points à vérifier. Il faut déterminer quelle type d’interférence génère l’eau oxygénée. La chlorophylle est également une porphyrine complexée au magnésium et présente en quantité non négligeable dans l’eau de mer il faut donc vérifier les interférences avec des porphyrines complexés à d’autre métaux. Les interférences avec d’autres espèces chimiques organiques ou minérales telles que les métaux traces ou les sidérophores devront également être testées. Des essais en eau de mer naturelle sont également à prévoir.

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Annexe : Préparation de l’eau de mer artificielle. Pour 40 Litres d’eau de mer artificielle finale Sels Anhydres 10 l

NaCl 981,842 g KBr 3,998 g Na2SO4 163,627 g NaHCO3 7,997 g KCl 28,001g H3BO3 1,200 g NaF 0,120 g NaF (6g/l) 20,0 mL Sels Hydratés 10 l

MgCl2, 6H2O 444,012 g CaCl2, 2H2O 61,747 g SrCl2, 6H2O 0,680 g SrCl2, 6H2O (34g/l) 20,0 mL

Eau milliQ 20 L

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