�9 ELSEVIER P a r i s 1985

Ann. Inst. Pasleur/Microbiol. 1985, 136 B, 75-91

DE D E U X

CHEZ

MISE EN I~VIDENCE

G R O U P E S SI~ROLOGIQUES P R I N C I P A U X

C L O S T R I D I U M T Y R O B U T Y R I C U M

par J.-L. Berg/~re

( A v e c la c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e de M m e s J . COMMISSAIRE e t N. PAMBOUKDJIAN)

Laboratoire de Microbiologie Laitidre, INRA, 78350 Joug-en-Josas (France)

SUMMARY

CHARACTERIZATION OF T~VO MAIN SEROLOGICAL GROUPS

IN (( CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM ))

Antisera prepared against heated cells of 10 strains of Closlridium tgrobutgricum gave cross-reactions with several other clostridial species. Such reactions could be completely eliminated by absorption with C. bei- jerinckii, C. fallax and C. tetanomorphum. Both agglutination and immuno- iluorescence tests with these antisera showed that 85 strains of C. tgro- butgricum were divided into two main serological groups, A and B. The 56 strains of group A possessed the same thermostable species-specific antigen, whereas those of group B were lacking in it.

Antisera prepared against either formol- or ethanol-treated cells or low-heated cells of C. tgrobulgricum showed only low titre cross-reactions with other clostridial species. When these were removed by absorption, only the homologous strains and a few other strains of C. tgrobulgricum group B were still agglutinated at a full titre by these antisera.

Therefore, only strains of group A of C. tyrobutgricum can be easily identified by a single type-specific antiserum.

Keg-words: Clostridium tgrobulgricum, Therniostable antigen; Serology, Taxonomy, Ensilage, Cheese production.

Manuscrit rel~u lc 11 mars 1985, accept5 le 28 mai 1985.

76 J.-L. BERGI~RE

I N T B O D U C T I O N

Clostridium tgrobulgricum est une bact6rie part iculi6rement redout6e dans la fabrication de certains fromages parce qu'elle provoque un gon- flement r6sultant de la production de gaz et une alt6ration du gof~t prin- cipalement due & la formation d'acide bu tyr ique [2]. Ce d6faut est devenu fr6quent depuis qu 'on utilise l'ensilage comme moyen de conservation des fourrages destin6s & l 'al imentation des animaux. En effet, cette prat ique favorise la multiplication de C. lgrobulgricum dans les fourrages et augmente ainsi les risques de contaminat ion du lair, par cette bact6rie, au moment de la t rai te [2].

Pour contr61er cette contaminat ion on caract6riser le d6faut dans les fromages, il serait utile de pouvoir identifier rapidement C. lgrobutgricum dans les milieux de d6nombrement qui ne sont pas s61ectifs ou d6tecter directement cette bact6rie dans l'ensilage, le lait et le fromage. Pour cela le fait de disposer d 'un s6rum sp6cifique permet t ra i t d 'envisager la raise au point de techniques appropri6es. Nous avons donc cherch6 fi pr6parer un tel s6rum.

I1 y a pen de publications sur les caract6res s6rologiques des Closlri- dium saccharolytiques [5, 8], et une seule concerne des Clostridium isol6s de laits et de fromages, C. lgrobulgricum, C. bulgricum et C. beijeriuckii [ 17]. Darts cette publication il avait 6t6 montr~ qn'un s6rum pr6par6 contre des cellules chauff6es de C. lgrobutgricum donnait des r6actions crois6es avec les deux autres esp6ces ainsi qu 'avec d 'autres Closlridium no tamment C. bolulinum t ype A. Apr6s 6puisement du s6rum par cette derni6re esp6ce, toutes ces r6actions crois6es sont supprim6es et le s6rum ainsi trai t6 est encore capable d 'agglutiner les diverses souches de C. lgrobulgricum 6tu- di6es. Les auteurs en avaient d6duit qu'elles poss6daient au moins un anti- g6ne thermostable comlnun et sp6cifique de l'esp6ce.

Dans le pr6sent t ravai l nons avons cherch6 fi utiliser ces r6sultats en r u e d 'obtenir un s6rum sp6cifique qui permet te d'identifier C. tgrobulg- ricum. Or nous avons pu constater sur une collection de souches plus large que celle 6tudi6e par les pr6c6dents auteurs, qu'il existe en fait, chez C. lgrobulgricum, un deuxi6me groupe s6rologique qui ne poss6de pas d'antig6ne thermostable d'esp6ce. Nous avons ensuite cherch6 fi voir s'il 4tait possible de caract6riser ce groupe sur la base des antig6nes thermo- labiles, mais nous n 'avons pas typ6 les divers sous-groupes qui le const i tuent car il parait tr6s h6t6rog6ne.

MATI~IRIEL ET Mt~THODES

Souches bacl#riennes.

Les diverses souches de Closlridium utilis6es dans ce travail provenaient de notre collection (CNRZ) et d'autres collections : Institut Pasteur, Paris (IPP) ou

GROUPES Sts DE C. T Y R O B U T Y R I C U M 77

Lille (IPL), National Collection of Dairy Organisms (NCDO), National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), National Collection of Types Cultures (NCTC), American Type Culture Collection (ATCC), Nederlands I n s t i t u t voor Zuivelon- derzoek (NIZO) et Ist i tuto di Microbiologia Agraria e Tecnica (IMAT, Bologne, Italic). Les num~ros des souches avec leur origine en abr~viation sont pr~cises dans les resultats.

Parmi les 85 souches de C. lgrobutgricum etudiees, 72 ont ~te isolees par nous par t i r d'ensilage, de lait et surtout de divers types de fromages provenant de

differentes regions de France. Ces souches ainsi que quelques souches des autres collections ont dejfi fait l 'objet d 'une etude taxonomique selon les crit~res classi- ques [16].

Coudilions de cullure el prdparalion des anligdues.

Tous les Closlridium utilises ont ete cultives ~ 37 ~ C en milieu RCM (reinforced clostridial medium) [10] exempt de gelose pour faciliter la recolte des cellules. Ce milieu a ere fraichement autoclave ou regenere juste avant inoculation. Les cultures ont ete effectuees en tube, le milieu e tan t recouvert d 'un melange paraffme et huile de parafflne, ou en ballons sous atmosph6re d'azote, et cela suivant la quanti te de cellules necessaire aux essais.

Les cellules ont ete recoltees en phase de croissance exponentielle ou juste avan t la fin de ce stade, leur ~tat e tant contr61e par examen microscopique. Elles ont ete immedia tement centrifugees ~ 1 500 g pendant 20 rain, reprises en t ampon phosphate salin TPS (0,0l M, pH 7,3, NaC1 8 g/l), et g~neralement centrifugees une nouvelle fois avant d'6tre mises en suspension en TPS. Toutes ces op6rations ont ere effectuees fi 4 ~ C.

Pour la p lupar t des essais, la suspension de cellules a et6 ensuite immediate- ment chaufl'ee au bain-marie fi 100 o C pendan t 1 h [17], centrifugee et reprise en TPS. Cependant, dans certains cas qui sont precises dans les resultats, on a utilise des cellules non traitees ou ayant s u n des t ra i tements differents.

Le t ra i tement par la chaleur a ete realise au bain-marie ~ differentes t empera - tures pendant des temps precises dans les resultats.

Pour le t ra i tement par le formol, les cellules recueillies apr~s centrifugation de la culture ont ere immedia tement raises en suspension en TPS contenant 0,25 ~, de formol, puis incubees pendant 1 nuit fi 37 ~ C, centrifugees et remises en suspension en ~[PS.

La detlagellation par l'alcool a 6te elIectuee selon la technique de Chandler et Hamil ton [4], les cellules e tant remises ensuite en suspension en TPS.

Les suspensions cellulaires destinees ~ la preparat ion de s6rums ont ete ensuite conservdes fi --30 ~ C. Pour les reactions d 'agglutination, dies ont ete conservees

4 ~ C en TPS additionne d 'azoture de sodium R 0,1~o, la congdat ion ent ra inant souvent des phenom~nes d 'autoagglutinat ion.

Prdpar(lliou des s&ums.

La technique d ' immunisat ion est l ' inoculation par vole veineuse d'une suspen- sion coutenant 109 cellules/ml. Chaque lapin a regu 0,5 ml de suspension les jours 1 et 4, 1 m l l e s jours 7 et 10, 2 m l l e s jours 14 et 17, puis respect ivement 0,5, 1 et 2 m l l e s jours 27, 30 et 33 ; il a ~te saigne 10 jours apr~s la derni~re injection et le sermn a ~te conserve h --30 ~ C. En cours d'utilisation, les serums decongeDs ont ete conserves ~ 4 ~ C apr~s dilution au demi en TPS contenant 0,1~o d 'azoture de sodium.

Un prel~vement de sang a ete effectu~ ~galement avan t la premiere inoculation pour la v~rification de l 'absence de reaction entre le serum et la souche bacterienne utilisee.

78 J.-L. BERGI~RE

Techniques s~rologiques.

Les essais d 'agglutination ont ~t~ effectu~s en plaque de microt i t rage (Greiner} fi cupules ~ fond rond, selon la m~thode d6crite par Williams et Whi t temore [22]. Les suspensions cellulaires ont ~t~ ajust~es pr~alablement fi une densit6 opt ique de 1,0 h 650 nm, ee qui eorrespondait ~ environ 5 • 108 eellules/ml, suivant l '~ta- lonnage qui a ~t~ effeetu~ avec les 10 souehes les plus utilis~es (tableau II). Le t i tre des s~rums indiqu~ dans les resultats correspond fi l ' inverse de la plus forte dilution provoquant un d~p6t different de eelui observ~ sur le t~moin sans s~rum, apr~s une incubation d'une nuit fi 37 ~ C. Au tours d'essais pr~liminaires, il a ~t~ v~rififi que les t i tres ainsi obtenus sont identiques ou tr~s peu diff~rents de ceux obtenus par la mfithode en tubes : un mdlange de 0,1 ml des diff~rentes dilutions et de 0,9 ml de suspension cellulaire a ~t~ ineub~ ~ 37 ~ C pendant 2 ti, puis ~ 4 ~ C pendant une nuit, et la pr6sence d 'agglut inats a 5t5 observ~e fi la loupe apr~s remise en suspension du culot. Les r5actions de type H (cellules non trait~es ou formolSes) n 'Stant pas tr~s nettes en plaques, les essais ont 5t~ effectu~s en tubes comme ci-dessus, mais la lecture a eu lieu juste apr~s l ' incubation fi 37 ~ C. Dans les deux cas, le ti tre des sSrums correspond h l ' inverse de la plus forte dilution provo- quant la formation d 'agglut inats compara t ivement /~ la dilution de suspension cellulaire incub~e sans s~rum.

L'essai du s6rum en immunofluorescence a et4 rSalis5 par la methode indi- recte [23] h l 'aide d'une prepara t ion d 'ant icorps de mouton ant i- lgG de lapin ( Ins t i tu t Pasteur Production) dilute ~ 1/100. L ' examen des preparat ions a 5t~ fair en fond noir avec un microscope (( Wild M20 )) ~quip~ d'une lampe fi vapeur de mercure HBO 50 W.

Lorsque cela a ~t5 necessaire, les sSrums ont ~tfi soumis a une absorption par des suspensions cellulaires d'esp~ces donnant des r~actions croisSes ou ~ventuelle- ment de certaines souches de C. tyrobul!lricum comme cela est indiqu~ dans les rSsultats. Le sfirnm pur ou dilu~ fi 1/2 ou h 1/4 a ~t5 m~lang~ fi un culot cellulaire fi raison d 'environ 5 • 10 ~ cellules/ml, incub~ fi 37 ~ C pendant 2 h 5 h, puis centri- fug5. L'op~ration a fit~ r~p~tSe jusqu'fi ce que le t aux d 'agglutinat ion fi l '~gard de la souche utilisee pour l 'absorpt ion soit suflisamment bas (voir r~sultats). Pour les 3 esp~ces donnant les plus fortes r~actions crois~es, C. bei/erinckii, C. /allax e t C. letanomorphum, des cellules lyophilis~es ont 5te ~galement utilisSes fi raison de 30 fi 50 mg (soit environ 2 • 10 ~~ cellules) par ml de s~rum dilu~ fi 1/2, ce qui a permis d 'obtenir des r~sultats plus reproductibles et d'Sviter de t rop diluer les s~rums.

R I ~ S U L T A T S

Agglutinalion de diverses esp~ces de Clos t r i d ium par un sdrum prdpard contre les cellules chauffdes d'une souche de C. t y r o b u t y r i e u m .

L ' i m m u n s 6 r u m p r @ a r ~ fi p a r t i r de C. lgrobulgricum ( C N R Z 510) agg lu t ine 6 au t r e s esp~ees h des t i t res a l l an t de 180 h 1.280 (colonne 1, t a b l e a u I) alors qu ' i l ne r6ag i t pas, ou p r a t i q u e m e n t pas , a v e c les 8 au t r e s esp6ces tes t~es (colonne 2, t a b l e a u 1).

L ' a b s o r p t i o n du s6rum p a r une des souches de C. beijerinckii p e r m e t de s u p p r i m e r l ' a g g l u t i n a t i o n des esp~ces d o n n a n t les plus fo r t e s r~aet ions erois6es, C. bulgricum et C. saccharobutgricum, mais non celles observ~es avee C. fallaz et C. telanomorphum. L ' a b s o r p t i o n pa r C. fallax ne s a p p r i m e pas l ' a g g l u t i n a t i o n de C. telanomorphum et v ice versa . L o r s q u e le s6 rum a 6t6 absorbfi avec ces 3 esp~ces, il n ' a g g l u t i n e plus a u e u n e des souehes

GROUPES St~ROLOGIQUES DE C. TYROBUTYRICUM 79

TABLEAU I. - - A g g l u t i n a t i o n de difffirentes esp$ces de ~r Clos tr id ium ~> par u n s ~ r u m ant i -~ C. t y r o b u t y r i c u m >> s o u c h e CNRZ 510.

Titre Titre du s6rum du sdrum

C. lgrobutgricum CNRZ 510 5.120 C. beijerinckii NCDO 1758 et 1.280-2.560

CNRZ 703 C. bulgricum (*) CNRZ 528,530 et 160-1.280

531 ; IPL A a e t N I Z O 520 C. saccharobutgricum (*) CNRZ 320-1.280

556,557 et 559 et IPL 3044

C. telanomorphum IPP EC ' I et 640 CNRZ 547

C. fallax IPL FM2 et S 320-640 C. botulinum A NCTC 7272 180-320

C. pasleurianum ATCC 6013 80 C. septicum IPP 5274 80 C. acetobutylicum IPL L41 < 2 0 C. bi[ermentans IPL TM < 2 0 C. lertium IPP 5018 < 2 0 C. sporogenes IPP 5570 et < 2 0

CNRZ 541 C. perfringens CNRZ 549 et < 2 0

551 C. sordelli NCIB 10717 < 2 0

Les cellules ayant servi h pr6parer et h 6prouver le sdrum ont toutes dtd chauffdes h 100 ~ C pendant 1 h.

(*) Selon les critbres de Beerens et coll. [1]. I1 a 6td montr6 que les souches 528, 530 et 531 pr6c6demment classdes darts l'esp~ce C. butgricum appar t i ennent en fait plut~)t ~ l'esp~ce C. bei- ]erinckii [13].

des autres esp6ces de Closlridium cit6es dans le tab leau I ~ un t i t re sup6- rieur ou 6gal ~ 40, y compris C. bolulinum. Son t i tre ~ l '6gard de la souche homologue est pass6 de 5.120 ~ 2.560. Essay6 sur d 'autres souches de C. tyrobulyricam prises au hasard dans la collection, les r6sultats suivants ont 6t6 obtenus :

- - 5 souches, CNRZ 505, 564, 573, 580 et IMAT-C4 sont agglutin6es des t i tres de 1.280 h 2.560, les t i tres obtenus avec le s6rum bru t 6tant

de 5.120 comme avec la souche homologue CNRZ 510; - - 4 souches, CNRZ 569, 606, 608 et 610 ne sont plus agglutin@s qu'h

des t i t res tr~s bas 80 h 120, alors que les t i tres obtenus avec le sOrum bru t sont de 1.280 h 2.560.

Agglutination de C. beijerinckii, C. fallax, C. t e t anomorphum el C. tyro- bu ty r i cum par les sdrums prdpards conlre les cellules chauff~es de 10 souches de C. ty robutyr icum.

Les r6sultats obtenus avec le s6rum anti-C, lyrobulyricum CNRZ 510 laissant entrevoir que les 10 souches essay6es comme antigone pourraient appartenir ~ au moins 2 groupes s6rologiques A et B, des s6rums ont 6t6 pr6par6s contre les cellules chauff6es de ces souches.

Les s6rums pr6par6s contre les 6 souches du premier groupe (505 IMAT-C4 tableau II) agglutinent :

les 6 souches correspondantes (A, tab leau II) ~ des t i t res 61ev6s, 6gaux ou peu inf6rieurs ~ ceux observ6s avec les souches homologues ;

- - les 4 souches du deuxi~me groupe (B) ~ des t i tres ne t t ement plus bas ;

80 J.-L. BERG~RE

TABLEAU II. - - Ac t iv i t~ a g g l u t i n a n t e de 10 s ~ r u m s anti-(( C. t y r o b u t y r i c u m >~ sur les s o u c h e s c o r r e s p o n d a n t e s et sur les 3 e sp~ces de (( C los tr id ium >~

d o n n a n t l e s p l u s for tes r ~ a c t i o n s cro is~es .

A CT 505 CT 510 (iT 564 CT 573 CT 580 CT IMAT-C4

B CT 569 CT 606 CT 608 CT 610

C. t. lPP EC'1 C. bj. NCI)O 1758 C. f. IPL S

Titre des sdrums prdpards contre les diverses souches de C. t g r o b u t g r i c u m des groupes

A B

505 510 573 569 606 610

25.600 12.800 25.600 25.600 12.800 12.800

1.600 1.600 1.600

6.400 1.600

6.400 6.400 6.400 6.400 6.400 6.400 ~

3.200 1.600 1.600 1.600

800 1.600

4O0

580 IMAT-C4

12.8001 25.600 I 6.400 25.600

12.800 25.600 ~2.8001 25.600 I

608

1.600 12.8( 3.200 12.8( 1.600 6.4( 1.600 6.4( 3.200 6.4(

800 3.2(

2.8oo 1T.si 5.6OO 12.8( 2.800 12.8t 2.800 12.8(

564

25.600 25.600 3.200 25.600 25.600 3.200 25.600 25.600 1.600 25.600 25.600 1.600 25.600 25.6001 '2.8001 25.600 6.400 25.600 25.600 6.400 25.600 1.600

-3~oo ~ 4~1 ~ I - - ~ Z o - 12.800 1.600 6.400 / 1.600[ 6.400 6.400 3.200 6.400[ 1.600[ 6.400 12.800

80012800i 1.600 6.400 2800

6.400 6.400 6.400 t 6.400 1.600 8001 3.200 1.600 3.200 800

I

6,400 3.200 3.200 3.200

12.800 1.600

25.600 25.600 25.600 25.600

2 800 i2 ool-; 40-- 3.200 doo 3.200 1.600 400

CT = C. t~,frobutgricum ; C. t . = C. t e t a n o m o r p h u m ; C. bj. ~ C. be i]er incki i ; C. f . = C. [al lax. l,es cellules trtiHsdes pour les agglut inat ions et la prdpara t ion des s6rums ont dtd chauff6es h

100 ~ C pendant 1 h.

- - les 3 autres esp~ces fi des t i tres vari6s mais toujours net tement in%- rieurs fi ceux observ6s avee la souche homologue, l'esp~ee donnant la plus forte r~action trois@ ~tant g6n~ralement C. beijerinckii.

Les s6rums pr~par6s contre les 4 souches du deuxi~me groupe (569 h 610, tableau II) agglutinent :

- - les 4 souches correspondantes (B) h des titres ~lev6s, 6gaux ou peu in%rieurs aux ti tres homologues;

- - les 6 souehes du premier groupe (A) fi des titres ne t t ement plus bas fl quelques exceptions Fr~s;

- - C . tetanomorphum h u n ti tre 6gal ou peu inf@ieur ~ celui observ6 avec la souehe homologue, alors que les r6actions observ@s avec C. beije- rinckii et C. [allax sont ne t tement plus faibles.

Les s6rums ont 6t6 absorb6s avec des cellules ehauff@s de C. beije- tinckii, C. lelanomorphuin et C. [allax jusqu'~ ee que les titres des r6actions eroisfies soient inffirieurs & 20. Dans le cas de C. lelanomorphum, il a ~t6 n@essaire de r6p6ter l 'op6ration de 1 h 5 lois pour obtenir ee rfsul tat , no tamment darts le eas des 4 s6rums dirig6s eontre les souches du groupe B. C'est la raison pour laquelle des pr@arations de eellules lyophilis@s plus eoncentr@s ont 6t6 utilis6es ult~rieurement. Les absorptions successives des 10 s6rums par ces 3 Clostridium suppriment toutes les autres r~aetions

GROUPES St~ROLOGIQUES DE C. TYROBUTYRICUM 81

crois~es avee les diverses esp~ces de Clostridium mentionn~es dans le tab leau I.

Les s~rums ainsi obtenus ont 6t~ essay,s avec les 10 souches de C. tyro- butgricum correspondantes (tableau III). Ceux dirig~s contre les 4 souehes du groupe B n 'agglut inent plus aueune des souches y compris les souehes homologues h des t i tres ~gaux ou sup~rieurs h 100. D'ailleurs, le plus souvent les ti tres obtenus ne sont pas sup~rieurs h ceux des rfiactions eroi- s~es r~siduelles, c'est-h-dire 20. Les 6 s~rums dirig~s contre les souehes du premier groupe (A) n 'agglutinent plus non plus les 4 souches du deuxi~me groupe mais eonservent une forte activit~ agglutinante/a l'~gard des souches eorrespondantes : les t i tres sont tous sup6rieurs ou ~gaux ~ 3.200 et peuvent aller jusqu 'a plus de 12.000. En outre, lorsqu'on absorbe l 'un de ees s6rums avee chacune des 5 autres souches, il perd toute aetivit~ agglutinante l'~gard des 6, y compris la souche homologue. L 'absorpt ion avee l 'une ou l 'autre des 4 souches du groupe B ne modifie pas les t i tres agglutinants l'~gard des 6 autres.

TABLEAU III. - - Agglutination de 10 souches de (( C. tyrobutyricum )) par les s~rums correspondants aprgs absorption par <( C. tetanomorphum )),

<( C. beijerinckii >> et << C. fallax >>.

C. lyrobulllricum

Ti t re des sdrums prdpards cont re les souches

de C. tyrobutyricum

A B

505 ,510 , 564, 573, 569, 606, 608 580 ou 1MAT-C4 ou 610

A CNBZ 505, 510, 564, 573, i>3.200 < 1 0 0 580 ou IMAT-C4

B CNBZ 569, 606, 608 ou 610 < 1 0 0 < 1 0 0

l,es ccl lulcs ont 6t6 chauff(!es h 100 ~ C p e n d a n t 1 h. Le t i t r e h l ' 6gard des t ro is esp6ces de Closlridium a y a n t scrvi h l ' a b s o r p t i o n est inf6r icur h 20.

Enfin, nous avons constat~ que l 'absorpt ion d 'un sfirum bru t dirig6 eontre l 'une des souches (IMAT-C4) du groupe A, par l 'une des souehes (606) du groupe B, conserve un t i tre ~lev~ (12.800) 5 l '6gard de la souehe homo- logue (IMAT-C4). Inversement un s6rum bru t dirig6 eontre la souehe 606 l 'agglutine encore ~ un t i tre ~lev~ (12.800) lorsqu'il a 6t~ absorb6 par la souche IMAT-C4.

R~parlition de l' ensemble des souches de C. t y r o b u t y r i c u m suivanl leur degr~ d'agglulinalion par les s~rums absorbds.

Sept des sfirums pr~c6demment absorb6s, les six du premier groupe et un du deuxi~me groupe ont fit6 essay,s sys t~mat iquement fi 1/100 et

Ann. Inst. Pasteur]Microbiol., 136 B, n ~ 1j 1985. 6

82 J.-L. BERGERE

TABLEAU IV. - - R4partition et origine des 85 souches de , C. tyrobutyricum ~> 4tudi4es suivant leur agglutination par les s4rums absorb4s.

R6pat'tition Groupe Nb des s o u c h e s

s6ro- Collec- de su ivant leur logique (1) t ion souches N u m 6 r o (~) Or ig in e (a) o r ig ine (*)

A 56 souches soit 66 %

A T G C 1 25755 - - - - N C I B 1 10635 - - - - N I Z O 3 BZ1 5 , 51, 611 . . . . . N C D O 4 1715, 1"~ 54, F - -

1755, 1757 I P L 2 T I , T 5 - - - I M A T 6 CJ, C4, C7, F - -

C10, C17, C19 C N B Z 33 5 0 5 , 5 1 0 , 5 6 4 , F 84,6

573, 580 2 - - L 5,2 4 - - E 10,2

B C N B Z 18 569 F 62,1 20 s o u c h e s 2 - - L 6,0 soit 34 % 9 606, 608, 610 E 31,0

(1) Les souches du groupe A sont agglut in6es h u n t i tre >~3200 par les 6 s6rums absorb6s du premier groupe d6j~ ut i l i s6s ( tableau II l ) , mais pas par le s6rum absorb6 du 2 e groupe $608 h u n t i tre de 100. Les souches du groupe B ne sont agglut in6es , h un t itre i>100, par aucun de ces s6rums.

(3) Pour les souches CNRZ seuls sont indiqu6s les num6ros des souches ayant servi h pr6parer des s6rums.

(8) Origine : F ~ fromages , L = lair et E ~ ensilage. (4) R6part i t ion en % dans chaque groupe seulement pour les souches C N R Z .

1/3.200 sur les cellules chauff6es des 85 souches de C. tgrobutgricum dont nous disposons en collection (tableau IV). Cinquante-six d'entre elles, soit 66% de l'ensemble, sont agglutin6es h un titre d'au moins 3.200 par les 5 s6rums du groupe A, mais ne le sont pas par le s6rum anti-608 du groupe B.

Les 29 autres souches, soit 34% de l'ensemble, ne sont agglutin6es un titre sup6rieur ~ 100 par aucun des s6rums absorb6s. Nous avons v6rifi6 que les m4mes s6rums ainsi que les s4rums anti-569, -606 et -610 (groupe B) les agglutinent, avant absorption, h des titres 6gaux ou peu inf6rieurs ceux observ6s avec les souches homologues, c'est-~-dire compris entre 6.400 et 25.600.

I1 apparait donc que l'ensemble des souches de C. tgrobutgricum 6tudi4es st r6partissent bien en deux groupes A et B suivant leur(s) antig6ne(s) thermostable(s) :

Fun (A) pour lequel on peut pr6parer un s6rum sp6cifique par absorption avec les 3 esp6ces donnant les plus fortes r6actions crois4es ;

- - l ' a u t r e (B) pour lequel cette absorption supprime toute activit6 agglut inante y compris h l'6gard de la souche homologue.

On remarquera que parmi les souches du groupe A figurent celles qui proviennent de collections 6trang6res et en particulier les 2 qui servent de

GROUPES St~ROLOGIQUES DE C. TYROBUTYRICUM 83

r6ftrence pour l'esp~ce C. lgrobutgricum, NCIB 10635 et ATCC 25755 [15]. Nous avons d'ailleurs v~rifi~ qu 'un s~rum prtpar~ contre cette derni~re souche donne les m~mes r~sultats que les 6 autres s t rums du groupe A lorsqu'il est absorbt.

Bien que la proportion de souches provenant de fromages paraisse plus tlev~e clans le groupe A que dans le groupe B, et inversement pour l'ensilage, cela n'est pas forc6ment significatif t t a n t donn6 les differences de nombres de souches entre ces deux categories, 51 provenant de fromages contre seulement 13 d'ensilage. De plus, on sait que l'origine des souches de C. tgrobutyricum, qui se d~veloppent dans les fromages, est presque tou- jours l'ensilage [2].

Enfin si on examine la r6parti t ion des souches suivant leur indice de similitude avec les souches de r6f6rence de l'esp~ce C. tgrobulgricum [16], on constate qu'elle est pra t iquement la m~me dans les deux groupes strologiques (tableau V) ; la souche CNRZ 515 qui diff~re le plus des sou- ches-types appar t ient comme elles au groupe A. Les 16 souches qui ne poss~dent pas les 2 principaux caract~res distinctifs d'esp~ce (fermentat ion du mannose et r~duction des nitrates [16] selon le manuel de Bergey [18]) se r tpar t issent entre les deux groupes strologiques selon les m~mes pro- portions que l 'ensemble des souches, c'est-~-dire environ 2/3 dans le groupe A et 1/3 dans le groupe B.

TABLEAU V. - - R6partition des souches de ~ C. tyrobutyricum ~> suivant leur groupe s6rologique et leurs caract~res taxonomiques.

Pourcentage des souches de chaque groupc suivant leur indice de s imil i tude de caract~res

avec les deux souches de r6f6rence (*)

100 97,2 94,4 91,6 88,9 83,2

A 8 14 39 23 15 < 1

B 12 12 40 28 8 0

(*) Les indices de simil i tude avec les souches de r6fdrencc ATCC 25755 et NCIB 10635 expri- m6s en % ont 6t6 d6termin6s dans un t ravai l pr6c~dent [16]. Le classemcnt des souches dans les deux groupes s6rologiques est celui qui figure dans le tableau IV.

R~actions d'immunofluorescence obtenues avec les s&ums prepares conlre des cellules chauff~es de C. ty robu tyr icum.

Les s6rums 6tudi6s au chapitre pr~c~dant ont t t~ essay,s en immuno- fluorescence, d 'une part pour permet t re de voir si cet te technique pourrai t remplacer l 'agglutination pour la d6tection directe de C. lyrobulyricum dans certains milieux comme le fromage, et d 'aut re par t pour permet t re de vtrifier si, apr~s absorption des strums, il ne reste pas des anticorps non

84 J.-L. BERGt~RE

agglutinants susceptibles de r6agir avec les souches de C. lgrobulgricum, notamment avee eelles du groupe B.

Les r6sultats obtenus avee 3 de ees s~rums envers les souehes eor- respondantes de C. lgrobulgricum et envers les diverses esp6ees de Clos- Iridium montrent qu'ils r6agissent & peu pros de la mfime mani6re qu'en agglutination (tableau VI). On remarque 6galement que l 'absorption par les trois autres esp~ees de Closlridium d~j~ mentionn@s supprime toutes les autres r6aetions crois~es mais aussi l 'aetivit6 des s6rums & l'6gard de la souehe 608.

TABLEAU VI . --- R6act ions obtenues en i m m u n o f l u o r e s c e n c e indirecte avec 3 s 6 r u m s ant i -~ C. t y r o b u t y r i c u m ~

essay6s sur les s o u c h e s correspondantes et sur diverses esp~ces de ~ Clos tr id ium ~.

Ti t re des sdrums (2)

ant i -510 an t i - lMAT-C4 anti-608 Souches dtodides (~) b r u t absorb6 b r u t absorb6 b r u t absorbd

C. tgrobutgricum CNRZ 510 6.400 800 12.800 6.400 1.600 < 1 0 0 IMAT-C4 3.200 400 12.800 6.400 1.600 < 1 0 0 CNRZ 608 800 < 1 0 0 800 < 1 0 0 12.800 ~<100

C. bei]erincMi 100 20 400 < 2 0 20 < 2 0 C. lallax 1.600 20 1.600 < 2 0 400 < 2 0 C. tetanomorphum 400 < 20 3.200 < 20 3.200 < 20 C. bulgricum ~< 400 ~< 20 100 < 20 ~< 400 ~< 20 C. septicum 400 < 20 400 < 20 < 20 < 20 C. saccharobutgricum ~<100 < 2 0 400 < 2 0 ~<100 < 2 0

C. acetobutglicum et C. sporogenes

C. pasteurianum, ~ 20 < 20 ~ 20 < 20 ~ 100 < 20 C. bilermentans, C. per[ri~gens et C. tertium

(1) Les souches de Clostridium son t les m~mes que celles du t ab l eau I. (2) Les s~rums b r u t s et absorb6s sont les m~mes que eeux u t i l i s6s en a g g l u t i n a t i o n dans les

t a b l e a u x I, I I et I I I . Les t i t r e s ind iquds cor responden t ~ l ' i nve r se du t a u x de d i l u t i on le plus for t d o n n a n t encore une fluorescence ne t t e pa r r a p p o r t ~ eelles des t6moins .

Le classelnent des souches obtenu par agglutination (tableau IV) re s t e valable lorsqu'on utilise les s6rums absorb6s anti-505, -510, -573, -580 et -IMAT-C4 en immunofluoreseenee. Ils donnent des r~aetions positives des titres var iant de 400 ~ 6.400 avee les souehes du groupe A alors qu'h un t i t re de 50, les r6aetions sont n6gatives ou tr~s faibles avee eelles du groupe B. Les s6rums anti-569, -606, -608 et -610 absorb6s ne r6agissent pas, ou tr6s faiblement, ~ un t i t re de 50, ni avee les souehes du groupe A, ni avee eelles du groupe B, y eompris les souehes homologues.

Activild de sdrums prgpards conlre des cellules formoldes de C. $yrobutyricum.

Puisque les souches des groupes B ne semblent pas poss~der d'anti- g~ne sp6cifique thermostable, des s6rums ont 6t6 pr6par6s contre des cel-

GROUPES St~ROLOGIQUES DE C. T Y R O B U T Y R I C U M 85

TABLEAU VII . - - Sp6cificit6 de deux s6rums pr~par6s contre des cellules formol4es d'une souehe de chacun

de (( C. tyrobutyricum )~. des groupes

T i t r e a g g l u t i n a n t des s O ' u r n s 0 ) a n t i - 5 1 0 - F (A) a n t i - 6 0 8 - F (B)

C. tgrobutgricum G r o u p e A :

- - C N R Z 5 1 0 - F 6 . 4 0 0 < 1 0 0 5 1 0 - C < 5 0 (800) < 100

- - 9 a u t r e s s o u e h e s - F (2) < l O 0 < 1 0 0

G r o u p e B : - - C N R Z 6 0 8 - F < 1 0 0 1 2 . 8 0 0

6 0 8 - C < 1 0 0 < 1 0 0 (800) - - C N R Z 5 6 2 - F < 1 0 0 3 . 2 0 0 - - C N R Z 6 0 7 - F < 1 0 0 6 . 4 0 0 - - 29 a u t r e s s o u e h e s - F (a) < 100 < 100

A u t r e s e sp~ces de Clostridium (4) < tOO < 100

F = ee l l u l e s t r a i t 6 e s p a r le f o r m o l ; C = e e l l u l e s c h a u f f ~ e s h 100 ~ C p e n d a n t 1 h . (*) S 6 r u m s a b s o r b 6 s a v e c les ee l l u l e s c h a u f f 6 e s d e l a s o u c h e h o m o l o g u e ; les t i t r e s a v a n t a b s o r p -

t i o n s o n t les m ~ m e s h p a r t 2 ea s i n d i q u d s e n t r e p a r e n t h b s e s . (2) S o u e h e s C N R Z 5 6 1 , 5 6 3 , 5 6 4 , 567 , 580 , 582 , 5 8 3 e t I P L T 5 . (a) L e s 29 a u t r e s s o u e h e s c i t f e s d a n s le t a b l e a u IV. (4) L e s m 6 m e s q u e dar t s le t a b l e a u l.

lules formol~es. Apr~s ce t ra i tement , les cellules conservent bien leurs flagelles, comme nous avons pu le v~rifier par examen en microscopie ~lectronique dans le cas d 'une souehe ; les agglutinations observ6es sont d'ailleurs floeonneuses et de type flagellaire. Comme le montrent les r~sul- ta ts du tableau VII, les 2 s~rums obtenus ne r~agissent pas, ou tr~s faible- ment, avec les autres esp~ces de Clostridium. A l'int~rieur de l'esp~ce C. lgrobutyrieum, le s~rum pr~par~ contre la souche du groupe A ne r~agit qu 'avec cette souche, et celui dirig6 contre la souche du groupe B ne r6agit qu 'avec 2 autres souches du m6me groupe en plus de la souche homologue. Un troisibme s6rum pr6par6 contre les cellules formol~es d 'une autre souche du groupe B n'a r6agi qu 'avec une seule souche de ce groupe, en plus de la souche homologue. Quelques essais effectu6s avec ties cellules non trait6es ont donnd les m~mes rdsultats.

Sp&ificild de s&ums pr@ards contre des cellules de C. t y r o b u t y r i c u m agant subi divers lraitements.

Les antig~nes somatiques pouvan t ~tre for tement endommag~s par le t ra i tement thermique ~lev~ qui a ~t~ utilis~ pr~c~demment ou inaccessi- bles en raison de la presence des flagelles (cellules vivantes ou trait~es par le formol), d 'autres t ra i tements ont ~t~ essay,s .

Pour une souche du groupe B, CNBZ 608, nous avons ainsi pr6par~ des s~rums h partir de cellules d6flagell~es par l 'alcool [4] ou ayan t subi

86 J.-L. BERGEBE

TABLEAU VIII. - - $pdcificitd des sdrums prdpards contre des cellules de la souche 608 de (< C. tyrobutyricum ~> ayant subi diffdrents traitements.

Titre des sdrums prdpards contre des ee l lu les de C. tgrobutgricum 608

chauffdes h chauffdes h traitdes 60 ~ C (10 m i n ) 100 ~ C (2 r a i n ) p a r l ' a l c o o l

S o u c h e s testdes Q) N A A N A A N A A

C. [allax I P L S 40 < 1 0 80 < 1 0 2 . 5 6 0 < 1 0 C. beijerinckii N C D O 1 7 5 8 10 < 5 3 1 0 < 5 320 < 1 0 C. telanomorphum I P P E C ' I 10 < 5 1 6 0 < 5 320 < 1 0

C. tgrobutgricum Groupe A :

- - 564 10 < 5 1 . 2 8 0 < 5 640 - - I M A T - C 4 f 0 < 5 2 . 5 6 0 < 5 1 .280

G r o u p e B : - - 608 a l e o o l 2 0 . 4 8 0

6 0 ~ C (10 m i n ) 5 . 1 2 0 5 . 1 2 0 2 . 5 6 0 1 0 0 ~ C (2 r a i n ) 5 . 1 2 0 5 . 1 2 0 5 . 1 2 0 100 ~ C (1 h) 80 < 5 640 < 5 1 .280

- - - 612 2 . 5 6 0 1 . 2 8 0 - - 616 6 4 0 160 .. . . 606 6 4 0 1 6 0

- 576 160 3 2 0 ..... 613 40 160 - - 568 160 2 0 . . . . 504 , 5 8 4 80 40 - - les 15 autres souehes ~<40 ~<40

< 1 0 < 1 0

1 0 . 2 4 0

2 . 5 6 0 < 1 0 3 2 0

4 0 < 1 0 < 1 0 < 1 0

40 4O

< 4 0

(1) Pour les tro is premieres souches de Clostridium les t i tres indiquds correspondent a u x eel- lu les chaugdes h 100 o C p e n d a n t 1 h q[ui ont servi h l 'absorpt ion . Les ce l lu les a y a n t subi les autres t r a i t e m e n | s d o n n a i e n t des t i tres gdndralement plus faibles .

P o u r routes les souches sau l la 608, les rdsultats correspondent h des cel lules chauffdes h 100 ~ C p e n d a n t 2 m i n ; les ce l lu les chauffdes h 60 ~ C p e n d a n t 10 r a i n o u traitdes par l ' a l c o o l d o n n a i e n t h peu pros les m~mes rdsultats .

N - - n o n a b s o r b 6 ; A = absorbd a v e c C. bei]erinckii pour les d e u x premiers sdrums, C. tetano- morphum et C. [allax pour le t r o i s i ~ m e .

des chauffages plus moddrds, et nous avons examin6 leur sp@ifi- eit6 (tableau VIII) . Nous n'avons fait figurer que les rdsultats eorrespon- dant aux ehauffages extremes, les autres dtant peu diff6rents.

Les rdaetions croisdes avee les 3 esp~ees de Closlridium dfijfi mention- ndes sont relativement faibles avee les 2 s6rums prdpards eontre des eellules ehauffdes, mais plus fortes avee le sdrum obtenu avee des eellules traitdes par l'aleool (tableau VIII) . I1 faut eependant remarquer que ees r6aetions eroisdes sont bien plus faibles que celles observdes avee le sfirum prdpar6 eontre des eellules ehauffdes pendant 1 h, surtout dans le eas de C. lelano- morphum dont le titre est aussi fort qu'avee la souehe homo- logue (tableau II).

Lorsqu'ils ont 6t6 absorb6s, les deux premiers sdrums agglutinent h un titre filev6 les cellules ehauffdes eontre lesquelles ils ont 6t6 prdpards, mais non les eellules ehauffdes pendant 1 h (tableau VIII) . Apr~s absorp-

GROUPES St~ROLOGIQUES DE C. TYROBUTYRICUM 87

tion, le s6rum obtenu avec des cellules trait6es par l'alcool, agglutine ces derni~res ~ un t i tre 61ev6 ; les cellules chauff~es ~ 100 o C pendant 2 min sont agglutin6es un peu moins, et celles chauff6es ~ 100 o C pendant 1 h ne le sont pas du tout . Qu'il soit absorb~ ou non, ce s6rum agglutine les cellules formol6es de la souche homologue ~ un t i t re 10 fois plus faible que les cellules trait~es par l'alcool, ce qui montre bien que les flagelles sont ~limin6s au moins en grande partie par le t ra i t ement par l'alcool.

Si deux des s~rums agglutinent les deux souches du groupe A /~ l '~tat brut, aucune ne les agglutine plus apr~s absorption. En ce qui concerne les souches du groupe B, seules quelques-unes sont encore agglutin~es par les sSrums obtenus avec les cellules chauff~es apr6s absorption, mais la plu- part il des titres tr~s faibles. Une seule souche est encore agglutin~e par le s~rum obtenu avec les cellules trait~es par l'alcool, mais la majorit~ des soucbes de ee groupe n'est agglutin~e par aucun des trois s~rums.

Des s~rums prepares contre les cellules trait~es par l'alcool de 5 autres souches du groupe B, CNRZ 500, 526, 584, 605 et 612, ont donn~ ~ peu pr6.s les m~,mes r~sultats que celui obtenu avec le s~rum anti-608. Les t i tres d 'agglut inat ion ~ l'~gard de la souche homologue et de 5 autres souches ~taient respectivement les suivants : 640 et moins de 20 pour le s~rum anti-500 ; 1.280 et moins de 40 pour le s~rum anti-526 ; 2.560 et moins de 20 pour le s~rum anti-605 ; 1.280, 320 (608) et moins de 10 pour le s~rum anti-612 ; 10.240, 2.560 (526), 640 (605), 320 (500) et moins de 20 pour le s~rum anti-584.

DISCUSSION

Sur la base des d~terIninants antig6niques thermostables, l'esp~ce C. lyrobulyricum peut donc ~tre subdivis~e en deux groupes s6rologiques principaux, le groupe A qui comprend environ les 2/3 des souches 6tudi6es et le groupe B qui rassemble le 1/3 restant.

Dans le groupe A se retrouvent des souches de provenances diverses et no tamment les deux souches de r6f6rence de l'esp~ce [18] alors que dans le groupe B ne figurent que des souches isol6es par nous. Cependant la r6partit ion des souches ne d6pend pas sp6cialement de leur origine et n 'est pas ell rapport avec leurs caract~res taxonomiques classiques ( tableaux IV et V). D'ailleurs les quelques souches des deux groupes qui ont ~t6 6tu- di~s d 'une mani~re plus approfondie au cours de t r avaux ant6rieurs ne se dist inguent pas non plus les unes des autres, ni par leurs caract~res physiologiques, ni par l 'u l t rastructure de la spore et de la cellule v~g6- ta t ive [3, 15].

Comme le montrent les r~sultats obtenus avec les s6rums bruts, il existe des d6terminants antig6niques communs aux souches des deux groupes de C. lyrobulyricum ainsi qu'~ d 'autres Closlridium. Les r6actions crois~es entre Closlridium ne sont pas rares [5, 8, 17, 19], mais il est int~- ressant de remarquer que darts le cas pr6sent elles se produisent non seu-

88 J.-L. BERG~RE

lement avec des esp~ces t axonomiquement voisines mais aussi avec d 'autres beaucoup plus ~loign~es, comme C. tetanomorphum.

Le groupe A de C. tgrobutgricum se caract~rise par l 'existence d'un d~ter- minant antig~nique suppl~mentaire et sp~cifique d'esp~ce comme l 'ont confirm~ les essais d 'absorpt ion de s~rums effectu~s avec les principales esp~ces de Clostridium donnant des r~actions crois~es, puis ceux pratiqu~s avec des souches du m~me groupe.

Le groupe B poss~de un ou plusieurs dSterminants antig~niques thermo- stables qui n 'existent pas dans le groupe A comme on peut le constater d'apr~s les t i tres des s~rums bruts ( tableau II) et d'apr~s l'essai d 'absorp- t ion d 'un de ces s&ums avec une souche du groupe A. Cependant ces d~terminants antig~niques paraissent communs ~ d 'autres Clostridium, sp~cialement C. tetanomorphum. En effet, ce dernier est agglutin~ au m~me ti tre que les souches de C. lgrobutgricurn ( tableau II), et c'est l 'absorp- t ion des s~rums par cette esp~ce qui est principalement responsable de leur perte d'activit~ h l'~gard des souches du groupe B. D'ailleurs, si on se limi- ta i t ~ l 'utilisation de ces s~rums on pourrai t confondre les souches du groupe B de C. lgrobutgricum avec C. lelanomorphum. En fair, ces deux Clostridium se distinguent ne t tement l 'un de l 'autre par leurs caract~res taxonomiques : C. tgrobulgricum est une esp~ce saccharolyt ique bien d~fi- nie [1, 18, 14] ~ spore ovoYde subterminale et class~e dans le groupe I des Clostridium [18], alors que C. tetanomorphum se rapproche beaucoup plus du groupe I I I [18], no tamment par le fair que sa spore est sph~rique et terminale [5]. Nous avons constat~ d'ailleurs qu 'un s~rum pr~par~ contre les cellules chauff~es de C. lelanomorphum n'agglutine la souche 608 du groupe B de C. lgrobutgricum qu'h un t i t re de 3.200 contre 12.800 pour la souche homologue, et que cette rSaction crois~e est supprim~e apr~s une

�9 seule absorption a v e c l a m0me soucbe 608, le s0rum devenant alors sp~ci- fique de C. telanomorphum. Enfin comme nous l 'avons vu ensuite les souches du groupe B de C. lgrobulgricum poss~dent des d~terminants antig~niques thermolabiles propres. I1 semble donc que les souches du groupe B manquen t de d~terminant antig~nique thermostable sp~cifique d~tectable par les m~thodes utilis~es ou bien que celui-ci soit inaccessible ou enfin que le compos~ qui le porte soit ~limin~ de la paroi par le chauffage. La perle d'activit~ des s~rums r~sultant de l 'absorption par C. tetanomorphum n'est cer tainement pas due h une absorption non sp~cifique des anticorps par les cellules de cette esp~ce, car elle devrai t se produire dans le cas des

s ~ r u m s dirig~s contre les souches du groupe A. Mais elle pourrai t ~tre due la presence d 'un d~terminant antig~nique commun, d~masqu~ par le

chauffage et port~ par un compos5 tel que le pept idoglycane [20]. L'existence des deux groupes s~rologiques A et B n'est pas particuli~re

la collection de souches ~tudi~e et parait representat ive de ce qu'on peut t rouver dans la nature. En effet, au cours d 'un travail applique, nous avons pu identifier ~ l 'aide de s~rums du groupe A entre 70 et 75~ des C. tgro- butgricum presents darts des ~chantillons d'ensilage, d 'excr~ments de vache et de laits [11], caract~ris~s par les m~thodes habituelles [1, 18]. Les 25 /~ 30% restants appar tenaient vra isemblablement au groupe B d'apr~s leor

GROUPES SI~ROLOGIQUES DE C. TYROBUTYRICUM 89

r~action avec les diff~rents s~rums, absorb~s ou non, dont nous disposions. Cette r~partition correspond done assez bien ~ eelle observ~e sur la collection de souehes ~tudi~e ( tableau IV).

Si Sharpe et Goudkov ont eonelu que toutes les souehes de C. tyro- butyricum se diff~reneient des autres esp~ees par l 'existence d'antig~nes sp~eifiques eommuns et thermostables [17], e 'est vra isemblablement parce que les 25 souches qu'ils ont ~tudifies appar t iennent routes au groupe A. Nous avons p u l e v~rifier au moins pour 5 d 'entre elles, no t amment pour les 2 (NCDO 1755 et BZ 15) qui leur ont servi ~ preparer leurs s~rums.

Bien que nous n 'ayons essayfi qu 'un pet i t nombre de s~rums prepares sur tout contre des souehes du groupe B, nous avons pu eonstater que, en plus des d~terminants antig~niques thermostables d~j~ mentionn~s, les eellules de C. tyrobutyricum poss~dent des antig~nes de surface flagellaires (eellules formol~es) ou non (eellules trait~es par l'aleool) qui sont sp~ei- fiques d'esp~ce. Mais ils ne sont eommuns qu'~ un tr~s pet i t nombre de souehes, quand ils ne sont pas l imit ,s ~ une seule. Le groupe B e s t done tr~s h~t~rog~ne et eomporterai t plusieurs s~rogroupes. I1 faudrai t done preparer tou te une s~rie de s~rums pour identifier les souehes de C. tyro- bulyricum B grfiee ~ ees d~terminants antig~niques. Une telle sp~eifieit~ a d~j~ ~t~ observ~e par exemple ehez C. botulinum t y p e E [12].

Le fait d'utiliser des ehauffages moderns permet d'~largir un peu la sp~eificit~ des s~rums prepares eontre une souehe du groupe B. Cependant peu de souehes sont agglutin~es, et le t i t re est g~n~ralement bas bien que les sfirums rfiagissent for tement avec la souehe homologue. Si les d~ter- minants antig~niques en cause sont por t , s par une prot~ine eomme e'est le cas ehez d 'autres baet~ries ~ Gram positif [7] et m~me ehez une esp~ee de Clostridium [21], il est possible que le ehauffage utilis~ ne permet te pas de d~naturer suff~samment cette prot~ine (ehauffage ~ 60 ~ C, 10 rain) pour faire apparai tre des r~aetions erois~es entre souehes de la m~me esp~ee, ou que ee ehauffage entraine un masquage du d~terminant antig~nique sp~ei- fique eommun [6] ou, encore, s'il est de 100 ~ C pendant 2 min, qu'il ~limine - - au moins en grande pat t ie - - eette prot~ine et qu'il en reste insuffisam- ment pour que l 'agglutination des souehes puisse se produire. Nous avons en effet eonstat~ que la paroi eellulaire de C. tyrobutyricum eontient une prot~ine majoritaire qui est extrai te de la paroi en m~me temps que la pro- t~ine flagellaire d~s les premieres minutes de ehauffage ~ 100 o C en solut~ physiologique tamponn~ [9].

I1 n 'est done pas possible de eonelure que les souehes du groupe B poss~dent on non un d~terminant antigfinique de surface (parifital ou autre) eommun et le probl~me de l 'obtention d 'un s~ruin pe rmet tan t d'identifier les souehes de C. tyrobutyricum appar tenant h e e groupe, reste ~ r~soudre.

RESUME

Des s~rums prepares contre les cellules chauff~es de deux souches de Closlridium tyrobutyricum donnent des r~actions crois~es avec plusieurs

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autres esp~ces de Closlridium, mais ces r6actions peuvent ~tre compl~te- ment supprim@s par absorption avee C. beijerinckii, C, fallax et C. tetano- morphum. Les 85 souches de C. tyrobutgricum 6tudi6es avee ees s6rums peuvent fitre elassfies au moins en deux groupes s6rologiques, A et B, aussi bien par agglutination que par immunofluorescenee. Cependant, seules 56 souehes du groupe A poss6dent un antigone thermostable sp6ci- fique d'esp6ee alors que eelles du groupe B n'en ont pas.

Des s6rums pr6par6s contre des cellules de C. tyrobulgricum trait6es par le formol ou par l'alcool, ou mod6r6ment ehauff6es, r~agissent beaueoup moins que les pr6efidents avec d 'autres esp~ces de Clostridium. Mais apr~s absorption ils n 'agglutinent que quelques souches du groupe B de C. tyro- bulgricum, et parfois m~me, uniquement la souehe homologue h un titre qui est d'ailleurs 61ev~.

I1 n 'est donc pas possible de proposer aetuellement un s6rum simple qui permet te d'identifier facilement les souehes de C. lyrobutgricum autres que celles du groupe A.

MOTS-CLI~S : Clostridium tgrobutgricum, Antigone thermostable ; Sdro- ]ogie, Taxonomie, Ensilage, Fromagerie.

REMERC IEMENTS

Nous remercions vivement les personnes qui nous ont aid~ lors de la pr6paration du manuscrit, J. Hermier pour ses suggestions et Madame J. Martin pour la dactylo- graphie.

Nous remercions 6galement les Drs Stadhouders, Sharpe, Matteuzzi, Gouet et ]3eerens pour les souches qu'ils nous ont aimablement transmises.

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