BIOCHIMIE, 1974, 56, 469-471.

Mise en dvidence d'une particule ribonucldoprotdiquc d6tachde par le KC1 des ribosomes de pois.

A l a i n F g I ~ R ~ , M i c h e l DELSENY et Yves GUITTON.

Laboratoire de Physiologic VEgdtale, Equipe de Recherche Associ~e n ° 226 du CNRS, Cenlre Universilaire de Perpignan, Avenue de Villeneupe, 66000 Perpignan (France).

(15-11-1973).

INTRODUCTION.

Dans le cadre d 'nne dtude de la synthbse protdique, ehez les v6gdtaux supdrieurs , nous avons 6t6 amends h pr6parer des sous -un i tds r ibosomiques fonct ion- nelles. It a 6t6 rapport6 [1, 2] que, lorsque los r ibo- sonms des v~gTtaux sont dissoci6s en pr6senee de KC1 (0,5 M) et de MgCI~ (0,005 M), la sous-uni td 40S est capable de fixer l ' aminoacyl - t -RNA. De plus, los deux sous-uni t~s r~assoei~es effeetuent la polym~risatim~ de la phTuyla lan ine dirig6e pa r l 'acide polyur idyl ique . En app l iquan t eette m~thode h des axes e m b r y o n n a i r e s de p iaa tu les de Pois, nous avons observ~ la prdsence d 'une f rac t ion r ibonucl~oprot~ique, s6d imen tan t m o i n s r i t e que ia sons-uni t6 40S, et que, par analogie avec ce qui a ~t6 d6crit darts les cellules an ima le s [3, 4] nous avons appel6 fraction KC1. Nous rappor tons darts cette co m m u n ica t i on une caract6r isa t ion des prot6ines et de I'ARN contenus duns cette f ract ion, dont l 'exis- tence n 'a j a m a i s dtd ment ionnde chez les vdg~.taux.

RESULTATS.

Los r ibosomes sont pr6par6s par une methode n ' u t i - l i san t pas de dTtergeant, d6riv6e de cello de Wet t s t e in

sous - un i t es ,g 6 a s

0 sous-unit6s Q 40S

fraction

i " - I [ t0 ='~ 3'~ ,'o 5o

Fractions

FIG. I . - - Sdparation des sons-unitds ribosomiqnes. Los r ibosomes (25 unitTs D.O.), dTpos6s au s o m m e t

d 'un grad ien t de saeeharose 14-30 p. cent dans la solu- t ion t amponn~e Tris-HC1 0,05 M pH 7,6, KC1 0,5 M, MgCl_. 0,005 M, sont centr i fug6s pendan t 15 h h 22 500 t o u r s / m i n u t e . (Spinco L50, Rotor SW 25.1). Le grad ien t est 61u6 h pa r t i r du fond du tube et la densit6 opt ique est enregistr6e en cont inu. Les f rac t ions indi - qu6es par los doubles fl6ches out dr6 rassembl6es et ut i l is$es pour la caract6r isa t ion des protfiines et des ARN.

et coll. [5]. L 'ex t rac t ion est r6alis6e h pa r t i r de p lan- tules cultivdes h l 'obscuritd, h 25°C, "~gdes de 72 h e t dont les cotylddons out 6t6 excisds jus te avan t l 'extraet ion. Les eulots de r ibosomes a ins i ob tenus sont m i s en suspens ion duns une so lu t ion t amponnde de Tris-HC1 0,05 M, pH 7,6, con tenan t du KC1 0,5 M et du MgCI,,, 0,005 M. Des a l iquotes de eette suspens ion

60S 4OS ®

®

I i

|

I i

Fraction K CI

1 1 2 0{10

,' - - - 85008

8 0 2 5 0 58800

~ 52500

. . . . 44800

F1o. 2. - - Analyse des proMines ribosomiques snr 9el de polyacrylamide.

Les prot6ines ex t ra i tes des 3 f rac t ions indiquSes h la figure 1 sont aualys~es pa r ~lectrophor~se su r gel de po iyac ry iamide h 10 p. cent en presence de SLS. 200 ~g de prot6ines sont ddposds sur chaqne gel (100 × 6 ram). La migra t ion dure 6 h 30 h 8 mA par gel. Les bandes prot6iqnes sont r6v61~es pa r le Coomass ie Br i l lan t Blue. Les poids mol~culaires ont dt~ d~termin~s pa r r~f6rence h des prot~ines de poids mol6cula i re connu.

sont d6pos6es au s o m m e t d ' un g rad ien t l in6aire de saecbarose (14 /t 30 p. cent) r6alis6 avee la m6me solu- t ion tamponn6e . Un profil caraet6r is t ique de la sdpa- ra t ion obtenue est pr6sent6 h la figure 1. Los 3 pies observ6s cor respondent respectJvement aux sous -nn i tds r ibosomiques 60S et 40S et h la [raclion KCl.

Los prot6ines de ehacune de ees par t icules r ibonu- cl6oprot6iques ont 6t6 ext ra i tes [6] et ana lysdes par 61ectrophor6se su r gel de po lyae ry lamide h 10 p. cent

470 A. Ferrer, M. Delseny et Y. Guitton.

en p r6sence de SLS [7]. L '6 tude des 61ect rophor6- g r a m m e s (fig. 2) m o n t r e la p r6sence d a n s la f r a c t i o n KC1 d ' u n c e r t a i n n o m b r e de p ro t ~ i ne s o r i g i n a l e s su r - t o u t d a n s la zone des p r o t 6 i n e s de po i d s m o l 6 e u l a i r e 61ev6. Une b a n d e e o r r e s p o n d a n t h u n e (ou des) p ro - t h ines d o n t le po ids m o l 6 c u l a i r e a 6t6 e s t i m 6 h 85 0OO es t p a r t i c u l i b r e m e n t ne t te . P l u s i e u r s a u t r e s b a n d e s (fl6ehes) so n t d6cel6es u n i q u e m e n t d a n s les 61ectro- p h o r 6 g r a m a n e s de la f r a c t i o n KC1 qui , en ou t re , ne c o n t i e n t pa s de p r o t 6 i n e s de po i d s m o l 6 e u l a i r e in f6- r i e u r h 20 000. On ne p e u t e x c l u r e a c t n e l l e m e n t q u ' n u e pa r t i e des p r o t 6 i n e s qu i m i g r e n t de la m S m e m a n i 6 r e que l ' u n e des p r o t 6 i n e s des d e u x s o u s - u n i t 6 s p r o v i e n n e d ' u n e c o n t a m i n a t i o n p a r des p r o d u i t s de d 6 g r a d a t i o n des s o u s - u n i t 6 s .

Les ARN e o n t e n u s d a n s la f r a c t i o n KC1 o n t 6t6 e x t r a i t s a u ph6no l [8] e t i l s r e p r 6 s e n t e n t 10 h 15 p. cen t de la m a s s e des p a r t i c u l e s . I ls o n t 6t6 a n a l y s 6 s pa r 61eet rophor6se s u r gel de p o l y a c r y l a m i d e h 2,5 p. cen t [91. I ls s o n t h6 t6 rog6nes en t a i l l e et m i g r e n t e n t r e I 'ARNr 18S et les A R N t (fig. 3). G r o s s i ~ r e m e n t , i l s se r 6 p a r t i s s e n t en d e u x c l a s ses , l ' u n e d o n t la m 6 d i a n e se s i t ue a u t o u r de 12-138 et l ' a u t r e v e r s 5-6S. U n de r - n i e r pic, s u p e r p o s a b l e a u x ARNt , p e u t 4tre 6 ] imin6 p a r u n e p u r i f i c a t i o n s n p p l 4 m e n t a i r e et c o r r e s p o n d done ~t

A R N ~ ~ S S

A R N r 1 8 5 :2

v

: !

. . . . . . . . . . ARN t o l a u x

A R N fracl lon ~CL

. . . . . A a N f , a ~ t i o . KCL p u r i f i e e

A R N ~ 4 S

Y

FIG. 3. - - Analyse des ARN par dlectrophorbse sur gel de polyacry lamide .

50 !!±g d 'ARN to t a l e x t r a i t d ' a x e s e m b r y o n n a i r e s hg6s de 72 h et 20 i~tg d 'ARN e x t r a i t de f r a c t i o n KC1 n o n purif i6e, s o n t a n a l y s 6 s p a r 61ect rophor~se s u r gel de p o l y a c r y l a m i d e h 2,5 p. cent . La m i g r a t i o n d u r e 1 h h 5 m A gel. Les d i f f6 ren t s t rac6s d e n s i t o m 6 t r i q u e s o n t 6t6 supe rpos6s .

des ARNt c o n t a m i n a n t s . La f r a e t i o a KC1 est , p a r con t re , p u r e de rou te c o n t a m i n a t i o n p a r l ' u n e ou l ' a u t r e des s o u s - u n i t 4 s r i b o s o m i q u e s . La p r6 sence 6 v e n t u e l l e de s 6 q u e n e e s p o l y a d 6 n y l i q u e s a 6t6 r e c h e r - eh6e d a n s I 'ARN e x t r a i t de la f r a c t i o n n o n pur i f i6e p a r l a t e c h n i q u e de l a f i l t r a t i o n s u r Mi l l ipore h h a u t e fo rce i o n i q u e [i10]. U n p o u r c e n t a g e de r 6 t e n t i o n s u r le f i l t re de 12 p. c en t a 6t6 observ6 , a l o r s que 0,8 p. cen t s eu l e - m e n t des ARNt pur i f i6s s o n t a d s o r h 6 s d a n s les m ~ m e s c o n d i t i o n s .

DISCUSSION.

Ces r 6 s u l t a t s m o n t r e n t l ' e x i s t e n c e chez les v 6 g 6 t a u x d ' u n e f r a c t i o n r i b o n u c l 6 o p r o t 6 i q u e se e o m p o r t a n t e o m m e u n e en t i t6 d 6 t a e h a h l e des r i b o s o m e s p a r le KC1, t o u t h f a i t s i m i l a i r e /t ce l les d6cr i t es d a n s les ce l lu l e s a n i m a l e s . II es t v r a i s e m b l a b l e qu ' e l l e n ' a pa s j u s q u ' h

p r 6 s e n t 6t6 obse rv6e chez les v6g6 t aux en r a i s o n de l ' 6 t a t p h y s i o l o g i q u e des o r g a n i s m e s 6 tud i6s p a r d ' a u t r e s a n t e u r s El, 2, 11]. En effet, a u cou r s d ' exp6- r i ence s c o i n p l 6 m e n t a i r e s , n o u s a v o n s observ6 la d i s p a - r i t i o n de la f r a c t i o n KC1 ] o r s q u e les p l a n t u l e s s o n t p lac6es sous a t m o s p h 6 r e d ' a zo t e [1] et n o u s a v o n s cons t a t6 son a b s e n c e l o r s q u e les r i b o s o m e s s o n t e x t r a i t s de g r a i n e s n o n ge rm6es , i nac t i ve s du p o i n t de r u e s y n t h 6 s e p ro t6 ique .

Les f r a c t i o n s :KC1 d ' o r i g ine a n i m a l e r e n f e r m e n t de I ' A R N m [4, 12]. D u n s la f r a c t i o n d ' o r i g ine v6g6ta le , la p r6sence de m:ol6cules d 'ARN c o n t e n a n t du p o l y A i u d i q u e q u ' a u m o t h s u n e p a r t i e de cet ARN es t de I 'ARNm. La d i s t r i b u t i o n des f a i l l e s des A R N m ac tue l - l e m e n t c o n n u s chez les e u c a r y o t e s e s t v o i s i n e de celle que n o u s o h s e r v o n s . De p l u s chez les v6g6 taux , les A R N m p r 6 s u m 6 s s o n t t r6s p o l y d i s p e r s e s [13] et i t s se s i t u e n t d u n s u n e zone a l l a n t de 6 h 25S. N o u s ne p o u v o n s e x c l n r e que les mo16cules qne n o u s d6c r ivons so i en t p a r t i e l l e m e n t d6grad6es e t le pie o b se rv6 d u n s la zone 5-6S p o u r r a i t i n c i t e r h le pense r . T o u t e f o i s , des p a r t i c u l e s r i b o n u c 1 6 o p r o t 4 i q u e s e o n t e n a n t de I 'ARN de cet te t a i l l e ou t s o u v e n t 6t6 d6cr i tes a u c o u r s d ' exp6- r i e n c e s de d i s s o c i a t i o n de r i b o s o m e s de ce l lu les a n t - m a l e s [14, /15, 161, et il n ' e s t pus i m p o s s i b l e que la f r a c t i o n KC1 so i t en f a i t r e l a t i v e m e n t h4 t6 rog6ne .

L ' 6ven t a i l de po ids m o l 6 c u l a i r e s des p r o t 6 i n e s de la f r a c t i o n KC1 p r 6 s e u t e des s i m i l i t u d e s f r a p p a n t e s avec ce qu i a 6t6 d6cr i t r 6 c e m m e n t [4, 16]. N o u s i g n o r o n s a c t u e l l e m e n t t o u t des f o n c t i o n s de ces p ro t6 ines . Ce- p e n d a n t , p o u r les ce l lu l e s a n i m a l e s , il es t c o n n u que l eu r p r6sence s t i m u l e l ' ac t iv i t6 de s y n t h 6 s e p r o t 6 i q u e d ' u n s y s t 6 m e a c e l l u l a i r e I4, 12, 16]. F a c t e u r s d ' i n i t i a - t i on et f a c t e u r s d ' 61onga t ion d o i v e n t donc se t r o u v e r pa r ro t ces p ro t6 ines . Les f a e t e u r s d ' b l o n g a t i o n de B16 o u t 6t6 r 6 c e m m e n t pur i f i6s e t les m o n o m 6 r e s o u t des po ids m o l 6 c u l a i r e s r e spec t i f s (EF, 60 000, EF: 70 000) [17, 18] qu i se s i t u e n t d u n s l a g a m m e que n o u s obse r - vons . Des p r o t 6 i n e s sp6ci f iques s o n t associ,6es h cer- t a i n e s zones de I ' A R N m , en p a r t i c u l i e r a u x s 6 q u e n c e s p o l y a d 6 n y l i q u e s [16, 19, 20] et on doi t 6 g a l e m e n t les r e t r o u v e r p a r m i les p r o t 6 i n e s de l a f r a c t i o n KC1. U n e p l u s a m p l e c a r a c t 6 r i s a t i o n es t t o u t e f o i s n 6 c e s s a i r e p o u r c o m p r e n d r e la f o n c t i o n de c h a c u n des c o m p o s a n t s de ces p a r t i c u l e s .

Rein erciements.

Les a u t e u r s r e m e r c i e n t le P r o f e s s e u r P. J e a n t e u r de l eu r a v o i r c o m m u n i q u 6 u n m a n u s e r i t a v a n t sa pa - r u t i o n . I ls s o n t t r6s r e c o n n a i s s a n t s h Y. C h a t t i e r , A. Got e t G. V iHe longue p o u r l e u r a i de t e c h n i q u e pr6- c ieuse .

Ce t r a v a i l a 6t4 r6a l i s6 d u n s le cad re de l ' E q u i p e de R e c h e r c h e Associ6e a u CNRS, ERA n ° 226.

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