Mémoire Présenté · 2016-06-20 · Par: Pingdwende Kader Aziz BAMOGO Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------

UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE

Mémoire Présenté

Par : Pingdwende Kader Aziz BAMOGO

Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées

de l’Université de Ouagadougou

SUR LE THEME:

DEVELOPPEMENT D’OUTILS BIOTECHNOLOGIQUES VIRAUX

POUR LA PRODUCTION DE PROTEINES A FORTE VALEUR

AJOUTEE DANS DES BIOSYSTEMES VEGETAUX.

Soutenu le……………………. devant le jury composé de :

Président : Prof XX, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Prof XX, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Dr XX Maître Assistant, Université de Ouagadougou

LABORATOIRE DE VIROLOGIE ET DE

BIOTECHNOLOGIES VEGETALES

N° d’Ordre .............................../LABIOGENE

i

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester.

Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.

Le master BioGeMA est :

Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie

moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE

Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.

Professeur Jacques SIMPORE

Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique

Moléculaire

UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologie

Université de Ouagadougou – Burkina Faso

ii

Dédicace Je dédie ce mémoire

A mes parents pour tous les sacrifices consentis à mon égard.

A ma fille Lagmègninsgo Jordane, véritable rayon de soleil dans ma vie. Avec tout

1'amour d’un père à sa fille. Et à sa merveilleuse Maman.

A notre grande sœur et seconde mère Wendy BAMOGO. Trouve dans ce document le fruit des sacrifices que tu as consenti depuis notre tendre enfance pour nous vêtir,

nous nourrir et nous scolariser.

iii

Remerciements Toute ma reconnaissances au Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire de Biologie

Moléculaire et de Génétique Moléculaire et coordonnateur du Master BioGeMA. Tout au

long du master et même bien avant vous vous êtes toujours montré disponible, merci pour

votre soutien moral lors de mes moments d’incertitude et pour votre soutien financier.

Je remercie sincèrement Christophe BRUGIDOU et son équipe pour m’avoir fait

confiance en m’offrant la chance de travailler sur ce projet. Merci à mes encadrants Martine

Bangratz, Séverine Lacombe et Drissa Sérémé, vous côtoyer a été une véritable école tant

sur l’apprentissage de la recherche que sur la vie de façon générale. Trouver ici l’expression

de ma reconnaissance et de ma profonde gratitude.

Un merci tout particulier à Dr. Fidèle Tiendrébeogo, pour m’avoir soutenu

quotidiennement durant mes durs moments, pour avoir cru en moi, et de m’avoir encouragé

pour en arriver là. Vous avez créé le chemin qui m’a mené jusqu’ici trouvez là l’expression

de ma profonde reconnaissance.

Le présent travail a été effectué au Centre de Recherches Environnementales et

Agricoles et de Formation de Kamboinsé (CREAF/K), plus précisément au Laboratoire de

Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV), merci au Dr. Korodjouma

OUATTARA, Directeur de l’INERA/K au Dr. Oumar Traoré, Directeur (LVBV), au Dr.

B. James Néya, Responsable du LVBV et codirecteur du Laboratoire Mixte Internationale

(LMI), au Dr. Edgard V. S. Traoré pour ses conseils. Merci aux camarades stagiaires qui

m’ont apporté leurs aides.

Au corps enseignant de l’Université de Ouagadougou en particulier aux enseignant du

Master BioGeMA et à l’équipe du Pr Jacques SIMPORE, merci pour les connaissances

acquises.

Merci à Adama SAWADOGO responsable du Laboratoire du Faso pour son soutien

financier et à toute l’équipe du Laboratoire du Faso.

Merci aux organismes qui soutiennent financièrement C Brugidou, car cela lui à

permis à son tour de me soutenir à ce titre, merci donc à l’institut de recherche pour le

développement (IRD) et au laboratoire Mixte Internationale (LMI Patho-Bios).

En terminant un grand Merci à ma famille à qui je dois beaucoup. A tous mes frères,

sœurs et amis qui, m’ont soutenu, trouvez ici l’expression de ma profonde reconnaissance.

iv

Résumé Les avancées dans les domaines de biotechnologies permettent aujourd’hui la

production de protéines d’intérêt dans les plantes. La capacité de production en protéines

recombinantes chez les plantes est affectée par des mécanismes tels que le gene silencing.

L’expression simultanée de protéines virales suppresseurs de gene silencing de la plante et de

la protéine d’intérêt permet d’améliorer les rendement. L’utilisation d’amplicon viraux permet

aussi d’augmenter le rendement. Aucun outil amplicon utilisable chez les monocotyledones

n’existe à ce jour. Le RYMV (Rice yellow mottle virus) est un candidat de choix pour le

développement de tels outils biotechnologiques utilisables chez le riz.

Nous avons exprimé de façon transitoire via Agrobacterium tumefaciens des feuilles de

Nicotiana benthamiana, une espèce apparentée au tabac des gènes mutants (C3) de

l’inhibiteur de l’alpha amylase (α-AI1) provenant de Phaseolus vulgaris en combinaison avec

un cocktail de suppresseurs de gene silencing, tous sous promoteur 35S. la protéine C3 a été

révélée par Western blot. Nous avons également exprimé dans les feuilles de N. benthamiana

et celles de riz l’outil amplicon RYMV portant le gène codant la PSA (Promastiguote surface

antigene) provenant de Leishmania infantum, protéine particulièrement intéressant de par ses

propriétés vaccinale avérées contre les leishmanioses. La réplication de l’outil amplicon

RYMV a été mise en évidence par RT-PCR chez N. benthamiana. La RT PCR sur les

échantillons de riz n’a pas donnée de résultats concluants quant à l’introduction et / ou la

réplication de l’outil dans le riz.

Nous avons démontré l’expression et l’accumulation de C3 dans les feuilles de N.

benthamiana. Les résultats obtenus laissent entrevoir une possible utilisation de l’outil

RYMV comme amplificateur pour la production de protéines d’intérêt dans les systèmes

plantes.

Mots clés : Protéines recombinantes, Amplicons viraux, Gene silencing , RYMV , cocktail

suppresseur de silencing

vi

Abstract In recent years, advances on biotechnology have lead to the emergence of plants as

bioreactor for the production of molecules of interests. The first crucial advance was the use

of transient expression systems relying on Agrobacterium as a vector to deliver DNA

encoding recombinant proteins directly into plant cells. Moreover, protein production can be

increased by the co-expression of viral proteins displaying suppression of gene silencing

activity. Indeed, presence of such viral proteins in these transient expression systems allows

overcoming the gene silencing defense. Another significant development in this plant

bioreactor field was the coupling of agro-infiltration with delivery of cDNA encoding viral

RNA used as “amplifier” for the protein production: viral amplicon technology. Whereas

several viral biotechnological tools are available for dicots species, only a few of them are

efficient in monocots such as rice. The RYMV appear as a candidate of choice for

implementation of this kind of tools.

We expressed in Nicotiana benthamiana leaves mutant gene (C3) encoding α-amylase

inhibitor-1 (α-AI1) from the common bean, Phaseolus vulgaris, under control of 35S

promoter and a suppressor of gene silencing cocktail. The presence of the C3 protein in N.

benthamiana leaves was identified by western blot. We also expressed in N. benthamiana and

rice leaves RYMV amplicon carrying PSA gene from Leishmania infantum. This protein

displays a very high interest due to its vaccinal properties against leishmanasis deseases .The

replication of RYMV tool was proven by RT-PCR in N. benthamiana leaves. Results on rice

do not allow conclusion about the introduction and / or replication of the RYMV tool.

We demonstrated expression and accumulation of C3 on tobacco leaves. The results show a

possible use of RYMV amplicon for high production of protein of interest in plants.

Key words: Recombinant proteins, viral amplicons, Gene silencing, RYMV, suppressor of

gene silencing cocktail.

vii

Table des matières PRÉFACE DU COORDONNATEUR DU MASTER BIOGEMA ..................................... I

DÉDICACE ........................................................................................................................ II

REMERCIEMENTS ......................................................................................................... III

RÉSUMÉ ........................................................................................................................... IV

ABSTRACT ....................................................................................................................... VI

TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................ VII

LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... XI

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................. XII

ABRÉVIATIONS ........................................................................................................... XIII

INTRODUCTION ................................................................................................................1

1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE .......................................................................................2

1.1. LES PROTÉINES RECOMBINANTES ...................................................................................2

1.1.1. Définition ..............................................................................................................2

1.1.2. Choix de l’hôte d’expression ou système d’expression ...........................................3

1.1.3. Les différents systèmes d’expression .....................................................................3

1.2. LES PLANTES COMME BIORÉACTEUR ..............................................................................4

1.2.1. Les techniques de transformation génétique des plantes .........................................4

1.2.2. Les avantages du système plantes..........................................................................6

1.3 LE « GENE SILENCING » ..................................................................................................9

1.3.1 Quelques protéines majeures du « gene silencing » ............................................... 11

1.3.1.1 RDR ............................................................................................................... 11

1.3.1.2 Dicer .............................................................................................................. 11

1.3.1.3 Argonaute ...................................................................................................... 12

1.3.2. Les suppresseurs viraux de gene silencing............................................................ 13

1.3.2.1 Inhibition de l’activité DICER : Exemple de la protéine P38 du TCV ............. 13

1.3.2.2. Inhibition de l’activité d’agronaute : exemple de la protéine 2b du CMV ....... 15

viii

1.3.2.3. Inhibition de l’activité d’agronaute : exemple de la protéine P0 des Polerovirus

.................................................................................................................................. 15

1.3.2.4. La protéine P1 du RYMV ............................................................................. 15

1.3.2.5. Séquestration des sRNA : exemple de la protéine P19 des tombusvirus ......... 16

1.4. TECHNOLOGIE AMPLICON : DES AMPLICON VIRAUX POUR LA PRODUCTION DE PROTÉINES

RECOMBINANTES DANS LES PLANTES VIA A. TUMEFACIENS ................................................... 17

1.5. LE VIRUS DE LA PANACHURE JAUNE DU RIZ COMME OUTIL AMPLICON ........................... 23

3. MATÉRIELS ET MÉTHODES ..................................................................................... 29

3.1 CADRE D’ÉTUDE ........................................................................................................... 29

3.2 GÉNÉRATION DES VECTEURS D’EXPRESSION DES PROTÉINES D’INTÉRÊTS ........................ 29

3.2.1 La réalisation des constructions génétiques .......................................................... 29

3.2.2 Matériel plasmidique (de départ) : Le vecteur pBin61 ......................................... 31

3.2.3 Extraction d’ADN plasmidique de bactéries Escherichia coli ............................... 32

3.2.4 Transformation génétique d’Agrobacterium tumefaciens par choc thermique ....... 32

3.3. CULTURE BACTÉRIENNE .............................................................................................. 32

3.3.1. Milieux de culture .............................................................................................. 32

3.3.2. Antibiotiques de sélection .................................................................................... 32

3.3.3. Cocktail de suppresseurs de gène silencing .......................................................... 33

3.4 Agroinfiltration .............................................................................................................. 34

3.4.1. Agroinfiltration des feuilles de N. benthamiana .................................................. 35

3.4.2. Agroinfiltration des feuilles de Oryza sativa ....................................................... 35

3.4.2.1. Préparation de l’inoculum portant des vecteurs pUbi .................................... 35

3.4.2.2. Inoculation mécanique des inoculums viraux ................................................ 35

3.5. LE MATÉRIEL VÉGÉTAL ................................................................................................ 36

3.5.1. Plantes de N. benthamiana ................................................................................... 36

3.5.2. Plantes de riz ...................................................................................................... 36

3.6. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE .................................................................... 37

3.6.1. Extraction des ARNs au TRIZOL ....................................................................... 37

3.6.2. Traitement à la DNAse ....................................................................................... 37

3.6.3. Vérification de la qualité des ARN ....................................................................... 38

3.6.4. Reverse transcription .......................................................................................... 38

3.6.5. Amplification des ADNc par PCR ...................................................................... 39

ix

3.6.6. Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose ............................................................. 41

3.7. TECHNIQUES DE PROTÉOMIQUE .................................................................................... 44

3.7.1. Extraction de protéines de feuilles de N. benthamiana........................................ 44

3.7.2. Détection immunologique des protéines par Western Blot................................... 44

3.7.2.1. Préparation du gel d’acrylamide SDS – PAGE ............................................. 44

3.7.2.2. Préparation des échantillons ......................................................................... 45

3.7.2.3. Dépôts des échantillons ................................................................................ 45

3.7.2.4. Migration ..................................................................................................... 45

3.7.2.5. Transfert ....................................................................................................... 46

3.7.2.6. Révélation .................................................................................................... 46

3.8. DESTRUCTION DES BACTÉRIES RECOMBINANTES ET DES PLANTES TRANSFORMÉES APRÈS

EXPÉRIMENTATION............................................................................................................. 47

4. RÉSULTATS .................................................................................................................. 48

4.1. EXPRESSION DE LA PROTÉINE C3 DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA .................. 48

4.1.1. Production de plants de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI

...................................................................................................................................... 48

4.1.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana........ 49

4.2. EXPRESSION DE L’AMPLICON DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA ET DE RIZ ......... 50

4.2.1. Expression de l’amplicon RYMV dans les feuilles de N. benthamiana ............... 50

4.2.1.1. Qualité des ARN extraits .............................................................................. 52

4.2.1.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des

échantillons pour le dépôt de produits PCR ................................................................ 52

4.2.1.3. Niveau d’accumulation des différents construits PSA ................................... 53

4.2.1.4. Effet de la P1 sur l’accumulation de la PSA ................................................... 54

4.2.1.4. Réplication de l’amplicon .............................................................................. 54

4.2.1.5. Amplifications aspécifiques ........................................................................... 55

4.2.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz .................................................. 56

4.2.2.1 Qualité des ARN extraits ................................................................................ 57

4.2.2.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des

échantillons pour le dépôt de produits PCR ................................................................ 58

4.2.2.3. Détection du signal de la PSA....................................................................... 59

4.2.2.4. Apparition d’amplifications aspécifiques ....................................................... 59

x

5. DISCUSSION ................................................................................................................. 60

5.1. PRODUCTION DE PIEDS DE N. BENTHAMIANA À TRAVERS LE DISPOSITIF MIS EN PLACE AU

LMI .................................................................................................................................. 60

5.2. EXPRESSION TRANSITOIRE DE LA PROTÉINE C3 DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA

......................................................................................................................................... 60

5.3. TEST EXPRESSION AMPLICON DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA ET DE RIZ ......... 61

5.4. EXPRESSION DE L’AMPLICON DANS LES FEUILLES DE RIZ ............................................... 62

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 64

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................... 66

ANNEXE .............................................................................................................................. A

xi

Liste des figures Figure 1: Carte simplifié du plasmide Ti natif (Assoumane A. et al., 2006) ...........................5

Figure 2 : Transfert d’un gène d’intérêt via Agrobacterium tumefaciens (Assoumane A. et al.,

2006) ......................................................................................................................................6

Figure 4 ............................................................................................................................... 10

Figure 5: DICER, structure et mode d’action : Représentation schématique des domaines

structuraux RNase. .............................................................................................................. 12

Figure 6 : Structure de la protéine ARGONAUTE (Song et al., 2004) ................................. 12

Figure 8 : Réprésentation schématique de la production de la protéine d’intérêt (Pi) via le

vecteur amplicon dans le biosystème plante. ........................................................................ 18

Figure 9 : Organisation génomique du RYMV. .................................................................... 24

Figure 10 ............................................................................................................................. 25

Figure 11: Description des constructions géniques codant les protéines d’intérêt C3 et PSA.

............................................................................................................................................. 30

Figure 12: Construits amplicon RYMV................................................................................ 30

Figure 13: Vecteur Pbin61 ................................................................................................... 31

Figure 14: Action du cocktail suppresseur de silencing (Lacombe et al., Soumis) ................ 34

Figure 15: Culture des plants de N. benthamiana ................................................................. 36

Figure 16: Pieds d’Oryza sativa agée de 11 jours ................................................................. 36

Figure 17: Broyage d’échantillons ....................................................................................... 37

Figure 18: Quelques matériels de biologie moléculaire ........................................................ 43

Figure 19: Détails du montage de transfert ........................................................................... 46

Figure 20 : Incinérateur ........................................................................................................ 47

Figure 21: Pieds de N. benthamiana aptes à l’agroinfiltration .............................................. 48

Figure 22: Production de C3 dans les feuilles de N.benthamiana. ....................................... 50

Figure 23 : Vérification par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 1% dépôt de 5 µl sur

45 µl ..................................................................................................................................... 52

Figure 24:Amplification PCR du gène eIF1 alpha .............................................................. 53

Figure 25: Amplifcation PCR du gène codant pour la PSA .................................................. 56

Figure 26 : Vérification par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 57

Figure 27: Produits PCR eiF1 .............................................................................................. 58

Figure 28: PCR PSA ............................................................................................................ 59

xii

Liste des tableaux Tableau 1 : Comparaison des différents systèmes d’expression de protéines recombinantes ...8 Tableau 2 : Les Vecteurs Viraux d’insertion de Gène couramment utilisés pour l’expression

transitoire dans les plantes via A.tumefaciens ........................................................................ 20 Tableau 3 : Les Vecteurs Viraux de Substitution de gène couramment utilisés pour

l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens .................................................... 21 Tableau 4 : Les Vecteurs Viraux issus de virus déconstruits couramment utilisés pour

l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens .................................................... 22 Tableau 5 : Les Virus entiers présentant des peptides couramment utilisés pour l’expression

transitoire dans les plantes via A.tumefaciens ........................................................................ 23 Tableau 6: Concentrations finales d'antibiotiques à ajouter au milieu nutritif en fonction de la

souche bactérienne et du plasmide utilisé. ............................................................................. 33 Tableau 7: Ratio de la combinaison suppresseur/ construction d’intérêt ............................... 34 Tableau 8: Mélange réactionnel pour la reverse transcription ............................................... 39 Tableaux 9: Détails sur les différentes amorces .................................................................... 41 Tableau 10 : Les différents traitements utilisés .................................................................... 49 Tableau 11: Les différents traitements utilisés ..................................................................... 51 Tableau 12 : Dosage au Nanodrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase ............... 52 Tableau 13: les différentes méthodes d’introduction ............................................................ 57 Tableau 14 : Dosage au NanoDrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase .............. 58

xiii

Abréviations °C : Dégré Celsius 3’nos : terminateur nopaline synthétase 35S : promoteur du virus de la mosaïque du chou fleur ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADN-T : ADN de transfert AGO: ARGONAUTE ARN : Acide RiboNucléique ARNm : ARN messager BET : Bromure d’Ethidium CaMV : Cauliflower mosaic virus : Virus de la mosaïque du chou-fleur cDNA : ADN complémentaire CHO : Chinese Hamster Ovary CMV : Virus de la mosaïque du concombre CP: protein de capside (caot protéine) dbRNA : ARN double brin Dicer : Protéine ressemblant à ribonucléase de type III DLC : DICER-like-protéine DO : densité optique ECL : ElectroChimioLuminescent eIF : eucaryotic initiation factor g :gramma GFP : Green Fluorescent Protein GUS ou uid A : β-glucuronidase h : heure HbsAg : Antigène de l’hépatite B HC-Pro : Helper Component Proteinase HcPro : Composant d’aide au protéinase ( helper component proteinase) hGH : Hormone de croissance HRP : Peroxidase de raifort ( horse radish peroxidase) kDa : Kilo Dalton mAb : Anticorps monoclonal MID : middle Milieu LB : milieu Luria-Bertani mn : minute NLS : Signal de locution nuclé aire nt : Nucléotide ORF: open reading frame PAZ: Piwi/Argonaute/Zwille pBin: Plasmide binaire PCR : Polymerase Chain Reaction PCR: Polymerase chain reaction RdRP ou RDR: RNA dependant RNA polymerase RE : Réticulum Endoplasmique rgs-CaM : regulator of gene silencing–calmodulin-like protein RISC : Complexe d’inactivation génétique induit par ARN RNase : ribonucléase Rpm: Rotation par minute

xiv

RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodécyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sRNA : petit ARN (short RNA) TAE : Tris Acetate EDTA TBSV : Tomato Bushy Stunt Virus TEMED NNNN’-tetramethyl ethylene diamine Tm : Température de fusion TMV Virus de la mosaïque du tabac (tabacco mosaique virus) UV : ultraviolet VPg: Viral protein link to the genome μl : Microlitre

1

Introduction D’importantes avancées ont eu lieu ces dernières années dans les domaines des

biotechnologies et notamment dans l’exploitation des plantes comme bioréacteurs pour la

production de protéines d’intérêt. Ainsi, des vaccins, des protéines d’intérêt pharmaceutique,

industriel ou agricole sont actuellement produits dans des systèmes végétaux (Daniell et al.

2009). L’intérêt majeur de ces systèmes par rapport à d’autres biosystèmes classiquement

utilisés pour la production de protéines recombinantes (les bactéries, les levures ou les

cellules de mammifères) réside en leur relatif faible coût et leur facilité à mettre en place ainsi

qu’en leur faible risque de contamination.

Alors que les travaux initiaux portaient essentiellement sur des plantes transgéniques

exprimant de façon stable la protéine d’intérêt, un effort particulier a été porté sur des

techniques alternatives moins coûteuses en temps et moins contraignantes en terme de

confinement. L’utilisation des plantes comme bioréacteur a ainsi connu des innovations

majeures, la première dans ce domaine a été l’utilisation de technologies basées sur l’emploi

d’Agrobacterium tumefaciens comme vecteur pour délivrer les séquences d’ADN codant les

protéines d’intérêt directement dans les feuilles par infiltration à la seringue : l’agro-

infiltration.

Même si de tels systèmes permettent de produire la protéine d’intérêt en quelques

jours, le rendement peut s’avérer relativement faible. En effet, face à l’introduction d’acides

nucléiques étrangers tels que les transgènes les cellules végétales mettent en place des

mécanismes de défenses parmi lesquels le « gene silencing » visant à dégrader spécifiquement

ces acides nucléiques (Johansen et Carrington, 2001). C’est ainsi qu’est née une autre avancée

majeure dans ce domaine : l’expression simultanée,de protéines virales ayant la capacité de

supprimer le « gene silencing » de la plante avec la protéine d’intérêt que l’on souhaite

produire permet de contourner cette contrainte et améliore ainsi le rendement de production

de la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). La dernière avancée significative est

l’utilisation de l’agro-infiltration pour délivrer des ADN codant des ARN viraux utilisés

comme amplificateur : la technologie amplicon. Une fois introduit dans la cellule végétale via

Agrobactérium tumefaciens, le vecteur amplicon modifié avec la séquence d’intérêt se

multiplie entrainant ainsi une production significativement augmentée de la protéine d’intérêt

(Gleba et al., 2007). Cette technologie a été utilisée avec succès pour la production d’un

certain nombre de protéines. Les vecteurs amplicon utilisés jusqu'à présent dérivent

2

principalement du TMV (Tobacco mosaic virus), du PVX (Potato virus X) et de CPMV

(Cowpea mosaic virus) associés à des plantes hôtes telles que le tabac ou Nicotiana

benthamiana. L’utilisation de ces vecteurs est sous le contrôle de brevets. Au jour

d’aujourd’hui aucun vecteur amplicon utilisable chez les monocotylédones (comme le riz)

n’existe. Le Rice yellow mottle virus, ou RYMV, du fait de sa relative petite taille et de la

simplicité de son génome est un candidat de choix pour le développement de tels outils

biotechnologiques utilisables chez le riz. C’est dans ce contexte de recherche appliquée que

s’inscrivent les travaux présentés dans ce manuscrit qui s’articule autour du thème ‘’

Développement d’outils biotechnologiques viraux pour la production de protéines à forte

valeur ajoutée dans des biosystèmes végétaux.’’

1. Revue bibliographique

1.1. Les protéines recombinantes

1.1.1. Définition Les protéines recombinantes sont ainsi qualifiées dans la mesure où elles sont produites à

partir d’un gène se trouvant dans une cellule distincte de celle dont il est originaire. La

protéine, synthétisée par une cellule différente de sa cellule d’origine, est ainsi dite

hétérologue ou recombinante. Au sens large, un système de production adapté à la fabrication

d'une protéine recombinante donnée, est un procédé biotechnologique qui s'appuie

principalement sur :

l'emploi d'un vecteur d'expression (un plasmide ou un virus), jouant le rôle de

transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée ;

l'utilisation d'une cellule hôte, chargée d'exécuter les instructions fournies par le gène

d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de synthétiser la protéine recherchée ;

une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les quantités de

protéines souhaitées ;

enfin, une séparation et extraction de la protéine du milieu de culture, suivie par une

purification de celle-ci.

Au sens restreint, un système de production de protéines recombinantes est caractérisé par un

couple constitué d'un vecteur d'expression et d'un hôte (cellule ou organisme).

3

1.1.2. Choix de l’hôte d’expression ou système d’expression Le choix de système d’expression sera en partie dicté par les impératifs économiques,

mais la qualité des protéines recombinantes produites constituera également un paramètre

déterminant, en particulier dans le cas de la production de protéines destinées à être utilisées

chez l’homme. Pour être stable et active in vivo, les protéines doivent subir de multiples

modifications post-traductionnelles. Les principales modifications sont le repliement, le

clivage, l’association des sous-unités, la γ-carboxylation et la glycosylation. Elles se

produisent après ou pendant la traduction de l’ARN messager en une chaîne d’acides aminés

et sont spécifiques du type de cellule considérée. Parmi les modifications souvent requises

pour assurer la fonction et la stabilité de la protéine, ainsi que son adressage vers le lieu où

elle est active, il y a la glycosylation qui est l’une des plus importantes modifications. Hors,

les glycanes associés aux protéines sont extrêmement variables en fonction de l’hôte dans

lequel la protéine d’intérêt est exprimée. Ainsi, la fonctionnalité des protéines recombinantes

est dépendante de l’hôte et de son système de glycosylation.

1.1.3. Les différents systèmes d’expression Actuellement, il existe divers systèmes d’expression voués à la production et à la

purification de protéines recombinantes : la bactérie Escherichia coli, la levure

Saccharomyces cerevisiae et les cellules Chinese Hamster Ovary (CHO) sont les plus

avancées. Les autres systèmes d’expression font l’objet de nombreux travaux et sont de plus

en plus présents dans le domaine des biotechnologies. Parmi ceux-ci, on trouve la levure

Pichia pastoris, les cellules d’insectes, les animaux et les plantes transgéniques. Les plantes

transgéniques sont des systèmes d’expression caractérisés par l’intégration du gène d’intérêt

dans le génome de la plante, ce qui permet une production à long terme de la protéine

d’intérêt. Cependant le principal inconvénient de ce type de système d’expression est que la

mise en place et la caractérisation des lignées transgéniques peuvent prendre plusieurs mois

et le rendement de la production de la protéine est imprédictible, (Fischer and Emans 2000).

De plus, la culture des plantes transgéniques requière des conditions phytosanitaires

spécifiques pour éviter des problèmes écologiques tels que les flux de gènes (Boehm 2007).

Nous ne saurons parler des systèmes d’expression plante sans noter que de nos jours,

des efforts particuliers sont portés sur des techniques alternatives moins couteuses en temps

et moins contraignantes en terme de confinement ; ainsi est née l’expression transitoire. Avec

cette dernière, la protéine d’intérêt est produite seulement en quelques jours.

4

1.2. Les plantes comme bioréacteur L’expansion du marché des protéines recombinantes n’est plus à démontrer, depuis la

fin des années 1990, plus de 280 protéines recombinantes thérapeutiques, dont une vingtaine

d’anticorps monoclonaux, sont commercialisées représentant un chiffre d’affaire estimé à près

de 49 milliards de dollars US en 2006. Ce segment connaît une croissance de 20% par an

contre 7% pour l’industrie pharmaceutique globale et près de 2200 nouvelles protéines

recombinantes sont actuellement en phase clinique (Cadoret et al., 2008 ). L’industrie

pharmaceutique et les sociétés de biotechnologie sont confrontés à un défi majeur : celui de

disposer de systèmes de production de protéines recombinantes qui puissent répondre à leurs

contraintes à la fois en termes de qualité, de quantité produite et de rentabilité. Il existe au

niveau mondial un déficit de capacité de production de ces protéines recombinantes, car les

systèmes actuellement disponibles ne permettent pas de produire la quantité et la qualité à un

coût raisonnable.

Aujourd'hui, les systèmes de production de protéines recombinantes font

essentiellement appel à la culture de cellules animales (les cellules de mammifères). Ce

procédé ainsi que d’autres biosystèmes basés sur les bactéries et les levures restent coûteux et

présentent des risques de vecteur de contamination (pathogènes et prions) d’autant plus qu’ils

ne sont pas facile à implémenter ce qui ne permet pas de couvrir la demande actuelle

grandissante. De plus, le système de production doit être capable de réaliser les modifications

post-traductionnelles, incluant le clivage du peptide signal, l’adressage de la protéine, la

formation des ponts disulfures, et la glycosylation. L'utilisation de plantes pourrait permettre

de palier à cette forte demande en protéines d’intérêt. Le système d’expression constitué par

les plantes est une voie prometteuse pour synthétiser des protéines d’intérêt avec des coûts

réduits (Boehm, 2007). Comme les systèmes eucaryotes, elles sont capables de réaliser toutes

les maturations post-traductionnelles.

1.2.1. Techniques de transformation génétique des plantes Deux familles de techniques sont utilisées pour la transformation génétique de cellules

végétales : l’une fait intervenir des méthodes physiques ou chimique qui permette la

pénétration de l’ADN directement dans les cellules végétales (en utilisant un canon à

particule, le polyéthylèneglycpol, en réalisant la fusion entre les protoplastes et des liposomes

qui sont vésicules artificielles de phospholipides encapsulant l’ADN à transférer ou encore en

faisant appel à des impulsions électriques, l’autre méthode consiste à utiliser les propriétés d’

5

Agrobacterium tumefaciens, l’avantage de cette dernière est que la paroi pectocellulosique

rigide de cellule végétale qui constitue un obstacle au transfert de gène peut eêtre contournée

par l’utilisation des bactéries du genre Agrobactérium.

Le principede la transgénèsepar Agrobactérium repose sur les caractéristiques du

plasmide Ti natif (Figure 1) qu’elle porte qui est alors utilisés comme un vecteur. Le plasmide

natif est responsable de la tumorisation des cellules végétales conduisant ces dernière à

synthétiser des substances qu’agrobactérium n’est pas à mésure de fabriquer toute seule Grace

à une modification génétique le plasmide Ti peut être utilisé. Pour la transgénèse (Figure 2)

les gènes ONC (Auxine Cytokinine et Opine) possède une fonction oncogène pour des

cellules végétales sont supprimés de l’ADN T et sont remplacés par le gène d’intérêt tout en

maintenant les bords droit et gauche de l’ADNT. Ceci à pour effet de désarmer le plasmide

Ti tout en conservant la possibilité le gène de la bactérie vers le noyau de la cellule végétale

par l’intermédiaire des gènes VIR. Le gène d’intérêt introduit dans le plasmide Ti désarmé

sera transféré dans le noyau de la cellule végétale il fait alors partie du patrimoine génétique

de la cellule qualifiée alors de plante transgénique. Cependant pour être qualifiée trangénique

il faut que toutes les cellules de la plante possèdent le trangène si non il s’agit d’une plante

chimère.

Figure 1: Carte simplifiée du plasmide Ti natif (Assoumane A. et al., 2006)

6

Figure 2 : transfert d’un gène d’intérêt via Agrobacterium tumefaciens (Assoumane A. et al., 2006)

1.2.2. Les avantages du système plantes Même si les rendements de protéines produites sont souvent encore limités dans les

systèmes d'expression végétaux (Ma et al., 1995), la capacité de production dans les plantes

est quasiment illimitée puisqu'elle dépend exclusivement des surfaces mises en culture

(Negrouk et al., 2005). Ainsi un "bioréacteur" végétal permettra d'obtenir jusqu'à 20 kg de

protéines recombinantes par hectare (Austin et al., 1994). Enfin, le principal avantage des

plantes par rapport aux systèmes traditionnels de culture de cellules de mammifères en

fermenteur, est que la production de protéines recombinantes serait jusqu'à 500 fois moins

coûteuse. Outre ces deux points, le système de production de protéines hétérologues par les

plantes présente d’autres avantages (Giddings et al., 2000 ; Yusibov and Rabindran, 2008) :

Les cellules végétales étant des cellules eucaryotes, elles disposent d’un système

permettant dans de nombreux cas de produire des protéines complexes ayant des

propriétés équivalentes aux protéines humaines. Elles sont en effet capables

d’effectuer toutes les modifications post-traductionnelles requises pour obtenir une

molécule bioactive. La production d’immunoglobulines dans les cellules végétales est

7

un bon exemple : ces dernières sont capables de synthétiser correctement, et

d’assembler les chaines polypeptidiques lourdes et légères constituant un anticorps.

Il n’existe pas, en l’état actuel des connaissances, de pathogènes végétaux capables

d’infecter l’homme et l’animal, éliminant ainsi le risque par exemple d’infection ou de

contamination virale par les protéines produites par les plantes, à la différence des

protéines produites par les cellules de mammifères ou d’animaux transgéniques. La

sécurité phytosanitaire est donc assurée.

Le niveau actuel des biotechnologies végétales permet de cibler de façon spécifique

les tissus dans lesquels s’exprimera la protéine d’intérêt. En particulier, dans le cas du

maïs, la protéine peut être ciblée dans les grains, permettant un stockage efficace et

une bonne stabilité de la protéine d’intérêt.

Enfin, la capacité de régénération et la pérennité du végétal sont des qualités qui

entrent en compte pour la production de protéines recombinantes. La luzerne, par

exemple, est un végétal bien adapté à la production de protéines recombinantes, en

raison de la facilité de son bouturage.

Les avantages et les inconvénients des différents systèmes de production, en termes de

coûts, de productivité, de sécurité et d’authenticité sont résumés dans le tableau ci après

(Tableau 1)

8

Tableau 1 : Comparaison des différents systèmes d’expression de protéines recombinantes

Systèmes de production

Cout de

production

Cout

d’extraction purification

Temps de

production

Capacité de production

Qualité

Cout de stockage

Glycosylation

Risques de

contaminations

Bactérie Faible Moyen Court Elevé, Centaines de mg/L

Médiocre Modéré (-20°C)

Aucune Endotoxines

Levures

Moyen

Faible

Moyen

Elevé,

200 mg/L

Moyenne

Modéré (-20°C)

Incorrecte

Risques faibles

Baculovirus/

Cellules d’insectes

Moyen

Faible

Court

Moyen, 10 à 100

mg/L

Bonne

Cher (N2)

Différences

majeures

Risques faibles

Cellules de

mammifères

Elevé

Faible

Long

Moyen,

Qq dizaines mg/L

Très

Bonne

Cher (N2)

Correcte

Virus, prions et ADN

oncogénique

Animaux

transgéniques

Elevé

Elevé

Très long

Très élevé,

Qq g/L

Très

Bonne

Cher

Correcte

Virus, prions et ADN

oncogénique

Cultures cellulaires végétales

Moyen

Faible

Moyen

Moyen

Bonne

Modéré

Différences mineures

Risques faibles

Plantes

transgéniques

Très faible

Elevé

Long

Très élevé 600mg/kg

Mat fraiche

Bonne

Peu cher

(T°C ambiante)

Différences mineures

Risques faibles

Fischer and Emans, 2000 ; Ma et al., 2003 ; Dingermann, 2008

9

1.3 Le « Gene silencing » La capacité de production en protéines recombinante chez les plantes est affectée par

des mécanismes endogènes de l’hôte tel que le « gène silencing ». Le gene silencing est un

mécanisme de régulation de l’expression des gènes spécifiques de leur séquence. C’est un

mécanisme majeur impliqué dans de nombreux processus comme la succession des étapes

développementales d’un organisme, le maintien de l’intégrité du génome, les réponses à

l’environnement et la défense contre les pathogènes, notamment les virus. Il n’a pourtant été

découvert que très récemment. Ses effets ont été observés pour la première fois sur des plants

de pétunia en 1990. Les expérimentations désireuses de renforcer la couleur des pétales ont

voulu induire une surexpression du gène codant pour la chalcone synthase dans ces plantes.

Etonnamment, le résultat de l’introduction de ce gène impliqué dans la biosynthèse des

anthocyanes dans ces plantes est l’extinction complète de l’expression du transgène et du

gène endogène conduisant au blanchiment des pétales, (Napoli et al., 1990) ( voir figure 3).

Au cours de l’évolution, les plantes ont développé un mécanisme de défense

permettant de se protéger contre les infections virales. Lorsque les ARN viraux sont présents

en quantité trop importante dans une cellule, un système de régulation spécifique appelé

«gene silencing » se met en place. Le gene silencing intervient dans les systèmes plantes de

production de protéines recombinantes. En effet, la surexpression de gènes chez les plantes

transgéniques s’apparente à la présence surnuméraire de certains ARN. En effet, ce

mécanisme se met en place en présence d’ARN viral dans la plante, mais aussi en présence

d’ARN étranger (Vaucheret and Fagard, 2001), notamment sous contrôle d’un promoteur

fort. Dans les plantes transformées, l’inactivation post-transcriptionnelle correspond à la

dégradation spécifique des ARN messagers (ARNm) codés par le transgène par la production

massive d’ARN double brin (ARNdb) sous l’action d’une RNA dépendante RNA polymérase.

L'ARNdb est dégradé par une nucléase de type Rnase III appelée DICER en petites molécules

d'ARN de 21 à 23 nucléotides (nt) de long appelés généralement « sRNA » pour short RNA,

qui vont servir de guide à un complexe multi-enzymatique : un complexe protéique

« effecteur » appelé RISC ( pour RNA induced silencing complexe) qui va dégrader tous les

ARN messagers homologues (Pfeffer et al., 2003). Le transgène est alors éteint (figure 4).

L’activité majeure de la protéine AGO est le clivage des RNA simples brins reconnus par

complémentarité de séquence avec le sRNA qu’elles portent.

10

Figure 3: Première mise en évidence du « gene silencing » (Napoli et al., 1990) Des plants de pétunia (A) ont été transformés par le gène de la chalcone synthèse (CHS) sous promoteur 35S.le transgène est cibler par le mécanisme de gene silencing. Les sRNA produits permettent également la reconnaissance du gène CHS endogène. Au lieu d’obtenir un renforcement de la coloration dû a une sur- accumulation des anthocyanes, les fleurs deviennent blanches, avec un patron d’expression spécifique à chaque plante (B-E)

Figure 4: Schéma du « gene silencing »

ARNm étranger

sRNA 21-24nt

AGO

11

1.3.1 Quelques protéines majeures du « gene silencing »

1.3.1.1 RDR Les RDR ou RNA polymérase RNA dépendante (RdRP) existent en nombre variable selon

l’espèce de plante considérée. En guise d’illustration, chez Arabidopsis thaliana, on en

compte six nommées RDR1, RDR3, RDR6, RDR3a, RDR3b, RDR3c (Voinnet 2008). Ces

enzymes utilisent l’ARNsimple brin comme matrice pour synthétiser le brin complémentaire,

produisant ainsi un ARN double brin, substrat de Dicer. Il semble exister des liens particuliers

entre certaines RDR et certaines Dicer. Une colocalisation a déjà pu être mis en évidence (Li

et al., 2006)

1.3.1.2 Dicer L’enzyme Dicer est responsable de la synthèse des sRNA. Le nombre de gènes codant

pour cette protéine varie selon l’organisme. Par exemple, chez Arabidopsis thaliana il existe

quatre protéines homologues de Dicer appelées DCL1 à DCL4 (pour Dicer-like protein, Dicer

étant le nom attribué à une protéine isolée de la drosophile par Bernstein et al en 2001).

Chacune de ces protéines produit des sRNA d’une taille spécifique. DCL1 et DCL4

produisent des sRNA de 21 nucléotides, DCL2 de 22nt et DCL3 forme des sRNA de 24nt,

tous ayant des fonctions particulières.

Les protéines DCL sont des RNase de classe III (Hammond, 2005). A ce titre, elle

porte toutes les domaines fonctionnels suivants: un domaine de liaison à l’ARN double brin

(DRB), deux domaines RNase III (identifiés chez tous les homologues de DICER connus à ce

jours), un domaine hélicase et un domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) retrouvé, comme

son nom l’indique, sur la protéine ARGONAUTE (Figure 5). La structure tridimensionnelle

de la protéine induit la formation d’un « dimère interne » des deux domaines RNase III ;

placés face à face, avec un léger décalage, ils permettent le clivage simultané des deux brins

de l’ARN, produisant une extrémité 3’ sortante de deux nucléotides, les sRNA produits ont

une extrémité 5’ monophosphate et une extrémité 3’OH. Le domaine PAZ reconnait l’ARN

double brin au niveau de son extrémité clivée caractéristique. Sa distance relative au domaine

RNase III est responsable de la spécificité de longueur des sRNA produit par chaque enzyme

.Ces données ainsi que des expériences utilisant un ARN double brin dont l’extrémité est

bloqué artificiellement (Zhang et al., 2002) indique que Dicer pourrait agir préférentiellement

à partir d’une extrémité de son substrat.

12

Figure 5: DICER, structure et mode d’action : Représentation schématique des domaines structuraux RNase. La disposition légèrement décalée des sites catalytique de part et d’autre du mRNA double brin conduit à la formation d’extrémité 3’ sortante de deux nucléotides, la distance eentre le domaine PAZ et les sites de clivage calibre précisement la taille des sRNA produit par chaque DICER ( hammond 2007)

RNase IIIa RNase IIIb DRB Hélicase PAZ

1.3.1.3 Argonaute Comme pour l‘enzyme Dicer, le nombre de représentant de la famille argonaute

diffère d’un organisme à un autre. Arabidopsis thaliana a dix gènes Argonaute nommés

AGO1 à AGO10. C’est un mutant d’AGO1 chez Arabidopsis thaliana qui a donné son nom à

cette famille. En effet, le phénotype d’une plante déficiente dans ce gène rappelle la

morphologie d’une pieuvre, Argonauta argo. La famille de protéine AGO est subdivisée en

trois groupes en fonction de leurs liens phylogénétiques et de la nature des sRNA qu’elles

fixent.

Les protéines AGO ont une taille d’environs 100 kDa. Elles possèdent un domaine N-

terminal variable, un domaine PAZ, un domaine MID (pour middle), un domaine PIWI et une

extrémité C-terminal conservée. Le domaine PAZ, similaire à celui des protéines Dicer

reconnait l’extrémité 3’ du sRNA simple brin alors que le domaine MID en fixe l’extrémité 5’

(figure 6).

Figure 6 : structure de la protéine ARGONAUTE (Song et al., 2004)

13

La fonction majeure des protéines Argonaute est de cliver les ARN simple brin

reconnus par complémentarité de séquence avec le sRNA qu’elles portent, cette activité

endonucléasique est dite « slicer ». Longtemps considérée comme une particularité des

protéines animales, l’inhibition de la traduction a été récemment démontrée chez les plantes

(Broderson et al., 2008). L’inactivation du messager pourrait s’opérer avant même l’initiation

de la traduction, par compétition entre la protéine Argonaute et les facteurs d’initiation pour la

liaison à la coiffe.

1.3.2. Les suppresseurs viraux de gene silencing Le mécanisme de gene silencing étant un moyen de lutte antiviral efficace et

spécifique chez les plantes, la plupart, sinon tous les phytovirus ont développé des protéines

capables de protéger l’intégrité du génome viral en inhibant ce mécanisme. Ces protéines

varient d’une espèce à l’autre, voire d’un virus à l’autre du point de vue de leur séquence mais

aussi et surtout, de leur mode d’action. Ainsi, chaque protéine dite « suppresseur » va pouvoir

cibler une ou plusieurs étapes du silencing, inhibant le gene silencing antiviral mais aussi

souvent d’autres voies du silencing fondamentales au développement de la plante. Il est

question ici de présenter quelques étapes différentes du gene silencing auxquelles s’attaquent

des suppresseurs viraux connus.

1.3.2.1 Inhibition de l’activité DICER : Exemple de la protéine P38 du TCV

La protéine P38 est une protéine multifonctionnelle dont le rôle premier est structural

puisque P38 est la protéine de capside du TCV. Elle est impliquée dans le mouvement

systémique du virus (Hacker et al., 1992) et est l’éliciteur de la résistance « gène pour gène »

chez un écotype d’Arabidopsis thaliana (Kachroo et al., 2000). Son activité suppresseur de

silencing a été découverte par Qu et al (2003). En effet, son expression abolit la synthèse de

sRNA dans un système Nicotiana benthamiana, une plante apparentée au tabac présentant un

gene silencing artificiel contre le gène rapporteur GFP. Ce système consiste en l’introduction

transitoire d’un cDNA codant la GFP dans les feuilles de plantes transformées de façon

stable par le gène de la GFP. L’introduction exogène d’une nouvelle construction GFP induit

le mécanisme de gene silencing dirigé contre l’inducteur lui-même mais aussi contre le

transgène GFP ce qui conduit à l’extinction de la fluorescence verte dans le patch

d’introduction de l’inducteur. La présence d’une protéine ayant une activité suppresseur de

14

silencing dans le patch d’induction empêche le gene silencing contre la GFP de se mettre en

place. Dans ce cas, le patch maintien sa fluorescence verte. Cette méthode dite de « patch

test » a été développée par Voinnet et al 1998 (figure 7) et est largement utilisé par

l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant aux suppresseurs de gene silencing.

P38 agit au niveau de l’activité Dicer (Qu et al., 2003). Les résultats obtenus par Qu et al.,

suggèrent que P38 pourrait lier les ARN double brin, entrant ainsi en compétition avec les

protéines Dicer en soustrayant leur substrat. Ainsi la production des sRNA en serait affectée

et la stabilité des ARN double brin augmentée.

Figure 7 : « patchs test » Cette technique est l’une des plus largement utilisée dans la recherche de l’activité de suppression d’une protéine virale. On utilise une plante de N benthamiana expriment le transgène GFP sous la dépendance d’un promoteur 35S qui fluoresce en vert sous UV. Par la méthode d’agroinfiltration, on introduit le transgène 35S-GFP. Cela provoque probablement une accumulation du transcrit reconnu comme une aberration par la plante ce qui conduit à la mise en place du gene silencing contre le transgène agroinfiltré et le transgène constitutif. On peut également utiliser une construction qui après transcription formera une structure en tige boucle dont la séquence correspond à tout ou partie du gène de la GFP (hpGF pour « harpin » correspondant à la portion 5’ de la GFP). Le patch corespondant à la zone infiltrée devient rouge sous UV : la GFP n’est plus exprimée, on ne visualise plus que la chlorophylle. Quelques jours plus tard, le système est établi et la plante devient complètement rouge. Si on co-infiltre avec les constructions 35S GFP ou hpGF (une construction codant pour une protéine capable d’inhibé localement le gene silencing), le patch devient vert.

15

1.3.2.2. Inhibition de l’activité d’argonaute : exemple de la protéine 2b du CMV

Des expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que 2b interagit avec AGO1

in vivo. Cette interaction est spécifique et prendrait place au niveau du domaine PAZ d’AGO.

La protéine virale bloquerait directement l’activité slicer de AGO1 en interagissant avec son

domaine PAZ (Zhang et al., 2006). Comme AGO est un effecteur du complexe RISC, 2b

permettrait de préserver l’intégrité du génome viral tout en perturbant les voies du silencing

endogènes de la plante.

1.3.2.3. Inhibition de l’activité d’argonaute : exemple de la protéine P0 des Polerovirus

La plupart des suppresseurs viraux de gene silencing interagissent soit avec l’ARN

double brin soit avec des duplex sRNA (Lakatos et al., 2006). Parmi les suppresseurs faisant

exception, on note la protéine 2b des Cucumovirus (Zhang et al., 2006) qui se lie sur la

protéine effecteur AGO1 et l’inactive (Morel et al., 2002, Qi et al., 2005), la protéine P38 du

TCV qui inhibe l’activité Dicer et la protéine P0 de gene silencing des Polerovirus (famille

des Luteoviridae).

La protéine P0 est codée par la F box des Polerovirus (Pazhouhandeh et al., 2006) elle cible

sur AGO1 le domaine PAZ et d’autres séquences qui lui sont adjacentes en amont et entraine

sa dégradation. Les protéines de la F box sont des éléments des complexes ubiquitine ligases

E3 qui marquent les protéines pour une dégradation via le protéosome. (Petroski et al., 2005).

P0 inhibe localement le gene silencing, cette activité devrait contribuer à une restriction du

virus dans le phloème dans le cas des virus du groupe des Polérovirus.

1.3.2.4. La protéine P1 du RYMV La protéine P1 du RYMV présente une activité de suppression de gene silencing à

efficacité variable selon l’origine de l’isolat viral. Cette activité de suppression de la P1 est

associée à une importante réduction de l’accumulation des sRNA de 21 et 24nt. La P1 s’est

révélée augmenter le gene silencing systémique dans les pieds de Nicotiana benthamiana

(Lacombe et al., 2010). Dans le riz, la P1 induit une dérégulation de la voie endogène des

sRNA dépendant de DCL4 alors que les autres voies endogènes ne sont pas affectées. La

protéine P1 du RYMV présente des effets multiples à la fois sur le gene silencing exogène et

endogène, pas seulement des activités de suppression mais aussi des activités en faveur du

16

gene silencing. Cela suggère que la protéine P1 joue un rôle clef dans le maintien de

l’équilibre entre les mécanismes de défenses et de contre-défenses afin d’assurer une

multiplication efficace du virus et un maintien de l’intégrité de l’hôte (Lacombe et al., 2010)

1.3.2.5. Séquestration des sRNA : exemple de la protéine P19 des Tombusvirus

Un des suppresseurs le mieux caractérisé est la protéine P19 provenant du Tomato

Bushy Stunt Virus (TBSV) (Qiu et al., 2002). La protéine P19 des tombusvirus intervient

dans le mouvement à longue distance du virus et a d’abord été caractérisée, comme de

nombreux suppresseurs, comme étant un « facteur de pathogénicité ». Depuis, il a été montré

que la protéine P19 est capable de lier des sRNA double brin in vitro et in vivo (Chapman et

al., 2004 à; Dunoyer et al.,2004) mais n’a qu’une faible affinité pour les sRNA simple brin

de grande taille ce qui suggère que sa fonction est d’inhiber le chargement du complexe

RISC. La protéine agit sous forme d’homodimère et est capable de fixer de manière très

spécifique des sRNA double brin de 21 nucléotides.

Plusieurs stratégies peuvent être adoptées pour éviter le phénomène de gène silencing,

en exprimant par exemple simultanément au gène d’intérêt un suppresseur de silencing.

L’expression simultanée de protéines virales ayant la capacité de supprimer le gene silencing

de la plante et de la protéine d’intérêt permet ainsi d’améliorer le rendement de production de

la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). Un des meilleurs suppresseurs caractérisé est la

protéine P19 provenant du Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) (Qiu et al., 2002). Ce

suppresseur, coexprimé avec une protéine recombinante a permis d’augmenter de plus de 50

fois le niveau d’expression de la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). La protéine HC-Pro

(Helper Component Proteinase) est capable de bloquer la production (Mallory et al., 2001 ;

Ma et al., 2008). Un autre gène a été mis en évidence, le gène rgs-CaM chez le tabac. Il code

pour une protéine liant le calcium capable d’inhiber le « gene silencing » et interagit avec HC-

Pro dans le mécanisme de suppression du gene silencing.

17

1.4. Technologie amplicon : des amplicon viraux pour la production de protéines recombinantes dans les plantes via A. tumefaciens

Dans le passé, le faible rendement d’expression de protéines recombinantes dans les

plantes constituait un frein. De ce fait, la plus part des activités de recherches dans ce domaine

se sont focalisées sur le développement de systèmes d’expression améliorés afin d’augmenter

les rendements. Initialement conçu pour l’étude des mécanismes fondamentaux qui se

déroulent lors de l’infection virale de la plante, les virus recombinants se sont révélés comme

des moyens d’atteindre des hauts rendements de part leur capacité d’intense et de rapide

réplication. (Gleba et al., 2005). Le principe consiste en l’intégration de la séquence codant

une protéine d’intérêt dans le vecteur amplicon reproduisant l’ARN d’un virus. Une fois

introduit dans la cellule végétale via Agrobactérium tuméfaciens, le vecteur amplicon modifié

avec la séquence d’intérêt se multiplie entrainant ainsi une production significativement

augmentée de la protéine d’intérêt (Gelba et al., 2007). Grâce à une amélioration de la

compréhension fondamentale des virus de plantes, de l’interaction virus-plante, du gene

silencing et de sa suppression et de la technique d’agroinfiltration, plusieurs avancées

majeures ont eu lieu dans le domaine du développement de systèmes d’expression basés sur

les virus de plante ces deux dernières décennies. Comme résultat, les vecteurs viraux de

plantes sont de nos jours utilisés en routine pour l’expression à haut rendement de vaccins,

d’anticorps et d’autres protéines d’intérêts dans toute la plante (Zhang et al., 2000). Deux

méthodes sont utilisées pour la réplication virale du gène d’intérêt dans la plante:

L’inoculation directe avec les transcrits viraux ou bien avec le virus recombinant entier et

l’usage de A.tumefaciens pour délivrer le vecteur viral aux cellules de la plante. Appliquer

directement le virus à la plante conduit à une faible efficacité de l’infection et de ce fait à un

faible rendement de protéines (Gleba et al., 2007). La meilleure méthode pour transférer

efficacement l‘amplicon viral est l’utilisation de A. tumefaciens. Lorsque la technique

d’agroinfiltration est utilisée, les cDNA copie du génome virale entier ou modifié et la

séquence d’ADN du gène d’intérêt, précédé d’un promoteur fort sont insérés entre le bord

droit et le bord gauche du plasmide Ti désarmés de A. tumefaciens. Durant l’infiltration du

matériel végétal, l’ADN Ti est transféré aux cellules de la plante hôte et délivré dans le noyau

où la réplication du vecteur viral conduit à une surexpression de la protéine d’intérêt. Dans les

feuilles transformées avec les construits amplicon, il y a transcription dans un premier temps

18

du gène de l’amplicon en ARNm. Les ARNm sont traduits par la machinerie cellulaire en

protéines parmi lesquelles on compte l’ARN polymérase-ARN-dépendante virale codée par

un ORF de la construction amplicon. Si elle trouve un environnement cellulaire propice à la

réplication virale, cette dernière permet la transcription du brin négatif du virus pour conduire

à la mise en place de l’ARN viral double brin. Cela aboutira à la multiplication de l’ARN

viral qui prendra le dessus pour l’expression de protéines virales et conduira à la

multiplication du virus donc à la production d’ARN viral génomique et subgénomique non

polyadénylé (figure 8)

Figure 8 : représentation schématique de la production de la protéine d’intérêt (Pi) via le vecteur amplicon dans le biosystème plante.

L’utilisation des vecteurs viraux pour la production de protéines recombinantes a été revue

dans les grands détails (Gleba et al., 2007, Lico et al., 2008). Quatre types de constructions

virales distincts sont utilisées pour la création des amplicons parmi lesquels les vecteurs

d’insertion de gène, les vecteurs de substitution de gène, les vecteurs utilisant les virus

déconstruits et les vecteurs présentant des peptides. Dans les vecteurs d’insertion de gène, le

gène d’intérêt est ajouté dans un nouveau ORF sous le contrôle d’un promoteur tout en

19

laissant les cDNA complet fonctionnel du virus intact (Lico et al., 2008). Dans les vecteurs

viraux de substitution de gène, une séquence endogène du génome viral est remplacée par la

séquence codant la protéine recombinante. Dans la technique de vecteurs déconstruit, le virus

est séparé en différents segments génétiques agissant ensemble comme un virus multipartite

dans lequel seuls les éléments essentiels pour l’expression du gène d’intérêt sont maintenus, et

le gène de la CP (protéine de capside) est remplacé par celui du gène d’intérêt. Dans les

vecteurs viraux présentant des peptides, le gène d’intérêt est fusionné à la CP permettant ainsi

une génération de la particule virale entière, le peptide souhaité est alors ancrer à la surface

de la particule virale.

La comparaison entre les niveaux de production obtenus en utilisant chaque type de

vecteur viral indique que plusieurs facteurs contribuent à la production de la protéine

recombinante. Par exemple, le rendement de protéine recombinante se montre plus dépendant

du type de plante hôte utilisé, du type de promoteur, que l’amplicon soit capable ou non de

mouvement systémique ou qu’un suppresseur de silencing soit ou non utilisé.

La technologie amplicon a été utilisée avec succès pour la production d’un certain

nombre de protéines. Les vecteurs amplicon utilisés jusqu'à présent dérivent principalement

du TMV (Tobacco mosaic virus), du PVX (Potato virus X) et de CPMV (Cowpea mosaic

virus) associés à des plantes hôtes telles que le tabac ou N. benthamiana. (Tableaux 2,

Tableaux 3, Tableaux 4, et Tableaux 5)

20

Tableau 2 : Les Vecteurs Viraux d’insertion de gène couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur APTT

(amplicon-plus targeting

technology)

BCTV-based vector

PVX-based vector

CPMV-based vector

Virus Utilisé PVX (potato virus X)

BCTV (beet curly top

virus)

PVX (potato virus X)

CPMV (Cowpea mosaic

virus) Promoteur Utilisé

Cauliflower mosaic

virus 35S (CaMV 35S)

CaMV 35S, CaMV 35S CaMV 35S

Plante hôte N. tabacum Xanthi; N.

benthamiana; Transgenic

TEV-B plants

N. benthamiana N. benthamiana N. benthamiana

Souche d’Agrobacterium utilisée

GV3101

GV3101 GV3101 LBA4404;C58C1

Protéine Recombinante produite

COPVL1 (Canine oral

papillomavirus LI)

GFP (Green

fluorescent protein)

haFGF (Human acidic

fibroblast growth factor)

GFP (Green

fluorescent protein)

Niveau d’expression (par masse fraiche)

-----

3 fois plus élévé qu’avec le

promoteur 35S CaMV seul

20 ug haFGF par g de feuille

fraiche

-----

Azhakanandam et al.,2007, Liu et al.,2007, Canizares et al., 2006, II Kim et al., 2007,

21

Tableau 3 : Les Vecteurs Viraux de Substitution de gène couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur

TMV launch vector

BYV-based vector

CMViva VMTA (virusmediated

transgene activation)

TRBO (TMV RNA-based rt

overexpression)

TMV-based vector

PVX-based vector

TMV launch vector

Virus Utilisé TMV (Tobacco mosaic virus)

BYV (Beet yellows virus)

CMV (Cucumber

mosaic virus)

TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco mosaic virus)


PVX (Potato virus X)


Promoteur Utilisé

CaMV35S CaMV 35S Facteur de transcription

introduit par le vecteur viral pour active

GAL4

CaMV 35S CaMV 35S CaMV 35S CaMV 35S

Plante hôte N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana souche

Agrobacterium Utilisé

A. rhizogenes A4

C58 GV2260 EHA105 LBA4404 GV3101 GV3101 GV3101 ------

protéine Recombinante

produite

Protéine cancéreuse du

ppapillomavirus humain (HPV)

GFP; GUS AAT (Alpha-1 -antitrypsin)

GUS;

GFP Antigene de la tuberculosis

Ag85B, ESAT6

GFP Divers antigène pour

vaccin

Niveau d’expression

400 mg par kg de feuille fraiche

25 fois plus élévé si p21est utilisée dans le

vecteur

390 mg AAT par kg de

feuille fraiche

40 ug IA-2ic par g de feuille

fraiche

5.5 mg GFP par g de feuille

fraiche

Environs 800 mg par kg de feuille fraiche

-----

0.5 g par kg de feuille fraiche

Lindbo, 2007a, Lindbo, 2007b, Dorokhovet al., 2007, Komarova et al., 2006, Hullet al 2005, Sudarshana et al., 2006, Chiba et al., 2006, Plesha et al., 2007, Musiychuk et al., 2007, Chichester et al., 2007, Massa et al 2007. * P21 protéine suppresseur de silencing du Beet yellows virus (BYV)

22

Tableau 4 : Les Vecteurs Viraux issus de virus déconstruits couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur

magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON CPMV-based vector

Virus utilisé TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco

mosaic virus)

TMV (Tobacco mosaic virus);

PVX (Potato virus

X)

CPMV (Cowpea mosaic

virus)

Promoteur utilisé

A. thaliana ACT2

A. thaliana ACT2

A. thaliana ACT2

A. thaliana ACT2

A. thaliana ACT2

A. thaliana ACT2;

CaMV 35S

Plante hôte N.benthamiana; N.tabacum; 50 dicot species

N. benthamiana N. benthamiana

N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N. benthamiana

souche d’ Agrobacterium

utilisée

GV3101 GV3101 GV3101 GV3101 GV3101 ------

LBA4404; AGL-1

Protéine recombinante

produite

GFP hGH (Human growth hormone); GFP

GFP hBsAg (antigene de

surface de l’hepatite B )

antigènes de Yersinia pestis

;

IgG mAb

IgG mAb

Niveau d’expression (par masse de feuille fraiche)

4 g par kg de feuille fraiche

1 mg hGH par g de feuille

fraiche; 5 mg GFP par g de feuille fraiche

------


1 mg par g de feuille fraiche

0.5 g mAb par kg feuille fraiche


Santi, et al., 2006, Sainsbury et al., 2008, Giritch et al.,2006, Gils et al.,2005, Marillonnet et al.,2004, Sheludko, et al., 2007, Huang et al., 2008, Huang, et al., 2006, Marillonnet , et al., 2005, Giritch et al., 2006, Gleba et al.,2005

23

Tableau 5 : Les Virus entier présentant des peptides couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens

Nom du vecteur TVCV-based vector PVX-based vector

Virus utilisé Tobacco mosaic virus (TMV) with CP from turnip vein clearing

virus (TVCV)

Potato virus X

Promoteur utilisé A. thaliana ACT2 CaMV 35S

Plante hôte N. benthamiana N. benthamiana

souche d’ Agrobacterium utilisée

GV3101 GV3101

protéiné recombinante produite

Protéine A (de la surface du virus)

Peptides du papillomavirus Humain

type 16 E7 et L2

Niveau d’expression (par masse de feuille fraiche)

>3 g par kg -------

Werner et al., 2006, Cerovska et al 2008

Au jour d’aujourd’hui aucun vecteur amplicon utilisable chez les monocotylédones

(comme pour le riz) n’existe. Le virus de la panachure jaune du riz (RYMV pour Rice yellow

mottle virus) est un candidat de choix pour le développement d’un tel outil biotechnologique.

En effet, la simplicité de son génome ainsi que la grande connaissance fonctionnelle des

protéines associées représentent des atouts majeurs pour le développement de tels outils

amplicons.

1.5. Le virus de la panachure jaune du riz comme outil amplicon L'agent pathogène de la panachure jaune du riz reconnu par le Comité international de

taxonomie des virus (ICTV) sous le nom d'espèce Rice Yellow Mottle Virus (acronyme :

RYMV) appartient au genre des Sobemovirus (Hull et Fargette, 2005). Le RYMV est un

virus facilement transmissible par contact au champ et par inoculation mécanique au

laboratoire. Il est transmis par plusieurs espèces d'insectes (Kouassi et al, 2005), et il l’est

aussi par les mammifères (Sarra et Peters 2003). Par ailleurs, la transmission par le vent et les

pratiques culturales ont été aussi démontrées (Traoré et al., 2006a). Les hôtes naturels du

RYMV sont les deux espèces de riz cultivées (Oryza. glaberrima et Oryza. sativa) et

24

plusieurs espèces de riz sauvages. La gamme d'hôtes du virus est très limitée et comprend

uniquement les espèces de la famille des poacées.

L’acide nucléique viral est un ARN monocaténaire d’environ 4450 nucléotides, de

polarité positive. L'organisation du génome des Sobemovirus a été récemment mise à jour

avec l'identification d'un nouveau cadre ouvert de lecture (ORF) (Ling et al., 2013). Par

conséquent, le génome du RYMV est organisé en cinq cadres ouverts de lecture (figure 9).

L’ORF1, situé à l'extrémité 5' du génome, code pour la protéine P1 impliquée dans le

mouvement du virus dans la plante et joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau

et al, 1998). ). Cependant, elle n’est pas indispensable à la réplication du RYMV. La protéine

P1 est capable de supprimer l'extinction post-transcriptionnelle des gènes (ou silencing) chez

Nicotiana benthamiana ou chez le riz (Voinnet et al. 1999). L’ORF2a code pour une

polyprotéine, clivée par la suite pour donner une sérine protéase et une protéine virale liée au

génome (VPg). La VPg est impliquée dans la virulence et détermine la capacité à contourner

les gènes de résistance (Hebrard et al., 2006; Pinel-Galzi et al., 2007). Elle est également

impliquée dans l'adaptation du RYMV à l’infection des espèces de riz asiatique ou africaine

(Thiemele et al., 2010). L’ORF 2b, code pour l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRP).

L’ORF3 code pour la protéine de capside (CP) par l'intermédiaire d'une molécule d'ARN

subgénomique, laquelle est un ARN messager à fort potentiel de traduction. En plus de son

rôle de protection du génome virale, la CP est impliquée dans la propagation du virus dans la

plante (Brugidou et al., 1995). L'extrémité 3 'de l'ARN viral n’est pas polyadénylée tandis

que l'extrémité 5' est lié de façon covalente à la VPg (Viral protein genome-linked,) (Hull,

1988; Hull et Fargette, 2005). Le rôle fonctionnel de l’ORFX n’est pas entièrement connu,

mais il semble contrôler la mise en place d'une infection systémique (Ling et al., 2013).

Figure 9 : Organisation génomique du RYMV. Cinq cadres ouverts de lecture (ORF) sont cartographiés sur le génome d’ARN~4450nt. Les ORF et les protéines correspondantes sont comme suit: ORF1 (P1), ORFX, ORF2a (protéase et VPg), ORF 2b (RdRp) et ORF3 (protéine de capside) (Ling et al, 2013).

25

De façon générale, pour construire un virus recombinant réplicatif, il faut d’abord

identifier un gène non essentiel à la réplication, ou conditionnellement nécessaire et remplacer

ce gène non essentiel par le « transgène ». Dans le cas de l’utilisation du RYMV comme

virus réplicatif ou outil amplicon, l’ORF1 codant pour la protéine P1 et l’ORF3 codant pour

la protéine de capside sont des ORF non essentiel à la réplication du virus. Pour la mise en

place de l’outil amplicon l’un ou l’autre de ces deux ORF peut être remplacé par le transgène.

Nous avons privilégié l’ORF3 compte tenu de fort potentiel de traduction (Figure 10).

L’ORF2b et ORF3 se chevauchant, le remplacement de l’ORF3 par le gène d’intérêt conduit à

une protéine fusion contenant la protéine d’intérêt fusionné avec l’extrémité N terminale codé

par la partie chevauchante ORF2b / ORF3.

Figure 10: L’outil amplicon RYMV. L’ORF 3 codant pour la protéine de capside est remplacé par le gène d’intérêt. La protéine d’intérêt sera en fusion car l’ORF2b et l’ORF3 sont chevauchant.

Comme exemples de protéines d’intérêt nous présenterons ici la PSA (Promastigote

surface antigen) de Leishmania infantum agent responsable de la leishmaniose chez l’homme

et l’animal et la C3 une protéine d’intérêt agronomique qui présente une activité d’inhibition

de l’alpha amylase de plusieurs ravageurs du coton et du café, l’amylase étant d’un rôle

majeur pour le mécanisme de digestion chez ces insectes.

Les leishmanioses représentent l'une des six maladies parasitaires majeures et sont

considérées, à ce titre, comme prioritaires par l'Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S).

Le gène de la PSA, codant pour des facteurs de virulence ou de pathogénicité (antigènes) chez

Leishmania infantum , est utilisable pour produire de tels facteurs chez les plantes via un outil

amplicon afin d'élaborer des compositions vaccinales contre les leishmanioses. La production

de cette protéine dans un système eucaryote plante apparait comme un nouveau moyen pour

la production d’un vaccin pour la prévention des leishmanioses chez l'animal et chez l'homme

26

en ce sens que sa production dans des systèmes procaryotes tel que Escherichia coli n’a pas

donnée de résultats concluants.

Anthonomus grandis cause de sévères dommages sur le coton (Haynes et Smith,

1992). Hypotheneumus hampei est responsable sur le café d’une perte annuelle de revenus

d’environ 500 millions de dollars (Barbosa et al., 2010). Oliveira-Neto et al., (2003) ont

démontré qu’ au champ, il y a une activité importante de l’alpha amylase dans le tube digestif

des insectes adultes et des larves. Dias et al. (2005) suggèrent que l’alpha amylase soit une

cible pour le contrôle du charançon A grandis chez le coton à travers une stratégie

biotechnologique. La protéine C3 identifier chez Phasoelus vulgaris présente une activité

d’inhibition de l’alpha amylase. Un gène muté de cette protéine présentant une activité

d’inhibition de l’alpha amylase significativement augmentée inhiberait l’activité amylase de

ces ravageurs et permettrait leur contrôle comme le suggèrent Dias et al. De plus, la protéine

C3 étant originaire d’un plante, cela laisse penser qu’un biosystème plante comme système

d’expression de cette protéine permettrait son expression sous une forme active.

Au regard des connaissances sur les gènes de PSA et de C3, des systèmes d’expression

basés sur les plantes seraient indiqués pour l’expression de PSA et de C3 fonctionnelles et

cela de façon rapide et à faible cout.

27

2. Objectifs du mémoire

L’objectif de cette étude est la mise en place et la validation de système de production

basée sur les plantes des deux protéines qui nous intéressent ici : la protéine PSA et la

protéine C3. Nous chercherons à déterminer si la protéine C3 peut être produite dans un

système plante. Pour la protéine PSA nous nous attacherons dans un premier temps à mettre

en place l’outil amplicon RYMV dans un hôte classiquement utilisé pour ce genre

d’approche, Nicotiana benthamiana. Nous nous intéresserons ensuite à l’hôte riz. Il s’agira de

mettre au point les techniques les plus efficaces pour l’introduction de l’outil amplicon dans

les feuilles de riz. Différents méthodes d’introduction ainsi que différents génotypes de riz

seront considérés. Il s’agira ensuite de valider la méthode d’une part en évaluant la

production de la protéine d’intérêt C3 et d’autre part en caractérisant la multiplication virale.

La protéine C3 d’intérêt agronomique a une activité insecticide contre des ravageurs de la

culture du coton et du café.

L’étude se situe dans le cadre des projets de recherche importants de l’équipe de C.

Brugidou, en collaboration ici avec des chercheurs de l’INERA plus précisément dans le

contexte d’un projet trilatéral Burkina France Brésil. Nos activités de recherche ne consistent

pas en l’implémentation de plantes transgéniques en Afrique mais en la mise en place d’un

système de production transitoire de protéines d’intérêt rapide à faible coût à grande échelle

et dans des conditions de sécurité adéquate pour des partenaires notamment les Brésiliens,

pour qui si l’efficacité de la C3 est prouvée établirons des plantes transgéniques au Brésil. Le

Brésil est un important producteur de café et de coton, cultures pour lesquelles la C3 peut être

un produit de biotechnologie pour le contrôle des ravageurs. Une mutagénèse aléatoire sur le gène codantune protéine provenant de Phaseolus

vulgaris présentant des propriétés d’inhibition de l’alpha amylase a donné 108 variantes de

forme du gène. Trois mutants alpha AIC3, alphaA11 et alpha AIG4 ont montré une

augmentation d’activité d’inhibition hautement significative par rapport à la forme sauvage de

l’alpha amylase chez A. grandis (Oliveira-Neto, et al., 2004). La C3 étant une protéine

végétale, sa production dans un biosystème végétal devrait donner une protéine sous forme

fonctionnelle. L’idée ici est donc de cribler des variantes de C3 issues de la mutagénèse

aléatoire à travers un dispositif permettant de les produire rapidement et à faible coût afin

d’identifier la variante de C3 présentant la meilleure activité d’inhibition de l’alpha amylase

pour guider a terme la production et l’implémentation au Brésil de plantes transgéniques

produisant la forme proteique C3 la plus adaptés. L’outil amplicon RYMV une fois mis en

28

place, permettra une production significativement augmentée non seulement des deux

protéines concernées dans cette étude mais aussi et d’autres protéines d’intérêts dans des

systèmes plantes. L’étude présentée ici initie cette mise en place.

29

3. Matériels et méthodes

3.1 Cadre d’étude L’étude a été réalisée en serre et en laboratoire dans les installations de la station de

recherche de l'INERA basée à Kamboinsé , Centre de Recherches Environnementales,

Agricoles et de Formation (CREAF) de Kamboinsé. Le CREAF, d’une superficie de 230 ha

est situé à 12 km au Nord de Ouagadougou sur l'axe routier Ouagadougou-Kongoussi-Djibo.

Les coordonnées géographiques de la station de Kamboinsé sont Latitude : 12° 28 Nord,

Longitude : 1° 32 Ouest, Altitude : 296 m. Les échantillons étaient constitués de feuilles de riz

(Oryza sativa) et de Nicotiana benthamiana, une espèce apparentée au tabac qui ont été

prélevées 5 jours après introduction du transgène dans les plantes. A leur arrivée au

laboratoire, elles ont été conservées dans un congélateur (-80°C). Les analyses ont été faites

sur la plateforme de Biologie Moléculaire et de Protéomique du LMI (Laboratoire Mixte

Internationale) Patho-Bios (www.patho-bios.com/) hébergée au Laboratoire de Virologie et

de Biotechnologie Végétale (LVBV) situé à l’INERA de Kamboinsé (CREAF).

3.2 Génération des vecteurs d’expression des protéines d’intérêts

3.2.1 La réalisation des constructions génétiques Les gènes d’intérêt dans cette étude sont : un gène muté de l’inhibiteur de l’alpha

amylase qui code pour une protéine à activité insecticide identifiée chez Phaseolus vulgaris,

et le gène de la PSA codant pour l’antigène de surface du promastigote de Leishmania

infantum, agent responsable de la leishmaniose (Figure 11).

Le génome du RYMV a servi à la mise en place de l’outil amplicon dans notre étude. Pour les

tests de fonctionnalité le gène de la PSA est substitué à celui de la capside du virus

(Figure 12). Le gène d'intérêt seul ne pouvant pas s'exprimer dans la cellule végétale, il est

inséré dans des constructions génétiques appelées plasmides.

Les séquences de régulation ajoutées aux trangènes dans cette étude sont d’une part soit le

promoteur35S (pour l’agroinfiltration dans le tabac) ou le promoteur ubiquitine « UBI » (pour

l’agroinfiltration dans le riz) situés en amont des gènes d’intérêts, et d’autre part une séquence

terminateur située en aval, elle signale la fin de la séquence codante. D'autres séquences

peuvent être ajoutées pour notamment cibler le lieu d'accumulation de la protéine dans la

plante. Dans notre cas, nous avons utilisé le peptide de rétention KDEL fusionné au gène de

la C3, qui permet son adressage dans le réticulum endoplasmique (RE) .On a également la

30

présence d’une étiquette histidine (TAG) pour la détection et la purification de la protéine

après la production.

Il convient de noter la présence dans les construits utilisés de gènes marqueurs permettent de

repérer et de sélectionner les cellules ayant intégrées le gène d'intérêt. Il s'agit dans cette

étude de gènes de résistance aux antibiotiques.

Figure 11: description des constructions géniques codant les protéines d’intérêt C3 et PSA. La séquence codant C3 et celle codant la PSA sont encadrées en amont par le promoteur 35S (35S) et en aval par le terminateur 3’nos (NOS).

A

B

C

Figure 12: Construits amplicon RYMV. A : L’ORF 3 codant la CP du virus est remplacé par la partie C terminale de la PSA, l’ORF1 codant la protéine P1 est délété. B : L’ORF 3 codant la CP du virus est remplacé par la partie C terminale de la PSA, l’ORF1 codant la protéine P1 n’est pas délété. Les construits A et B sont encadrés en amont par un promoteur 35S et en aval par le terminateur 35S. B : construction idem à celle B à la différence que cette dernière destinée à être utilisée chez le riz est de ce fait encadré par le promoteur Ubi et un terminateur.

31

Tous ces fragments portant les gènes d'origines différentes, gènes d'intérêt, gènes marqueurs

et signaux, sont intégrés dans des plasmides binaires. On obtient ainsi la construction

génétique qui est multipliée puis utilisée pour l'étape de transformation.

3.2.2 Matériel plasmidique (de départ) : Le vecteur pBin61 Le vecteur pBin61 est dérivé du vecteur pBin19 (Bevan, 1984). Il possède le gène de

résistance à la kanamycine, permettant de sélectionner les bactéries portant les séquences

bordantes gauche et droite (left border et right border) du plasmide Ti mais contient en plus

entre ces bordures une cassette de clonage composée du promoteur 35S du CaMV et du

terminateur 35S du CaMV flanquant un site multiple de clonage (Bendahmane et al., 1999)

(Figure 13).

Figure 13: Vecteur Pbin61

Les construits de départ sont disponibles au LMI dans des Escherichia coli. En effet, les

souches Escherichia coli supportent l’amplification et la propagation des plasmides binaires

32

contenant le transgène d’intérêt. Sur les plasmides, en dehors de l’ADN-T, se trouve un gène

conférant la résistance à la kanamycine, permettant de sélectionner les bactéries

recombinantes.

3.2.3 Extraction d’ADN plasmidique de bactéries Escherichia coli Après 24 heures de culture des bactéries dans un milieu LB (composition en annexe 1.2) sous

agitation à 37°C, les bactéries sont culotées par centrifugation (12 000 rpm pendant 5

minutes). Les plasmides sont extraits à l’aide du kit (High Purify Plasmid Miniprep Kit de

NéoBiotech). L'ADN plasmidique est élué dans 50 μl d’eau autoclavée.

3.2.4 Transformation génétique d’ Agrobacterium tumefaciens par choc thermique

Cette technique est utilisée pour transformer les souches bactériennes agrocompétentes

(annexe 2) d’Agrobacterium tumefaciens. Pour chaque transformation, sur un aliquot

d’Agrobacterium tumefaciens chimio-compétente conservé à - 80°C, 5 μl de miniprep de

plasmide sont ajoutés. Le tube contenant le mélange est décongelé lentement dans la glace.

Un choc thermique de 5 minutes est alors réalisé en plongeant le tube dans un bain-marie à

37°C, puis en le transférant immédiatement dans la glace durant 2 mn. 1 ml de milieu YEP

(annexe 1.3) est ajouté et le tube est mis à incuber à 28-30°C pendant 3h30 mn. Pour terminer,

la suspension est étalée sur un milieu LB solide (en boîte de pétri) contenant les antibiotiques

adéquats après centrifugation 2 mn à 12 000trs/mn et élimination de 800 μl du surnageant.

3.3. Culture bactérienne

3.3.1. Milieux de culture Les souches bactériennes sont cultivées sur différents milieux de culture : le milieu LB

(Luria-Bertani) pour les souches d’Escherichia coli et les souches d’ Agrobacterium

tumefaciens transformées, et le milieu YEP (Vervli et et al., 1975) pour les souches non

transformées d’ Agrobacterium tumefaciens. Les milieux solides sont obtenus par ajout de 15

g/L d’agar avant autoclavage 20 minutes à 120°C.

3.3.2. Antibiotiques de sélection Les antibiotiques sont utilisés pour la sélection d’une souche bactérienne recombinante

particulière, à la concentration finale indiquée dans le tableau 6 après dilution de leur solution

stock préalablement filtrées à 0,2 μm. Les antibiotiques sont toujours ajoutés au milieu après

autoclavage. Dans le cas des milieux solides, ils sont ajoutés lorsque le milieu est en surfusion

(environ 50°C) juste avant de le couler dans les boîtes de pétri.

33

Tableau 6: Concentrations finales d'antibiotiques à ajouter au milieu nutritif en fonction de la souche bactérienne et du plasmide utilisés.

Souche Plasmide Résistance Escherichia coli pBin Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml)

Agrobacterium tumefaciens C58C1

……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) Tetracycline (stock 100mg/ml- final 50ug/ml)

GV3101

……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) Tetracycline ( stock 100mg/ml- final 50ug/ml)

EHA 105 ……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) GV3101 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)

Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml) EHA 105 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)

Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml) EHA 105 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)

Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml)

3.3.3. Cocktail de suppresseurs de gene silencing Face à l’introduction d’acides nucléiques étrangers tels que les acides nucléiques

viraux ou les transgènes dans leur génome, les plantes réagissent par le phénomène de gène

silencing (Figure 14). Pour contourner ce mécanisme de défense, plusieurs protéines virales

ont acquis des fonctions diverses de suppression de gene silencing et de ce fait ont été

nommées « suppresseurs de silencing ». L’effet inhibiteur des protéines virales sur le gène

silencing a été exploité pour améliorer l’expression de protéine d’intérêts dans les plantes.

Une combinaison de différents suppresseurs viraux de gene silencing agissant à

différents niveaux de la voie du silencing permet d’atteindre ce but (Figure 14). La protéine

P19 du Tomato bushy stunt virus (TBSV) a été choisie car classiquement utilisée pour

l’augmentation de l’expression de gène (Garabagi, al., 2012, Lombardi, al., 2009, Voinnet

2003). Elle agit en se liant sélectivement au sRNA de 21nt empêchant leur incorporation sur

le complexe AGO1-RISC. La protéine P1 du Rice Yellow Mottle Virus (RYMV) agit sur les

sRNA de 24 nt et empêche fortement leur accumulation (Hamilton et al., 2002, Voinnet al.,

2002, Lacombe, S et al., 2010). Le suppresseur P0 des Beet western yellows virus (BWYMV)

est également choisi car agissant sur des éléments de la voie du silencing autre que les sRNA.

P0 agit directement avec AGO1 entrainant sa dégradation de ce fait empêche la formation

d’un complexe RISC fonctionnel (Baumberger et al., 2007, Bortolamiol et al., 2007).

34

Les gènes codant ces différentes protéines suppresseur de silencing sont insérés

respectivement dans le vecteur d’expression binaire pBin. Les vecteurs ainsi générés sont

utilisés pour transformer des souches d’Agrobacterium tumefaciens. Les agrobactéries portant

les transgènes d’intérêt sont alors infiltrées dans les feuilles de N. benthamiana en

combinaison avec ce cocktail de suppresseur selon le ratio v:v (construction d’intérêt :

cocktail de suppresseur) (tableau 7)

Figure 14: action du cocktail suppresseur de silencing (Lacombe et al., Soumis)

Tableau 7: ratio de la combinaison suppresseurs/ construction d’intérêt

Transgène porté par l’agrobactérie Transgène d’intérêt P19 P0 P1 Volume d’inoculum (ml) 12 4 4 4

3.3.4. Agroinfiltration L'agroinfiltration est une méthode de transformation des cellules végétales permettant

le transfert d'un ou plusieurs gènes d'intérêt. Cette méthode est nommée ainsi car elle

implique l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens (agro-) introduit de manière

mécanique dans une plante hôte (-infiltration). Lorsque l'agroinfiltation est pratiquée sur des

organes non-reproducteurs (généralement les feuilles) elle résulte en l'expression transitoire

du gène introduit. Celui-ci n'est donc pas transféré à la génération suivante. L'agroinfiltration

35

permet l'expression de gènes recombinants plus rapidement que les méthodes de

transformation des plantes traditionnelles puisqu'elle n'exige pas le développement de

lignées stables.

3.4.1. Agroinfiltration des feuilles de N. benthamiana Les agrobactéries recombinantes sont cultivées en milieu LB additionné des

antibiotiques adéquat à 28°C jusqu’à DO 600 nm égale à 0.5. Elles sont alors centrifugées à

4000 g puis resuspendues dans un même volume de MgCl2 10 mM additionné d’

acétosyringone à 100 µM. Le mélange est laissé à l’obscurité, à température ambiante durant

4-6 Heures ou une nuit. Ensuite on procède à l’agro-infiltration des feuilles de N.

benthamiana à l’aide d’une seringue.

3.4.2. Agroinfiltration des feuilles de Oryza sativa Les feuilles de riz de part leur structure ne se prêtent pas facilement à la technique de

l’infiltration à la seringue. Pour introduire les constructions d’intérêt dans les feuilles de riz

plusieurs méthodes ont été élaborées. L’inoculation directe de l’amplicon dans les feuilles de

riz via Agrobactérium a été réalisée en optimisant les conditions de croissance des plantules

de riz de façon à obtenir les feuilles les plus tendres possible (11ème jour après semis). Nous

avons également inoculé un virus « sauvage » dans le but de favoriser la réplication de

l’amplicon (virus chimérique).

3.4.2.1. Préparation de l’inoculum portant des vecteurs pUbi Les précultures d’agrobactéries ayant subit 48h de croissance en milieu liquide LB à

28 °C sous agitation sont étalées sur des boites AB (composition à mettre en annexe 11) (200

µl par boite), puis incubées pendant 3 jours à 28-30°C. Après développement des bactéries sur

la boite AB qui forment alors une pâte visqueuse sur la totalité de la surface de la boite, les

agrobactéries sont raclées à l’aide d’une spatule plate et transférées dans une solution de

MgCl2 10 mM additionnée d’acétosyringone à 200µM. Le mélange est vortexé (figure 14) ou

fortement secoué jusqu’à homogénéisation. La DO est ajustée à 0,5 puis la solution est

laissée à température ambiante pendant au moins une heure avant l’inoculation.

3.4.2.2. Inoculation mécanique des inoculums viraux Les inoculums viraux correspondent soit à du virus RYMV Ci4 (isolat Côte d’ivoire)

purifié ou soit à des feuilles de N. benthamiana exprimant des constructions amplicon

utilisées comme source d’inoculum . Les inoculums sont préparées dans du tampon phosphate

additionné d’une pincée de carborundum. La méthode d’inoculation par friction manuelle a

été utilisée : le doigt est trempé dans l’inoculum puis on frotte la dernière feuille dégainée.

36

Après inoculation, nous avons procédé à une coupure de la partie apicale de la feuille inoculée

pour ainsi l’identifier..

3.5. Le matériel végétal

3.5.1. Plantes de N. benthamiana N. benthamiana une espèce apparentée au tabac a été utilisée pour les essais

d’expression transitoire des protéines d’intérêt. Les graines de N. benthamiana sont semées

en terreau (Terreau multi usage JARDINOVA) et placées en chambre de culture 12h de

lumière, 12h d’obscurité à 24 °C (Figure 15). Deux semaines après semis, les jeunes plants de

N. benthamiana sont repiqués individuellement dans des pots. Après trois semaines ils ont été

utilisés pour l’expression transitoire de la protéine d’intérêt.

Chambre de culture

Pieds de N. benthamiana

âgés de 2 semaines

Repiquage des pieds de N.

benthamiana

Figure 15: culture des plants de N. benthamiana

3.5.2. Plantes de riz Trois variétés de riz espèce Oryza sativa disponibles au laboratoire de virologie et de

biotechnologie végétal (LVBV) ont été utilisées. Ces variétés ont été choisies en fonction de

leur comportement par rapport au RYMV qui est le virus candidat pour le développement de

l’outil amplicon. Deux d’entre elles sont sensibles au virus , il s’agit d’ IR 64 et BG 90-2 et la

variété Digang est résistante au RYMV. 11 jours après semis, les plants de riz ont été utilisés

pour les tests d’introduction de l’outil amplicon (Figure 16).

Figure 16: Pieds d’Oryza sativa agée de 11 jours

37

3.6. Techniques de biologie moléculaire

3.6.1. Extraction des ARNs au TRIZOL Les ARN totaux sont extraits des tissus végétaux à l’aide de TRIzol ou TRI reagent

(annexe 4). Il s’agit d’une solution monophasique de phénol et d'isothiocyanate de

guanidinium qui solubilise simultanément la matière biologique et dénature les protéines.

Après solubilisation, l'addition de chloroforme provoque une séparation des phases aqueuses

et organiques. Les protéines demeurent dans la phase organique, l’ADN à l'interface, et les

ARN restent dans la phase aqueuse. Par conséquent, l'ARN, l'ADN et les protéines peuvent

être purifiés à partir d'un seul échantillon (d'où le nom TRIzol).

Des mortiers et des pilons sont préalablement stérilisés à 120°C pendant 2 h, ensuite

placés à -80°C pendant une nuit. Les échantillons stockés à -80 °C sont broyés dans les

mortiers froids et repris dans un tube eppendorf de 2 ml (Figure 17) dans lequel on ajoute

1000 μl de TRIzol stocké à 4°C. Le mélange est homogénéisé au vortex. Ensuite 200 μl (1/5

du volume de TRIzol) de chloroforme froid sont ajoutés puis le tout a été homogénéisé, le

mélange est maintenu dans la glace pendant 5 mn. Une centrifugation à 14000 rpm pendant

15 mn à 4°C, a été conduite afin de séparer la phase aqueuse (supérieure) de la phase

organique. Ce surnageant a été transféré dans un nouveau tube Rnase free de 1,5 ml, à

laquelle de l’isopropanol froid (le même volume que le surnageant prélevé) est ajouté. Les

tubes sont alors placés à -20°C pendant une nuit. Le mélange est ensuite centrifugé à 14000

rpm durant 10 mn à 4° C. Le culot contenant l’ARN est lavé à l’éthanol 75% froid puis

récupéré par centrifugation (12000rpm pendant 5 mn toujours à 4°C). Le culot est séché

environ 20 mn sous la hotte puis repris dans 40 μl d’eau Rnase free.

Figure 17: Broyage d’échantillons

3.6.2. Traitement à la DNAse Avant la reverse transcription, les ARN extraits sont traités à la DNase pour éviter

toute contamination avec de l’ADN. Pour ce faire, à 8 μl d’ARN on ajoute 1 μl de DNAse

38

(Promega) et 1μl de tampon DNase 10X. L’ensemble est incubé à 37°C pendant 30 mn. A la

fin de l’incubation, 1μl d’EDTA 50 mM est ajouté suivie d’une deuxième incubation à 65°C

pendant 10min pour stopper la réaction. La concentration en ARN est ensuite mesurée avec

le NanoDrop 2000.

3.6.3. Vérification de la qualité des ARN Pour vérifier si les ARN ne sont pas dégradés, les solutions d’ARN sont migrées sur

un gel agarose 1 % contenant du bromide d’éthidium. Pour se faire, 5 µl d’ARN + 5 µl de

H2O + 3 µl de FDE (composition en annexe 5) sont déposés sur le gel. Après migration à

100 Volts pendant 10 minutes, les ARN sont visualisés sous UV.

3.6.4. Reverse transcription Les ARNs ont été retro-transcrits en ADNc en utilisant la transcriptase reverse M-

MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Rnase H Minus selon les recommandations du

fournisseur Promega. Afin de mettre en évidence une réplication de l’outil amplicon RYMV

deux types de synthèse d’ADNc ont été réalisés. La première avec des amorces oligo dT (10

μM) uniquement. Et la seconde en utilisant un mélange des amorces oligo dT (10 μM) et P3

(10 μM) spécifique de la PSA (figure 8 plus haut dans la partie synthèse biliographique).

L’amorce reverse P3 s’hybride sur l’ARN au niveau de la séquence de PSA permettant ainsi

la mise en évidence la réverse transcription spécifique de l’amplicon.

Le mélange d’ARN et d’amorces est incubé à 70°C pendant 10 mn ce qui permet

d’une part une dénaturation des ARN qui prennent alors une forme linéaire et d’autre part une

hybridation des amorces sur les molécules d’ARN. 5 μl du mélange ARN-amorce est prélevé

et ajouté à 20 μl de mix RT (tableau 8). L’ensemble est porté à 42°C pendant 60 min pour la

réaction de reverse transcription proprement dite. A cette température, la reverse transcriptase

est à son optimum d’activité et permet la synthèse d’ADNc. 2.5 μl ADNc sont utilisés pour

la réaction de PCR.

39

Tableau 8: mélange réactionnel pour la reverse transcription Concentration

initiale Concentration

finale Volume

H20 12,75

dNTP 10 mM 400 µM 1

Tampon RT M-MLV RT RNase

Promega

5X 1X 5

RNase Inhibitor Promega

40 U/µl 1U/µl 0,5

M-MLV RT RNase H Minus DNA

polymerase Promega

200 U/µl 4 U/µl 0,75

3.6.5. Amplification des ADNc par PCR La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR est une méthode d’amplification génique in

vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'une faible quantité d’acide nucléique (quelques

picogrammes), d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur

définie. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double

brin d'ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les

extrémités 3’ pointent l'une vers l'autre. Elles définissent alors, en la bornant, la séquence à

amplifier. La méthode consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme

matrice pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est

exponentielle. Les amplifications PCR ont été conduites dans un thermocycler (Bio Rad)

Afin de disposer d’un contrôle interne de la quantité d’ARN, une PCR de 35 cycles a été

effectué avec les amorces eIF1α Forward et eIF1α Reverse (tableau 9). Ces amorces

amplifient un gène de ménage exprimé de façon constitutif dans les cellules végétales. Le

gène Eif1α code pour un facteur d’élongation impliqué dans la synthèse des protéines

(Sturzenbaum and Kille 2001). Après amplification, 14 μl de produit PCR eIF1α est déposé

sur un gel agarose 1.5% contenant du bromide d’éthidium et observé sous UV.

40

Les amorces PSA8 et P3 (Tableau 8) sont utilisées pour une amplification PCR de 25 cycles

afin de mettre en évidence les différents niveaux de transcription du gène de la PSA. Ces

amorces ont été choisies à partir de la région C-terminale du gène de la PSA. Les volumes

d’échantillons ajustés grâce à la PCR eIF1α sont déposés sur un gel agarose 1.5% contenant

du bromide d’éthidium. Les amplifications PCR-PSA sont alors observées sous UV.

De façon générale, les réactions sont réalisées dans un volume de 50 μl contenant : 10 μM de

chaque amorce sens et antisens (Reverse et Forward), 10 mM de dNTP, 10μl de tampon

d’activité polymérase 5X, 0.2 μl (200 U/µl) de Taq DNA polymerase et de 2.5 μl d’ADNc

matrice. La réaction débute par une étape de dénaturation de l’ADN à 94°C pendant 5 mn.

Cette étape permet de : déshybrider les ADNc double brin, d’éliminer les structures

secondaires, d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique et de dénaturer

d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution. Elle est suivie de 25 à 35 cycles

comprenant chacun une étape de dénaturation (94°C pendant 30 secondes), une étape

d’hybridation (58°C pendant 30 secondes) et une étape d’élongation (72°C pendant 45

secondes). L'hybridation des amorces au niveau des séquences complémentaires des ADN

matrices s’effectue à une température optimale permettant un appariement spécifique. Cette

dernière dépend de la température de fusion Tm (c’est la température à laquelle la moitié de

l’ADN est sous forme monobrin et l’autre moitié sous forme double brin.) des deux amorces

déterminée par leur longueur, leur teneur en base purique, et la concentration en ion Na du

milieu réactionnel.

Pour un oligonucléotide de taille comprise entre 14 et 20 nucléotides, le calcul du Tm

est : Tm = (wA+xT) x 2 + (yG+zC) x 4 où w, x, y et z sont le nombre de nucléotides A, T, G

et C respectivement.

Pour un fragment plus long (plus de 20 nucléotides), le calcul recommandé du Tm est: Tm =

81,5 + 16,6(log10 (Na+)) + 0,41(%G + %C) - (675/N). Où N est le nombre total de

nucléotides et (Na+) la concentration en sodium du milieu d’hybridation.

Si la température du milieu réactionnel est supérieure au Tm, l’ADN et l’oligonucléotide ne

s’hybrideront pas. Ils resteront sous forme monobrin. Si la température est égale (en pratique

légèrement inférieure) au Tm, il y aura hybridation spécifique, c’est à dire à l’endroit de la

séquence cible qui est complémentaire de l’oligonucléotide. Si la température est très

inférieure au Tm, il y aura hybridation sur la séquence complémentaire mais aussi hybridation

non spécifique, c’est à dire à des endroits de la séquence cible qui ne sont pas parfaitement

complémentaires à l’amorce.

41

L’étape d'élongation permet la synthèse du brin complémentaire par la Taq DNA polymerase

à 72°C. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présent dans le milieu réactionnel. La

durée de cette étape dépend de la longueur de l’amplicon. Une fois ce premier cycle terminé,

le second commence et ainsi de suite jusqu’à atteindre le nombre de cycles nécessaires pour

l’amplification désirée.

La PCR débute à 94°C pendant 5 mn pour dénaturer l’échantillon et activer l’enzyme. La

dénaturation est suivie des cycles d'amplification (30 secondes à 94°C, 30 secondes à la

température d’hybridation des amorces, puis 45 seconde à 72°C), avant de terminer par 10

minutes à 72°C (élongation finale). Les amorces utilisées sont décrit dans le tableau suivant:

Tableaux 9: Détails sur les différentes amorces Amorces Séquence Amplicon Tm

eIF1 F (tabac) 5’- CCTTGGTCAGCTAGAAGAGGCA-3 650 pb 58°C

eIF1 R (tabac) 5’- AGTAGCTCACCAATTAGACGGA-3’ eIF1 F (riz) 5’- GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’

400 pb 58°C eIF1 R (riz) 5’- AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT -3’

PSA8 5’- TGCTGGTGCGGACTGC-3’ 196 pb 58°C

P3 5’- CAGGCACGTCTTCTCGTCCGTC -3’

Oligo dT (20) 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

3.6.6. Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode en biologie moléculaire pour

séparer l'ADN ou l'ARN en fonction de leur taille. Cette technique est basée sur la séparation

des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette

séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles

se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

Le premier facteur affectant la migration est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation

se fait en fonction de sa taille. Toutefois la conformation de l'ADN est aussi importante. Pour

éviter les problèmes liés à cette conformation, seul l’ADN linéaire est séparé sur ce gel (ADN

amplifié par PCR ou encore de l'ADNc). L'augmentation de la concentration d'agarose dans

un gel réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite

taille.

42

Selon la taille des produits d’amplification PCR et pour une meilleure résolution les

produits PCR sont séparés sur un gel d’agarose 1.5% contenant du bromure d’ethidium (BEt).

Nous n’avons pas eu avant le dépôt des échantillons d’ADN à additionner du tampon de

charge car le tampon d’activité polymérase 5X fait également office de tampon de charge.

Lors de la migration, le gel d’agarose, immergé dans du tampon TAE 0,5X (annexe 6), est

soumis à un champ électrique de 100 V (environ 10V/cm) pendant 20 minutes. La taille

approximative des produits PCR est déterminée grâce à un marqueur de taille ayant migré sur

le gel en même temps que les échantillons (1kb DNA ladder de Promega).

La méthode de révélation utilisée est la révélation au bromure d'éthidium ou BEt. Il

s’agit d’un intercalant couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique en biologie

moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec

une couleur rouge-orangée plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. Après migration des produits

PCR dans le gel contenant du bromure d’éthidium, les ADNc amplifiés sont observés sous

UV (λ = 254 nm).

43

Vortex Centrifugeuse

Table UV Cuve d’électrophorèse

Thermocycleurs

Figure 18: Quelques matériels de biologie moléculaire

44

3.7. Techniques de protéomique

3.7.1. Extraction de protéines de feuilles de N. benthamiana Les tubes sont préparés la veille et placés à -20°C. Les feuilles de N. benthamiana

récoltées et conservées au -80°C sont broyés dans des mortiers stériles préalablement lavés à

l’eau de Javel et passés pendant 2 h au four à 120°C. Les échantillons sont broyés de manière

à obtenir la poudre la plus fine possible et sont rapidement récupérés dans les tubes froids.

200 à 400 μl de tampon d’extraction sont ensuite ajoutés. Le mélange est centrifugé (figure 18

plus haut) à 4°C à 12000 rpm pendant 30 mn. Le surnageant contenant la fraction protéique

est récupéré dans un nouveau tube et conservé au -20°C.

3.7.2. Détection immunologique des protéines Par Western Blot Le western blot est une technique permettant de détecter une protéine spécifique dans

un échantillon donné. Elle utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions

dénaturantes pour séparer les protéines, selon leur taille. Les protéines sont ensuite transférées

du gel sur une membrane. Celle-ci est incubée avec un anticorps spécifique de la protéine

d'intérêt. Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un

extrait et d'évaluer sa taille apparente.

La technique de l'électrophorèse permet de séparer les protéines selon leurs poids

moléculaires apparents et consiste en la migration de protéines dénaturées chargées placées

sous l'influence d'un champ électrique, ceci se faisant au travers d'un gel de polyacrylamide en

présence de sodium dodécylSulfate (SDS). On parle alors de SDS-PAGE : SDS

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.

3.7.2.1. Préparation du gel d’acrylamide SDS – PAGE Le réseau de polyacrylamide est formé par polymérisation de monomère d'acrylamide

en présence de petite quantité de bis acrylamide (NN'méthylène-bisacrylamide) laquelle

polymérisation est catalysée par deux agents chimiques que sont l’ammonium persulfate 10

% (10g dans 100ml) et le TEMED. Le taux de réticulation, qui correspond à la porosité du

gel, dépend de la concentration et du ratio acrylamide/bis-acrylamide. Nous avons utilisé un

gel à 15% d’épaisseur 1,5 mm pour notre analyse .Le gel SDS – PAGE est formé de deux

compartiments : le gel de concentration qui est à 5%, les échantillons se concentrent jusqu'à

obtention de zones protéiques très fines et le gel de séparation à 15 % où a lieu la séparation

proprement dite de la protéine étudiée (C3). Le passage de l'une à l'autre se fait avec un

changement de pH caractérisé par l’utilisation de deux Tris HCl différent le Tris HCl 1.5 M

pH 8.8 pour le running gel et le Tris HCl 1 M pH 6.8 pour le stacking gel et par

45

l’augmentation de concentration en acrylamide du gel (5% ET 15%). Du SDS 20% est

additionnée à chaque type de gel à un volume de 50 µl et 15 µl respectivement pour le

running gel et le stacking gel. Après avoir fait le montage des plaques, le running gel est

bien mélanger sur un agitateur magnétique puis il est rapidement coulé à l’aide d’une

pipette. On recouvre ensuite le gel coulé de butanol-1 pour écraser les bulles d’air formées à

l’interface gel-air et favoriser une bonne polymérisation. Après 30 mn d’attente, le butanol

est entièrement enlevé à l’aide d’un papier Watmann. On mélange bien le stacking gel qui est

coulé sur le running gel. Enfin un peigne servant à la formation des puits de dépôt est

délicatement placé dans le stacking gel. Après 30 mn d’attente le gel est prêt et peut être

utilisé pour la migration il peut aussi être conservé à 4°C jusqu’au lendemain. L’ensemble des

réactifs utilisés se trouve au LMI à 4°C. (Composition des gels en annexe 10)

3.7.2.2. Préparation des échantillons 30 μl d’échantillon protéique sont additionnés de 10μl tampon de charge 4X (annexe

12). Ce tampon donne une densité à l'échantillon lui permettant d'être déposé facilement au

fond des puits. L’ensemble est porté à 100 °C pendant 5 à 10 mn pour être dénaturé. Après

dénaturation les tubes sont rapidement mis dans la glace.

3.7.2.3. Dépôts des échantillons Le tampon de migration 1X est préparé à partir du TG SDS 10X. Le gel est ensuite

mis dans la cuve rempli du tampon de migration, cela permet au gel de prendre la même

température que le tampon. Le peigne est délicatement enlever. Les échantillons sont pulsés

puis déposer délicatement dans les puits. Dans le premier puits est déposé le marqueur de

taille (Prestained Protein Molecular Weight Marker de Euromedex)

3.7.2.4. Migration Le gel est mis à migrer en cuve d’électrophorèse dans le tampon de migration TG

SDS 1X (annexe 8). Une migration à 80 Volts est d’abord effectuée puis une fois les

protéines dans le gel de migration, le voltage est augmenté jusqu’à 100V pendant 1h30.

46

3.7.2.5. Transfert Le principe du transfert est le même que l'électrophorèse. Les protéines, après

séparation, sont toujours entourées de SDS et donc sous l'influence d'un champ électrique, les

protéines vont migrer de la cathode vers l'anode. Un « sandwich » est effectué avec 4 papiers

watmann, 2 éponges + la membrane de nitrocellulose coupés à la taille de du gel (Figure 19).

« Le sandwich » est mis dans la cuve contenant le tampon de transfert (annexe 12). Le

transfert est effectué pendant 1H à 100 Volts et au froid (4°C). On se base sur le marqueur de

taille coloré présent initialement sur le gel pour observer l’état du transfert.

Anode (+)

Cathode (-)

Figure 19: détails du montage de transfert

3.7.2.6. Révélation Après le transfert, la membrane est récupérer et déposée dans une petite boîte

d’environ 20 ml de contenance. On procède au Blocage de la membrane avec du lait de

commerce écrémé (3%) dilué dans du TBSt pH 7,5 (annexe 13) 1h sous agitation. La solution

de blocage est retirée puis la membrane est incubée avec un 1er anticorps pendant 1h sous

agitation, un anticorps anti C3 produit dans du lapin cet anticorps à été conçu pour reconnaitre

la fraction beta de la protéine C3. Avant incubation, l’anticorps est dilué 1/2000 dans une

nouvelle solution de blocage. La solution de blocage contenant l’anticorps anti C3 est ensuite

vidée et la membrane est rinc 6 fois pendant 5 mn avec du TBSt pH 7,5. On procède ensuite à

l’incubation pendant 1h avec le 2ème anticorps conjugué dilué dans du tampon de blocage.

L'anticorps secondaire est un anti-IgG de lapin commercial (sigma) qui est conjugué de

manière covalente à la HRP ((HorseRadish Peroxidase). Son activité enzymatique pourra être

Sens de migration

47

détectée sur un film radiographique. Au bout d’une heure la membrane est rincée 6 fois

pendant 5 mn avec du TBSt pH 7,5 puis récupérée et déposée sur un film transparent. La

membrane est recouverte de 2 ml de solution de détection / membrane (ECL Prime Western

Blotting Detection Reagent) et enveloppée dans le film transparent. A l’obscurité un film

radiographique est déposé sur la membrane en prenant soin de noter sur la membrane

l’échelle de taille correspondant au marqueur. 5 min après le film radiographique est

récupéré . puis trempé successivement dans le révélateur et le fixateur durant 30 sec. Le film

est ensuite rincé à l’eau et analysé après séchage..

3.4. Destruction des bactéries recombinantes et des plantes transformées après expérimentation Après prélèvement des feuilles transformées, les pieds de riz et de N. benthamiana sont

arrachés et incinérés (Figure 20). Après l’agroinfiltration, le reste de bactéries recombinantes

est récupéré dans une bouteille en verre puis autoclavé à 120°C pendant 2h. Après

refroidissement de l’eau de javel est additionné et le tout est jeté à l’évier.

Figure 20 : Incinérateur

48

4. Résultats

4.1. Expression de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana Cette manipulation a pour objectif de déterminer si la protéine C3 peut être produite et

s’accumuler dans un système plante. Cette protéine étant originaire d’une plante ( Phasoelus

vulgaris), son expression dans un système plante parait adaptée. Un cocktail de suppresseur

de gene silencing optimisé est co-infiltré dans les feuilles de N. benthamiana dans le but de

bloquer au mieux le mécanisme ce défense de la plante. Un peptide KDEL est fusionné au

gène de la C3, dans l’optique de permettre son adressage dans le Réticulum Endoplasmique

(RE) afin d’augmenter potentiellement le rendement.

4.1.1. Production de plants de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI

N. benthamiana une espèce apparentée au tabac est classiquement utilisée pour les essais

d’expression transitoire de protéines d’intérêt. Les graines de N. benthamiana sont semées en

terreau (Terreau multi usage JARDINOVA fabriqué en France EMB 44179B) et placées en

chambre de culture (12h de lumière, 12h d’obscurité à 24 °C). Deux semaines après semis, les

jeunes plants de N. benthamiana sont repiqués individuellement dans des pots. Après trois

semaines , ils sont utilisés pour l’expression transitoire de la protéine d’intérêt. Les conditions

de culture mises en place au cours du stage ont permis d’obtenir des pieds de N. benthamiana

qui présentent une croissance végétative assez satisfaisante. Les pieds de N. benthamiana

issus du dispositif se sont bien prêtés à l’agroinfiltration (Figure 21) tant en terme de facilité

et d’efficacité d’infiltration.

Pieds de N. benthamiana de cinq semaines

Agroinfiltration d’une

feuille de N.benthamiana

Patch formé lors d’une

agroinfiltration

Figure 21: Pieds de N. benthamiana aptes à l’agroinfiltration

49

4.1.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana

Deux clones indépendant correspondant à un même mutant du gène inhibiteur de

l’alpha amylase de Phaseolus vulgaris sont insérés dans des constructions pBin sous un

promoteur 35S ; 35S :: C3.1 et 35S :: C3.2. Les gènes de ces deux clones sont fusionnés à un

peptide KDEL pour l’adressage de la protéine dans le RE. Une construction pBin vide est

utilisée comme contrôle négatif. Chaque construction est infiltrée dans les feuilles de plantes

de N. benthamiana âgées de 5 semaines en combinaison avec le cocktail de suppresseur

(35S :: P19 + 35S :: P0 + 35S :: P1) sous un ratio suppresseurs : construction de 1 :1 (V :V) (

Figure 10). Deux feuilles par plante et quatre plantes par traitement sont utilisées. Les tissus

infiltrés sont prélevés 5 jours après infiltration.

Tableau 10 : Les différents traitements utilisés Traitement 1 pBin vide + P19+ P0+P1

Traitement 2 C3.1 + P19+P0+P1

Traitement 3 C3.2 + P19+P0+P1

Les protéines de tissus infiltrés sont extraites selon le protocole décrit dans la section

matériel et méthode. Les protéines sont séparées selon leur taille par migration en gel SDS-

PAG puis visualisées par coloration du gel au bleu de coomasie, (Figure 22). La protéine

d’intérêt produite est également mise en évidence par une approche basée sur

l’immunodétection par western blot (Figure 22).

L’analyse SDS-PAGE des extraits de protéine des tissus infiltrés avec les deux clones

de la C3 fait apparaitre une bande apparente de 28 kDa, taille comparable à la protéine C3

native. La révélation de cette bande protéique par un anticorps anti C3 confirme

l’accumulation de C3 dans les feuilles de N.benthamiana traitées. En plus de la bande

apparente correspondant à la protéine d’intérêt, on observe sur le gel SDS-PAGE deux

fractions protéiques d’environs 14 et 19 kDa. Pour ce qui est de ces deux fractions

protéiques, l’immunodétection par western blot ne met en évidence que la seule bande de 14

kDa. En ce qui concerne l’échantillon correspondant au témoin pBin aucune bande apparente

aux tailles de 28, 19 et 14 kDa n’est discernable sur le gel SDS-PAGE. De plus l’analyse

Western blot par anticorps dirigé contre la protéine C3 qui est plus spécifique qu’une

50

coloration au bleu de coomassie ne révèle aucune bande d’expression pour le contrôle.

(Figure 22)

L’ensemble de ces résultats indique clairement que la protéine C3 a été produite et

s’accumule dans les feuilles de N. benthaminana exprimant les constructions C3 dans les

conditions utilisées ici.

Gel acrylamide SDS-PAGE 15 %coloré au bleu de coomassie

Film radiographique: Détection de C3 avec un Ac anti C3

Figure 22: production de C3 dans les feuilles de N.benthamiana. Les premières lignes représentent le marqueur. Les lignes pBin correspondent aux témoins négatifs et les lignes C3.1 et C3.2 aux échantillons tests. A gauche on a la séparation des extraits protéiques par SDS-PAGE 15% colorées au leu de coomassie. Les bandes protéiques sont observées. A droite on a la photo de la détection spécifique de la C3 à l’aide d’un anticorps anti C3. La taille des bandes d’intérêt est indiquée dans les flèches

4.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de N. benthamiana et de riz

4.2.1. Expression de l’amplicon RYMV dans les feuilles de N. benthamiana N. benthamiana n’est pas un hôte naturel du RYMV sur lequel on s’est basé pour la

construction de l’outil amplicon mais est une espèce classiquement utilisée pour la

production de protéines recombinantes car se prêtant bien à l’agroinfiltration. L’objectif de

cette partie est de déterminer si l’amplicon RYMV est capable d’initier une réplication lorsqu’

il est exprimé de façon transitoire dans les feuilles de N. benthamiana . Pour se faire la partie

C-terminale de la PSA est insérée dans 3 types de construction amplicon sous promoteur

35S :

50kD

34kD

26kD

19kD

28 kDa

19 kDa

14 kDa

28 kDa

14 kDa

35kD

25kD

15kD

10kD

pBin C3.1 C3.2 pBin C3.1 C3.2

51

- 35S :: amplicon PSA : cette construction est délétée de l’ORF1 codant la protéine P1 et de

l’ORF3 codant la CP,

- 35S : P1 amplicon PSA : cette construction est délestée de l’ORF3 codant la CP.

- Une construction 35S ::PSA sans environnement amplicon est utilisée comme contrôle

caractérisant l’expression sous la dépendance du promoteur 35S seulement.

Une construction pBin vide est utilisée comme contrôle négatif. Chaque construction est

infiltrée dans les feuilles de N. benthamiana agées de 5 semaines en combinaison avec le

cocktail de suppresseur (P19 + P0 + P1) sous un ratio suppresseurs : construction 1 :1 (v : v)

(tableau 11). Deux feuilles par plante et quatre plantes par traitement sont utilisées. Les tissus

infiltrés sont prélevés cinq jours après infiltration.

Tableau 11: Les différents traitements utilisés Traitement 1 pBIN + P19+ P0+P1

Traitement 2 35S: PSA + P19+P0+P1

Traitement 3 35S:amplicon PSA + P19+P0+P1

Traitement 4 35S P1 amplicon PSA + P19+P0+P1

L’ARN a été extrait selon le protocole d’extraction au TRIzol puis traité à la DNAse

selon les recommandations du fournisseur (RQ1, Promega).

Deux types de reverse transcription se différenciant par les oligonucléotides utilisés sont

effectués à l’aide de la RT MLV (promega). Une première reverse transcription est effectuée

avec l’oligodT. La solution de cDNA obtenue représente la population d’ARNm polyA. En

cas de réplication de l’amplicon viral, les ARN viraux ne sont pas représentés dans cet

échantillon puisqu’ils ne sont pas polyadénylés. La deuxième reverse transcription est

effectuée avec une combinaison d’oligodT et d’amorce P3 spécifique de la séquence de la

PSA et par conséquent de l’ARN viral. La population de cDNA ainsi obtenue représente les

ARNm poly A ainsi que les ARN viraux en cours de réplication non polyadénylé mais portant

la séquence de la PSA.

Un gène endogène connu pour présenter une expression constitutive, le gène eIF1 sert de

contrôle interne puisque la RT-PCR sur ce gène doit être similaire pour chaque échantillon.

L’accumulation d’ARN portant la partie PSA est évaluée par PCR avec les 2 amorces PSA8

et P3.

52

4.2.1.1. Qualité des ARN extraits La migration des ARN totaux extrait au TRIzol sur un gel agarose 1% (Figure 23)

ainsi que le dosage au Nanodrop 2000 (tableau 12) ont montré que les ARN étaient de bonne

qualité. Pour tous les quatre échantillons, de claires bandes correspondant aux ARN

ribosomaux 28S et 18S ont été observées après migration sur gel contenant du bromide

d’éthidium . L’observation de la fluorescence sous rayons UV montre que lesARN extraits

n’ont pas été dégradés (Figure 23).

N° Echantillon 1 pBIN 2 35S :: PSA 3 35S:: amplicon PSA 4 35S:: P1 amplicon PSA

Figure 23 : Vérification de la qualité et la quantité des ARN extraits par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 1% dépôt de 5 µl sur 45 µl

Tableau 12 : Dosage au Nanodrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase N° Echantillon Concentration en ARN A260 A280 A260/280 1 pBIN 909,6ng/µl 22,739 14,105 1,61 2 35S Cterm PSA 993ng/µl 24,824 15,587 1,59 3 35S: amplicon Cterm 817ng/µl 20,425 12,703 1,61 4 35S: P1 amplicon Cterm 502ng/µl 12,549 7,953 1,58

* A260 = absorbance à 260 nm * A280 = absorbance à 280 nm

4.2.1.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des échantillons pour le dépôt de produits PCR

L’amplification du gène eiF1α par PCR a servi de contrôle interne pour la reverse

transcription mais aussi d’indicateur de la quantité de produit PCR à déposer sur le gel afin de

mettre tous les échantillons dans les mêmes conditions. La présence d’une bande à la taille

attendue (650 pb) pour chaque échantillon indique que la reverse transcription a bien eu lieu

(Figure 24). Par ailleurs, pour tous les échantillons, on observe également que ces produits

d’amplification présentent une intensité sensiblement égale (Figure 24). Cela montre que les

1 2 3 4

28S

18S

53

quantités de produits PCR déposés ont permis de mettre les échantillons dans les mêmes

conditions c'est-à-dire qu’on est parti d’une quantité comparable d’ARN totaux de départ pour

chaque échantillons.

N° Echantillon 1 pBIN 2 35S Cterm PSA 3 35S: amplicon Cterm 4 35S: P1 amplicon Cterm

Figure 24: RT-PCR eIF1α. RT-PCR effectuée sur chacun des échantillons de cDNA produit à partir d’un oligonucleotide oligodT (partie haute) ou un mélange d’oligodT et d’oligonucleotide P3 (partie basse). L’identité des échantillons est notée dans le tableau, la taille du produit d’amplification est indiquée.

4.2.1.3. Niveau d’accumulation des différents construits PSA Quand les transcrits de l’amplicon sont exprimés de façon transitoire dans les feuilles

de N. benthamiana, le gène de l’amplicon est d’abord transcrit en ARNm polyadénylé sous

l’effet du promoteur 35S. Si le processus de réplication a lieu, l’ARNm non polyadénylé

complémentaire est synthétisé grâce à l’ARN-polymerase-ARN-dépendant qui utilise l’ARN

génomique comme modèle pour la synthèse du brin complementaire. De nouveaux ARN

génomique et subgénomique sont synthétisés conduisant à une accumulation d’ARN viral non

polyadénylé dans la cellule. Dans le cas de réplication, on retrouve donc dans les cellules

exposées au construit amplicon deux types d’ARN PSA ; les ARN PSA issus de la

transcription sous 35S qui sont poly A et ceux issus de la réplication du virus non poly A. De

façon générale, aussi bien sur la reverse transcription effectuée avec les oligodT que sur celle

1 2 3 4

1 2 3 4

Oligo dT

Oligo dT + P3

650 pb

650 pb

54

effectuée avec une combinaison d’oligodT et d’amorce P3 spécifique de l’ARN viral,

l’amplification du gène PSA a montré des bandes à la bonne taille (192 pb) pour tous les

échantillons sous environnement PSA par contre, sur l’échantillon 1 (témoin négatif) ,

aucune bande n’a été révélée à cette taille (Figure 25). L’échantillon 2 (35S :: PSA) présente

l’intensité de bande la plus élevée après migration des produits PCR sur gel d’agarose

contenant du BEt alors que l’intensité de fluorescence pour les échantillons représentant les

amplicons (3 et 4) s’est montrée très faible. L’intensité de la fluorescence étant

proportionnelle à la concentration de cDNA cible (cDNA PSA) contenue dans l’échantillon et

par conséquent de la quantité de ARN de PSA polyadénylé et viral non polyadénylé

accumulée dans les feuilles de N. benthamiana, on peut donc conclure que dans l’échantillon

2 où il n’y a que des ARN polyadénylé il y eu plus d’accumulation de ARN PSA que dans les

échantillons 3 et 4. Ces deux échantillons sont sous environnement amplicon. L’accumulation

des ARN PSA sans l’outil amplicon RYMV est donc plus importante lorsqu’ils sont

exprimés dans les cellules de N. benthamiana.

4.2.1.4. Effet de la P1 sur l’accumulation de la PSA Non indispensable à la réplication du RYMV la protéine P1 est capable de supprimer

l'extinction post-transcriptionnelle des gènes et est impliquée dans le mouvement du virus

dans la plante. Elle joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau et al, 1998). La

présence du gène codant cette protéine sur un des construits est supposée mettre le virus

recombinant dans les conditions propices d’infection. Sur les pieds de N. benthamiana

soumis aux construits sous environnement amplicon (35S :: amplicon PSA (3) et 35S :: P1

amplicon PSA (4)), l’intensité des bandes est sensiblement identique (Figure 25). La P1 n’a

donc pas eu d’effet majeur sur la réplication du virus dans les cellules de N. benthamiana ce

qui s’est traduit par une accumulation des ARN de PSA similaire à celle observée avec le

construit délété de la P1 que ce soit pour les cDNA oligodT ou oligodT + P3.

4.2.1.4. Réplication de l’amplicon Dans les feuilles transformées avec les construits amplicon, il y a transcription dans un

premier temps du gène de l’amplicon en ARNm sous l’effet du promoteur 35S. Les ARNm

sont traduits par la machinerie cellulaire en protéine parmi lesquelles on compte l’ARN

polymérase-ARN-dépendante virale codée par l’ORF2b de la construction amplicon. Si elle

trouve un environnement cellulaire propice à la réplication virale, cette dernière permet la

transcription du brin négatif du virus pour conduire à la mise en place de l’ARN viral double

brin. Cela aboutira à la multiplication de l’ARN viral qui prendra le dessus pour l’expression

55

de protéines virales et conduira à la multiplication du virus donc à la production d’ARN viral

génomique et subgénomique non polyadénylé (Figure 8 plus haut dans la partie revue

bibliographique). En conséquence, la présence d’ARN viral non polyadénylé indiquera que la

réplication de l’amplicon a bien lieu. L’hypothèse ici est que la présence d’ARN viral non

polyadénylé rend compte de la réplication de l’amplicon dans les feuilles infiltrées. Pour

vérifier cela on compare l’amplification du gène de PSA sur les populations de cDNA issus

de la reverse transcription avec oligo dT représentant les ARNm à celle issue de la reverse

transcription oligo dT+P3 représentant les ARNm ainsi que les ARN viraux non polyA si ils

existent. Cette comparaison pour le contrôle 35S : PSA présente une même intensité pour les

deux types de reverse transcription ce qui est en accord avec le fait que dans cet échantillon

l’ensemble des ARN PSA sont polyA. L’intensité d’amplification sur les échantillons cDNA

issus de la RT oligo dT + P3 est plus élevée comparativement à celle des échantillons cDNA

issu de la RT oligo dT pour les échantillons 3 et 4 sous environnement amplicon (figure 25).

Au regard du profil du contrôle 35S :: PSA pour les deux type de reverse transcription

(similarité des amplifications des deux retrotranscriptions), cette disparité importante de

niveau d’amplificationn’est pas le fait de l’usage de l’amorce P3 mais tient surtout du fait

d’une augmentation d’ARN de PSA retro transcrit dans les construits amplicon. Cela

témoigne de la présence spécifique d’ARN de PSA non polyA dans les échantillons

amplicons. Ce qui suggère que l’outil amplicon RYMV a pu initier une réplication lorsqu’il a

été exprimé de façon transitoire dans les feuilles N. benthamiana.

4.2.1.5. Amplifications aspécifiques Il est également à noter la présence d’une amplification aspécifique (Figure 25) sur les

produits PCR oligodT + P3 autour de 250 pb. Cette amplification que l’on retrouve sur tous

les échantillons sous environnement PSA (échantillons amplicon ou non) est aussi présente

sur le témoin négatif. Les amorces PSA8/P3 se seraient donc hybridées à d’autres séquences

que celle cible de la PSA.

56

N° Echantillon 1 pBIN 2 35S Cterm PSA 3 35S: amplicon Cterm 4 35S: P1 amplicon Cterm

Figure 25: RT-PCR PSA RT-PCR effectuée sur chacun des échantillons de cDNA produit à partir d’un oligonucleotide oligodT (partie haute) ou un mélange d’oligodT et d’oligonucleotide P3 (partie basse). L’identité des échantillons est notée dans le tableau, la taille du produit d’amplification est indiquée.

4.2.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz Nous avons démontré plus haut qu’il y a eu une réplication de l’amplicon dans cellule

de N. benthamiana mais cette réplication n’est pas efficace en termes de rendement. Le

RYMV infecte le riz comme hôte naturel, ce qui nous conduit à l’hypothèse selon laquelle

l’outil amplicon RYMV s’il est exprimé dans son hôte naturel pourrait retrouver des

conditions propices à sa réplication. Pour cela plusieurs techniques d’introduction de l’outil

amplicon dans les feuilles de riz ont été considérées en prenant en compte différents

génotypes de riz (des variétés sensibles et tolérantes). Cela permet du même coup d’identifier

le type de variété qui se prête le mieux à l’introduction de l’outil. Dans ce cas nous avons

utilisé une construction amplicon contenant l’ORF1 codant la P1, la construction étant sous

promoteur Ubi. (Figure 12 du matériel et méthodes)

Les tests d’introduction de l’outil ont été effectués sur trois types de variété de riz ;

deux variétés sensibles IR 64 et BG-92.1 et une variété tolérante appelé Digang. Quatre

méthodes d’introduction ont été utilisées (Tableau 13). Les ARN totaux ont été extraits au

TRIzol puis nous avons effectué une reverse transcription avec une combinaison d’oligodT et

d’amorce P3 spécifique de l’ARN viral, cette dernière au cours de réplication du virus

1 2 3 4

1 2 3 4

Oligo dT

Oligo dT + P3

192 pb

192 pb

57

n’étant pas polyA la combinaison d’amorce permet la détection des ARN PSA poly A issus

de transcription guidée par le promoteur Ubi et des ARN PSA non poly A issu d’une

éventuelle réplication de l’outil amplicon.

Tableau 13: les différentes méthodes d’introduction Méthode Description de la method

Méthode A Agroinfiltration directe

Méthode B Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis agroinfiltration 3 jours après

Méthode C Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis inoculation mécanique 3 jours

après

Méthode D Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis utilisation de feuille de tabac

comme source d’inoculum * le virus Ci4 (dilué 10 8) est inoculé à l’ensemble des pieds de riz contenu dans un pot

4.2.2.1 Qualité des ARN extraits La migration des ARN totaux extraits au Trizol sur un gel agarose 1% (Figure 26)

ainsi que le dosage au NanoDrop 2000 (tableau 14) ont montré que les ARN étaient de bonne

qualité. Pour tous les sept échantillons de riz, de claires bandes correspondants aux ARN

ribosomaux 28S et 18S ont été observés après migration sur gel contenant du bromide

d’éthidium. L’observation de la fluorescence sous rayons UV montre que les ARN extraits

n’ont pas été dégradés

N° Echantillon

3 C- : échantillon de riz jamais mis

en contacte avec la PSA

4 Variété Digang, méthode A

5 Variété IR 64, méthode B

6 Variété BG, méthode C

7 Variété IR 64, méthode D

8 Variété Digang, méthode D


Figure 26 : Vérification par électrophorèse de la qualité et la quantité des ARN sur gel d’agarose dépôt de 5 µl sur 45 µl

3 4 5 6 7 8 9

28s

18S

58

Tableau 14 : Dosage au NanoDrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase

*3 : échantillon de riz jamais exposé à la PSA * 4, 5, 6, 7, 8, et 9 : échantillons de riz test ayant été exposé à la PSA

* Les échantillons 1 et 2 respectivement eau et miniprep de PSA ne figure pas dans ce tableau. * A260 = absorbance à 260 nm * A280 = absorbance à 280 nm

4.2.2.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des échantillons pour le dépôt de produits PCR

Les bandes obtenues pour l’amplification eIF1 sur tous les échantillons témoignent de

la qualité et de la quantité de l’ARN extrait (Figure 27). Cela signifie également que la

retrotranscription de l’ARN en ADNc s’est bien déroulée et les populations de cDNA sont

comparables entre elles en termes de quantité d’ARN initial.

N° Echantillon 1 Eau 2 C+ :miniprep de PSA









Figure 27: Produits PCR eiF1

N° Méthode Concentration A260 A280 A260/ A280 3

325,8ng/µl 8,145 4,51 1,81

4 A 1243,4ng/µl 31,084 16,861 1,84 5 B 2185,2ng/µl 54,631 26,962 2,03 6 C 1785,4ng/µl 44,634 22,383 1,99 7 D 1794,1ng/µl 44,853 29,075 1,54 8 D 623,8ng/µl 15,594 10,007 1,56 9 D 1243,9ng/µl 31,098 16,479 1,89

400 pb

750pb 500pb 200pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

RT Oligo dT + P3

59

4.2.2.3. Détection du signal de la PSA L’amplification PSA sur les échantillons test n’a révélé aucune bande à la taille

attendue. Le témoin 2, témoin positif qui est une extraction plasmidique de PSA montre une

claire bande à 192 pb. Dans le témoin eau (1) il n’y a aucune bande, ce qui indique l’absence

de contamination. Pour le témoin 3, un échantillon de riz exposé à la construction

pUBi ::vide, nous n’avons pas non plus observé de bande à la bonne taille. Au regard de ces

observations, techniquement, nous ne sommes pas arrivés à détecter une réplication de

l’amplicon dans le riz. (Figure 28)

4.2.2.4. Apparition d’amplifications aspécifique L’analyse de la PCR PSA sur RT Oligo dT + P3 des échantillons de riz, laisse voir des

amplifications aspécifiques aussi bien sur l’échantillon de riz exposé au vecteur vide que sur

les échantillons exposés au vecteur contenant l’outil amplicon portant le gène d’intérêt

(Figure 28). Les échantillons 3, 4, 5, et 6 présentent deux bandes aspécifiques. Ces

échantillons sont issus d’une reverse transcription réalisée à 42°C. Sur les trois derniers

échantillons à savoir les échantillons 7 ,8 et 9, nous avons voulu éliminer les amplifications

aspécifiques en augmentant la température à 52°C ce qui a eu pour résultat la diminution du

nombre d’amplifications non spécifiques.

Figure 28: PCR PSA

N° Echantillon 1 Eau 2 C+ :miniprep de PSA









1 2 3 4 5 6 7 8 9

RT Oligo dT + P3

750 pb 500 pb 400 pb

625 pb 400 pb 192 pb

60

5. Discussion

5.1. Production de pieds de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI Les plantes appartenant au genre Nicotiana tel que N. benthamiana sont très utilisées

pour la production de protéine d’intérêt particulièrement pour leur haut rendement en

biomasse et leur facilité de croissance. Elles se prêtent à une transformation transitoire ou

stable par un transgène sous un promoteur 35S à l’aide d’ A. tumefaciens. Cela aboutit à une

importante accumulation de protéines d’intérêts. Cependant, pour être utilisé comme système

de culture, les pieds de N. benthamiana demandent des conditions de cultures particulières

(température, humidité, photopériodisme…). Au vue des résultats obtenus, on peut dire que

le dispositif mis en place au cours du stage dans la chambre de culture a permis d’obtenir des

plants dans les conditions requises.

5.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana L’expression et l’accumulation de la protéine C3 ont été prouvées à travers cette étude.

Le gel SDS-PAGE ainsi que le western blot ont révélé une hétérogénéité en terme de taille

des protéines exprimées. Nos résultats sont en accord avec ceux de Moreno et al (1989) qui

ont montré que la maturation de la protéine native de l’inhibiteur de l’ α-amylase des

phaseolus aboutissait à son clivage en deux polypeptides de 19 et 14 kDa. Aussi dans les pois

transgéniques exprimant α-AI1, trois polypeptides ont été observés par immunoblot

(Schroeder et al., 1995). Par ailleurs Obiro et al (1995) ont montré que la protéine native de

l’inhibiteur de l’ α-amylase dans plusieurs plantes transgéniques, peut être clivée en plusieurs

polypeptides du fait des variations dans leur glycosylation ou de la transformation des

glycanes. Un exemple nous a été donné par Altabella et al (1990) qui ont mis en évidence par

immunodétection 11 polypeptides dans des graines de tabac transgéniques transformés avec le

gène de α-AI1. Nous ne saurons parler de l’hétérogénéité des tailles des protéines observées

lors de l’expression de la C3, sans noter que les travaux de Sawada et al (2002) ont montré

que même chez P. vulgaris (espèce d’où est issu le gène de α-AI1 natif) les sous-unités α et β

de α-AI1 ne sont pas toujours glycosylées de la même façon.

La bande de 28 kDa révélée par Western blot et sur le gel SDS-PAGE correspond

parfaitement en terme de taille à la protéine non maturée. Cette dernière, étant en fusion

61

avec le peptide KDE, est retenue dans le RE, la maturation de la C3 a pourtant lieu dans

l’appareil de Golgi après passage de la protéine dans le RE qui constitue son site

d’adressage. Dans le cadre notre étude, la protéine retenue dans le RE reste immature

puisqu’elle est normalement maturée après le RE. L’addition d’un peptide KDEL au

construit C3 ne serait pas une stratégie adaptée car elle conduirait à l’obtention de protéine

C3 immature donc potentiellement non fonctionnelle. La mise en évidence des fractions de

19 et 14 kDa montre que la rétention ne s’est pas effectuée à 100%, ces fractions étant le

résultat de la modification post-traductionnelle d’une partie de la protéine native non

retenue.

Sur le gel SDS-PAGE, le profil de protéines des échantillons exprimant les clones de la

C3 a révélé trois polypeptides caractéristiques autours de 28, 19 et 14 kDa or

l’immunodétection n’a montré que les bandes de 28 et 14 kDa. Cela se justifie par le fait

que l’anticorps anti C3 utilisé pour l’immunodétection a été conçu à partir d’un peptide de la

sous-unité β de la C3. Pour cette raison, il a permis la reconnaissance de la fraction β sur la

protéine immature correspondant à la bande de 28 kDa. Les fractions de C3, non retenues

dans le site d’adressage, subissent dans l’appareil de Golgi leur maturation qui consiste en

un clivage en deux pour donner les fractions α et β. L’anticorps étant dirigé contre la

fraction β, dès lors que le clivage a lieu, seul cette fraction β est reconnue ce qui explique la

révélation de deux bandes lors de l’immunodétection comparativement à trois bandes mises

en évidence après coloration du gel SDS-PAGE au bleu de coomassie. La présence de deux

bandes β pourrait s’expliquer par différentes formes de glycosylation comme cela a été

fréquemment décrit dans la littérature (Sawada et al., 2002). La bande de 19 kDa

correspondant à la fraction α n’a pas d’affinité avec l’anticorps et de ce fait n’est pas

détectée dans l’immunoblot.

5.3. Test expression amplicon dans les feuilles de N. benthamiana et de riz La comparaison de l’amplification PSA des échantillons amplicon 3 et 4 (Figure 25)

issus des reverses transcriptions « oligo dT + P3 et oligo dT » a montré une réplication de

l’amplicon dans les cellules de N. benthamiana car la différence de l’intensité de

l’amplification entre les reverses transcriptions oligo dT et oligo dT + P3 est due à la

présence d’ARN non polyadénylés dans ce dernier et donc à la mise en exergue de la

réplication du virus dans les échantillons amplicon. L’amplicon a initié une réplication

lorsqu’on l’a exprimé de façon transitoire dans les cellules de N. benthamiana. Cependant

62

lorsqu’on appose le niveau d’accumulation d’ARN des échantillons 3 et 4 à celui de

l’échantillon 2 (échantillon sous environnement non amplicon caractérisant l’expression sous

la dépendance du promoteur 35S seulement), il s’avère que l’accumulation sous la

dépendance de l’amplicon est moins importante que l’accumulation sous le contrôle du

promoteur 35S uniquement (Figure 25). Cela suggère que l’amplicon dans N. benthamiana

n’est pas l’outil le plus efficace pour améliorer l’accumulation de protéines d’intérêt. Cela se

justifie en ce sens que l’outil viral RYMV dans N. benthamiana se situe dans un contexte non

hôte. Son hôte naturel étant le riz, dans N. benthamiana les conditions propices à sa

réplication ne seraient pas réunies. D’où l’intérêt de passer sur le riz pour réaliser une

expression transitoire. Il convient également de noter que l’expression en premier lieu de la

protéine d’intérêt via l’outil amplicon dans N. benthamiana est une étape importante pour le

test de fonctionnalité de l’outil en ce sens que N. benthamiana est classiquement utilisée pour

ce genre d’approche, en raison de ses feuilles qui se prêtent bien à l’agroinfiltration. La

protéine P1 n’est pas nécessaire à la réplication du RYMV mais est capable de supprimer

l'extinction post-transcriptionnelle des gènes et est impliquée dans le mouvement du virus

dans la plante. Elle joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau et al, 1998). La

présence du gène codant cette protéine sur un des construits est supposée mettre le virus

recombinant dans les conditions propices. Cependant aucune différence significative n’a été

observée dans l’accumulation d’ARN entre le construit amplicon codant en plus du gène

d’intérêt la P1 et celui délété de la P1. La P1 n’a donc pas eu d’effet majeur sur le pouvoir de

réplication du virus dans N. benthamiana.

Même si elle est faible, la réplication de l’outil observée sur les feuilles de N.

benthamiana, suggère que ces feuilles peuvent être utilisées comme source d’inoculum pour

passer sur d’autres plantes tel que le riz et amorcer potentiellement une réplication.

5.4. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz L’analyse de la PCR PSA sur la RT Oligo dT+P3 des échantillons de riz, ne permet

pas de conclure quant à la réplication de l’outil dans le riz (Figure 28). Cela nous conduit aux

hypothèses suivantes : est-ce qu’il y eu introduction de l’outil amplicon des cellules de

feuilles de riz via Agrobactérium tumefasciens ? Cette question s’appuie sur le fait que les

feuilles de riz n’étant pas tendres, elles se prêtent difficilement à l’agroinfiltration, c’est dire

ici que l’application de cette technique sur le riz n’est pas des plus adaptées. La deuxième

question à laquelle nous arrivons est ainsi : est-ce que la réplication typique de l’amplicon a-

elle eu lieu ? En effet pour chacun des échantillons testés, aucune amplification correspondant

63

à celle attendue n’a été observée. Notre troisième question nous emmène à la mise en cause de

la spécificité des amorces P3et PSA8 utilisées pour l’amplification du gène d’intérêt. En effet,

ces dernières n’amplifient aucune séquence à la taille attendue mais amplifient deux autres

séquences inattendues à 650 et 400 pb. Cela suggère qu’elles reconnaitraient d’autres

séquences sur le génome du riz.

Dans les méthodes d’introduction B, C, et D, du virus Ci4 a d’abord été inoculé avant

de procéder à l’introduction proprement dite de l’outil. Ce virus inoculé devrait servir de

« helper » pour amorcer et soutenir la réplication du virus chimérique. Il convient de noter

que des symptômes du RYMV ont été observés 10 jours après inoculation du virus Ci4, ce qui

laisse penser que l’inoculation a bien marché. On peut donc se demander si dans les

échantillons 5, 6, 7 et 8 (Figure 28 partie résultat) l’apport de l’outil a lieu à un moment ou le

virus Ci4 était bien en activité dans le point d’inoculation . Si l’amplicon est apporté à un

moment où le virus n’est pas actif ou n’est pas présent, cela reviendrait à se retrouver dans un

contexte d’un apport sans virus.

64

Conclusion et perspectives

Les travaux menés au cours de mon stage ont permis la production de la protéine

d’intérêt agronomique C3. Le peptide KDEL qui a été flanqué à la construction C3 a permis

la rétention de la protéine dans le RE. Cependant cette rétention entrave la maturation post-

traductionnelle de la protéine qui devrait s’effectuer après le site de rétention dans l’appareil

de Golgi (Santino et al., 1992) et permettre l’obtention de protéines fonctionnelles. Exprimer

la C3 à l’aide d’une construction sans KDEL est une perspective qui permettra d’obtenir

davantage de protéines matures et ainsi de procéder à des tests de fonctionnalité des protéines

ainsi obtenues transitoirement dans les feuilles de N. benthamiana.

Les premiers tests portant sur l’utilisation de l’outil amplicon dans N. benthamiana se

sont révélés assez concluant en ce sens qu’une réplication de l’amplicon a pu être mise en

évidence chez N. benthamiana. Cependant, il faut noter que l’amplicon dans N. benthamiana

ne s’est pas montré comme un outil efficace pour augmenter significativement

l’accumulation d’ARN de PSA par rapport à une construction plus classique tel que le gène

d’intérêt sous promoteur fort 35S. Ceci donne un regain d’intérêt à la nécessité de mettre en

place la technique d’introduction de l’outil amplicon la plus efficace dans son hôte naturel

qu’est le riz chez qui le virus chimérique pourrait trouver un environnement plus favorable à

sa réplication.

Chez le riz, les résultats du transfert de l’outil ne se sont pas montrés concluant. Aucun

signal de réplication n’a pu être mis en évidence. Cependant plusieurs hypothèses donnent

l’espoir de pouvoir améliorer la production d’une protéine d’intérêt avec l’outil amplicon par

son introduction chez son hôte naturel qu’est le riz.

Parmi ces espoirs on compte la co-introduction de l’outil et d’un second virus qui

jouera le rôle de « helper ». Ceci nécessite de déterminer le pattern spacio-temporel du virus

helper afin d’introduire l’amplicon dans le bon tissus et au bon moment c'est-à-dire lorsque le

virus helper est présent et actif. Ainsi, le virus chimérique issu de l’expression de l’amplicon

se retrouverait dans des conditions propices à sa réplication en recrutant les protéines

nécessaires que le virus helper aurait déjà produites.

Par ailleurs aussi bien chez le riz que chez N. benthamiana, on a remarqué la présence

d’amplifications non spécifiques ce qui laisse entrevoir une affinité non optimum des amorces

65

P3 et PSA8 utilisées pour l’amplification PSA dans cette étude. La définition d’autres

amorces pour l’amplification du gène de la PSA en portant plus d’attention sur leur spécificité

serait une solution pour la détection spécifique de la PSA.

La transformation de feuilles de riz via Agrobacterium n’étant pas aisée, il serait

intéressant de prendre en compte d’autres tissus de riz plus propices à l’introduction de

l’amplicon via Agrobactérium telles que les suspensions cellulaires de riz en culture liquide.

En effet, les cultures de suspension cellulaire de riz présentent une meilleure possibilité

d’une transformation efficace via Agrobactérium ce qui pourrait contribuer à l’introduction

efficace de l’outil dans le riz.

L’expression et l’accumulation de la protéine d’intérêt ayant été démontrées dans

cette étude, on pourra envisager la production d’autres protéines d’intérêts tels que des

anticorps ou des vaccins à travers de tels systèmes d’expressions « plantes » qui tiendront

compte de la sécurité biologique.

66

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A

Annexe 1. Composition du milieu de culture bactérienne

1.2 Composition du milieu LB

composant Quantité (g/L)

Tryptone 10

Yeast Extract 5

NaCl 10

1.3 Composition du milieu YEP

composant Quantité (g/L)

Tryptone 10

Yeast Extract 10

NaCl 5

Les milieux solides sont obtenus par l’ajout de 20 g/L d’Agar avant autoclave.

1.4 Milieu AB pour la croissance des agrobactéries

Tampon AB (stock 20X)

K2HPO4 60g/l (12g pour 200ml)

KH2PO4 20g/l (4g pour 200ml)

Autoclaver

Sels AB (stock 20X)

NH4Cl 20 g/l (4g pour 200ml)

MgSo4,7H2O 6 g/l (1.2g pour 200ml)

KCl 3 g/l (0.6g pour 200ml)

CaCl2 0,20g/l (0.04g pour 200ml)

FeSO4,7H2O 50 mg/l ( 10mg pour 200ml)

Autoclaver et conserver à 4°C

B

Pour 1 L de milieu AB, mélanger 5 g de glucose, 15g de difco bacto agar et 900ml d’eau

bidistillée et autoclaver. Ajouter ensuite 50 ml de tampon AB autoclavé et 50ml de sels

AB. Ajouter les antibiotiques appropriés à la souche et couler les boîtes de Pétri.

2. Preparation de bactéries agrocompétantes

Inoculer 5 ml de YEP Rifampicine 5ul stock 50 mg/ml et gentamicine 10ul 10mg/ml

avec la souche GVM3101

Incuber O/N à 30°

Le lendemain matin :

Inoculer 50 ml de YEP Rif/genta avec 2 ml de culture O/N. incuber à 30°C sous

agitation pendant environs 4h jusqu’à DO à 600nm = 0.8.

Pendant ce temps, refroidir dans un bac à glace, la solution de CaCl2 10 mM et des

tubes eppendorf vides (10 à 12 tubes).

Centrifuger à 3000 rpm pendant 10mn.

Reprendre délicatement le culot de bactéries dans 1 ml de C aCl2 10Mm.

Aliquoter en 100 ul par tubes eppendorf. Flash freeze dans de l’éthanol technique.

Conserver à -80°C.

3. Préparation des antibiotiques

Toutes les solutions « mères » d’antibiotiques sont stockées à -20°C et protégées de la lumière.

KANAMYCINE

Préparation de la Kanamycine à 10 mg/ml dans de l’eau. Stérilisation par filtration à 0,22 µm. Utilisation à 50 µg/ml

RIFAMPICINE

Préparation de la rifampicine à 16 mg/ml dans du DMSO. Utilisation à 50 µg/ml

TETRACYCLINE Préparation de la Tétracycline à 5 mg/ml dans de l’éthanol. Ne pas stériliser. Utilisation à 10 µg/ml

C

4. Trizol « maison »

0,8 M Guanidine thiocyanate (118,16 g)

0,4 M Ammonium thiocyanate (76,12g)

0,1 M Sodium Acétate pH5 (33,4ml de Sodium Acétate stock à 3 pH5)

50 ml Glycérol 50%

qsp H20 620 ml

Autoclaver

Ajouter 380 ml de phénol saturé

5. FDE

10 ml formamide déionisé

200 µl 0.5 M EDTA pH 8

10 mg xylène cyanol FF

10 mg bleu de bromophénol

6. TAE 50X Tris base 242 g Acide acétique glacial 57,1 ml EDTA 0,5 M pH 8 100 ml Eau qsp 1 L Autoclaver Utiliser à 0,5X, diluer la solution mère dans de l’eau distillée

7. dNTP 10mM dATP 100 mM 50 µl dCTP 100 mM 50 µl dGTP 100 mM 50 µl dTTP 100 mM 50 µl Eau 300 µl

8. Tampon de migration

Pour 1 litre de solution 10X

250 mM Tris base 30.285 g

2.5 M glycine 187.67 g

Tampon de migration 1X = 100 ml de 10X + 5ml SDS 20% qsp 1 Litre

D

9. Tampon d’extraction des protéines. 50 ml

Composant Quantité

Tris HCl pH 7.5 1 ml

NaCl 292 mg

Na2 EDTA, 2H2O 186 mg

D glucose 225 mg

Triton X 100 50 µl

EGTA 95 mg

Glycerol 2.5 ml

DTT 250 µl

Inhibiteur de protéase 250 µl

E

10. Volume gel SDS-PAGE

Gels de 1,5 mm épaisseur 1 gel 15% 2 gels 15%

RUNNING GEL A 15 % (10ml/gel)

Acrylamide Bis-acrylamide 40 % (4°C)

Tris HCl 1.5 M pH 8.8 (4°C)

SDS 20 %

Ammonium Persulfate 10 % (10g dans

100ml)

Temed (4°C)

H20

3,75 ml

2,6 ml

50 µl

100µl

10 µl

3,49 ml

7,5 ml

5,2 ml

100 µl

200 µl

20 µl

6,98 ml

STACKING GEL A 5 % (3 ml)

Acrylamide Bis-acrylamide 40 % (4°C)

Tris HCl 1 M pH 6.8 (4°C)

SDS 20 %

Ammonium Persulfate 10 %

Temed (4°C)

H20

375 µl

375 µl

15 µl

30 µl

3 µl

2,25 ml

750 µl

750 µl

30 µl

60 µl

6 µl

4,5 ml

11. Tampon de transfert

Pour 1 litre

Tris base 2.42 g

Glycine 11.26 g

Méthanol 200 ml

F

12. Bleu de charge 4X

Pour 10 ml

200 mM Tris HCl pH 6.8 2 ml (1 M)

400 mM DTT 0.716 g

8 % SDS 4 ml (20 %)

0.4.1 % Bleu bromophénol 40 mg

40 % Glycérol 4 ml

13. TBSt pH 7.5

Pour 1 litre

20 mM tris base 2.423 g

75 mM NaCl 3.146 g

2,5 mM MgCl2, 6H2O 0.508 g

pH 7.5 avec HCl

Tween 20 0.05 % (à rajouter extemporanément

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Mémoire Présenté · 2016-06-20 · Par: Pingdwende Kader Aziz BAMOGO Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université