Modification des caractkres culturaux et biochimiques du Salmonella paratyphi B aprks incubation dans I'eau de rner

AMINA BAKHROUF ET MONCEF JEDDI Facult6 de pharmacie de Monastir, rue Avicenne, 5000 Monastir, Tunisie

ET

MICHEL J. GAUTHIER

Institut national de la sant6 et de la recherche, Unite' 303, 1, avenue Jean-Lorrain, 06300 Nice, France

Recu le 9 decembre 1991

Revision recue le 31 janvier 1992

Accepte le 2 mars 1992

BAKHROUF, A., JEDDI, M., et GAUTHIER, M. J . 1992. Modification des caractkes culturaux et biochimiques du Salmonella paratyphi B aprks incubation dans l'eau de mer. Can. J . Microbiol. 38 : 87 1-874.

Les cellules du Salmonella paratyphi B incubkes dans l'eau de rner ont perdu rapidement leur potentiel de culture sur les milieux bactCriologiques. Leur adaptation prealable a la haute osmolarite a cependant fortement ralenti cette evolution. Au plan qualitatif, les souches isolees des microcosmes d'eau de mer, aprks des pkriodes d'incubation plus ou moins longues, ont montre une modification de certains caractkres culturaux (forme et taille des colonies) et bio- chimiques (acidification de certains sucres, activite gelatinase, production d'acetoi'ne, reduction des nitrates) qui les rendaient suffisamment atypiques pour exclure leur identification au genre Salmonella. Cette alteration du phenotype, bien que reversible, pourrait etre responsable de resultats faussement nkgatifs lors de la recherche et l'identification de ces bacteries dans les Cchantillons d'eau de mer.

Mots clks : Salmonella paratyphi B, eau de mer, survivance, production d'acetoi'ne.

BAKHROUF, A., JEDDI, M., and GAUTHIER, M. J. 1992. Modification des caractkres culturaux et biochimiques du Salmonella paratyphi B aprks incubation dans l'eau de mer. Can. J . Microbiol. 38: 87 1-874.

After incubation in seawater Salmonella paratyphi B cells rapidly became unable to grow on bacteriological media. Previous adaptation to high osmolarity conditions greatly slowed down this process. Strains isolated from seawater microcosms after varying incubation periods were qualitatively different and showed changes in some of their growth (colony shape and size) and biochemical properties (acidification of some sugars, gelatinase activity, acetoin produc- tion, nitrate reduction). Because of these modifications, the bacteria showed atypical profiles and could not be identified as members of the Salmonella genus. The alteration of the phenotype, although reversible, could explain some of the false-negative results obtained upon isolation and identification of these bacteria in seawater samples.

Key words: Salmonella paratyphi B, seawater, survival, acetoin production. [Journal translation]

Au cours des 10 dernikres annkes, un nouvel intkr2t a kte porte au problkme de l'adaptation des bacteries entkriques pathogknes au milieu marin, suite a la dkcouverte de leur kvolution vers un ktat dormant viable mais non cultivable (VNC) (Xu et al. 1982; Colwell 1987; Roszak et Colwell 1987). Dans l'eau de mer, ces bactkries subissent de pro- fondes modifications structurales et mktaboliques (Zaske et al. 1980; Morita 1982; Chai 1983; Kjelleberg et al. 1987; Gauthier et al. 1989; Bakhrouf et al. 1990), dont on ne con- nait encore que peu la signification adaptative et la reversi- bilite. Les implications quantitatives de cette derive struc- turale et physiologique, qui influence profondement la signification des denombrements de ces bacteries aprks leur sejour en eau de mer, ont ete immediatement perques et lar- gement discutees (Colwell 1987; Roszak et Colwell 1987). On a plus rarement considere ses consequences au plan qua- litatif, par exemple sur l'identification des bacteries-tests de contamination fecale, ou des espitces entkropathogknes, dans les kchantillons marins (Munro et al. 1987).

Au cours de nos recherches sur les mecanismes d'adapta- tion des salmonelles en mer, nous avons observe leur pas- sage a l'ktat filtrable (Bakhrouf et al. 1990) et constatk que, aprks un temps de sejour plus ou moins long dans l'eau de mer, certaines de leurs propriktks phknotypiques ktaient

modifiees de manikre suffisamment marquee pour rendre difficile, voire impossible, leur identification par les methodes traditionnelles. Un travail expbimental a donc ktk realisk dans le but de prkciser la nature des changements phk- notypiques les plus significatifs de ce point de vue, a l'aide d'une souche appartenant a l'espkce Salmonella paratyphi B, isolee d'un malade a 1'Institut Pasteur de Tunis. Bien que n'etant pas un skrotype strictement humain (Le Minor 1982), cette espkce, pathogkne pour l'homme, est frkquemment ren- contree dans les eaux naturelles polluees. Des tests compa- ratifs complementaires ont ete realises sur une souche de Salmonella wien isolee dans ce m2me Institut Pasteur chez des porteurs sains.

~volution de la viabilitk des cellules dans l'eau de rner Plusieurs milieux de culture solides ont ete utilises au cours

de cette etude : gelose nutritive (GN) (Institut Pasteur Production, Paris), GN additionnee de NaCl (23 g/L) (GNNa), GN preparke a l'eau de rner (GNEM), milieu desoxycholate-citrate-lactose-agar (DCLA) (Difco Labo- ratories, Detroit, Michigan), milieu pour Salmonella- Shigella (SS) (Institut Pasteur Production). Les cellules a inoculer dans les microcosmes d'eau de rner ont ete culti- vees en bouillon nutritif (Institut Pasteur Production) pre- park a l'eau distillee (BN) ou a l'eau de rner (BNEM).

1. Auteur correspondant. Printed in Canada / Imprime au Canada

Les tests de survie ont kte realises dans des fioles d'Erlenmeyer de 2 L contenant 600 mL d'eau de rner natu-

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

Uni

vers

ity o

f P.

E.I

. on

11/1

3/14

For

pers

onal

use

onl

y.

CAN. J . MICROBIOL. VOL. 38, 1992

TABLEAU 1 . Perte de viabilitk + Ccarts types, dans l'eau de mer, du Salmonella paratyphi B prkalablement cultivk en milieu a basse ou haute osmolarite

Indice de perte de viabilitCa

Milieu de culture Apres 2 jours Aprks 5 jours

Bouillon nutritif 143 + 35 140+ 10 Bouillon nutritif + NaCl (0,5 M) 4 + 3 3,2+3

NOTA : Les ecarts types des indices sont basks sur deux experiences. 'Exprime par le rapport du nombre d'UFC par millilitre au debut des expkriences, au nombre d'UFC

par millilitre aprks 2 et 5 jours d'incubation en eau de mer.

TABLEAU 2. Perte de viabilitk, dans l'eau de mer, du Salmonella paratyphi B prealablement cultivk a basse osmolaritk, CvaluCe par denombrement des cellules

cultivables sur differents milieux selectifs ou non sklectifs

Indice de perte de viabilitea

Milieu de culture Apds 2 jours Apres 5 jours

Gelose nutritive a l'eau distillee 1158+250 2626 + 890 Gelose nutritive a l'eau de mer 4.18 + 65 436 + 87 Milieu pour Salmonella-Shigella 1250 + 560 2220 + 690 Milieu desoxycholate-citrate-lactose-agar 1656 + 230 8630 + 1580

NOTA : Les ecarts types des indices sont bases sur deux experiences. 'Exprime par le rapport du nombre d'UFC par millilitre au debut des experiences, au nombre d'UFC

par millilitre apres 2 et 5 jours d'incubation en eau de mer.

relle autoclavCe (1 20" C, 15 min). Les cellules bactkriennes, prkalablement cultivCes sur GN ou GNEM, ont CtC incubCes pendant 18 h a 37"C, respectivement en bouillon BN et BNEM. Elles ont CtC lavCes trois fois en eau physiologique ou en eau de rner par centrifugation (10 000 x g, 10 min, 20°C) et le culot final a CtC suspendu dans 5 mL du m2me liquide que celui utilisC pour le rin~age. Les microcosmes ont CtC inoculCs a l'aide de ces suspensions, jusqu'a l'obten- tion d'une concentration cellulaire d'environ lo5 a lo6 uni- tCs formant colonies (UFC) par millilitre, puis incubCs a la tempCrature ambiante (20-25°C) a I'obscuritC. La perte de viabilitC des cellules dans ces microcosmes a CtC CvaluCe par le rapport du nombre d'UFC par millilitre au dCbut des expC- riences, au nombre d'UFC par millilitre aprks 2 et 5 jours d'incubation dans l'eau de mer. Chaque test de survie a CtC effectuC a deux reprises et une analyse de variance a CtC rCa- lisCe pour Cvaluer la signification de certaines diffkrences observkes.

I1 a CtC rCcemment suggCrC que les entCrobactCries, et plus particulikrement 1'E. cofi, peuvent survivre assez longuement dans l'eau de rner oligotrophe lorsqu'elles sont capables de surmonter le choc hyperosmotique subi lors du transfert dans ce milieu (Munro et af. 1989; Gauthier et af. 1991). Les rCsultats dCcrits ci-dessus montrent que les salmonelles pathogknes ont une reaction analogue car elles y survivent mieux lorsqu'elles sont prCadaptCes en milieu a haute osmolaritC. Ceci suggkre que le S. paratyphi B posskde des mecanismes de rkgulation osmotique analogues a ceux qui ont CtC dCcrits chez le Salmonella typhimurium (Booth et af. 1988; Csonka 1989). Par ailleurs, la reviviscence d'une par- tie de la population, aprks une longue pCriode d'incubation en eau de mer, par ajout de milieu pepton6 et incubation a basse tempkrature (24"C), suggkre le passage du S. paratyphi B a 1'Ctat VNC, tel qu'il a CtC dCcrit antkrieu- rement pour de nombreuses autres espkces bactkriennes d'origine humaine (Roszak et Colwell 1987).

Les rCsultats de ces tests, effectues comparativement avec le S. paratyphi B prCcultivC en milieu a basse (BN) ou haute Modification des caract6resphknotypiques apr6s incubation (BNEM) osmolaritC, sont prCsentCs au tableau 1. 11s mon- en eau de mer trent que, conformCment aux observations antCrieures faites avec d'autres entCrobactCries, et plus particulikrement 1'Escherichia cofi (Munto et af. 1989), la survie dans l'eau de rner des cellules prkalablement cultivkes en milieu sale est beaucoup plus importante. Dans le cas des bactCries non prCadaptCes en milieu salC, la dCcroissance du nombre de cellules cultivables sur milieu GN, trks rapide pendant les trois premiers jours, s'est stabiliske aprks 5 jours d'incuba- tion en eau de mer, puis a diminuC trks lentement pendant les semaines suivantes. Aucune cellule cultivable n'a pu 2tre dCcelCe dans les microcosmes aprks environ 2 mois d'incu- bation. Ce dknombrement a cependant largement variC selon le milieu utilise (tableau 2), le milieu GN Ctant plus favo- rable ( p < 0,05) et le milieu DCLA plus dCfavorable ( p < 0,05) a la rCcupCration des bactkries.

Un premier ensemble de tests a CtC rCalisC aprks une courte incubation des cellules en eau de rner (4-20 jours). Les carac- teres culturaux des souches isolCes des microcosmes ont CtC notCs aprks culture sur milieux GN, GNNa, GNEM, DCLA et SS a 37°C pendant 1 a 8 jours. Leurs caractkres biochi- miques ont CtC dktermines sur galeries API 20E et API ZYM (API System, BioMCrieux, ~arcy-1 '~ to i le ) .

La souche du S. paratyphi B presentait normalement , sur GN, aprks 24 h d'incubation a 37"C, des colonies typiques des entCrobactCries : lisses, blanches, 1Cgerement translu- cides, a contour rCgulier, de taille moyenne (2-3 mm de dia- mktre). Ces colonies Ctaient plus plates sur GNNa et plus petites sur GNEM. Apres un sejour de 4 a 6 jours dans l'eau de mer, cette souche a dCveloppC, sur GN, des colonies bom- bCes, a contour irrkgulier, 1Cgkrement concaves et a surface

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

Uni

vers

ity o

f P.

E.I

. on

11/1

3/14

For

pers

onal

use

onl

y.

NOTES 873

plus rugueuse sur GNNa. Sur GNEM, elle presentait deux types de colonies, blanches et tres petites (0'5-1 mm) ou lege- rement translucides et plus larges (2-3 mm). Sur milieu SS, on observait egalement une dissociation en colonies typiques a centre noir et en petites colonies transparentes atypiques. Les souches isolkes a partir de ces colonies ont montrk un profil phknotypique analogue : sur galeries API 20E, toutes diffkraient de la souche parentale par la production d'ack- toi'ne et, pour certaines, une lkgkre activite arginine dihy- drolase et une trks forte activitk dknitrifiante (tableau 3, isolats nos 1, 2 et 3). Le Salmonella wien ne se developpait pas sur GNNa et GNEM avant incubation en eau de mer. Aprks 24 h d'incubation dans cette eau, il presentait les mgmes caractkres culturaux que le S. paratyphi B sur GN, GNNa et GNEM. Les modifications phenotypiques obte- nues aprks une courte pkriode d'incubation en eau de rner etaient toutes rkversibles, les souches atypiques retrouvant le profil de la souche initiale (souche de refkrence) aprks une nouvelle culture sur milieu GN.

Aprks 15 jours d'incubation en eau de mer, les souches isolees des microcosmes sur milieux GN et GNNa (tableau 3, isolats nos 4 et 5) diffkraient de la souche initiale sur gale- ries API 20E par l'absence d'acidification du mklibiose et par l'acidification de l'inositol. Lorsque les cellules en sus- pension dans l'eau de rner ktaient rkcoltees par centrifuga- tion et testkes directement sur les galeries API 20E sans cul- ture prealable (tableau 3, isolats nos 6 et 7)' leur profil phknotypique diffkrait plus nettement encore de celui des cellules initiales, avec une evolution differente selon la periode de contact avec l'eau de rner : lkgkre activitk argi- nine dihydrolase, production d'acktoi'ne, acidification de l'inositol, activitks 0- et P-glucosidases aprks 8 jours, acidi- fication de l'inositol et de l'amygdaline, activitk P-glucosidase seulement aprks 20 jours.

Apres une trks longue periode de contact avec l'eau de rner (7 mois), le S. paratyphi B n'etait plus capable de se developper sur GN. GNNa et GNEM. Toutefois, l'addition de BN (109'0, v/v) a l'eau des microcosmes a permis de revi- vifier une fraction au moins de la population : apres 3 jours d'incubation a 24°C' un trouble est apparu dans le melange eau de rner - BN. L'etalement d'environ 10 pL de cette cul- ture sur GN a conduit, aprks 3 jours d'incubation a 24°C' au dkveloppement de colonies lisses, bombkes, a contour regulier, analogues aux colonies de la souche initiale et au developpement d'autres colonies plus transparentes. Les pro- fils API 20E de ces deux types de colonies etaient identiques : il s'agissait de bacteries posskdant une activitk gelatinase, capables d'acidifier l'arabinose et de reduire les nitrites en azote, mais presentant une rkaction nkgative pour l'ensemble des autres tests (tableau 3, isolat no 8). Apres des cultures successives en BN a 37°C' ces bactkries ont reproduit divers caracteres de la souche initiale, bien qu'en diffkrant encore par l'activite arginine dihydrolase (faible), la production d'acetoi'ne, l'acidification de l'inositol, l'absence d'acidifi- cation du rhamnose et du mklibiose et la rkduction des nitrites (tableau 3, isolat no 9). Ici encore, le profil phk- notypique de la souche initiale ktait retrouvk aprks quelques subcultures sur milieu GN.

Ces resultats montrent donc que l'kvolution des salmo- nelles vers l'etat VNC s'accompagne d'une modification physiologique qui peut avoir une grande importance sani- taire et epidt5miologique. La derive progressive des carac- teres culturaux et mktaboliques du S. paratyphi B dans l'eau

I I I I I I I I I I

I I I I I I I I I I

I I I I I I I I I I

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

Uni

vers

ity o

f P.

E.I

. on

11/1

3/14

For

pers

onal

use

onl

y.

874 CAN. J. MICROBIOL. VOL. 38, 1992

de rner concernait en effet certaines propriktks phknoty- piques qui jouent un r81e clk pour la recherche et l'identifi- cation des salmonelles dans les eaux et les produits marins consommables. C'est le cas pour la production d'acktoi'ne et, a moindre titre, l'acidification de l'amygdaline qui sont considkrkes comme absentes du genre Salmonella (MacFaddin 1980; Le Minor 1982). Dans le systeme API 20E (API System S.A. 1990), les caracteres de la souche de rkfkrence lui conferent le nombre-code 4 704 552, pour lequel l'identification au genre Salmonella est tres bonne (96'5%). Par contre, les caracteres API 20E des souches iso- lkes des microcosmes apres 4 jours d'incubation en eau de rner (tableau 3, isolats nos 1, 2 et 3)' correspondant aux codes 4 705 552 et 6 705 552, les excluaient de ce genre sur la base du seul caractere production d'acktoi'ne positif. I1 en est de meme pour les populations testkes sans culture prk- alable, sur les galeries API 20E, apres 8 et 20 jours de con- tact avec l'eau de rner (tableau 3, isolats no% et 7 : codes 6 705 712, atypique sur I'a base du caractere production d'acktoi'ne positif, et 4 704 753, atypique pour le caractere amygdaline positif). Ces rksultats ne permettent kvidemment pas d'expliquer une telle production d'acktoi'ne par le S. paratyphi B incubk dans l'eau de mer. Celle-ci pourrait etre like a la modification transitoire de certains des mkca- nismes qui permettent la synthese ou le catabolisme de l'ace- toi'ne et du 2,3-butanediol (Harden et Walpole 1906; Parestsky et Werkman 1947; Juni et Heym 1956) condui- sant, par example, a l'accumulation de l'acktoi'ne jusqu'a un niveau dkcelable par la rkaction de Voges-Proskauer (MacFaddin 1980). Diverses activitks mktaboliques sont effectivement activkes chez les entkrobactkries en milieux sales (Brisou 1980). I1 semble cependant que cette propriktk soit transitoire et ne soit dktectable au ' a~ re s une incubation des cellules de 1 (ou 2) jour(s) 8 (bu i0) jours dans l'eau de mer. Au plan pratique, la modification, meme transitoire, de cette propriktk chez les salmonelles incubkes dans l'eau de rner pourrait donc gknkrer des rksultats faussement nkga- tifs lors de leur recherche et de leur identification dans les kchantillons d'eaux, de skdiments ou d'organismes comes- tibles d'origine marine.

Remerciements Ce travail a ktk rkalise, et partiellement financk, dans le

cadre d'une convention de collaboration entre le ministere des Affaires ktrangeres fran~ais et le ministere de la Recherche tunisien.

API System S.A., 1990. API 20E, catalogue analytique. 2e ed. La Balme-les-Grottes, Montalieu-Vercieu.

Bakhrouf, A., Jeddi, M., Bouddabous, A., et Gauthier, M.J. 1990. Production of filterable minicells by Salmonella paratyphi B in seawater. Microbios Lett. 43 : 123-129.

Booth, I.R., Cairney, J., Sutherland, L., et Higgins, C.F. 1988. Enteric bacteria and osmotic stress: an integrated homeostatic system. J . Appl. Bacteriol. 17(Symp. Suppl.) : 35s-49s.

Brisou, J.-F. 1980. Les bactCries marines. Collection Biologie des milieux marins. Masson, Paris. pp. 32-33.

Chai, T.J. 1983. Characteristics of Escherichia coli grown in bay water as compared with rich medium. Appl. Environ. Micro- biol. 45 : 1316-1323.

Colwell, R.R. 1987. From counts to clones. J. Appl. Bacteriol. 16(Symp. Suppl.) : IS-6s.

Csonka, L.N. 1989. Physiological and genetic response of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev. 53 : 121-147.

Gauthier, M. J . , Thomas, P. , et Munro, P.M. 1989. Modification de la structure des enveloppes et du contenu en proteines d'Escherichia coli en survie dans l'eau de mer. Can. J. Microbiol. 35 : 843-849.

Gauthier, M.J., Flatau, G.N., LeRudulier, D., et al. 1991. Intra- cellular accumulation of potassium and glutamate specifically enhances survival of Escherichia coli in seawater. Appl. Envi- ron. Microbiol. 57 : 272-276.

Harden, A., et Walpole, G.S. 1906. Chemical action of Bacillus lactis aerogenes (Escherich) on glucose and mannitol production of 2,3-butyleneglycol and acetylmethylcarbinol. Proc. R. Soc. London B, 77 : 399-407.

Juni, E., et Heym, G.A. 1956. A cyclic pathway for the bacterial dissimulation of 2,3-butanediol, acetylmethylcarbinol, and diacetyl. 11. The synthesis of diacetylmethylcarbinol from diacetyl, a new diphosphothiarnin catalyzed reaction. J. Bacteriol. 72 : 746-772.

Kjelleberg, S., Hermansson, M., et Marden, P. 1987. The transient phase between growth and nongrowth of heterotrophic bacteria, with emphasis on the marine environment. Annu. Rev. Micro- biol. 41 : 25-49.

Le Minor, L. 1982. Salmonella. Dans Bacteriologic medicale. Ed- teurs : L. Le Minor et M. Veron. Flammarion MCdecine- Sciences, Paris. pp. 259-274.

MacFaddin, J .F. 1980. Voges-Proskauer test. Dans Biochemical tests for identification of medical bacteria. ~ d i t e u r : J.F. MacFaddin. Williams & Wilkins, Baltimore, pp. 308-320.

Morita, R.Y. 1982. Starvation-survival of heterotrophs in the marine environment. Adv. Microb. Ecol. 6 : 171-198.

Munro, P.M., Gauthier, M.J., et Laumond, F. 1987. Changes in Escherichia coli cells starved in seawater and grown in seawater- wastewater mixtures. Appl. Environ. Microbiol. 53 : 1476- 148 1.

Munro, P.M., Gauthier, M.J., Breittmayer, V.A., et Bongiovanni, J . 1989. Influence of osmoregulation processes on starvation survival of Escherichia coli in seawater. Appl. Environ . Microbiol. 55 : 2017-2024.

Parestsky, D., et Werkman, C.H. 1947. The conversion of 2,3-butyleneglycol to acetylmethylcarbinol in bacterial fermenta- tion. Arch. Biochem. Biophys. 14 : 11-23.

Roszak, D.B., et Colwell, R.R. 1987. Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol. Rev. 51 : 365-379.

Xu, H.-S., Roberts, N., Singleton, F.L., et al. 1982. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microb. Ecol. 8 : 31 3-323.

Zaske, S.K., Dockins, W .S., et McFeters, G.A. 1980. Cell envelope damage in Escherichia coli caused by short-term stress in sea- water. Appl. Environ. Microbiol. 40 : 386-390.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

Uni

vers

ity o

f P.

E.I

. on

11/1

3/14

For

pers

onal

use

onl

y.