Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 plaque - 96 72561 5 plaques - 480 72562 TROUSSE DE DÉPISTAGE COMBINE DES ANTICORPS ANTI-VHC ET DE L’ANTIGENE VIRAL DU VIRUS DE L'HÉPATITE C DANS LE SÉRUM OU LE PLASMA HUMAIN PAR TECHNIQUE IMMUNOENZYMATIQUE

862224 – 2014/09

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Table des Matières 1. UTILISATION PREVUE ................................................................................... 3 2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST ............................................................ 3 3. PRINCIPE DU TEST ....................................................................................... 3 4. REACTIFS ..................................................................................................... 4 5. AVERTISSEMENTS ET MESURE DE PRECAUTION ....................................... 5 6. ECHANTILLONS ............................................................................................ 7 7. MODE OPERATOIRE ..................................................................................... 7 8. LIMITES DU TEST ....................................................................................... 10 9. CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ................................................ 11 10. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................... 13

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1. UTILISATION PREVUE : Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 est un test qualitatif immuno-enzymatique pour la mise en évidence de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) basé sur la détection des anticorps anti VHC et de l’antigène de capside dans le sérum ou le plasma humain. Ce test, destiné au dépistage de l’hépatite C, peut être utilisé par les laboratoires de diagnostic et les banques de sang.

2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST : Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à enveloppe à ARN de sens positif (9,5 kb) appartenant à la famille des Flaviviridae dont six génotypes majeurs ont été identifiés. Le VHC est reconnu comme la principale cause des hépatites virales non-A et non-B. L’infection par le VHC se caractérise par une forme aiguë et une forme chronique qui peut entrainer une cirrhose et des carcinomes hépatocellulaires. La preuve sérologique de l'infection par le VHC peut être obtenue par des tests de détection d’antigènes et/ ou d'anticorps et/ou d’ARN du VHC. Comparativement à un test de détection des anticorps anti-VHC seul, l'utilisation d’un test de dépistage combiné d’anticorps anti-VHC et de l’antigène de capside du VHC permet de réduire la fenêtre sérologique et d’améliorer la détection de l’infection.

3. PRINCIPE DU TEST : Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 repose sur l'utilisation d'une phase solide préparée avec des antigènes purifiés : deux protéines recombinantes de la région non structurale (NS3 et NS4), un peptide de la région structurale (capside) du virus de l’hépatite C et un anticorps monoclonal dirigé contre la capside de l’hépatite C. La phase liquide comprend deux conjugués. Le premier conjugué (R6) est constitué d’un anticorps monoclonal murin biotinylé dirigé contre la capside de l’hépatite C. Cet anticorps monoclonal ne réagit pas contre le peptide capside utilisé sur la phase solide. Le second conjugué (R7) est un mélange d’anticorps murins anti IgG humaines marqués à la peroxydase et de streptavidine marquée à la peroxydase. La mise en œuvre du test comprend les étapes réactionnelles suivantes : 1) Le conjugué 1 puis les échantillons à étudier et les sérums de contrôle sont distribués dans les puits de

la microplaque. Si des anticorps anti-VHC sont présents, ils se lient aux antigènes fixés sur la phase solide. Si des antigènes de capside de l’hépatite C sont présents, ces antigènes sont liés par les anticorps monoclonaux de la phase solide et les anticorps monoclonaux biotinylés du conjugué 1.

2) Après une incubation de 90 minutes à 37°C et une étape de lavage, le conjugué 2 contenant des anticorps anti IgG humaines marqués à la peroxydase et de la streptavidine marquée à la peroxydase sont ajoutés à chaque puits de la microplaque. Dans le cas de présence d’IgG humaines ayant réagi avec la phase solide, le conjugué anti IgG humain se lie aux anticorps humains. Le conjugué peroxydase/streptavidine se fixe sur la biotine du conjugué 1 dans le cas d’une présence de l’antigène de capside du virus de l’hépatite C dans l’échantillon.

3) Après 30 minutes d’incubation à 37°C et élimination des conjugués enzymatiques non liés par lavage, la présence des complexes antigène-anticorps-peroxydase sont révélés par addition du substrat.

4) Après 30 minutes d’incubation à température du laboratoire (18-30°C) et arrêt de la réaction, la lecture s'effectue au spectrophotomètre à 450/620-700 nm. L'absorbance mesurée pour un échantillon permet de conclure quant à la présence ou l'absence d'anticorps anti-VHC et/ou d’antigène de capside de l’hépatite C dans l’échantillon testé. L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'anticorps anti-VHC et/ou d’antigène capside de l’hépatite C liés sur la phase solide.

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4. REACTIFS : 4.1. Description :

Identification de l’étiquetage Description

Présentation / Préparation

72561

Présentation / Préparation

72562

R1 MICROPLATE

Microplaque 12 barrettes sensibilisées avec un anticorps monoclonal anti-capside du VHC, des antigènes recombinants purifiés (NS3, NS4) et un peptide de la région capside du VHC Identifiant spécifique = 93

1 plaque Prêt à l’emploi

5 plaques Prêt à l’emploi

R2 CONCENTRATED

WASHING SOLUTION (20X)

Solution de lavage concentrée 20 fois Tampon Tris NaCl pH 7,4 Conservateur : ProClin™ 300 (0,04%)

1 flacon (70 ml)

A diluer

1 flacon (235 ml) A diluer

R3 NEGATIVE CONTROL

Contrôle négatif Tampon Tris HCl, contenant de la S.A.B. (albumine de sérum bovin); Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon (1 ml)

Prêt à l’emploi

1 flacon (1 ml)

Prêt à l’emploi

R4 POSITIVE CONTROL

Contrôle positif Sérum humain contenant des anticorps anti-VHC négatif pour l'antigène HBs et pour les anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2 dilué dans un tampon Tris HCl contenant de la S.A.B. et inactivé photochimiquement Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon (1,5 ml)

Prêt à l’emploi

1 flacon (3 ml)

Prêt à l’emploi

R5a ANTIGEN POSITIVE CONTROL

Contrôle positif Antigène positif synthétique de contrôle contenant un peptide de capside lyophilisé

1 flacon (1 ml)

A reconstituer q.s. ad 1 ml

1 flacon (1 ml)

A reconstituer q.s. ad 1 ml

R5b ANTIGEN DILUENT

Diluant du R5a Eau distillée contenant un conservateur : ProClin™ 300 (0,5 %)

1 flacon (1 ml)

A reconstituer

1 flacon (1 ml)

A reconstituer

R6 CONJUGATE 1

Conjugué 1 Anticorps monoclonal murin dirigé contre la capside du VHC marqué à la biotine. Coloré en violet. Conservateur : Azide de sodium (<0,1%), Cosmocil® CQ (0,025%)

1 flacon (15 ml)

Prêt à l’emploi

2 flacons (2 x 30 ml)

Prêt à l’emploi

R7 CONJUGATE 2

Conjugué 2 Anticorps murins anti-IgG humaines marqués à la peroxydase et streptavidine marquée à la peroxydase Coloré en vert. Conservateur : ProClin™ 300 (0,5 %)

1 flacon (15 ml)

Prêt à l’emploi

2 flacons (2 x 30 ml)

Prêt à l’emploi

R8 SUBSTRATE BUFFER

Substrat Solution d'acide citrique et d'acétate de sodium pH 4,0 contenant 0,015% d'H2O2 et 4% de diméthylsulfoxyde (DMSO)

1 flacon (60 ml)

A reconstituer

2 flacons (2 x 60 ml)

A reconstituer

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R9 CHROMOGEN : TMB SOLUTION

(11X)

Chromogène : solution TMB Solution contenant du 3,3’, 5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB)

1 flacon (5 ml)

A diluer

2 flacons (2 x 5 ml) A diluer

R10 STOPPING SOLUTION

Solution d’arrêt Solution d'acide sulfurique (H2SO4 1N)

1 flacon (28 ml)

Prêt à l’emploi

3 flacons (3 x 28 ml)

Prêt à l’emploi

4.2. Conditions de conservation et de manipulation : La trousse doit être gardée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le coffret (sauf indication spécifique). Après ouverture et en l'absence de contamination, les réactifs R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 et R10 conservés à 2-8°C sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette.

Identification Conservation

R1 Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées à +2-8°C sont stables pendant 1 mois dans leur sachet d’origine refermé avec soin avec du ruban adhésif.

R2 La solution de lavage diluée peut être conservée à +2-30°C pendant 2 semaines. La solution de lavage concentrée (R2) peut être conservée à +2-30°C.

R5a + R5b Après reconstitution la solution de travail de l’antigène positif de contrôle (R5) peut être conservée 1 mois à +2-8°C et 2 mois à -20°C (jusqu’à 5 cycles de congélation/décongélation après congélation à -20°C).

R8 + R9 Après reconstitution, les réactifs conservés à l'obscurité sont utilisables pendant 6 heures à la température ambiante (18-30°C).

5. AVERTISSEMENTS ET MESURE DE PRECAUTION : Pour utilisation en diagnostic in vitro par un professionnel de santé.

5.1. Précautions relatives à la santé et à la sécurité : • Ce coffret doit être manipulé uniquement par du personnel qualifié formé aux procédures de

laboratoire et familier avec leurs risques potentiels. Porter des vêtements protecteurs appropriés, gants et protection des yeux/visage et manipuler de manière appropriée selon les bonnes pratiques de laboratoire requises.

• La trousse contient des composants du sang humain. Le matériel d’origine humaine utilisé dans la

préparation du réactif R4 (Positive Control) a été testé et trouvé non-réactif en antigène de surface du virus de l’hépatite B (Ag HBs), et en anticorps dirigés contre les virus de l’immunodéficience humaine (anti VIH-1 et anti VIH-2) et réactif en anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-VHC). De ce fait, il a été inactivé photochimiquement. Aucune méthode d’analyse connue ne peut offrir une complète assurance que des agents infectieux sont absents. Par conséquent, tous les dérivés du sang humain, réactifs et échantillons humains, doivent être manipulés comme s’ils étaient capables de transmettre une maladie infectieuse, en suivant les précautions universelles recommandées pour les pathogènes sanguin comme définies par OSHA les guides actualisés du CDC/NIH Biosafety in Microbiologique and Biomedical Laboratories et/ou les réglementations nationales, régionales et locales.

• Projections Biologiques : les projections de matériel humain doivent être traitées comme potentiellement infectieuses. Les projections ne contenant pas d’acide doivent être immédiatement décontaminées (incluant la zone de projection, le matériel et toute surface contaminée ou équipement) avec un désinfectant chimique approprié qui doit être efficace pour les risques potentiels relatifs aux échantillons impliqués (communément une dilution à 1:10 d’eau de Javel, 70-80% Ethanol ou Isopropanol, un iodophor [tel que 0,5% Wescodyne™ Plus, etc.), et séchées.

Les projections contenant de l’acide doivent être absorbées (essuyées) de manière appropriée ou neutralisées, la zone lavée avec de l’eau et séchée; le matériel utilisé pour absorber la projection peut nécessiter d’être jeté dans une poubelle pour risque biologique. Ensuite la zone doit être décontaminée avec un des désinfectants chimiques.

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NOTE : Ne pas mettre des solutions contenant de l’eau de Javel dans l’autoclave !

• Jeter tous les échantillons et le matériel utilisés pour réaliser le test comme s’ils contenaient un agent infectieux. Les déchets de laboratoire, chimiques ou biologiques doivent être manipulés et jetés selon les réglementations locales, régionales et nationales.

• Pour les risques et recommandations de précaution relatifs à certains composants chimiques dans

cette trousse, merci de vous référer au(x) pictogramme(s) indiqué(s) sur les étiquettes et à l’information fournie à la fin de la notice. La fiche de données de sécurité du produit est disponible sur www.bio-rad.com.

5.2. Précautions relatives au protocole : 5.2.1. Préparation :

La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : • Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d’un même essai. • Avant utilisation, sortir les réactifs de la boite et attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à la

température ambiante (18-30°C). • Le nom du test ainsi qu’un numéro d’identification spécifique du test sont mentionnés sur le cadre de

chaque microplaque. Ce numéro d’identification spécifique figure également sur chaque barrette. Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 : Numéro spécifique d’identification = 93

Cette identification doit être vérifiée avant chaque utilisation. Toute barrette dont le numéro de test est absent ou différent de celui correspondant au test réalisé, ne doit pas être utilisée. REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage (R2, identifié 20X en vert sur l’étiquette), de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11X en violet) et de solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et même lot de ceux-ci au cours d'une même série. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de notre société. Contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées.

• Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. • Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à

usage unique. • Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la distribution des réactifs. • La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence,

aucun élément métallique ne doit entrer en contact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou la solution substrat.

• La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé. Pour cette préparation, utiliser de préférence des récipients et du matériel de distribution en plastique à usage unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée. Conserver cette solution à l'abri de la lumière.

• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation.

5.2.2. Réalisation :

• Ne pas changer le mode opératoire • Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de

poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. • Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. • Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation : respecter le nombre de cycles

de lavages prescrits et s'assurer que toutes les cupules soient complètement remplies, puis complètement vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects.

• Pour des performances optimales, suivre attentivement les procédures de lavage décrites. Selon les instruments, il peut être nécessaire d’optimiser la procédure de lavage (augmentation du nombre d’étapes de cycles de lavage et/ou le volume de la solution de lavage pour chaque cycle) afin d’obtenir un niveau acceptable de bruit de fond pour les échantillons négatifs.

• Contacter Bio-Rad pour l’adaptation et les procédures spéciales.

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6. ECHANTILLONS : Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests sont effectués sur des échantillons non dilués de sérum ou de plasma (collectés sur EDTA, Citrate de Sodium ou ACD). L’utilisation d’échantillon prélevé sur des tubes contenant de l’héparinate de lithium n’est pas recommandée. Une diminution du signal a été observée sur les échantillons positifs pour l’antigène VHC. Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en suspension peuvent donner des résultats faussement positifs. Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à -20°C. Eviter les congélations/décongélations répétées (au-delà de 3 cycles de congélation /décongélation). Les échantillons doivent être décongelés à température ambiante (18-30°C). Il est recommandé de les homogénéiser par retournement avant utilisation. Les échantillons contenant jusqu’à 120 g/l d’albumine, 50 µg/l de biotine, et 200 mg/l de bilirubine, les échantillons lipémiques contenant jusqu’à l’équivalent de 33 g/l de trioléine et les échantillons contenant jusqu’à 2 g/l d’hémoglobine n’affectent pas les résultats. Il est cependant recommandé de ne pas utiliser des échantillons contaminés, hyper lipémiques et hyper hémolysés. Le chauffage des échantillons n’est pas recommandé car il peut réduire de façon significative la détection antigénique VHC. Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés.

7. MODE OPERATOIRE : 7.1. Equipement nécessaire mais non fourni :

• Eau distillée ou complètement déminéralisée. • Eau de javel et bicarbonate de soude. • Papier absorbant. • Films adhésifs. • Gants à usage unique. • Lunettes de protection. • Tubes à usage unique. • Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes pouvant distribuer 50 μl, 80 μl,

100 μl, 200 μl et 1 ml. • Eprouvettes graduées de 10 ml, 200 ml et 1 000 ml. Agitateur type vortex. • Système de lavage, automatique*, semi-automatique* ou manuel pour microplaque. • Bain-marie, ou incubateur sec*, pouvant être thermostaté à 37°C ± 1°C. • Conteneur de déchets contaminés. • Appareil de lecture* pour microplaques (équipés de filtres 490, 620, 450/620-700 nm).

(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils validés par nos services techniques.

7.2. Préparation des réactifs : 7.2.1. Réactifs prêts à l'emploi :

Réactif 1 (R1) : Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet aluminium scellé. Couper le sachet à l’aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus de la soudure. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement avec du ruban adhésif et le replacer à +2-8°C. Réactif 6 (R6) : Conjugué 1 Homogénéiser par retournement avant utilisation. Réactif 7 (R7) : Conjugué 2 Homogénéiser par retournement avant utilisation.

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7.2.2. Réactifs à reconstituer

Réactif 2 (R2) : Solution de lavage concentrée (20X) Diluer 20 fois la solution dans l’eau distillée. On obtient ainsi la solution de lavage prête à l’emploi. Prévoir 800 ml pour une plaque de 12 barrettes. Réactif 8 (R8) + Réactif 9 (R9) : Solution de révélation enzymatique Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11e (exemple : 1 ml de réactif R9 dans 10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Homogénéiser. Réactif 5a (R5a) + Réactif 5b (R5b) : Solution de travail (R5) Remplir le flacon de R5a avec la totalité de la solution du flacon R5b. Reboucher et attendre 10 minutes à température ambiante (18-30°C) en agitant de temps en temps le flacon par inversion du flacon.

7.3. Protocole opératoire : Suivre strictement la procédure. Utiliser les sérums des contrôles positifs et négatifs pour chaque test afin de valider la qualité du test. Suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoire suivantes :

1) Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons. 2) Préparer la solution de lavage diluée R2 et la solution de travail de l’antigène positif de contrôle (R5a

+ R5b) (se référer § 7.2). 3) Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l'emballage protecteur.

Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C.

4) Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement : • 100 μl de conjugué 1 (R6) dans chaque cupule puis • 50 μl de contrôle négatif (R3) en A1, • 50 μl de contrôle positif (R4) en B1, C1, D1, • 50 μl de la solution de travail de l’antigène positif de contrôle (R5a + R5b) en E1, • 50 μl du premier échantillon en F1, • 50 μl du deuxième échantillon en G1, etc...

Homogénéiser le mélange par 3 aspirations minimum ou avec un agitateur de microplaque durant 5 secondes. Si la distribution des échantillons excède 10 minutes, il est alors recommandé de distribuer les contrôles négatifs et positifs après les échantillons à tester. En fonction du système utilisé, il est possible de modifier la position ou l’ordre de distribution des contrôles. REMARQUE : Après la distribution des échantillons, la cupule contenant l’échantillon (ou les contrôles) vire du violet au bleu. Il est possible de vérifier la présence de (échantillon + conjugué 1) dans les cupules par lecture spectrophotométrique à 620 nm (se référer § 7.7). 5) Couvrir si possible d'un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer

l'étanchéité. 6) Incuber la microplaque pendant 90 minutes (± 5 min.) à 37°C ± 1°C. 7) Si nécessaire, retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur

pour déchets contaminés (contenant de l'hypochlorite de sodium) et ajouter dans chacune d'elles un minimum de 370 µl de solution de lavage. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4 fois (au total, au moins 5 lavages sont effectués). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 μl (si nécessaire, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). Si l'on dispose d'un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire.

8) Distribuer rapidement 100 μl de la solution de conjugué 2 (R7) dans toutes les cupules. Le conjugué doit être agité avant emploi. Recouvrir, si possible, d'un film neuf et incuber pendant 30 minutes (± 5 min.) à 37°C ± 1°C.

REMARQUE : Le conjugué est coloré en vert. Il est possible de vérifier la présence du conjugué dans les cupules par lecture spectrophotométrique à 620 nm (se référer § 7.7). 9) Retirer le film adhésif, vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois comme

précédemment. 10) Préparer la solution de révélation (réactif R8 + R9).

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11) Distribuer rapidement dans toutes les cupules 80 μl de la solution de révélation de l'activité enzymatique (R8 + R9) préalablement préparée. Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 minutes (± 5 min.) à température ambiante (18 à 30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.

REMARQUE : La distribution de la solution de révélation qui est colorée en rose, peut être contrôlée visuellement. (Se référer §7.7) 12) Ajouter 100 μl de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de

distribution que pour la solution de révélation.

REMARQUE : La distribution de la solution d'arrêt, qui est incolore, peut être contrôlée visuellement à ce stade de la manipulation. La coloration du substrat, rosée (pour les échantillons négatifs) ou bleue (pour les échantillons positifs), disparaît des cupules qui deviennent incolores (pour les échantillons négatifs) ou jaunes (pour les échantillons positifs) après addition de la solution d'arrêt.

13) Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution

de la solution d'arrêt, et, dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620-700 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

14) S'assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d'identification des plaques et des échantillons.

7.4. Contrôle qualité : Utiliser les contrôles positifs (R4 et R5) et le contrôle négatif (R3) dans chaque série de test pour valider l’essai. (Se référer §7.5).

7.5. Critères de validation du test : Le test est validé si les conditions ci-dessous sont respectées :

1) Pour le contrôle négatif (R3) :

La valeur d’absorbance mesurée doit être inférieure à 60% de la valeur seuil : DO < Valeur Seuil (VS) x 0.6

2) Pour le contrôle positif (R4) :

0,800 ≤ Moyenne de DO R4 ≤ 2,700 Si l’une des valeurs individuelles du contrôle positif (R4) s’écarte de plus de 30 % de la moyenne, refaire le calcul avec les deux valeurs de contrôle positif restantes.

3) Pour la solution de travail (R5) :

DO > 0,500

7.6. Calcul / Interprétation des résultats : La valeur seuil est déterminée à l’aide du contrôle positif R4 : Calculer la moyenne des absorbances mesurées pour le contrôle positif R4 Calcul de la Valeur Seuil (VS) :

Moyenne DO R4 VS = ---------------------

5 La présence ou l'absence des anticorps anti-VHC et /ou d’antigène de capside VHC est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée. Pour chaque échantillon, le ratio suivant est calculé : Ratio = DO de l’échantillon / Valeur Seuil Les échantillons dont la densité optique est inférieure à la valeur seuil sont considérés négatifs (ratio < 1) d'après le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2.

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Toutefois, les résultats situés juste au dessous de la valeur seuil (VS-10 % < DO < VS, ratios compris entre 0,9 et 1) doivent être interprétés avec prudence et il est conseillé de tester de nouveau les échantillons correspondant en double lorsque les systèmes utilisés et les procédures du laboratoire le permettent. Les échantillons dont la densité optique est supérieure ou égale au seuil (ratio ≥ 1) sont considérés comme initialement positifs et doivent être re-testés en double avant l'interprétation finale. Après répétition de l'essai, l'échantillon est considéré positif d'après le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA si la deuxième et/ou la troisième mesure est (sont) positive(s), c'est-à-dire supérieure ou égale à la valeur seuil. L'échantillon est considéré négatif si ces deux valeurs sont trouvées inférieures à la valeur seuil. Les échantillons qui ont été testés 2 fois et trouvés négatifs avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, mais dont l’une des deux valeurs de ratio est proche de la valeur seuil (ratio compris entre 0.9 et 1), doivent être interprétés avec prudence. Il est conseillé de re-tester le patient avec un autre prélèvement ou avec une autre technique. Dans le cas où des échantillons testés ont des densités optiques très faibles (DO négative) et que leur présence a été contrôlée ainsi que celle des réactifs, alors les résultats peuvent être interprétés comme négatif. Il est conseillé de confirmer les échantillons positifs conformément aux recommandations et algorithmes nationaux en vigueur.

7.7. Vérification spectrophotométrique du dépôt des échantillons et du conjugué (optionnel) :

Vérification du dépôt du Conjugué 1 (R6) et des échantillons lors de la première étape La présence simultanée du (R6) et de l’échantillon (ou du contrôle) peut être vérifiée par une lecture spectrophotométrique à 620 nm. Chaque puits contenant simultanément le (R6) et un échantillon (ou un contrôle) doit présenter une densité optique supérieure à 0,800. REMARQUE : après ajout de l'échantillon, le (R6) vire du violet au bleu Vérification du dépôt du conjugue (R7) lors de la deuxième étape Remarque : le conjugué 2 (R7) est de coloration verte. La présence de conjugué (R7) dans les cupules peut être vérifiée par lecture spectrophotométrique à 620 nm. La valeur de DO mesurée pour chaque cupule devra être supérieure à 0,300 (une valeur se situant en dessous de cette norme indique une mauvaise distribution du conjugué). Vérification du dépôt de la solution de révélation Il est possible de vérifier la présence de la solution de révélation rosée par lecture automatique à 490 nm. Une cupule contenant la solution de révélation doit avoir une densité optique supérieure à 0,100 (une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de révélation). Il y a une différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation rosée.

8. LIMITES DU TEST : En raison de la diversité des réponses immunologiques des patients infectés par le virus de l'hépatite C (notamment lors de séroconversions), des différences de détection entre tests peuvent être observées en fonction de la nature des protéines antigéniques utilisées. Un résultat analytique négatif lors d'un test de dépistage n'exclut donc pas la possibilité d'une exposition ou d'une infection par le virus de l'hépatite C. Selon la littérature, des patients porteurs du VHC sous traitement immunosuppresseurs ou co-infectés VIH-VHC, pourraient présenter des niveaux d’anticorps particulièrement bas, inférieurs à la limite de détection des tests anti-VHC. Toute technique ELISA peut produire des réactions faussement positives. Il est conseillé de vérifier la spécificité de la réaction pour tout échantillon trouvé positif répétable, selon les critères d'interprétation de la trousse Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 par une méthode appropriée : utilisation d'un test ELISA de dépistage des anticorps anti-VHC seul ou par un test immuno-blot pour prouver la présence d'anticorps anti-VHC. Si nécessaire, utiliser un test de biologie moléculaire de dépistage du génome viral du VHC. La méthode colorimétrique de vérification du dépôt des échantillons et/ou des conjugués et/ou de la solution de révélation ne permet pas de vérifier l'exactitude des volumes distribués mais seulement de montrer la

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présence d'échantillon et/ou des conjugués et/ou de la solution de révélation. Le taux de réponses erronées obtenues avec cette méthode est lié à la précision du système utilisé (des CV cumulés de pipetage et de lecture supérieurs à 10% peuvent dégrader significativement la qualité de cette vérification). L’utilisation du test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 n’est pas validée sur des pools d’échantillons ou des échantillons dilués. De fines particules ont pu être exceptionnellement observées dans le Conjugué 1 (R6), leur présence n’altère en aucun cas la qualité du réactif.

9. CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES : 9.1. Mesure de fidélité :

La répétabilité et la fidélité intermédiaire ont été déterminées à l’aide d’échantillons à différentes concentrations en anticorps anti VHC et en antigène VHC. Les échantillons ont été testés à 30 reprises lors d’une même série pour déterminer la répétabilité. Les échantillons ont également été testés en double pendant 20 jours à raison de 2 essais par jour. Les moyennes, les écart-types et les coefficients de variation (CV) ont été déterminés sur les ratios.

9.1.1. Répétabilité :

Echantillons N Ratio moyen Ecart Type CV %

Négatif S1 30 0,23 0,024 10,4

Positif Antigène

VHC

S2 30 1,21 0,048 4,0 S3 30 1,43 0,053 3,7 S6 30 7,18 0,166 2,3

Positif Anticorps anti VHC

S4 30 1,42 0,046 3,2 S5 30 1,35 0,083 6,1 S7 30 6,73 0,153 2,3

Les CV obtenus sur les 6 échantillons positifs sont <10%. 9.1.2. Fidélité intermédiaire :

Echantillons N Ratio moyen

Intra essai Inter essai / opérateur Inter jour Reproductibilité

totale ET CV % ET CV % ET CV % ET CV %

Négatif S1 80 0.22 0.017 7.5 0.028 12.5 0.029 12.7 0.043 19.4

Positif Antigène

VHC

S2bis 80 2,80 0,143 5,1 0,277 9,9 0,283 10,1 0,421 15,0 S3 80 1,56 0,124 7,9 0,129 8,2 0,083 5,3 0,197 12,6 S6 68 6,69 0,500 7,5 0,621 9,3 0,557 8,3 0,973 14,5

Positif Anticorps anti VHC

S4 80 1,57 0,062 3,9 0,125 8,0 0* N/A 0,140 8,9 S5 80 1,75 0,075 4,3 0,164 9,3 0* N/A 0,181 10,3 S7 80 7,69 0,285 3,7 0,531 6,9 0* N/A 0,603 7,8

* : La valeur de variance négative est estimée à 0.

Les CV obtenus sur les 6 échantillons positifs n’excèdent pas 15%.

9.2. Performances cliniques : Les performances du test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 ont été déterminées en analysant des échantillons provenant de donneurs de sang, de patients hospitalisés, de patients souffrant d’infection aigue et chronique pour le virus de l’hépatite C, et de patients présentant des signes cliniques sans rapport avec l’infection par le virus de l’hépatite C. Les études ont été réalisées sur 2 sites de dons de sang, sur un site hospitalier ainsi que sur le site de Bio-Rad.

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9.2.1. Spécificité diagnostique :

L’étude a été réalisée sur des échantillons de sérum et de plasma EDTA recueillis auprès de 2 centres de dons sur des donneurs non sélectionnés. Une étude de spécificité a également été réalisée sur des échantillons provenant de patients hospitalisés. Tous les échantillons ont été testés avec un test anti-VHC marqué CE.

Population Site Type d’échantillon Nombre

Echantillons répétés réactifs

(RR)

Spécificité (%)

Intervalle de confiance 95%

Donneurs de sang

#1 sérum 537 1 536/537

plasma 2002 0 2002/2002

#2 sérum 2638 2 2636/2638

#1 + #2 5177 3 5174/5177 99,94% 99,83% – 99,99%

Patients hospitalisés #3 sérum 502 1 501/502

99,80% 98,92% - 100,00%

* 3 donneurs trouvés indéterminés avec le test de référence ont été retirés des calculs

9.2.2. Sensibilité diagnostique :

La sensibilité diagnostique a été étudiée sur 575 échantillons provenant de patients infectés par le virus de l’hépatite C. Parmi ces échantillons, 25 provenaient de patients prélevés dans les 24 heures précédant le dosage. 481 échantillons génotypés (1; 2; 3; 4; 5; 6) ont été testés.

Table 1 : Génotypes testés

Génotypes 1 2 3 4 5 6

Total (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a,

2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n)

N 241 56 107 63 8 6 481

La sensibilité diagnostique sur l’ensemble des échantillons testés est de 100% (575/575) avec un intervalle de confiance à 95% de [99.4-100.0]. Echantillons provenant de patients présentant une infection aigue : 39 panels de séroconversions (incluant 10 profils capside, 10 profils NS3 et 19 profils multiples) ont été testés avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 et comparés d’une part à un test combiné antigène / anticorps et d’autre part à un test de détection anticorps anti VHC marqué CE. La précocité de réponse a été mesurée pour l’ensemble des panels. Parmi les 39 panels, 1 panel n’a pas été détecté avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, et 3 n’ont pas été détectés avec le test combiné pris en comparaison. Sur les 38 panels détectés avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, 5 ont été détectés de façon plus précoce, 27 ont été détectés de façon équivalente et 6 de façon plus tardive, par rapport au test combiné Ag-Ac. Comparé à un test anticorps, 28 panels ont été détectés de façon plus précoce, 9 de manière équivalente et 1 de façon plus tardive.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus Test combiné Ag-Ac VHC

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 versus Test Ac VHC

Nombre de panels 38 38

Détection plus précoce 5 28

Détection équivalente 27 9

Détection plus tardive 6 1

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9.3. Spécificité analytique / réactions croisées : 365 échantillons potentiellement interférents, contenant des anticorps dirigés contre des pathogènes pouvant entrainer des maladies infectieuses (Cytomégalovirus, Epstein Barr virus, VZV, virus de la rougeole, virus de la rubéole, virus des oreillons, herpes virus, virus de la grippe, virus de l’hépatite A, virus de l’hépatite B, VIH 1/2, HTLV 1/2, Syphilis, Toxoplasma gondii, Dengue, Chagas), des échantillons issus de groupes à risque (patients dialysés, atteints de cirrhose non hépatiques, de femmes enceintes, de femmes multipares) ou d’échantillons provenant de patients présentant des désordres en relation avec le système immunitaire (auto anticorps, facteurs rhumatoïdes, anticorps anti-souris, myélomes) ont été testés avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Deux échantillons ont été trouvés positifs répétables avec le test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. La spécificité observée sur cette population ciblée de 99,45% (363/365) est comparable à la spécificité observée sur une population hospitalière.

9.4. Effet crochet : L’existence d’un possible effet crochet a été étudiée en testant 5 échantillons à titres élevés à différentes dilutions. L’équivalence de résultats observés entre les échantillons non dilués et dilués indique l’absence d’effet crochet.

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