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MÉTABOLISME ET SIGNALISATION CELLULAIRE DANS LE QUADRICEPS DES PATIENTS ATTEINTS DE LA MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE Thèse Bruno Lemire Doctorat en médecine expérimentale Philosophiae Doctor (PhD) Québec, Canada © Bruno Lemire, 2013

Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

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MÉTABOLISME ET SIGNALISATION CELLULAIRE DANS LE QUADRICEPS DES PATIENTS ATTEINTS DE LA

MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE

Thèse

Bruno Lemire

Doctorat en médecine expérimentale Philosophiae Doctor (PhD)

Québec, Canada

© Bruno Lemire, 2013

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III

Résumé La dysfonction musculaire est une des manifestations importantes de la

maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Cette dysfonction musculaire

amène plusieurs anomalies musculaires tant au niveau clinique, structural,

métabolique que biochimique. Ces anomalies contribuent à l’intolérance à l’effort,

la perte de masse maigre et de force musculaire, ainsi qu’à la diminution de la

qualité de vie des patients atteints de la MPOC.

Cette thèse a pour objectif général l’étude de la dysfonction musculaire

périphérique dans la MPOC, plus précisément 1) l’étude des mécanismes

cellulaires impliqués dans l’atrophie musculaire 2) l’étude du métabolisme

musculaire à la suite d’un exercice en endurance et 3) l’étude de la réponse

cellulaire suite à un exercice en résistance.

Tout d’abord, nous avons démontré que la voie de signalisation des MAPK,

plus précisément les protéines p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK, pourrait jouer un rôle

important dans le développement de l’atrophie musculaire chez les patients

atteints de la MPOC.

Par la suite, nous avons démontré que le SAA1 pourrait être impliqué dans

la dysfonction des muscles périphériques chez les patients atteints de la MPOC.

Le SAA1 est augmenté de façon significative tant au niveau de l’expression du

gène que le niveau d’ARNm chez les patients présentant une MPOC.

En second lieu, nous avons démontré une plus grande dépendance du

système énergétique à la glycolyse a été observée lors d’un exercice en

endurance chez les patients MPOC, ce qui pourrait contribuer à l’intolérance à

l’exercice chez la MPOC.

Finalement, nous avons déterminé qu’il existe une réponse cellulaire

différente pour les protéines associées au maintien de la masse maigre suite à une

session d’exercice en résistance chez les patients MPOC en comparaison à des

sujets sains appariés pour l’âge.

Cette thèse jette donc la lumière sur la contribution des voies de

signalisation et des facteurs inflammatoires impliqués dans la dysfonction

musculaire chez les patients présentant une MPOC et de la réponse à l’exercice

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IV

tant en endurance qu’en résistance dans la MPOC. Ces résultats ajouteront aux

connaissances moléculaires et cellulaires qui contribuent à la dysfonction

musculaire périphérique et à l’intolérance à l’effort chez les patients atteints de la

MPOC.

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V

Abstract Peripheral muscle dysfunction is one of the most important systemic

manifestations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). This

dysfunction brings many muscle abnormalities at the clinical, structural, metabolic

and biochemical levels. These abnormalities contribute to the exercise intolerance,

loss of muscle mass and force as well as diminishing quality of life of patients with

COPD.

This thesis as for general objective the investigation of peripheral muscle

dysfunction in COPD, more precisely 1) the study of signalling pathways involved

in muscle atrophy 2) the study of muscle metabolism in response to endurance

exercise involved in exercise intolerance and 3) the study of muscle cellular

adaptations to resistance exercise involved in the less than optimal response

following resistance training in patients with COPD.

First, we showed the possible contribution of the MAPKs, more precisely

p38 MAPK, ERK1/2 and JNK, to the peripheral muscle dysfunction in COPD. The

phosphorylation levels as well as the mRNA expression of these key proteins are

elevated in patients with COPD compared to age-matched healthy controls.

We also demonstrated that SAA1 could have a possible role in the

peripheral muscle dysfunction in COPD.

Secondly, we observed that patients with COPD have a greater reliance on

the muscle glycolytic metabolism during an endurance exercise done until

exhaustion, therefore possibly contributing to the exercise intolerance seen in

patients with COPD.

Lastly, we demonstrated that the cellular adaptation in response to

resistance exercise training is different for proteins involved in muscle mass

regulation in patients with COPD compared to age-matched healthy controls, thus

possibly contributing to the less-than-optimal response to resistance exercise

training in patients with COPD.

This thesis puts at the forefront the signalling pathways and inflammatory

markers contributing to the inherent peripheral muscle dysfunction in patients with

COPD, as well as the investigation of exercise response in patients with COPD.

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These results will add to the scientific knowledge of the metabolic and cellular

aspects of peripheral muscle dysfunction in COPD.

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VII

Table des matières

Résumé .................................................................................................................... III Abstract ..................................................................................................................... V Table des matières .................................................................................................. VII Liste des tableaux .................................................................................................... XI Liste des figures ..................................................................................................... XIII Liste des abréviations ............................................................................................ XV Dédicace .............................................................................................................. XVII Remerciements ..................................................................................................... XIX Avant-Propos ........................................................................................................ XXI Liste des publications ........................................................................................... XXV CHAPITRE I .............................................................................................................. 1

INTRODUCTION GÉNÉRALE ............................................................................... 1 1.1 LA MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE .......................... 2

1.1.1 Introduction générale ................................................................................ 2 1.1.2 Le diagnostic de la MPOC ........................................................................ 3 1.1.3 Épidémiologie ........................................................................................... 5 1.1.4 Pathologie et physiopathologie ................................................................. 5 1.1.5 Les exacerbations dans la MPOC ............................................................. 7 1.1.6 Traitements ............................................................................................... 8 1.1.7 Les manifestations systémiques de la MPOC ......................................... 10

1.2 LE MUSCLE SQUELETTIQUE ...................................................................... 13 1.2.1 Introduction générale .............................................................................. 13 1.2.2 Le métabolisme énergétique ................................................................... 15 1.2.3 La signalisation intramusculaire associée au maintien de la masse musculaire ........................................................................................................ 22

IGF-1/AKT/mTOR ..................................................................................... 25 Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) .............................................. 26 Ubiquitine-protéasome (Ub-P’some) ......................................................... 27 Les cytokines inflammatoires .................................................................... 29

1.2.4 La réponse cellulaire à l’exercice en résistance ...................................... 31 1.3 LA DYSFONCTION MUSCULAIRE ASSOCIÉE À LA MPOC ....................... 38

1.3.1 Observations cliniques ............................................................................ 38 1.3.2 Observations structurales ....................................................................... 39 1.3.2 Observations métaboliques ..................................................................... 41 1.3.2 Observations biochimiques ..................................................................... 42 1.3.3 Les causes .............................................................................................. 43 1.3.4 La solution ............................................................................................... 48

CHAPITRE II ........................................................................................................... 50 PROBLÉMATIQUES, OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES DES TRAVAUX ............ 50

CHAPITRE III .......................................................................................................... 56 MAPK SIGNALLING IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH COPD ............ 56

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3.1 Page titre ........................................................................................................ 57 3.2 Résumé .......................................................................................................... 58 3.2 Abstract .......................................................................................................... 59 3.3 Introduction .................................................................................................... 60 3.4 Methods ......................................................................................................... 61 3.5 Results ........................................................................................................... 67 3.6 Discussion ...................................................................................................... 69 3.7 Conclusion ..................................................................................................... 73 3.8 References ..................................................................................................... 74 3.9 Tables ............................................................................................................ 78 3.10 Figures Legend ............................................................................................ 81 3.11 Figures ......................................................................................................... 82

CHAPITRE IV .......................................................................................................... 88 SAA1 EXPRESSION IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH COPD ........ 88 4.1 Page Titre ...................................................................................................... 89 4.2 Résumé .......................................................................................................... 90 4.2 Abstract .......................................................................................................... 91 4.3 Introduction .................................................................................................... 92 4.4 Methods ......................................................................................................... 94 4.5 Results ........................................................................................................... 97 4.6 Discussion ...................................................................................................... 99 4.7 Conclusion ................................................................................................... 101 4.8 References ................................................................................................... 102 4.9 Figure Legend .............................................................................................. 105 4.10 Figure Legend ............................................................................................ 110 4.11 Figures ....................................................................................................... 111 Figure1 ............................................................................................................... 111

CHAPITRE V ......................................................................................................... 116 QUADRICEPS METABOLISM DURING CONSTANT WORKRATE CYCLING EXERCISE IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE ................ 116 5.1 Page titre ...................................................................................................... 117 5.2 Résumé ........................................................................................................ 118 5.2 Abstract ........................................................................................................ 119 5.3 Introduction .................................................................................................. 120 5.4 Methods ....................................................................................................... 122 5.5 Results ......................................................................................................... 127 5.6 Discussion .................................................................................................... 129 5.7 Conclusion ................................................................................................... 132 5.8 References ................................................................................................... 134 5.9 Tables .......................................................................................................... 138 5.10 Figures Legend .......................................................................................... 141 5.11 Figures ....................................................................................................... 142

CHAPITRE VI ........................................................................................................ 145 THE ACTIVATION OF SIGNALLING PATHWAYS INVOLVED IN MUSCLE MASS REGULATION AFTER AN ACUTE BOUT OF RESISTANCE TRAINING EXERCISE IN PATIENTS WITH COPD ............................................................ 145 6.1 Page titre ...................................................................................................... 146

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6.2 Résumé ....................................................................................................... 147 6.2 Abstract ....................................................................................................... 148 6.3 Introduction .................................................................................................. 149 6.4 Methods ....................................................................................................... 151 6.5 Results ......................................................................................................... 155 6.6 Discussion ................................................................................................... 157 6.7 Conclusion ................................................................................................... 159 6.8 References .................................................................................................. 161 6.9 Tables .......................................................................................................... 165 6.10 Figures Legends ........................................................................................ 168 6.11 Figures ....................................................................................................... 169

CHAPITRE VII ....................................................................................................... 173 DISCUSSION GÉNÉRALE ................................................................................ 173

CHAPITRE VIII ...................................................................................................... 181 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .............................................................. 181

RÉFÉRENCES ...................................................................................................... 185 ANNEXES ............................................................................................................. 201

Annexe A ........................................................................................................... 201

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XI

Liste des tableaux TABLEAU 1. SYMPTÔMES CLINIQUES POUR LE DIAGNOSTIC D’UNE MPOC ...................... 4 TABLEAU 2. LES STADE DE SÉVÉRITÉ DE LA MPOC ...................................................... 5 TABLEAU 3. REVUE DE LA LITTÉRATURE COMPARANT LES RÉPONSES CELLULAIRES

TEMPORELLES À L’EXERCICE EN RÉSISTANCE. ..................................................... 37 TABLEAU 4. REVUE DE LA LITTÉRATURE COMPARANT LES DISTRIBUTIONS DE TYPES DE

FIBRES DU QUADRICEPS CHEZ LES PATIENTS ATTEINTS DE LA MPOC .................... 41

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XIII

Liste des figures FIGURE 1. MÉCANISMES D’ACTION DE LA PATHOPHYSIOLOGIE DE LA MPOC. .................. 7 FIGURE 3. LE MUSCLE SQUELETTIQUE.. ..................................................................... 14 FIGURE 4. SCHÉMA RÉCAPITULATIF DES FILIÈRES ÉNERGÉTIQUES MENANT À LA

PRODUCTION D’ATP ......................................................................................... 18 FIGURE 5. SCHÉMA DE LA CONTRIBUTION TEMPORELLE DES DIFFÉRENTES FILIÈRES

ÉNERGÉTIQUES À L’EXERCICE ............................................................................ 20 FIGURE 6. SÉQUENCE DES ÉVÈNEMENTS DE L’ADAPTATION CELLULAIRE À LA SUITE DE

STIMULI ............................................................................................................ 22 FIGURE 10. MÉCANISMES D’ACTION MENANT À LA DYSFONCTION MUSCULAIRE SUITE AU

SÉDENTARISME ET À L’INACTIVITÉ PHYSIQUE. ...................................................... 46 FIGURE 11. MÉCANISMES D’ACTION MENANT À LA DYSFONCTION MUSCULAIRE CHEZ LA

MPOC. ........................................................................................................... 47 FIGURE 12. MÉCANISMES CELLULAIRES PROPOSÉS POUR LA VOIE DES MAPK. .......... 175

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XV

Liste des abréviations

% Pourcentage 4E-BP1 eIF4E binding protein 1 μg Microgramme μM Micromolaire ADN Acide désoxyribonucléique AKT Protéine kinase B ARNm Acide ribonucléique messager ATP Adénosine triphosphate COPD Chronic obstructive pulmonary disease CRP Protéine C-réactive CS Citrate synthase CVF Capacité vitale forcée E1 Ubiquitin-activating enzyme E2 Ubiquitin-carrier protein E3 Ubiquitin-protein ligase ERK Extracellular signal-regulated kinase FoxO Forkhead box of the class O GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease g gramme GSK-3β Glycogen synthase kinase 3β HADH 3-hydroxyacyl-CoA deshydrogenase IGF-1 Insulin-like growth factor 1 IGF1R Récepteur de l’insulin-like growth factor 1 IL Interleukine JNK Jun N-terminal kinase kDa Kilodalton LDH Lactate dehydrogenase MAFbx Muscle Atrophy F-box ou Atrogin1 MAPK Mitogen-activated protein kinase mM Millimolaire mmHg Millimètre de mercure ms Millisecondes MPOC Maladie pulmonaire obstructive chronique mTOR Mammalian target of rapamycin MuRF1 Muscle RING Finger 1 NF-κB Nuclear factor kappa B p70S6K Isoforme de 70 kDa de la protéine S6 kinase 1 PaO2 Pression partielle en oxygène Sec Seconde SEM Standard error of the mean TNF-α Tumor necrosis factor alpha

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Ub-P’some Système ubiquitine-protéasome VEMS Volume expiratoire maximal en 1 seconde VEMS/CVF Indice de Tiffeneau

2OV max Consommation maximal d’oxygène

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XVII

Dédicace

Quelques pensées qui m’ont influencé et inspiré pendant mon doctorat! ‘Make everything as simple as possible, but not simpler’

Albert Einstein ‘Bad times have a scientific value. These are occasions a good learner would not miss’

Ralph Waldo Emerson ‘If you're not prepared to be wrong, you'll never come up with anything original’

Sir Ken Robinson

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Remerciements D’abord et avant tout, j’aimerais remercier mon superviseur et directeur de

thèse François Maltais pour m’avoir donné la chance de faire partie de son équipe de

recherche à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec. François

est dynamique, persévérant et son intérêt envers la recherche est très contagieux. Je me

considère très privilégié de t’avoir rencontré, toi ainsi que toute ton équipe de recherche.

Grâce à toi et à l’équipe, mon doctorat a été une expérience professionnelle et sociale des

plus enrichissantes. J’espère avoir l’occasion der collaborer avec toi sur d’autres projets

dans l’avenir.

Je remercie également mon co-superviseur Richard Debigaré. Richard a un esprit

de synthèse remarquable et une approche pédagogique rigoureuse. Il m’a transmis une

façon « fondamentale » de voir les choses. Merci pour ta simplicité qui m’a permis de ne

pas trop dévier pendant mon doctorat…une chose parfois difficile à faire en science

fondamentale!

Merci à Didier Saey qui a partagé ses données postdoctorales afin de créer notre

collaboration sur le projet des métabolites. Merci pour ton expertise, ton expérience, ta

camaraderie et nos bonnes discussions!

Merci à Claude H. Côté et Yohan Bossé qui ont siégé sur mon comité d’examen

de pré-doctoral. Vous avez su m’aider tout au long de mon doctorat avec mes projets et

mes articles scientifiques.

J’aimerais aussi remercier ma copine Marie-Claude pour sa patience et ses

encouragements tout au long de mon doctorat, surtout dans les derniers mois à Québec.

La complémentarité que nous avons développée pendant nos études à Québec est

exceptionnelle et j’espère collaborer un jour avec toi.

Plusieurs personnes ont contribué de près ou de loin au succès de cette thèse.

Merci à :

Annie Dubé qui m’a « coacher » dans le laboratoire de science fondamentale. En

fait, elle m’a tout montré! C’est à elle que je dois ma découverte des sciences

fondamentales au quotidien. Un grand merci de m’avoir aussi aidé dans ma vie de tous les

jours…En plus d’être une exellente professionnelle de recherche, elle est une personne

très généreuse. Je n’oublierai jamais ton sourire contagieux et nos fous rires à n’en plus

finir!!! Je n’aurais pas pu trouver mieux comme collègue de travail et amie. Merci de ton

amitié.

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Marie-Ève Paré, Marie-Eve Thériault, Marc-André Caron et Mathieu Morissette

à qui je dois un gros merci pour votre soutien dans le laboratoire. Ce n’est pas toujours

facile de travailler avec un « clinicien ». Vous avez toute mon admiration pour votre

persévérance et vos connaissances hors pair en science fondamentale. Merci pour vos

conseils de fondamentalistes!

Philippe Gagnon et Vincent Mainguy à qui je dis un très gros merci. Je suis

extrêmement content de vous avoir rencontré pendant mon doctorat. Quel bel adon cette

rencontre! Ce n’est pas à tous les jours que l’on rencontre des individus de votre calibre.

Merci de m’avoir intégré dans votre groupe et j’espère que notre amitié continuera malgré

la distance qui nous séparera. Bonne chance pour la suite!

Un gros merci aux docteurs Steeve Provencher et Julie Milot qui m’ont

grandement aidé avec les nombreuses biopsies musculaires dans le cadre de mes projets

de recherche. Votre collaboration a été primordiale pour la réussite de mes projets.

Merci à toute l’équipe élargie du centre de recherche et surtout aux infirmières

de recherche Marie-Josée Breton, Josée Picard, Brigitte Jean et Marthe Bélanger pour vos efforts pendant mon doctorat. Tout geste, aide, idée et temps donné ne sont pas

passés inaperçu. Vous avez contribué de façon importante à cette thèse et je vous en

remercie sincèrement.

J’aimerais remercier tous les patients qui ont participé à mes études. De

nombreux sacrifices et points de suture ont été faits pendant mes 4 ans de doctorat!

Je voudrais aussi remercier les Instituts de Recherches en Santé du Canada

pour le support financier pendant mes trois premières années au doctorat et aussi le

Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec pour la bourse doctorale lors de ma dernière année d’étude.

Et finalement, merci à mes parents qui mon supporté moralement et monétairement pendant non seulement mon doctorat mais aussi pendant toutes mes années d’études universitaires…ce qui veut dire 9 ans, 3 villes différentes et 6 déménagements!!!

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XXI

Avant-Propos Cette thèse comprend 4 articles scientifiques ayant comme thème général la

dysfonction musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC).

L'introduction abordera les concepts généraux (épidémiologie, pathogénèse et

traitements) de la MPOC ainsi que ses conséquences systémiques. Par la suite, deux

concepts généraux seront discutés, soit le métabolisme énergétique du muscle

squelettique ainsi que la signalisation cellulaire associée au maintien de la masse

musculaire et à la réponse à l’exercice. Les 4 articles scientifiques suivront. À noter que

les références inclues dans les articles scientifiques sont formatées selon le style du

journal dans lequel ils ont été soumis, publiés ou en préparation et que ces références

sont exclues des références finales de la thèse.

Article 1 : MAPK SIGNALLING IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH CHRONIC

OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Cette publication met l’emphase sur la contribution possible de la voie de

signalisation des «Mitogen-Activated Protein Kinase», plus précisément les protéines p38

MAPK, ERK 1/2 and JNK à la perte de masse maigre chez les patients atteints de la

MPOC. Étant donné que la voie des ‘MAPK’ est activée par des conditions perturbantes

pour la cellule telles que l’inflammation et le stress oxydant et que ces facteurs se

retrouvent souvent associés à la MPOC, nous voulions étudier la phosphorylation et le

niveau d’ARNm des trois principales protéines de cette voie de signalisation. De plus, les

résultats obtenus avec les expériences cellulaires et animales démontrent que les MAPK

ont un rôle à jouer dans la diminution du diamètre des myotubes en culture et même dans

l’atrophie musculaire chez la souris. Notre objectif était de quantifier l’activation des

MAPK ainsi que les niveaux d’ARNm dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC

en faisant le lien avec le maintien de la masse musculaire dans cette population. Cette

étude a été réalisée sous la direction du Dr François Maltais. Le protocole a été écrit par

une professionnelle de recherche du Dr Maltais avant mon arrivée dans l’équipe. J'ai

recruté les patients, amassé les données, analysé tous les résultats et rédigé la version

initiale de l'article. Le Dr Richard Debigaré, mes collègues Dre Annie Dubé et Marie-Eve

Thériault ont collaboré à l'interprétation des résultats ainsi qu’à la réalisation des images

d’immunohistochimie. Le Dr Claude H. Côté a collaboré à la révision de l'article. Ces

résultats ont été présentés au congrès de l’«American Thoracique Society» en mai 2011.

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XXII

Ils ont fait l’objet d’une présentation orale et sont publiés dans le «Journal of Applied

Physiology» (110).

Article 2 : QUADRICEPS SERUM AMYLOID A1 EXPRESSION IN COPD

Cette publication aborde une découverte fortuite à la suite d’une analyse de

données génétiques obtenues à partir du quadriceps de patients atteint de la MPOC. En

effet, dans le cadre d’une étude parallèle, nous avions fait une analyse de puces à ADN

avec les échantillons de nos patients ayant une MPOC. Les résultats de ces analyses ont

mis en évidence la surexpression d’un facteur inflammatoire dans le quadriceps des

patients MPOC, soit le Sérum Amyloïde A1 (SAA1). Le SAA1 pourrait jouer un rôle

d’importance dans le maintien de la masse maigre chez les patients MPOC en plus d’être

un biomarqueur potentiel de la dysfonction musculaire périphérique chez la MPOC. Notre

objectif était de mesurer les niveaux de SAA1 au niveau génétique et transcriptionnel chez

des patients atteints de la MPOC en période de stabilité de la maladie ou pendant une

exacerbation de leur maladie. Cette étude a été réalisée sous la direction du Dr François

Maltais. J'ai amassé les données, analysé tous les résultats et rédigé la version initiale de

l'article avec l’aide du Dre Annie Dubé. Le Dr Richard Debigaré et le Dr Yohan Bossé ont

collaboré à l'interprétation des résultats. Ces résultats sont en préparation pour

soumission prochainement.

Article 3 : QUADRICEPS METABOLISM DURING CONSTANT WORKRATE CYCLING

EXERCISE IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Cette publication met en évidence la contribution du système glycolytique au

métabolisme musculaire pendant l’effort chez les patients atteints de la MPOC. Étant

donné qu’il existe une diminution de la capacité oxydative du muscle squelettique ainsi

qu’une transition de fibre musculaire de type I à type II, nous voulions mesurer l’impact de

ces anomalies sur le métabolisme musculaire à l’effort dans la MPOC. Notre objectif était

de mesurer les métabolites, enzymes et substrats énergétiques lors d’un effort en

endurance réalisé jusqu’à épuisement chez les patients atteints de la MPOC. Cette étude

a été réalisée sous la direction du Dr François Maltais. Ce travail a été fait dans le cadre

du stage postdoctoral du Dr Didier Saey à l’IUCPQ. Dr Saey a écrit le protocole, recruté

les patients et amassé les données. J’ai analysé les résultats et écrit le manuscrit avec

l’aide du Dr Saey. J’ai également coordonné les efforts d’analyses avec le laboratoire du

Dr Tuppling à l’Université de Waterloo. Ces résultats ont été présentés au congrès du

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XXIII

«Regroupement Stratégique en MPOC du FRQ-S» en février 2009 lors d’une présentation

orale et sont publiés dans le «Journal of Applied Physiology» (173).

Article 4 : THE ACTIVATION OF SIGNALLING PATHWAYS INVOLVED IN MUSCLE

MASS REGULATION AFTER AN ACUTE BOUT OF RESISTANCE TRAINING

EXERCISE IN PATIENTS WITH COPD

Ce projet témoigne de l’activation de certaines protéines essentielles ayant une

influence sur le maintien de la masse musculaire à la suite d’une session d’exercice en

résistance chez les patients atteints de la MPOC. Étant donné que les études sur la

réadaptation dans la MPOC démontrent une faible amélioration de la force et de la masse

musculaire en comparaison avec des sujets sains et que certaines voies de signalisation

seraient dysfonctionnelles dans la MPOC, nous voulions étudier la voie de signalisation

IGF-1/AKT/mTOR et la voie des MAPK en réponse à l’exercice en résistance chez les

patients atteints de la MPOC. Cette étude a été réalisée sous la direction du Dr François

Maltais. J'ai écrit le protocole, recruté les patients, amassé les données et analysé tous les

résultats en collaboration avec la Dre Annie Dubé. Le Dr Richard Debigaré, mes collègues

Marie-Eve Thériault et le Dre Annie Dubé ont collaboré à l'interprétation des résultats. Ces

résultats ont été présentés au congrès de l’«American Thoracic Society» en mai 2012. Ils

ont fait l’objet d’une présentation orale et sont en préparation pour une soumission dans le

«Journal of Applied Physiology».

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Liste des publications 1- MAPK SIGNALING IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE Bruno B. LEMIRE, Richard DEBIGARÉ, Annie DUBÉ, Marie-Eve THÉRIAULT, Claude H. CÔTÉ, François MALTAIS 2- QUADRICEPS SERUM AMYLOID A1 EXPRESSION IN COPD Bruno B. LEMIRE, Marie-Eve THÉRIAULT, Annie DUBÉ, Yohan BOSSÉ, Richard DEBIGARÉ, François MALTAIS 3- QUADRICEPS METABOLISM DURING CONSTANT WORKRATE CYCLING EXERCISE IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE Didier SAEY*, Bruno B. LEMIRE*, Philippe GAGNON, Éric BOMBARDIER, A. Russel TUPLING, Claude H. CÔTÉ, François MALTAIS 4- THE ACTIVATION OF SIGNALLING PATHWAYS INVOLVED IN MUSCLE MASS REGULATION AFTER AN ACUTE BOUT OF RESISTANCE TRAINING EXERCISE IN PATIENTS WITH COPD Bruno B. LEMIRE, Annie DUBÉ, Marie-Eve THÉRIAULT, Richard DEBIGARÉ, Claude H. CÔTÉ, François MALTAIS

* co-premier auteur Co-auteur :

1. CHARACTERIZATION OF THE QUADRICEPS MUSCLE IN PATIENTS WITH MILD COPD Philippe GAGNON, Bruno B. LEMIRE, Annie DUBÉ, Didier SAEY, Alexandra PORLIER, Steeve PROVENCHER, François MALTAIS

2. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PERIPHERAL MUSCLE SATELLITE CELLS FROM PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE Marie-Eve THÉRIAULT, Marie-Ève PARÉ, Bruno B. LEMIRE, François MALTAIS and Richard DEBIGARÉ.

3. GUIDE BPCO : L’EXPLORATION FONCTIONNELLE À L’EFFORT. Maltais F, Provencher S, Lemire BB, Gagnon P, Mainguy V. 2011

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

CHAPITRE I

INTRODUCTION GÉNÉRALE

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

2

1.1 LA MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE

1.1.1 Introduction générale

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une maladie

chronique caractérisée par l'essoufflement, la toux et une production

d’expectorations. Cette maladie s’installe et progresse pendant des années avant

l’apparition des symptômes et le diagnostic est posé plusieurs années après

l’apparition des symptômes. La MPOC se présente sous deux principales formes,

soit la bronchite chronique et l'emphysème et n’exclut pas une combinaison des

deux.

La bronchite chronique est définie par une toux productive chronique d’une

durée d’au moins trois mois, et ce, pendant deux années consécutives chez un

patient chez qui d'autres causes de toux chronique ont été exclues (32). Cette

définition a été utilisée dans plusieurs études, en dépit de la durée des symptômes

arbitrairement choisis et du manque de justification biologique.

L'emphysème est défini par l'élargissement anormal et permanent des

espaces aériens qui sont en aval des bronchioles terminales. Ceci est

accompagné par la destruction des parois alvéolaires, sans fibrose évidente (165).

Cependant, une augmentation du collagène dans les poumons des patients

présentant une MPOC modérée a déjà été démontrée, ce qui indique qu’un certain

degré de fibrose est probablement présent, bien que ce ne soit pas la lésion

principale (151, 211). L'emphysème peut exister chez des individus qui n'ont pas

d'obstruction bronchique, mais il est le plus souvent accompagné par un

obstruction bronchique modérée ou sévère (66, 135).

La MPOC évolue lentement sur une période qui peut s’étendre sur plusieurs

années. L’évolution de la MPOC est associée à de fréquentes exacerbations de la

maladie et à la perte de capacité respiratoire pouvant mener au décès prématuré

(162). Avec la progression de la maladie, la diminution de la capacité pulmonaire

entraîne de plus en plus d'essoufflement, une réduction importante des niveaux

d'activité physique et une réduction considérable de la qualité de vie des patients.

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

3

L'American Thoracic Society (ATS), l’European Respiratory Society (ERS)

ainsi que la British Thoracic Society (BTS) ont toutes et chacune définie la MPOC

de façon légèrement différente au cours des 15 dernières années (189).

L'«Initiative Mondiale pour la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique», dans

un rapport produit par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) et

l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a définit la MPOC comme suit (66) :

« La maladie pulmonaire obstructive chronique est une maladie

évitable et traitable avec des effets extrapulmonaires significatifs

qui peuvent contribuer à la sévérité de la maladie chez certains

patients. Sa composante pulmonaire est caractérisée par une

limitation du débit aérien qui n'est pas entièrement réversible. La

limitation du débit est habituellement progressive et associée à

une réponse inflammatoire anormale des poumons à des

particules ou des gaz nocifs. »

1.1.2 Le diagnostic de la MPOC

Le diagnostic de la MPOC doit être suspecté chez tous les patients qui

signalent une combinaison d’un ou plusieurs des symptômes suivants: toux

chronique, expectoration chronique, dyspnée au repos ou à l'effort dans un

contexte d’exposition à un irritant respiratoire (fumée de cigarette ou de

biocarburant, produits chimiques reliés au travail) (32). Étant donné que la

dyspnée à l'effort est souvent sous-estimée par les individus, ceux-ci consultent

plus tardivement leur médecin, ce qui retarde considérablement le diagnostic de la

MPOC.

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

4

Tableau 1. Symptômes cliniques pour le diagnostic d’une MPOC Toux chronique : Présente de façon intermittente ou à tous les

jours, à tout moment de la journée, rarement seulement la nuit

Production chronique d’expectoration :

Toute forme d’apparition de production de sécrétion

De la dyspnée qui est : Progressive (s’aggrave avec le temps)

Persistante (tous les jours) Décrite comme «une augmentation de l’effort à

respirer», «chercher son souffle» Aggravée par l’exercice

Aggravée par les infections respiratoires

Facteurs de risques :

Histoire tabagique élevée Exposition aux poussières ou aux produits

chimiques Exposition à la fumée de combustion

Basé sur L'Initiative Mondiale pour la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique Les patients qui présentent les caractéristiques décrites dans le tableau 1

devraient subir une spirométrie, surtout s'il y a des antécédents d'exposition à des

facteurs de risques de la MPOC (par exemple, la fumée de cigarette) (161). La

spirométrie est utilisée pour diagnostiquer la MPOC, déterminer la gravité et la

réversibilité de l'obstruction bronchique et monitorer la progression de la maladie.

Les valeurs les plus importantes qui sont mesurées sont le volume expiratoire

maximal en une seconde (VEMS) et la capacité vitale forcée (CVF). Lorsque le

ratio VEMS/CVF (l’Indice de Tiffeneau) est inférieur à 0,70, cela indique la

présence d’obstruction des voies respiratoires.

La MPOC est confirmée quand un patient, qui présente des symptômes qui

sont compatibles avec la MPOC, montre également une obstruction bronchique

(rapport VEMS/CVF inférieur à 0,70 et un VEMS moins de 100% de la valeur

prédite) et qu’il n'y a aucune autre explication pour les symptômes et l’obstruction

des voies aériennes. L’importance de la diminution du VEMS par rapport aux

valeurs prédites déterminera le degré de sévérité de la maladie. Le tableau 2

démontre les quatre stades de la MPOC selon «L’Initiative Mondiale pour la

Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique» (GOLD).

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

5

Tableau 2. Les stade de sévérité de la MPOC GOLD I: MPOC légère VEMS/CVF < 0,70

VEMS ≥ 80% de la valeur prédite

GOLD II: MPOC modérée VEMS/CVF < 0,70 50% ≤ VEMS < 80% de la valeur prédite

GOLD III: MPOC sévère VEMS/CVF < 0,70

30% ≤ VEMS < 50% de la valeur prédite

GOLD IV: MPOC très sévère

VEMS/CVF < 0,70 VEMS< 30% de la valeur prédite ou VEMS< 50% de la valeur prédite + insuffisance respiratoire chronique

1.1.3 Épidémiologie

Selon un rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé, la MPOC, avec

ses trois millions de décès en 2004 seulement, s’est vue attribuer le quatrième

rang au classement des causes de mortalité pour l’ensemble de la population tout

âge confondu (222). Selon de récentes estimations, il a été évalué que 10% de la

population mondiale âgée de 40 ans et plus est au prise avec une MPOC de stade

II ou plus avancé (26). Au Canada, on estime qu’environ trois millions de

Canadiens souffriraient de cette maladie chronique (5). Dans un sondage du

Canadian Community Health Survey (CCHS) en 2005, 4,4% (329 500) d’hommes

et 4,8% (425 300) de femmes rapportaient avoir reçu un diagnostic de MPOC par

un professionnel de la santé (27). De plus, 84% des Canadiens âgés de plus de 35

ans et qui affirment souffrir de MPOC étaient ou ont déjà été fumeurs.

Les coûts associés au traitement des patients atteints de la MPOC sont

considérables. Au Canada, les coûts directs et indirects associés atteignaient

3200$ par patient en 2003 (34). Ce montant peut même s’élever à 10 000$

annuellement en soins et médicaments pour un patient de stade GOLD IV (83).

1.1.4 Pathologie et physiopathologie

Le tabagisme est la principale cause de la MPOC dans les pays

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

6

industrialisés. La fumée de cigarette contient plusieurs agents nocifs pour les voies

respiratoires et l'épithélium bronchique, augmentant ainsi l’activation de processus

cellulaires liés au stress oxydant (73, 120, 188) et à l’inflammation (11).

L’inflammation bronchique est associée à une infiltration neutrophilique, qui

est typique à la MPOC (22). Cette augmentation des neutrophiles contribue à la

libération de protéases, perpétuant les déséquilibres en faveur de la destruction du

tissu pulmonaire. De plus, les neutrophiles augmentent les niveaux d'élastase

relâchés dans le tissu pulmonaire. L’élastase augmente le nombre de

macrophages et l'activation des cellules épithéliales (22). Par conséquent,

l’inflammation bronchique cause une hypersécrétion des cellules épithéliales

menant aux signes et symptômes de la bronchite chronique, et à une destruction

du tissu pulmonaire menant aux signes et symptômes de l’emphysème.

De son côté, le stress oxydant au niveau du poumon et de la circulation

sanguine a bien été démontré dans la MPOC (48, 118). Les sources de stress

oxydant proviennent majoritairement des cellules inflammatoires, comme les

macrophages et les neutrophiles, et génèrent les dérivés réactifs de

l'oxygène (DRO) lors de leur activation. Chez les sujets en santé, l’équilibre entre

les agents oxydants et antioxydants est présent et contribue à garder un

environnement stable. Chez la MPOC, les conséquences du stress oxydant

surviennent lorsque ce stress oxydant n’est pas contrebalancé par le système

antioxydant, ce qui contribue au remodelage pulmonaire et à la destruction du tissu

pulmonaire (122).

Ces phénomènes se traduisent ultimement en obstruction des voies

respiratoires. La figure 1 démontre les facteurs de remodelage contribuant à la

limitation du débit ventilatoire chez la MPOC (88).

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

7

Figure 1. Mécanismes d’action de la pathophysiologie de la MPOC. Adapté de Barnes et al. 2000 (9)

CD8+ : ‘cluster of differentiation’ positif; IL-8 : Interleukin-8.

Chez les individus en santé, une fois les agents nocifs supprimés par les

défenses primaires, les processus de réparation devraient, normalement,

permettre aux voies aériennes un retour à une structure et à une fonction normale.

Un processus de réparation inadéquat est considéré comme étant un joueur clé

dans le développement de la MPOC, malgré l'abandon du tabac (216). Cet échec

de la réparation contribue à la destruction du parenchyme pulmonaire et à

l’hypersécrétion de mucus dans les voies aériennes.

1.1.5 Les exacerbations dans la MPOC

Une exacerbation aiguë de la MPOC est une aggravation soudaine des

symptômes (essoufflement, production d’expectorations) qui dure généralement

plusieurs jours. Elle peut être déclenchée par une infection bactérienne, virale ou

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

8

par des polluants environnementaux. En général, les infections causent environ

75% ou plus des exacerbations. L’inflammation des voies respiratoires est

augmentée au cours de l’exacerbation entraînant une augmentation de

l'hyperinflation en réduisant le débit d'air expiré et en rendant inefficace les

échanges gazeux (209). Ces périodes d’exacerbations sont caractérisées par des

diminutions importantes des niveaux d’activités physiques et par une plus grande

utilisation de soins de santé, ce qui ultimement contribue à une diminution

importante de la qualité de vie des patients atteints de la MPOC (210). Malgré le

fait que ces épisodes sont caractérisés par une baisse de la fonction respiratoire, il

est estimé que seulement 50% des exacerbations sont rapportées au médecin

traitant (183).

1.1.6 Traitements

La pharmacothérapie associée à la MPOC est utilisée pour prévenir et

diminuer les symptômes (en particulier la dyspnée), réduire la fréquence et la

gravité des exacerbations, améliorer l'état de santé en général et améliorer la

capacité à l’exercice (66). L'«Initiative Mondiale pour la MPOC» suggère une

combinaison de traitements pharmacologiques et non-pharmacologiques pour

contrôler les symptômes, favoriser la diminution des exacerbations et améliorer la

qualité de vie des patients (66).

Les piliers de la pharmacothérapie pour la MPOC sont les

bronchodilatateurs (beta2-agonistes et anticholinergiques) et les anti-

inflammatoires (glucocorticostéroïdes inhalés) administrés seuls ou en

combinaison, en fonction de la gravité de la maladie et de la réponse au

traitement.

L'éducation thérapeutique dont l’objectif est de favoriser la compréhension

de la maladie et de son traitement ainsi que l’apprentissage des techniques

d’inhalation des bronchodilatateurs et des anti-inflammatoires est essentiel. Il est

également essentiel que les patients apprennent à reconnaître les symptômes et

les signes annonciateurs des exacerbations afin de pouvoir amorcer rapidement

un traitement thérapeutique adéquat.

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

9

L’arrêt tabagique est évidemment essentiel et les thérapies

complémentaires, telles que l'oxygénothérapie au long cours et la réadaptation

pulmonaire doivent être envisagées car elles jouent un rôle important dans la

gestion de la MPOC.

Afin de déterminer si le patient répond de façon adéquate à la thérapie, il est

nécessaire de surveiller les symptômes (par exemple, la dyspnée, la tolérance à

l'effort, la toux, les expectorations), la fonction respiratoire, la fréquence d'utilisation

des bronchodilatateurs de courte action et la fréquence des exacerbations (66).

Dans le cadre de cette thèse, une discussion plus approfondie sur la réadaptation

pulmonaire est de mise.

La réadaptation pulmonaire est un concept thérapeutique large. Elle est

définie par l'American Thoracic Society (ATS) et l’European Respiratory Society

(ERS) comme étant « une intervention fondée sur des preuves, multidisciplinaire et

globale pour les patients qui présentent des symptômes et ont une diminution des

activités de la vie quotidienne» (142). Intégrée dans le traitement individualisé du

patient, la réadaptation pulmonaire est conçue pour réduire les symptômes,

optimiser l’état fonctionnel et réduire les coûts des soins de santé par la

stabilisation et/ou la prévention des manifestations systémiques de la maladie (15,

142, 160, 167). Les patients atteints de la MPOC diminuent plus souvent

qu’autrement leur niveau d’activité physique car cette dernière aggrave la dyspnée.

Le déconditionnement progressif associé à l'inactivité physique initie un cercle

vicieux de détérioration de la maladie. La réadaptation pulmonaire a donc comme

but de briser ce cercle vicieux. Ces points plus spécifiques seront discutés

davantage plus loin dans cette thèse ainsi que dans les articles scientifiques

présentés.

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

10

1.1.7 Les manifestations systémiques de la MPOC

Même si la MPOC touche principalement les poumons, elle s’accompagne

également d’importantes manifestations systémiques (figure 2). Figure 2. Mécanismes des manifestations systémiques dans la MPOC. Adapté de Barnes et Celli 2009. (10)

IL-6 ; Interleukin 6 : IL-8 : Interleukin 8 : TNF-α ; Tumor necrosis factor alpha.

La MPOC est souvent associée à d’autres maladies chroniques, par

exemple les maladies cardiovasculaires, ou d’autr es non-spécifiques à la MPOC

comme la dépression (47). D'autres conditions sont également considérées

secondaires à la maladie, comme la cachexie et la perte de la masse maigre,

l'ostéoporose et la dysfonction du muscle squelettique, tant au niveau biochimique

que métabolique. Un intérêt particulier est porté sur les muscles respiratoires et

périphériques parce que leur fonctionnement (ou dysfonctionnement) influencent

non seulement les symptômes de la maladie, mais contribuent directement à

l’intolérance à l’effort des patients (71). La faiblesse des muscles squelettiques

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

11

favorise, indépendamment des paramètres de la fonction pulmonaire, l’état de

santé (187), l’utilisation de soins de santé (42), et la survie (132, 196). Les muscles

représentent donc une cible potentielle pour améliorer le niveau fonctionnel des

patients et la qualité de vie de ces derniers, en dépit de l’atteinte primaire

irréversible aux poumons. Au cours des derniers 25 ans, des études cliniques et

biochimiques ont dressé un portrait des anomalies des muscles squelettiques, en

particulier le quadriceps (190). Par contre, l'étiologie de ces changements demeure

un sujet de recherche d’intérêt dans la communauté scientifique. Pendant cette

même période, les études moléculaires et cellulaires concernant la dysfonction

musculaire se sont multipliées. Malgré ce fait, les mécanismes pertinents à la

MPOC demeurent à ce jour largement inconnus.

L’analyse de la littérature sur les causes des manifestations systémiques de

la MPOC révèle un point primordial : celle-ci est multifactorielle. Les facteurs

considérés comme potentiellement pertinents au dysfonctionnement des muscles

périphériques chez la MPOC comprennent l'hypoxie, l'hypercapnie, la prise de

corticostéroïdes, la nutrition souvent déficiente, le déséquilibre hormonal

anabolique/catabolique, l’inflammation locale et systémique, le stress oxydant, la

susceptibilité génétique et le dernier et non le moindre, l’inactivité physique. Les

plus importants d’entre eux seront discutés plus loin dans cette thèse.

Il existe deux points de vue intéressants à considérer lors de l’étude de

l’étiologie des manifestations systémiques de la MPOC. Plusieurs chercheurs

proposent que ces manifestations soient le résultat d'un «spill-over» systémique

des évènements inflammatoires et réparateurs qui se produisent dans les

poumons des patients atteints de la MPOC, tout en gardant la maladie au centre

du processus. Pour d'autres chercheurs, les manifestations pulmonaires de la

MPOC sont une forme d'expression d'un état d’inflammation systémique générale

avec l’implication de plusieurs organes (55, 185). Il est très clair qu’une direction

scientifique adéquate devra être mise place pour élucider les liens qui existent

entre la MPOC et ces expressions systémiques de la maladie.

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CHAPITRE I. La maladie pulmonaire obstructive chronique

12

Étant donné que le muscle squelettique est d’une importance capitale dans

les manifestations systémiques chez la MPOC, la prochaine section introduira ce

sujet qui servira de base pour cette thèse.

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

13

1.2 LE MUSCLE SQUELETTIQUE

1.2.1 Introduction générale

Le muscle squelettique a pour fonction d’assurer le mouvement, la stabilité

des articulations et la production de chaleur. Le muscle squelettique constitue

environ 40% de notre masse corporelle contribuant à environ 25% de notre

métabolisme de base et est en soi, un réservoir important de protéines (56).

Le muscle est composé de plusieurs types de cellules (Figure 3). Les

myotubes (fibre musculaire), l’endothélium vasculaire, les fibroblastes et les

cellules satellites composent le tissu musculaire. Les fibres musculaires sont

organisées en groupes appelés faisceaux. Les faisceaux sont séparés par une

couche de tissu conjonctif, soit le périmysium. À l’intérieur d’un seul faisceau, nous

pouvons retrouver des dizaines de fibres musculaires. Chaque fibre musculaire est

une cellule individuelle composée principalement de longs cylindres, soit les

myofibrilles. Les myofibrilles comptent pour environ 90% du volume des cellules

musculaires. Chaque myofibrille est un enchaînement de sarcomères et ceux-ci

constituent l’unité de base contractile du système musculaire. Un sarcomère

individuel est un regroupement organisé de myofilaments épais (myosine),

chevauchés de part et d’autre par des myofilaments minces (actine, troponine,

myotroponine). C’est l’interaction entre la myosine et l’actine des filaments minces,

en présence de calcium cytosolique, qui engendre les contractions musculaires.

Finalement, l’organisation extrêmement serrée des myofibrilles fait en sorte que les

mitochondries et les noyaux de la cellule musculaire sont principalement confinés

dans les zones périphériques du sarcoplasme du myocyte.

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

14

Figure 3. Le muscle squelettique. Adapté de Farell et al. 2012.

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

15

Pour répondre aux nombreuses et diversifiées tâches physiques

quotidiennes, le muscle est composé de plusieurs types de fibres musculaires. Les

fibres musculaires sont classées selon le type de myosine qu’elles expriment.

Chez l’humain, trois types de fibres coexistent. Les fibres I, IIa et IIx (56). Les

fibres de type I ou fibres à contraction lente (slow twitch) démontrent

principalement un métabolisme oxydatif pour produire leur énergie et sont

résistantes à la fatigue. Elles sont donc le type de fibres de prédilection des efforts

d’endurance, comme la course de longue durée. Les fibres de type IIx, ou fibres à

contraction rapide (fast twitch), démontrent principalement un métabolisme

glycolytique pour produire leur énergie et sont à prédominance anaérobique. Elles

sont donc le type de fibres impliquées dans les efforts de haute intensité et de

courte durée. Les fibres de type IIa, également à contraction rapide, démontrent un

métabolisme intermédiaire (oxydatif et glycolytique). Elles sont utiles pour des

efforts aussi bien d’endurance que de sprint (56).

1.2.2 Le métabolisme énergétique

La transition de l’état de repos à une contraction tétanique musculaire

impose une demande importante au métabolisme musculaire en comparaison aux

autres tissus. Cette contraction musculaire dépend principalement de l'énergie

obtenue par l'hydrolyse de l'adénosine triphosphate (ATP). L’utilisation de l’ATP

peut augmenter de 0.01 μmol/g/sec au repos jusqu’à 10 μmol/g/sec en 30 ms (56).

C’est seulement en considérant la réponse du système énergétique musculaire

dans son ensemble que nous pouvons apprécier et comprendre ce phénomène

bien orchestré.

Plusieurs filières énergétiques sont connues pour nous permettent de

subvenir à nos besoin en ATP. Il s’agit de la filière de l’adénosine triphosphate-

créatine phosphate (ATP-CP ou phosphagène), de la filière glycolytique et de la

filière aérobie.

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

16

La filière de l’adénosine triphosphate-créatine phosphate (ATP-CP ou phosphagène) Une certaine quantité d’ATP est entreposée dans nos muscles, ce qui

permet une contraction rapide au début de l’effort. Par la suite, la formation rapide

de l'ATP peut être accomplie par le transfert d’un lien phosphate riche en énergie

de la phosphocréatine (CP) vers l’adénosine diphosphate (ADP). Cette réaction est

catalysée par l’enzyme créatine kinase (CK). Il y a aussi la réaction de l’adénylate

kinase (ADK) qui transforme 2 molécules d’ADP en ATP (56). Parce que la

quantité de CP et d’ADP dans le muscle est faible, la contribution de cette réaction

est très courte (entre 0 et 10 secondes après le début de l’effort). Lorsque

l'oxygénation et la contribution du système glycolytique du muscle deviennent

suffisantes, les quantités de CP et d’ADP sont reconstituées.

La filière glycolytique Une fois la source énergétique des phosphagènes épuisée, de nouveaux

substrats sont nécessaires pour assurer une resynthèse rapide de l’ATP. C’est le

glycogène emmagasiné dans les muscles et le foie ainsi que le glucose sanguin

qui assurent cette production énergétique. La production d’énergie se déroulant

dans le sarcoplasme musculaire (grâce aux réactions enzymatiques) permet un

effort de haute intensité mais limité en durée (entre 30 secondes et 2 à 3 minutes)

(56). La dégradation du glucose produit de l’ATP et de l’acide pyruvique destinés

au cycle de Krebs pour la phosphorylation oxydative, mais qui se transforme aussi

en lactate lors d’une chute d’oxygène et lorsque que l’effort musculaire élevé

cause une surproduction de pyruvate et une saturation du complexe pyruvate

déshydrogénase (PDC). Le lactate accumulé dans les muscles et déversé dans le

sang est associé à une altération du fonctionnement des filières énergétiques, à la

fatigue musculaire, à la douleur musculaire ainsi qu’à l’apparition d’ions H+ qui

seraient à l’origine de l’acidité musculaire suite à un exercice de haute intensité (3).

Par contre, les mécanismes reliés à ce phénomène ne sont pas encore tous

élucidés.

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

17

La filière aérobie L’apport d’oxygène dans les fibres musculaire va permettre un énorme

rendement énergétique. Plus de 90% de l’ATP synthétisé au niveau musculaire est

fourni par la filière aérobie. La transformation se produit dans les mitochondries,

centrales énergétiques permettant de transformer l’ATP dans les cellules

musculaires. Cette filière, par l’entremise du cycle de Krebs, permet d’oxyder

l’acide pyruvique issu de la glycolyse (phosphorylation oxydative) et métaboliser

les lipides (beta-oxydation) pour produire de l’énergie. Elle rend aussi possible la

réutilisation du lactate pour resynthétiser du glycogène ou de l’ATP. À ce titre,

nous pouvons considérer l’acide lactique non pas comme un déchet, mais comme

une source d’énergie chimique. Seuls les acides présents dans le sang seront

tamponnés et éliminés dans les urines (3).

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

18

En guise de résumé des principaux acteurs qui seront abordés dans le

chapitre 3, la figure suivante récapitule l’ensemble des joueurs capitaux des filières

énergétiques.

Figure 4. Schéma récapitulatif des filières énergétiques menant à la production

d’ATP.

ATP, Adénosine triphosphate : ADP, Adénosine diphosphate : Pi, Phosphate inorganique : CK, Créatine kinase : Cr, Créatine : ADK, Adénylate kinase : HK, Hexokinase : G-1-P, Glucose-1-Phosphate : G-6-P, Glucose-6-Phosphate : F-6-P, Fructose-6-Phosphate: PFK, Phosphofrutokinase : CS, Citrate synthase HADH, 3-Hydroxyacyl CoA-déhydrogénase : LDH, Lactate déhydrogénase.

De façon hiérarchique, le système ATP-CP procure la première source

d’ATP au début de l’exercice. Tout d’abord, l’ATP accumulé dans le muscle sera

utilisé alors que les réactions de la CK et de l’ADK se poursuivront afin de soutenir

le niveau d’ATP pendant les premières secondes de l’exercice. Par la suite, la

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

19

glycolyse, par l’entremise de la dégradation du glycogène et du glucose, produira

une grande quantité d’ATP, de pyruvate en présence d’oxygène et de lactate en

anaérobie. Plusieurs étapes de la glycolyse sont cruciales, dont la reprise du

Phosphate inorganique (Pi) et des réactions de l’Hexokinase (HK) qui transforme

le glycogène en Glucose-6-Phosphate (G-6-P) et la Phosphofrutokinase (PFK) qui

transforme le Fructose-6-Phosphate (F-6-P) en pyruvate. Une quantité de pyruvate

sera transformée en lactate par la réaction du lactate déhydrogénase (LDH),

surtout en début d’exercice, à très haute intensité et en réduction d’oxygène. Lors

de l’exercice persistant, le pyruvate sera repris par le cycle de Krebs où le glucose

et les lipides formeront une très grande quantité d’ATP avec la réaction de la

phosphorylation oxydative et de la beta-oxydation. Les enzymes comme la citrate

synthase (CS), première étape du cycle de Krebs, et la 3-Hydroxyacyl CoA

dehydrogenase (HADH), troisième étape de la beta-oxydation des lipides, servent

de marqueur de la capacité oxydative. Il est à noter que ces filières énergétiques

travaillent sans cesse pendant un effort physique. Seulement leur contribution en

production d’ATP changera pendant l’exercice (Figure 5).

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

20

Figure 5. Schéma de la contribution temporelle des différentes filières énergétiques à l’exercice

Les substrats énergétiques Les principaux types de «carburants» utilisés par le muscle sont le

glycogène, le glucose et les acides gras libres (54, 58, 214). Les sources d'énergie

utilisées par les muscles qui travaillent lors d’un exercice en endurance dépendent

d'un certain nombre de facteurs comme l'intensité, le type et la durée de l'exercice,

le conditionnement physique de l’individu et le régime alimentaire de celui-ci (67).

Au repos, les muscles utilisent principalement les acides gras (56, 58). Au cours

d’un exercice de haute intensité, l'exercice isométrique, la glycolyse anaérobie et

la réaction de la CK sont les principales sources d'énergie (214). Pendant

l'exercice sous-maximal, le type de substrat utilisé par le muscle est fortement

dépendant de l'intensité relative de l'exercice. Lors d’un exercice sous-maximal de

faible intensité, les principales sources d'énergie sont le glucose du sang et les

acides gras libres. Pendant un exercice sous-maximal de haute intensité, la

proportion d'énergie provenant du glycogène et du glucose est augmentée, et par

conséquent, le glycogène devient la principale source. Une des causes de la

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

21

fatigue musculaire survient lorsque le glucose et les réserves de glycogène sont

épuisées (communément appelé «frapper le mur») (56). Les sources d'énergie

musculaire varient également selon la durée de l'exercice. Au cours de la première

heure d’un exercice à faible intensité (comme le jogging), le glucose, le glycogène,

et acides gras libres sont les principales sources d'énergie. L'absorption des

acides gras libres par le muscle augmente sensiblement après la première heure

d’exercice jusqu’à environ la 4ième heure. Après quatre heures, l'oxydation des

lipides devient la principale source d'énergie (40). La section suivant abordera

comment le muscle maintien sa structure et son volume au niveau cellulaire.

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

22

1.2.3 La signalisation intramusculaire associée au maintien de la masse musculaire

Le muscle squelettique est un tissu malléable capable d’altérer son type et

sa quantité de protéines en réponse à des perturbations de l’homéostasie

cellulaire. Le stress oxydant, l’inflammation et la contraction musculaire

représentent de puissants stimuli qui peuvent générer des perturbations

significatives dans le milieu cellulaire musculaire et ainsi provoquer des

modulations importantes et initier une adaptation à l’environnement extracellulaire.

La perturbation de l’homéostasie de façon fréquente et répétée produit une

cascade d’évènements biochimiques qui modifieront dans un premier temps les

mécanismes adaptatifs, suivi par les modifications des caractéristiques

musculaires pour ainsi répondre aux perturbations cellulaires (Figure 6) (217).

Figure 6. Séquence des évènements de l’adaptation cellulaire à la suite de stimuli. Adapté de Williams 2011

Basé sur Williams 2011 (217)

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

23

Les avancées biotechnologiques ont permis la découverte de mécanismes

spécifiques de la signalisation cellulaire qui initient la réplication de séquences

d’ADN et participent à la traduction du messager génétique pour ainsi créer de

nouvelles protéines. Ultimement, les processus d’adaptation et de plasticité

musculaires sont déterminés par la source, l’intensité et la fréquence des stimuli

ainsi que la demi-vie des protéines influentes.

Le procédé par lequel un signal mécanique est converti en évènement

biochimique dans une cellule musculaire a été nommé la mécanotransduction (84).

Ce procédé inclut l’activation de messagers primaires et secondaires qui initient

une cascade d’évènements cellulaires, résultant en l’activation et/ou la

désactivation de différentes voies de signalisation reliées entre autres à la

synthèse et à la dégradation protéique (217). Plusieurs stimuli peuvent entraîner

une modulation de diverses voies de signalisation, mais il n’en demeure pas moins

que la contraction musculaire est l’un des facteurs les plus puissants pour

influencer les voies de signalisation associées à la synthèse ou à la dégradation

protéique (84).

La majorité des signaux proviennent des facteurs suivants, mais ne sont pas

nécessairement limités à :

Une surcharge musculaire (l’entraînement en résistance);

Une augmentation de l’activation électrique du muscle (EMG);

Une influence autocrine (IGF-1, prostaglandines, etc.);

Une réponse associée aux cytokines inflammatoires (IL-6, TNF, IL-8, etc.);

Une influence des facteurs de croissance;

Une diminution des enzymes associées au profil glycolytique (CK, LDH) ;

Une régulation accrue de la myostatine,

et finalement,

Une traduction de signaux extracellulaires qui activent les signaux

intracellulaires ainsi que des facteurs de transcription.

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

24

Une réponse commune aux signaux extracellulaires est l’activation de

protéines kinases et de phosphatases intracellulaires qui modifient le niveau de

phosphorylation de plusieurs molécules intracellulaires et nucléaires. En bout de

ligne, ces modifications affecteront la fonction de protéines cruciales au niveau

musculaire. En plus de la phosphorylation et de la déphosphorylation des

protéines, d’autres modifications post-transcriptionnelles comme l’ubiquitination, la

glycosylation, l’acétylation et d’autres peuvent exercer une influence sur l’activité

des protéines (89). La prochaine section mettra l’emphase sur les principales voies

de signalisation influencées par les cytokines inflammatoires la phosphorylation et

l’ubiquitination, surtout impliquées dans l’hypertrophie du muscle squelettique,

c’est-à-dire une réponse biologique où la surface transversale des fibres d’un

muscle augmente, et l’atrophie du muscle squelettique, c’est-à-dire une diminution

de la taille de la cellule principalement causée par la perte de protéine et la

diminution du volume cytoplasmique.

Les voies de signalisation Après l'initiation de signaux extracellulaires, de nombreuses cascades de

signalisation s’activent dans les cellules musculaires. Il y a plusieurs voies de

signalisation ainsi que de nombreuses possibilités de « cross-talk » entre ces

voies. À ce jour, plusieurs voies de signalisation qui influencent le maintien de la

masse musculaire ont été démontrées (Figure 7) (178).

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

25

Figure 7. Schéma des principales voies de signalisation jouant un rôle dans le maintien de

IL-6, Interleukin 6 : IL-8, Interleukin 8 : TNF-α, Tumor necrosis factor alpha : NF-κB, Nuclear factor kappa B: MAPK, Mitogen-Activated Protein Kinase: ERK, Extracellular signal-regulated kinase: JNK, c-Jun N-terminal Kinase : p38, p38 MAPK : IGF-1, Insulin-like growth factor 1: mTOR, Mammalian target of rapamycin: p70S6K, Isoforme de 70 kDa de la protéine S6 kinase 1 : 4E-BP1, eIF4E binding protein 1: FoxO, Forkhead box of the class O: GSK-3β, Glycogen synthase kinase 3β: Atrogin1, MAFbx Muscle Atrophy F-box: MuRF1, Muscle RING Finger 1: Translocation Activation Inhibition Un «P» dans un cercle signifie une phosphorylation de la protéine. Un «FT» signifie un facteur de transcription.

IGF-1/AKT/mTOR Une des voies de signalisation ayant un rôle majeur dans la synthèse

protéique est la cascade de signalisation reliée à ‘l'Insuline-like Growth Factor’

(IGF-1) et la protéine kinase B (AKT) (146). Dans cette cascade, l'IGF-1 se lie à

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

26

son récepteur, une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle et active entre autres

AKT, ce qui ultimement promouvoit la synthèse des protéines par l'activation du

mammalian target of rapamycin (mTOR), une protéine pivot dans la traduction

protéique (117) et de la protein 70 s6 kinase (p70S6K), une kinase nécessaire pour

le maintien de la masse musculaire (144). De plus, la phosphorylation d’AKT

bloque la glycogen synthase kinase-inhiber 3β (GSK-3β), inhibiteur de la synthèse

protéique (146).

En plus de l’activation de la p70S6K, mTOR est aussi connue pour inhiber la

l’Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1), qui est un

régulateur négatif du facteur d’initiation de la transcription eIF-4E (158). Bien que

la voie de l'IGF-1 active la protéine mTOR en aval de la phosphorylation de 4E-

BP1 et de la p70S6K, les acides aminés provenant du milieu extracellulaire peuvent

aussi influencer directement mTOR, ce qui provoque une stimulation subséquente

de l'activité de la p70S6K (79).

En plus de stimuler la synthèse protéique, AKT inhibe également

l'expression des E3 ligases, soit l’enzyme Muscle-specific RING Finger E3 (MuRF)

et le muscle-specific atrophy gene-1/muscle atrophy F-box (Atrogin1) par

l’entremise de la phosphorylation de la classe de facteurs de transcription forkhead

box O (FoxO) (172), ce qui séquestre celui-ci au cytoplasme et ne peut donc pas

lui permettre de transcrire et d’initier l’expression des gènes des E3 ligases et ainsi

participer à la dégradation protéique par la voie de l’Ubiquitine-protéasome (Ub-

P’some) qui sera discutée dans une section subséquente.

Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) Les MAPK sont activées en réponse à un stress mécanique comme

l’exercice, un stress oxydant et même l’inflammation (98). Les 3 membres les plus

étudiés de la famille des MAPK, sont l’Extracellular signal-Regulated Kinase 1-2

(ERK 1/2), la p38 MAPK et la c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Ils sont connus pour

être impliqués dans le processus d’atrophie musculaire en culture cellulaire et chez

les modèles animaux d'immobilisation (94, 114). Dans des cellules C2C12 exposées

au TNF-α, l’activation de ERK 1/2 donne lieu à une plus grande expression d’une

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

27

E3 ligase spécifique aux muscles, Atrogin1, qui est impliquée dans la dégradation

des protéines, suggérant que ERK 1/2 pourrait jouer un rôle crucial dans la

pathogenèse de l'atrophie musculaire (150). D’un autre côté, compte tenu de la

réponse très variée de ERK 1/2 à différent stimuli, il est raisonnable de suggérer

que ERK 1/2 est un médiateur de processus cellulaires d’important pour le

maintien de la masse musculaire chez l’humain (98). La p38 MAPK est également

un médiateur important dans la réponse au stress oxydant qui peut induire

l'expression des gènes d’Atrogin1 et MuRF ainsi que l’activité du protéasome dans

le muscle squelettique (90, 114). Enfin, les souris déficientes en JNK sont

protégées contre la perte de force musculaire induite par un stress inflammatoire

(194).

Les joueurs clés ayant une influence sur la modulation et la régulation de la

voie des MAPK sont complexes et proviennent de multiples sources. Il est bien

connu que la voie des MAPK est critique dans la réponse biologique de nombreux

types cellulaires (33, 82).

Ubiquitine-protéasome (Ub-P’some) Le système de l’Ubiquitine-protéasome est une voie régulatrice responsable

de la dégradation de protéines endommagées ou devenues inutiles puisqu’ayant

jouées leur rôles biologiques (221). Une fois marquée par une queue de

polyubiquitines, ces protéines sont dégradées par le protéasome, un complexe

multi-protéique qui catalyse la fragmentation des protéines en polypeptides (221).

Ce marquage constitue un signal cellulaire qui pourra, entre autres, permettre la

migration d’une protéine vers un compartiment cellulaire spécifique. Puisque l’objet

de cette thèse s’intéresse à la dégradation des protéines contractiles, le focus de

cette section se fera sur son rôle en tant que machinerie protéolytique.

Le marquage de protéines avec l'ubiquitine comporte trois étapes cruciales.

La première étape est faite par une enzyme nommée « Ubiquitin-activating

enzyme » (E1) et consiste en une carboxylation de l’ubiquitine. Cette enzyme

ubiquitine possède une quantité importante d’énergie (ATP) qui est nécessaire aux

prochaines étapes d’ubiquitination de la protéine à marquer pour la dégradation.

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

28

La deuxième étape de l’ubiquitination est sous la responsabilité des « Ubiquitin-

carrier proteins » (E2). À la suite de son activation par l’enzyme E1, l’ubiquitine est

transférée sur une E2 et est ensuite responsable du transport de l’ubiquitine vers la

protéine à dégrader (107). Ensuite, les E2 préparent la molécule ubiquitine (Ub)

pour la conjugaison avec l‘« Ubiquitin-protein ligases » (E3) et catalysent la liaison

finale de l'ubiquitine aux protéines spécifiques qui seront dégradées par le

protéasome (178). Ces étapes sont répétées à plusieurs reprises et forment une

queue de polyubiquitines sur les protéines ciblées pour être dégradées. Ce sont

les E3 qui sont responsables de la spécificité du système ubiquitine-protéasome

(140) (Figure 8). La voie de l’Ub-P’some est activée dans un certain nombre de

conditions atrophiques, y compris l'inactivité et l'inflammation (106).

Figure 8. Schéma du processus de dégradation protéique par l’ubiquitination

E1, Ubiquitin-activating enzyme : E2, Ubiquitin-carrier proteins : E3 Ubiquitin-protein ligases

En plus d'avoir une spécificité au niveau des protéines cibles (HIF, Notch,

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

29

etc), les ubiquitines ligases ont une spécificité tissulaire: par exemple, Atrogin1 et

MuRF sont spécifiquement exprimés dans le muscle (68, 106). L’activité et la

pertinence de MuRF et Atrogin1 ont d'abord été identifié par rapport à l’atrophie

induite par l’immobilisation et aux modèles animaux ayant une inhibition de

l’expression de ces ligases qui sont résistants à l'atrophie musculaire causée par

une dénervation (17).

Les cytokines inflammatoires Un domaine de signalisation important est celui associée aux cytokines

inflammatoires, notamment la signalisation associée au Tumor Necrosis Factor-α

(TNF-α). Entre autre, les niveaux sanguins de TNF-α sont augmentés chez les

patients présentant une cachexie cancéreuse (4). La liaison du TNF-α à son

récepteur induit une activation de la famille des facteurs de transcription reliés à

NF-κB (213), qui est essentielle à la dégradation protéique associée à

l’inflammation (102). Cette cytokine est impliquée dans l'atrophie musculaire par

l’entremise de facteurs de transcription comme FoxO (108, 179). Elle augmente la

dégradation protéique par l’entremise de la p38 MAPK (114). Étant donné que les

essais expérimentaux d’anti-TNF-α n’ont pas démontré de prévention significative

de la cachexie cancéreuse, il se pourrait qu’in vivo, TNF-α soit un facilitateur et non

le seul responsable de la dégradation protéique (57). Par conséquent, TNF-α

pourrait agir en synergie avec d’autres facteurs inflammatoires comme

l’Interleukine-6 (IL-6) ou même le Sérum Amyloïde A1 (SAA1) pour promouvoir la

dégradation protéique (voir plus bas). Les cytokines jouent un rôle d’importance

dans le maintien de la masse musculaire ainsi que dans la réponse à l’exercice

chez l’humain (149, 225). Par contre, l’étude de leur action spécifique sur les voies

de signalisation musculaire était au-delà des objectifs de cette thèse. Le chapitre 4 de ma thèse requiert une introduction plus approfondie sur le

Sérum Amyloïde A1 (SAA1). SAA1 est une protéine de phase aiguë de la famille

des apolipoprotéines associées aux lipoprotéines de haute densité (HDL). Elle est

impliquée dans la réponse aux dommages tissulaires, d’infection et surtout

d’inflammation. Il est à noter que le but premier des protéines de phase aiguë est

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

30

de restaurer l’homéostasie cellulaire (123). Donc, SAA1 semble être un marqueur

typique de la réponse inflammatoire, et ce, probablement en lien avec un rôle dans

la modulation de plusieurs réponses immunitaires (81, 124, 205). On a proposé

récemment que cette protéine puisse être utile comme marqueur potentiel de

l’exacerbation chez les patients atteints de la MPOC (23). Ses fonctions

biologiques spécifiques sont par contre très peu connues. La source principale de

production de SAA1 semble être le foie, mais plusieurs études démontrent des

niveaux mesurables de SAA1 dans plusieurs autres tissus incluant les reins,

l’estomac, la rate, le cœur, le cerveau et surtout le muscle squelettique (204, 205).

Dans l’inflammation chronique, lors de dérèglement de l’homéostasie, les niveaux

de SAA1 augmentent considérablement et avec d’autres molécules pro-

inflammatoires, contribuant à la boucle de rétroaction positive inflammatoire,

incapable d’être contrôlée par les médiateurs anti-inflammatoires communs. Plus

spécifiquement dans le muscle, la participation de SAA1 dans l’expression de

cytokines pro-inflammatoires et sa contribution dans l’augmentation de la

dégradation protéique musculaire sont déjà démontrées dans un modèle cellulaire

(224). Cependant, les mécanismes biochimiques associés à ce phénomène

demeurent encore méconnus.

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

31

1.2.4 La réponse cellulaire à l’exercice en résistance

La réponse cellulaire déclenchée par une seule séance d'exercice génère

une augmentation de la transcription nucléaire résultant en une plus grande

quantité d’ARNm spécifiques aux gènes impliqués dans la réponse à l’exercice.

L'expression des gènes, les niveaux d’ARN et des protéines en réponse à

l'exercice est modulée à plusieurs niveaux, mais reflète généralement une

adaptation à un nouveau milieu cellulaire causé par l’exercice (20). La contraction

musculaire répétée génère des augmentations transitoires de la quantité d'ARNm

en provenance des gènes stimulés entre 3 et 12 heures après l'exercice, tandis

que le retour au niveau de base est normalement atteint 24 heures après l’exercice

(16, 152, 159). Par conséquent, des sessions d’exercice successives se traduiront

par une activité transcriptionnelle accrue qui amplifiera la synthèse des protéines

musculaires. Dans ce contexte, l'adaptation musculaire chronique à l’exercice est

due aux effets cumulatifs de chaque session d’exercice, menant ultimement à un

changement de l'état d'équilibre de la synthèse protéique spécifique à l’exercice

qui est fait. Ce phénomène amène un effet d’adaptation à l’exercice se traduisant

en gain de fonctions musculaires (Figure 9) (62, 121).

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

32

Figure 9. Schéma de l’adaptation cellulaire post-exercice chez l’humain. Adapté de

Freyssenet 2006

Basé sur Freyssenet (62)

De façon plus spécifique et toujours en gardant en tête les voies de

signalisation discutées auparavant, les prochains paragraphes se veulent un survol

de la réponse individuelle à l’exercice de chaque protéine d’intérêt pour cette

thèse.

AKT à l’exercice La voie IGF-1/AKT/mTOR induit une hypertrophie du muscle squelettique

via l’initiation de la traduction et l'augmentation du contenu protéique (138). Tel

qu’indiqué auparavant, AKT a de nombreuses cibles moléculaires en rapport avec

ses diverses fonctions physiologiques, y compris celles qui sont impliquées dans la

synthèse des protéines (mTOR, GSK-3β, p70s6k, FoxO) (59, 99, 147). Par

exemple, l’activation d’AKT augmenterait la synthèse protéique par l’augmentation

de l’activité du facteur de l’eukariotic initiation factor 2B (elF2B) (95). De plus, AKT

peut phosphoryler mTOR, qui à son tour, peut mener à la phosphorylation de

p70s6k et 4E-BP1 (80). Ceci dit, l’activation répétée d’AKT pour une période de 2 à

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

33

3 semaines est suffisante pour augmenter de façon significative la masse maigre

(103). Bolster et al. (2003b) ont étudié l'évolution temporelle de la réponse d’AKT à

l'exercice en résistance et ont observé que la phosphorylation d’AKT est à son

maximum entre 5 et 15 minutes à la suite d'une session d’exercice en résistance

(18). De plus, Dreyer et al (2006) ont observé une augmentation de la

phosphorylation d’AKT 60 minutes après une session d’exercice en résistance

(51). Par contre, Masher et al. (2008) n’ont remarqué aucun changement des

niveaux de phosphorylation d’AKT 120 minutes après une session d’exercice en

résistance (134). Les différences entre les sites de phosphorylation, le temps de

prise des biopsies, l’intensité et le type d’exercice peuvent avoir contribué à des

conclusions diverses. Malgré tout, AKT demeure un médiateur d’importance dans

la réponse à l’exercice en résistance chez l’humain.

mTOR à l’exercice Le complexe protéique impliquant la protéine mTOR est capable de détecter

des signaux divers et de produire une multitude de réponses, y compris la

traduction de l’ARNm, la biogenèse des ribosomes et le métabolisme des

nutriments (180). Les cibles primaires en aval de mTOR comprennent p70S6K, 4E-

BP1 et le facteur de l’eukaryotic initiation factor 4B (eIF4B) qui relient mTOR avec

la traduction de l’ARNm, la synthèse protéique et la taille des cellules (17, 144,

171). Cependant, les mécanismes complexes d’activation de mTOR liés à

l'adaptation à l’exercice ne sont pas tous connus (180). Dreyer et al. (2006) ont

montré une augmentation de la phosphorylation de mTOR jusqu'à 2 heures après

une session d’exercice en résistance, procurant du même coup des évidences que

la protéine mTOR est impliquée dans les processus anabolisants après l'exercice

en résistance (51). Masher et al. (2008) ont aussi démontré une augmentation du

niveau de phosphorylation de mTOR 15 à 120 minutes après une session

d’exercice en résistance (134). mTOR semble donc être un joueur notable dans la

synthèse protéique en réponse à l'entraînement en résistance, et ce, même s’il

peut aussi être modulé par la nutrition, l'activité physique et l'âge (117).

p70 S6K à l’exercice

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

34

De nombreuses études supporte le rôle fondamental de la p70S6K dans

l'hypertrophie du muscle squelettique (6, 17, 92, 139). Il semble exister un lien

étroit entre l'augmentation de l'activité de la p70S6K et l’hypertrophie musculaire

suite à 6 semaines de stimulation électrique à hautes fréquences (7). De même,

l’augmentation de la phosphorylation de la p70S6K associée à la contraction

excentrique serait nécessaire pour l’hypertrophie musculaire (191). La protéine

p70S6K est reconnue pour initier la traduction de protéines contractiles (36, 44, 50,

134) et sa phosphorylation rapide après une séance unique d’entraînement corrèle

avec le gain de masse maigre à la suite d’un programme d’entraînement de

plusieurs mois (197).

GSK-3β à l’exercice La protéine GSK-3β, de son côté, est un substrat distinct de la voie mTOR,

directement activée par AKT. L’expression de la protéine dominante négative

GSK-3β, inhibiteur de la synthèse protéique (146), a un effet sur l’hypertrophie

musculaire dans des myotubes en culture (168). À la suite d’un exercice en

résistance, les niveaux de phosphorylation de la GSK-3β sont augmentés de

façon significative et ce jusqu’à 3 heures après la fin de la session d’exercice (109,

133, 175).

MAPK à l’exercice La voie des MAPK fait partie des voies de signalisation les plus complexes.

Les MAPK coordonnent l'expression de gènes du cycle cellulaire, du métabolisme,

de la survie et de l'apoptose (169). Parmi les cinq groupes distincts de MAPK,

deux d’entre eux ont été davantage caractérisés à l'égard de la réponse à

l'exercice, soit ERK 1/2 et la p38 MAPK avec ses isoformes α, β, γ et δ (176). La

capacité de l’exercice à induire une activation des MAPK est indéniable. Par

contre, la spécificité de cette réponse et le résultat physiologique demeurent

méconnus et probablement contexte dépendant (143, 199, 219).

ERK 1/2 à l’exercice L’activité et l’expression de ERK 1/2 à la suite d’un exercice augmentent

quels que soient l'intensité, la durée ou le mode d'exercice (43, 219). Fait

Page 61: Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

35

intéressant, cette réponse peut être atténuée avec l'âge (219). Il a été postulé que

ERK 1/2 est impliqué dans une «réponse générale» à l'exercice qui pourrait inclure

l’expression de gènes spécifiques à l’exercice ou contribuer à la modulation de

voies de signalisation importantes pour la traduction protéique (63, 186, 219).

Compte tenu de la réponse très variée de ERK 1/2 à l’exercice, il est raisonnable

de suggérer que ERK 1/2 est un médiateur de processus cellulaires qui est

important pour le maintien de la masse musculaire (98). La durée du signal de

ERK1/2 influence l'activité fonctionnelle des gènes, et ultimement la réponse

biologique (136).

p38 MAPK à l’exercice L'activation de la p38 MAPK a été observée à la suite d’un exercice en

résistance chez les humains (92, 219). Il semble que la p38 MAPK soit

responsable de multiples régulations de processus cellulaires, y compris

l'expression des gènes myogéniques et mitochondriaux et de l'activité de

l’ubiquitine-protéasome, ce qui rend difficile d’établir un rôle clair et précis pour la

p38 MAPK en réponse à l'exercice (1, 114, 116). Une étude de Deldicque et al.

(2008) a démontré une augmentation de 10 fois les valeurs de base de la

phosphorylation de la p38 MAPK à la suite d’un exercice en résistance (43). Ces

auteurs ont suggéré que la p38 MAPK pourrait agir sur la p70s6k et ainsi être un

joueur majeur dans la réponse à l’exercice en résistance chez l’humain. De plus,

une étude menée par Li et al. (2005) a révélé que la p38 MAPK serait également

impliquée dans l'atrophie musculaire, par l’entremise de la cytokine inflammatoire

TNF-α.

La réponse divergente des MAPK à la suite d’un exercice limite notre

compréhension sur les fonctions physiologiques humaines. En effet, une grande

partie de nos connaissances concernant les réponses des MAPK suite à l'exercice

repose sur des données de corrélation avec peu d'information sur les mécanismes

de régulation.

Page 62: Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

CHAPITRE I. Le muscle squelettique

36

Les cytokines à l’exercice Les cytokines qui sont produites majoritairement par les muscles actifs, sont

des petits polypeptides libérés au site de l'inflammation en réponse à de nombreux

facteurs, y compris les dommages musculaires causés par l'exercice (28, 86, 148).

Plusieurs cytokines (TNF-α, IL-6, Interleukine-8 (IL-8)) ont été impliquées dans

l'initiation et la suppression de la dégradation et de la synthèse protéique suite à

une blessure musculaire (65, 220).

L’exercice en résistance fournit une réponse autant inflammatoire qu’anti-

inflammatoire dans le muscle squelettique (25, 76). Il semble désormais possible,

sinon très probable, que cette réponse soit due à des changements locaux dans le

muscle plutôt qu’à des changements systémiques (148). Le muscle squelettique

est considéré comme un organe endocrine participant à l’activation de

l’inflammation en raison de sa capacité à produire des cytokines comme l’IL-6 et le

TNF-α (148, 154). Une étude a démontré que les adaptations à l’exercice en

résistance améliorent la force musculaire et réduisent la réponse des niveaux

d'ARNm inflammatoire sans altérer les concentrations plasmatiques de TNF-α ou

d’IL-6 (104). Par contre, la quantité et le rôle précis des médiateurs inflammatoires

sécrétés par le muscle squelettique ne sont pas encore bien définis.

Page 63: Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

37

Tableau 3. Revue de la littérature comparant les réponses cellulaires temporelles à l’exercice en résistance.

Page 64: Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

CHAPITRE I. Le muscle squelettique

1.3 LA DYSFONCTION MUSCULAIRE ASSOCIÉE À LA MPOC La MPOC s’accompagne de manifestations extrapulmonaires. Un intérêt

particulier a été porté aux muscles périphériques parce que leur dysfonction

influence non seulement les symptômes qui limitent l'exercice physique, mais

contribue directement à l’intolérance à l’exercice chez les patients atteints de la

MPOC (71). Entre autres, la faiblesse musculaire est reconnue pour contribuer,

indépendamment de la fonction respiratoire, au piètre état de santé des patients

atteints de la MPOC (187) et à l’augmentation de l'utilisation des soins de santé et

à la mortalité (196).

1.3.1 Observations cliniques

Les marqueurs traditionnels de la sévérité de la MPOC, comme le VEMS,

ne prédisent pas bien la mortalité en comparaison avec, par exemple, le

regroupement de facteurs prédictifs comme l’indice de BODE (Body mass index,

airway Obstruction (FEV1), Dyspnea, Exercise tolerance) (31). En effet, la

présence d’obstruction bronchique sévère (VEMS < 50% de la valeur prédite) n’est

pas un très bon indice de survie et de tolérance à l’exercice chez les patients

atteints de MPOC (132, 196). À l’inverse, la normalisation de la fonction

pulmonaire suite à une transplantation pulmonaire ne corrige pas la tolérance à

l'exercice (218). De plus, la réadaptation pulmonaire est efficace pour améliorer de

la qualité de vie et la tolérance à l’exercice des patients, mais n'améliore pas la

fonction pulmonaire (77). Par ailleurs, Schols et al. (1993) ont démontré que

jusqu'à 45% des patients MPOC stables avaient une masse maigre insuffisante ou

avait eu une diminution importante de celle-ci (182). Les techniques d’imageries

médicales récentes ont permis de mettre en lumière des réductions significatives

de la surface de la mi-cuisse et du mollet chez les patients atteints de la MPOC en

comparaison avec des individus sains appariés pour l’âge (13, 132). Bien que

l’essoufflement soit une cause d’arrêt de l’exercice souvent citée chez les patients

MPOC, Killian et al. (1992) ont démontré qu'une proportion étonnante de patients

avaient des symptômes de fatigue musculaire dans les jambes à la suite de l’arrêt

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

39

d’un test à l’effort, ce qui implique que le dysfonctionnement des membres

inférieurs peut contribuer à la l’intolérance à l’effort chez ces patients (93). Alors

qu’environ 25% des patients atteints de MPOC citeront la fatigue musculaire des

jambes comme cause d’arrêt de l’exercice lors de la marche, (l’essoufflement étant

la raison la plus commune), environ 70% d’entre eux indiqueront la fatigue

musculaire comme cause d’arrêt lors d’un exercice fait sur vélo stationnaire (130).

La majorité des études ont démontré une réduction de l'endurance et une

augmentation de la fatigabilité du quadriceps (2, 119, 184) en comparaison avec

des sujets sains appariés pour l’âge. Ces anomalies semblent être particulièrement

localisées aux quadriceps. Malgré la présence d'une réduction de 30% de la force

du quadriceps, des études ont déterminé que la force du diaphragme, l'adducteur

du pouce et les muscles abdominaux sont relativement préservés chez les patients

atteints de la MPOC (128, 131). En comparaison avec le quadriceps, le

diaphragme est relativement résistant à la fatigue à l'exercice exhaustif chez les

patients atteints de la MPOC (29). Les fibres du diaphragme d’un patient MPOC

sont métaboliquement plus efficaces que celles des sujets témoins (193). Parmi

les patients présentant une atteinte pulmonaire grave, la force du quadriceps est

un prédicteur de la mortalité (196), comme l’est aussi l’indice de la masse maigre

(132). La faiblesse du quadriceps est également associée à une distance de

marche réduite (71), une réduction de la consommation maximale d'oxygène

( 2OV max) (78) et à l’augmentation de l'utilisation des services de santé (42).

En résumé, les études cliniques démontrent bien que les conséquences de

la MPOC dépassent l’atteinte primaire des poumons et ont d’importantes

répercussions systémiques.

1.3.2 Observations structurales

Les études qui démontrent les anomalies musculaires structurales chez la

MPOC proviennent majoritairement du quadriceps. La plupart des études

démontrent une proportion réduite des fibres de type I des patients atteints d’une

MPOC modérée à sévère en comparaison avec des sujets sains (70). Ce

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

40

phénomène est souvent accompagné d’une plus grande proportion de fibres de

type IIx (tableau 4). Ceci a été corroboré par une plus grande proportion de la

chaîne lourde de myosine d’isoforme de type II dans le quadriceps des patients

atteints de la MPOC (127). Ce changement représente un renversement de la

tendance normale du vieillissement qui est caractérisée par une augmentation des

fibres de type I. En plus des changements dans la proportion des fibres

musculaires, une atrophie des fibres de type I, IIa et IIx (70) et une réduction des

capillaires sanguins pour tous les types de fibres musculaires (91) ont été

rapportées. Il est également intéressant de noter que les adaptations structurales

du diaphragme des patients atteints de la MPOC sont à l’opposé de celles

observées dans le quadriceps (28), avec une augmentation de la proportion des

fibres de type I, une réduction des fibres de type II (112, 113) et une augmentation

de la capacité oxydative (111).

Page 67: Métabolisme et signalisation cellulaire dans le quadriceps des … · 2018-04-20 · FoxO Forkhead box of the class O . GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

CHAPITRE I. Le muscle squelettique

41

Tableau 4. Revue de la littérature comparant les distributions de types de fibres du quadriceps chez les patients atteints de la MPOC MPOC

Études n VEMS1

(% de la prédite)

Type I (% des fibres

totales)

Type IIa (% des fibres

totales)

Type IIx (% des fibres

totales) Whittom, 1998 20 37 32 45 25 Debigaré, 2003 16 39 26 54 20 Couillard, 2003 12 33 27 38 35 Allaire, 2004 16 37 27 43 33 Doucet, 2004 12 65 45 35 20 Russell, 2004 15 46 40 35 25 Koechlin, 2004 18 35 32 39 29 Saey, 2005 32 42 35 42 23 Doucet, 2007 11 31 35 40 25 Gosker, 2007 (Revue) 419 33 (19-44) 41 (18-56) 26 (13-46)

Lemire, 2012 18 34 35 65 SUJETS SAINS

Études n VEMS1

(% de la prédite)

Type I (% des fibres

totales)

Type IIa (% des fibres

totales)

Type IIx (% des fibres

totales) Whittom, 1998 9 --- 60 30 10 Debigaré, 2003 9 --- 39 53 8 Couillard, 2003 10 104 43 2 29 Allaire, 2004 16 110 58 32 7 Doucet, 2004 16 95 55 30 20 Russell, 2004 7 95 62 28 10

Lemire, 2012 9 104 51 49

1.3.2 Observations métaboliques

L’activité enzymatique oxydative est inférieure chez les patients MPOC en

comparaison avec des sujets sains appariés pour l’âge (125). La capacité

d'endurance du quadriceps a été associée de façon significative avec la proportion

de fibres de type I et avec le ratio de l'activité enzymatique oxydative/glycolytique

(195). De plus, la glycolyse est augmentée dans la MPOC tel que démontré par

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

42

une élévation de l'activité de la phosphofructokinase (PFK) et de la lactate

déshydrogénase (LDH) dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC (87).

De plus, l’augmentation rapide des niveaux de lactate sanguin pendant l'exercice

(126, 177) pourrait être en soit responsable d'une chute du pH musculaire et d’une

acidose systémique (155). Une diminution de la capacité oxydative et une

réorientation vers un métabolisme glycolytique pourraient avoir des implications

négatives sur la tolérance à l’effort (56, 74). Le ratio entre la phosphocréatine (PC)

et le phosphate inorganique (Pi) est étroitement lié à celui de l'ATP/ADP et, par

conséquent, est un marqueur de l'état de l'énergie musculaire. Le rapport PC/Pi

est significativement plus faible (100) lors de l'exercice chez les patients atteints de

la MPOC et la diminution de la PC est plus rapide (198). Gosker et al. (2003) et

Russell et al. (2004) ont également démontré des niveaux significativement réduits

de l’UCP-3 (protéine découplante-3), impliquée dans la régulation du métabolisme

énergétique dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC (69, 170).

1.3.2 Observations biochimiques

Les études visant à déterminer si les voies de signalisation cellulaire sont

impliquées dans l'étiologie de la dysfonction musculaire associée à la MPOC en

sont encore à leurs débuts. Doucet et al. (2007) ont démontré des niveaux

d’ARNm de MuRF et d’Atrogin1, ainsi que les des niveaux protéiques de FoxO

significativement augmentés dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC,

suggérant une modulation de l’activité des voies atrophiantes chez la MPOC (49).

Contrairement à l’hypothèse de départ, ils ont aussi démontré une augmentation

de la phosphorylation d’AKT, suggérant que la régulation transcriptionelle de

MuRF et d’Atrogin1, par l'intermédiaire FoxO se produit indépendamment d’AKT.

Une augmentation du niveau de phosphorylation de trois protéines associées à

l’hypertrophie musculaire (p70S6K, GSK-3β et 4E-BP1) a aussi été observée chez

les patients atteints de MPOC et ayant une faible masse musculaire par rapport

aux patients ayant une masse musculaire préservée (49). Les auteurs ont proposé

que ceci pourrait être le résultat d'une boucle de rétroaction résultant d’une

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

43

tentative non-fonctionnelle de compenser le processus d'atrophie musculaire

présent chez ces patients. Une autre étude a permis de mettre en évidence une

augmentation de d’Atrogin1 et de Nedd4, une E3 ligase impliquée dans le

marquage des protéines à dégrader (153). Au contraire de Doucet et al. (2007),

cette étude n’a pas démontré des niveaux de phosphorylation d’AKT, de p70S6K et

de GSK-3β plus élevés dans le quadriceps des patients MPOC. Un autre groupe a

récemment démontré que la p38 MAPK n’était pas significativement augmentée

dans le quadriceps des patients MPOC, mais que certaines protéines en amont de

la p38 MAPK l’étaient (166). Par contre, une méthodologie contestable pourrait

être à l’origine de ces résultats.

1.3.3 Les causes

Le stress oxydant Le stress oxydant est identifié comme un mécanisme potentiel contribuant à

la dysfonction musculaire chez la MPOC. Les niveaux de stress oxydants sont

augmentés non seulement chez des patients MPOC exacerbés mais aussi chez

les patients stables (164). Le stress oxydant dirige les cellules musculaires dans

un état catabolique et l'exposition chronique à celui-ci mène au dysfonctionnement

du muscle squelettique, notamment en marquant les protéines myofibrillaires pour

la dégradation (24, 96, 115). En contrepartie, il existe des preuves contradictoires

en ce qui concerne la capacité antioxydante chez les patients atteints de la MPOC.

Des études démontrent une diminution de la capacité antioxydante du muscle

squelettique (37, 53), alors qu’une autre étude ne démontre aucune différence

significative entre les patients atteints de la MPOC et des sujets sains (163). La

contribution du stress oxydant à la dysfonction musculaire dans la MPOC demeure

à ce jour spéculative. L’inflammation L'inflammation systémique pourrait être un facteur contribuant à la

dysfonction musculaire dans cette maladie. Comme pour plusieurs autres maladies

chroniques, la MPOC est caractérisée par une inflammation systémique de bas

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

44

niveau (181). Certaines cytokines inflammatoires, comme le TNF, d’IL-6, d’IL-8 et

de la protéine C-réactive (CRP) chez les patients atteints de la MPOC (41, 45, 52,

181), suggèrent que les cytokines inflammatoires pourraient jouer un rôle dans la

dysfonction musculaire associée à la MPOC. La littérature suggère que

l'inflammation systémique associée aux exacerbations aiguës peut aussi être

d’une importance capitale dans le développement de la dysfonction musculaire

chez la MPOC. Certains auteurs ont rapporté une relation inverse entre les

niveaux d’IL-8 et la force du quadriceps chez les patients hospitalisés pour une

exacerbation de la MPOC (192). Toutefois, l’implication directe des cytokines

inflammatoires sur la dysfonction musculaire chez la MPOC demeure

controversée. Une étude a démontré que le niveau des cytokines inflammatoires

requis pour induire la perte de masse maigre est beaucoup plus élevé que la

concentration plasmatique observée chez les patients hospitalisés (105). D’autre

part, la préservation relative de la fonction de certains muscles, comme le

diaphragme, est aussi difficile à expliquer si une cause inflammatoire systémique

est retenue comme facteur principal à l’origine de la dysfonction musculaire dans

la MPOC (156). D’autre part, il reste savoir si c’est l'inflammation systémique ou

musculaire qui est la plus importante à étudier dans un contexte de dysfonction

musculaire. Une étude a démontré que le niveau du récepteur TNFRII (récepteur II

du TNF-α) et de la cytokine TNF-α étaient significativement plus bas chez les

patients atteints de la MPOC en comparaison avec des sujets sains appariés pour

l’âge (12). De toute évidence, il semble que les résultats varient selon les études

concernant l’inflammation systémique et musculaire chez la MPOC. Malgré le fait

que l’inflammation semble pouvoir théoriquement contribuer à la dysfonction

musculaire chez la MPOC, aucun résultat ne semble être définitif sur ce sujet. L’inactivité physique

En plus du stress oxydant et de l’inflammation, l’inactivité physique est

possiblement une des causes des anomalies musculaires dans la MPOC. Une

réduction significative de l’activité physique est remarquée dès le début de la

maladie (207). L’inactivité chronique des muscles locomoteurs, fréquente dans la

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

45

MPOC (202), s’accompagne de remodelage significatif du muscle soit par la perte

de protéines musculaires (145), des changements de phénotypique de fibres

lentes en fibres rapides (85), une altération des voies métaboliques (85) et par des

adaptations délétères de la jonction neuromusculaire, du cytosquelette et de la

vascularisation intramusculaire (203, 208). Un autre élément en faveur de

l’inactivité comme facteur causal de la dysfonction musculaire dans la MPOC est le

fait que le profil métabolique et morphologique des muscles locomoteurs soit

différent de celui des autres muscles chez les patients MPOC (29). Le diaphragme

par exemple, démontre une capacité oxydative augmentée (29, 113) et une

augmentation des fibres de type I (112), ce qui est à l’opposé du profil observé

chez le quadriceps. Ceci nous porte à croire que les effets de l’inactivité physique

affectent davantage les muscles impliqués dans la locomotion. De plus, la plupart

des anomalies observées dans la MPOC peuvent être aussi rencontrées dans

d’autres maladies chroniques comme l’insuffisance cardiaque et rénale (61), toutes

deux aussi caractérisées par une diminution importante des niveaux d’activité

physique.

En contrepartie, plusieurs observations favorisent l’existence d’une

myopathie non-reliée à l’inactivité physique chez les patients atteints de la MPOC

(38). La fonction et structure musculaire des patients atteints de la MPOC ne sont

pas directement corrélés au niveau d’activité physique (21, 141, 206). De plus, une

disparité de la fonction et la structure musculaire demeure lorsque les patients

atteints de la MPOC sont comparé avec des sujets sains appariés pour le même

niveau d’activité physique (39, 72).

Étant donné que les adaptations associés à l’inactivité physique influencent

les voies de signalisation impliquées dans la synthèse protéique (107), le stress

oxydant (97) et le métabolisme énergétique (46), il est donc normal de s’attarder à

ces phénomènes dans la MPOC (Figure 10).

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

46

Figure 10. Mécanismes d’action menant à la dysfonction musculaire suite au sédentarisme et à l’inactivité physique. Adapté de Bajotto et al. 2006 (8)

MAPK, Mitogen-Activated Protein Kinase: ERK, Extracellular signal-regulated kinase: JNK, c-Jun N-terminal Kinase : p38, p38 MAPK : IGF-1, Insulin-like growth factor 1: mTOR, Mammalian target of rapamycin: p70S6K, Isoforme de 70 kDa de la protéine S6 kinase 1 : 4E-BP1, eIF4E binding protein 1: FoxO, Forkhead box of the class O: GSK-3β, Glycogen synthase kinase 3β: Atrogin1, MAFbx Muscle Atrophy F-box: MuRF1, Muscle RING Finger 1: Nedd4, neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4.

À la lumière des observations cliniques, structurales, biochimiques et

signalétiques démontrant des anomalies musculaires importantes, on peut

supposer que la présence de l’inflammation systémique et locale, de stress

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

47

oxydant et surtout d’inactivité physique sont des facteurs potentiels contribuant à la

dysfonction musculaire chez la MPOC (Figure 11).

Figure 11. Mécanismes d’action menant à la dysfonction musculaire chez la MPOC. Adapté de Couillard et al. 2005.

Basé sur Couillard, 2005 (38)

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

48

1.3.4 La solution

La réadaptation pulmonaire chez la MPOC Contrairement à la notion que les patients atteints de la MPOC ne peuvent

atteindre des niveaux d'exercices suffisamment intenses pour produire un effet

d'entraînement physiologique (137), les études des vingt dernières années ont

confirmé que la réadaptation pulmonaire, basée sur le réentraînement

cardiovasculaire et musculaire, est l’intervention non pharmacologique la plus

efficace dans l'amélioration de l'état de santé chez les patients atteints de la

MPOC. Ces améliorations se produisent sans changement de la fonction

pulmonaire de ces patients (101). La réadaptation pulmonaire est devenue la

pierre angulaire de la gestion de la MPOC et pour cause; l'amélioration de la

qualité de vie démontrée dans les études de réadaptation pulmonaire dépasse

largement les effets observés dans les essais cliniques de bronchodilatateurs,

corticoïdes inhalés ou en combinaison (200). Cependant, la réadaptation

pulmonaire ne corrige pas complètement toutes les anomalies observées dans le

quadriceps des patients MPOC (14, 215).

Les patients MPOC démontrent, après avoir complété un programme de

réadaptation de 8 semaines, des gains de force musculaire équivalent à 70% de la

force musculaire de sujets sains appariés pour l’âge non entraînés (60). De plus,

après un entraînement de 10 semaines avec ou sans supplément de testostérone,

les patients MPOC participant au régime d’entraînement en résistance ayant reçu

le placebo ont seulement gagné 0.1 kg de masse maigre, alors que les patients

recevant seulement de la testostérone ont montré des gains de 2.3 kg de masse

maigre en 10 semaines (30). Plusieurs facteurs peuvent limiter les gains de force

et de masse musculaire chez les patients MPOC participant à un programme

d’exercice en résistance. Le réentraînement musculaire visant à augmenter la

masse musculaire induit des évènements moléculaires et cellulaires impliqués

dans la synthèse des protéines. En effet, l'augmentation de la masse maigre

concorde avec l'augmentation de l’activité de la voie de signalisation d’IGF-1/AKT

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CHAPITRE I. Le muscle squelettique

49

et l'activation de la machinerie de la synthèse protéique. Une étude a investigué la

réponse cellulaire suite à un programme d’exercice en résistance chez les patients

MPOC cachexiques. Les résultats démontrent une réponse atténuée de la voie de

l’IGF1/AKT chez ces patients cachexiques par rapport aux patients non

cachexiques (212). Étant donné que les bénéfices physiologiques et

psychologiques de la réadaptation pulmonaire chez la MPOC sont bien

documentés (201), mais n’améliorent que partiellement les fonctions musculaires,

des études portant sur la réponse moléculaire et cellulaire à l’exercice méritent de

voir le jour pour tenter de bonifier l’intervention de réadaptation pulmonaire chez la

MPOC.

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CHAPITRE II

PROBLÉMATIQUES, OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES DES TRAVAUX

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

51

Cette thèse a pour objectif général l’étude de la dysfonction musculaire

périphérique dans la MPOC, plus précisément 1) l’étude des mécanismes

cellulaires impliqués dans l’atrophie musculaire (Chapitres 3 et 4) 2) l’étude du

métabolisme musculaire à la suite d’un exercice en endurance (Chapitre 5) et 3)

l’étude de la réponse cellulaire suite à un exercice en résistance (Chapitre 6).

Voici une brève description de la problématique de chaque projet de

recherche ainsi que les principaux objectifs et hypothèses de recherche.

La première problématique traitée sera présentée dans le chapitre 3. Cette

étude établira le fait que des voies de signalisation autre que l’IGF-1/AKT

pourraient être impliquées dans le processus d’atrophie musculaire chez la MPOC.

Étant donné que la voie de signalisation d’IGF-1/AKT fait l’objet d’un paradoxe dû

au fait que la phosphorylation de protéines pro-synthèses est augmentée chez des

patients MPOC ayant une masse maigre considérablement réduite, d’autres voies

de signalisation comme les MAPK sont certainement impliquées dans le processus

atrophique associé à la MPOC. Puisqu’aucune donnée n’était disponible

concernant l’activation de cette voie de signalisation dans le quadriceps de

patients MPOC, nos objectifs étaient de :

1) Mesurer les niveaux de phosphorylation de p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK

2) Mesurer les niveaux d’ARNm de p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK

3) Mesurer les niveaux protéiques et d’ARNm des E3 ligases, Atrogin1 et

MuRF

Notre hypothèse générale pour cette étude:

Les niveaux de phosphorylation et d’ARNm des joueurs majeurs de la voie

des MAPK (p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK) sont plus élevés dans le quadriceps des

patients atteints de la MPOC en comparaison avec des sujets sains appariés pour

l’âge.

La deuxième problématique fera l’objet du chapitre 4. Cette étude

démontrera qu’un facteur inflammatoire, le SAA1, pourrait avoir un impact dans

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

52

l’atrophie musculaire des patients. Étant donné que 1) les résultats publiés à date

concernant les facteurs inflammatoires communément mesurés dans les études

sur la MPOC sont discordants et qu’il n’existe aucun consensus sur le fait que

l’inflammation est présente ou pas dans les muscles périphériques des patients

atteints de MPOC et que 2) il a été montré que SAA1 est augmenté dans le

quadriceps de patients MPOC sans pour autant faire l’objet d’une investigation

plus approfondie; nous produirons des évidences qui supportent l’idée que cette

apolipoprotéine est présente de façon importante dans la MPOC et qu’elle pourrait

jouer un rôle dans le développement de l’atrophie musculaire dans cette maladie.

Cette étude avait donc comme objectif de :

1) Mesurer les niveaux d’expression du gène de SAA1 dans le quadriceps dans

une cohorte de patients MPOC modérés à sévères.

2) Mesurer les niveaux d’ARNm de SAA1 dans le quadriceps chez une autre

cohorte de validation de patients MPOC modérés à sévères.

3) Mesurer les niveaux d’ARNm de SAA1 dans le quadriceps chez une cohorte de

patients MPOC ayant une exacerbation

Notre hypothèse générale pour cette étude :

Les niveaux d’expression du gène et les niveaux d’ARNm sont plus élevés

dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC en comparaison avec des

sujets sains appariés pour l’âge et les patients présentant une exacerbation de la

MPOC démontrent des niveaux plus élevés de SAA1 que les patients MPOC

stables et les sujets sains appariés pour l’âge.

La troisième problématique sera présentée dans le chapitre 5. Cette étude

démontrera une plus grande dépendance à la glycolyse comme voie métabolique

de prédilection pendant un exercice en endurance chez les patients atteints de la

MPOC modérée à sévère. Étant donné que plusieurs études démontrent que la

capacité oxydative est réduite dans le quadriceps des patients MPOC, ce projet

tentera d’illustrer un effet compensatoire du système glycolytique dans le muscle

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

53

de ces patients, tout en suggérant que ceci pourrait contribuer à l’intolérance à

l’exercice dans la MPOC. Cette étude avait donc comme objectif de :

1) Mesurer les métabolites (ATP, ADP, CP, Pi) dans le quadriceps à la

suite d’un exercice en endurance chez des patients MPOC

2) Mesurer les facteurs intermédiaires de la glycolyse (F-6-P, G-1-P et G-6-

P) dans le quadriceps à la suite d’un exercice en endurance chez des

patients MPOC

3) Mesurer l’activité enzymatique reliée à la capacité oxydative (HADH, CS)

et à la capacité glycolytique (PFK, LDH) dans le quadriceps chez des

patients MPOC

4) Mesurer les taux d’utilisation de glucose/glycogène ainsi que de lactate

dans le quadriceps à la suite d’un exercice en endurance chez des

patients MPOC

Notre hypothèse générale pour cette étude:

Les patients MPOC montrent une plus grande dépendance au système

glycolytique pendant un exercice en endurance, ce qui contribue en partie à

l’intolérance à l’exercice dans la MPOC.

La quatrième problématique de cette thèse sera élaborée dans le chapitre 5.

Cette étude consistera à quantifier la réponse cellulaire des voies de signalisation

impliquées dans le maintien de la masse musculaire à la suite d’un exercice en

résistance chez les patients atteints de MPOC modérée à sévère. Même si la

littérature démontre que l’exercice en résistance est bien toléré et aide les patients

MPOC à retrouver une meilleure qualité de vie, il semble qu’ils ne répondent pas

tous aussi bien à l’exercice en résistance en comparaison avec des sujets sains

appariés pour l’âge. Par conséquent, ce projet de recherche mesurera la réponse

cellulaire à l’exercice en résistance chez les patients atteints de la MPOC modérée

à sévère.

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CHAPITRE II. Problématique, hypothèses et objectifs de recherche

54

Cette étude avait donc comme objectif de :

1) Mesurer dans les quadriceps les niveaux de phosphorylation de

protéines clés impliquées dans le maintien de la masse musculaire

(AKT, mTOR, p70s6k, p38 MAPK, ERK 1/2) à la suite d’un exercice en

résistance chez des patients MPOC;

2) Mesurer dans le quadriceps les niveaux de protéines et d’ARNm des E3

ligases (Atrogin1 et MuRF) impliquées dans la dégradation protéique à la

suite d’un exercice en résistance chez des patients MPOC;

3) Mesurer dans le quadriceps les niveaux d’ARNm de cytokines (TNF-α,

IL-6, IL-8), impliquées dans la réponse inflammatoire à la suite d’un

exercice en résistance chez des patients MPOC.

Notre hypothèse générale pour cette étude était :

La réponse cellulaire des patients atteints de la MPOC à la suite d’un

exercice en résistance est différente de celle des sujets sains appariés pour l’âge.

Les patients MPOC montrent une réponse pro-synthèse atténuée en comparaison

aux sujets sains, ce qui contribue à la moins bonne réponse à l’exercice en

résistance dans la MPOC.

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CHAPITRE III

MAPK SIGNALLING IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH COPD

Article publié dans the Journal of Applied Physiology

Lemire BB, Debigaré R, Dubé A, Thériault ME, Côté CH, and Maltais F. MAPK signaling in the quadriceps of patients with chronic obstructive pulmonary disease. J Appl Physiol 113: 159-166, 2012 Journal of Apply Physiology 113: 159-166, 2012.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

57

3.1 Page titre

MAPK SIGNALLING IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH CHRONIC

OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Authors:

Bruno B. LEMIRE1, Richard DEBIGARÉ1, Annie DUBÉ1, Marie-Eve THÉRIAULT1,

Claude H. CÔTÉ2 and François MALTAIS1

Affiliation :

1Centre de recherche, Institut Universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, Canada. 2Centre de recherche, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Pavillon CHUL, Université Laval, Québec, Canada

B B. Lemire is the recipient of a PhD training award from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). R. Debigaré is a Research Scholar of the Fonds de la Recherche en Santé du Québec. F. Maltais holds a GSK/CIHR Research Chair on COPD at Université Laval. This work has been supported by CIHR grant MOP-115136. Running head: Intramuscular signalling in the quadriceps of patients with COPD Word count: 2221 Address of correspondence: Dr François Maltais

Institut Universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec

2725 Chemin Ste-Foy Québec, Québec G1V 4G5 CANADA Tel: 418-656-4747 Fax: 418-656-4762

E-mail: [email protected]

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

58

3.2 Résumé

L'atrophie musculaire dans la MPOC est associée à une réduction de la tolérance à

l'effort, de la force musculaire et de la survie. Les mécanismes moléculaires conduisant à

l'atrophie musculaire dans la MPOC sont encore méconnus. Les « Mitogen-Activated

Protein Kinases » (MAPK), tels que la p38 MAPK et ERK 1/2, peuvent augmenter les

niveaux de MAFbx/Atrogin1 et MuRF1 qui sont spécifiquement impliqués dans la

dégradation des protéines musculaires. L’objectif de l’étude était de déterminer les niveaux

de phosphorylation de la p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK dans le quadriceps des patients

atteints de la MPOC. Une biopsie du quadriceps a été obtenue chez 18 patients atteints de la

MPOC ainsi que chez 9 sujets sains appariés pour l’âge. Nous avons évalué les niveaux de

phosphorylation ainsi que les niveaux de protéines totales de la p38 MAPK, ERK 1/2 et

JNK ainsi que de MAFbx/Atrogin1 et MuRF1 chez tous les participants de l’étude. Les

niveaux d'ARNm des protéines auparavant mentionnées ont été évalués par PCR en temps

réel. Les ratios phosphorylation/protéine totale de la p38 MAPK (p = 0,02) et ERK 1/2 (p =

0,01) étaient significativement plus élevés chez les patients atteints de la MPOC par rapport

aux sujets sains. De plus, le niveau de protéines de MAFbx/Atrogin1 avait tendance à être

plus élevé chez les patients atteints de la MPOC (p = 0,08). Les niveaux d’ARNm de la p38

MAPK (p = 0,03), ERK 1/2 (p = 0,02) et MAFbx/Atrogin1 (p = 0,04) étaient

significativement plus élevés chez les patients atteints de la MPOC. De plus, les ratios

phosphorylation/protéine totale de la p38 MAPK (Pearson’s = -0,45, p <0,05) et de ERK

1/2 (Pearson’s = -0,47, p <0,05) étaient négativement associés à la surface transversale du

quadriceps des participants. Finalement, ces données soutiennent l'hypothèse que les

MAPK pourraient jouer un rôle dans le développement de l'atrophie musculaire associée à

la MPOC.

Mots-clés: MPOC, MAPK, signalisation intramusculaire, biopsie musculaire

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

59

3.2 Abstract

Muscle atrophy in COPD is associated with reduced exercise tolerance, muscle

strength and survival. The molecular mechanisms leading to muscle atrophy in COPD

remain elusive. The Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) such as p38 MAPK and

ERK 1/2 can increase levels of MAFbx/Atrogin and MuRF1, which are specifically

involved in muscle protein degradation and atrophy. Our aim was to investigate the level of

activation of p38 MAPK, ERK 1/2 and JNK in the quadriceps of patients with COPD. A

biopsy of the quadriceps was obtained in 18 patients with COPD as well as in 9 healthy

controls. We evaluated the phosphorylated as well as total protein levels of p38 MAPK,

ERK 1/2 and JNK as well as MAFbx/Atrogin and MuRF1 in these muscle samples. The

corresponding mRNA expression was also assessed by qPCR. Ratios of phosphorylated to

total level of p38 MAPK (p=0.02) and ERK 1/2 (p=0.01) were significantly elevated in

patients with COPD compared to controls. Moreover, protein levels of MAFbx/Atrogin

showed a tendency to be greater in patients with COPD (p=0.08). mRNA expression of p38

MAPK (p=0.03), ERK 1/2 (p=0.02) and MAFbx/Atrogin (p=0.04) were significantly

elevated in patients with COPD. In addition, phosphorylated to total p38 MAPK ratio

(Pearson’s r=-0.45; p < 0.05) and phosphorylated to total ERK 1/2 ratio (Pearson’s r=-0.47;

p < 0.05) were negatively associated with the mid-thigh muscle cross-sectional area. These

data support the hypothesis that the MAPKs might play a role in the development of muscle

atrophy in COPD.

Word count: 245

Keywords: COPD, MAPK, intramuscular signalling, muscle biopsy

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

60

3.3 Introduction

Peripheral muscle dysfunction in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is

characterized by fiber-type shifting, metabolic alterations and atrophy. Among these,

muscle atrophy is associated with reduction in exercise tolerance, strength, quality of life

and even survival (33). Although a role for the ubiquitin/proteasome pathway in the

development of muscle atrophy in COPD has been proposed (12, 29), other biochemical

pathways may also be involved in this process.

In this regard, several observations suggest a possible involvement of the Mitogen-

Activated Protein Kinases (MAPKs) pathway in the COPD-related atrophying process.

MAPKs can be activated in response to inflammatory and oxidative stress (20), two

common findings in peripheral muscles of patients with COPD (33). The MAPKs,

including extracellular signal-regulated kinase 1-2 (ERK 1/2), p38 MAPK and c-Jun N-

terminal kinase (JNK) are involved in the muscle atrophy process in cell culture and animal

models of immobilization-induced atrophy (19, 21, 37). In C2C12 cells exposed to TNF,

ERK activation led to a greater expression of muscle atrophy F-box protein

(MAFbx/Atrogin) that is involved in protein degradation suggesting that ERK could play a

crucial role in the pathogenesis of muscle atrophy (27). p38 MAPK also mediates oxidative

stress-induced MAFbx/Atrogin gene expression and ubiquitin-conjugating activity in

skeletal muscle (18, 21). Lastly, JNK has been shown to potentiate the caspase activity

during inflammation, which in itself can lead to loss of muscle proteins, while JNK-

deficient mice are protected against the inflammation-induced loss of muscle force (40).

Because the ubiquitination of proteins and the levels of E3 ligases such as MuRF1

and MAFbx/Atrogin have been associated with skeletal muscle atrophy and since the active

forms of ERK 1/2, p38 MAPK and JNK could modulate their expression, we hypothesized

that the level of MAPKs protein phosphorylation would be increased and the corresponding

mRNA overexpressed in the quadriceps of patients with COPD. We also speculate that the

quadriceps level of ubiquitinated and polyubiquitinated proteins and of MAFbx/Atrogin

and MuRF1 would be upregulated in this context. Lastly, we hypothesized that these

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

61

biochemical abnormalities would be associated with evidence of inflammation and

oxidative stress at the muscle level.

To test these hypotheses, we investigated the phosphorylation levels of ERK 1/2,

p38 MAPK and JNK and of ubiquitinated proteins, MAFbx/Atrogin and MuRF1 in the

quadriceps of patients with COPD in comparison to aged-matched healthy controls. The

presence of several key markers of inflammation (tumor necrosis factor α [TNF-α],

interleukin-6 [IL-6], interleukin-8 [IL-8], serum amyloid A1 [SAA11], cluster of

differentiation 45 receptor [CD45R]) and of oxidative stress (lipid peroxidation, protein

carbonylation and advance oxidative protein products) was also evaluated in the quadriceps

of these individuals.

3.4 Methods

Subjects

Eighteen patients with moderate to severe COPD and nine healthy aged-matched

controls subjects participated in this study. The diagnosis of COPD was based on

spirometry showing moderate to severe irreversible airflow obstruction (forced expiratory

volume in 1 second [FEV1] < 80% predicted value, and FEV1/ forced vital capacity [FVC]

< 70%). All patients with COPD were in a stable condition at the time of the study without

any acute exacerbation of their disease or exposure to systemic corticosteroids within 2

months of their participation in the study. None of the patients was receiving long-term

oxygen therapy. Patients with COPD and healthy controls were excluded if they presented

any medical condition, other than COPD (in the case of patients with COPD), likely to

influence muscle and biochemical testing (i.e. cardiovascular, neurological,

musculoskeletal, locomotor or other respiratory diseases). In both groups, only sedentary

male ex-smokers who had stopped for at least 6 months were included in the present study

in order to minimize heterogeneity in the measurements. The institutional ethics committee

approved the research protocol and a signed informed consent was obtained from each

subject.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

62

Study design

After reviewing medical history and familiarization with the study procedures,

subjects filled out a physical activity questionnaire (41). Anthropometric measurements,

pulmonary function testing, mid-thigh muscle cross-sectional area measures and a body

composition assessment were performed. Subjects were also given a physical activity

monitor for a period of 7 days. Subjects then returned to the laboratory for a quadriceps

biopsy at rest.

Pulmonary function testing

Standard pulmonary function tests including spirometry, lung volumes, and carbon

monoxide diffusion capacity were obtained in all subjects during the initial evaluation

according to previously described guidelines (3). Results were related to previously publish

normal values (31).

Physical activity measurement and score

The level of physical activity was assessed with a multisensor wearable device worn

on the right arm designed to collect and analyze a broad range of data from the body and its

movements (SenseWear Armband, Pittsburg, PA) for at least 7 days. The level of physical

activity in daily living was also assessed with the Voorrips physical activity questionnaire

described by Baecke et al. adapted for elderly individuals and used in patients with COPD

(4, 36, 41). This questionnaire attributes a score for household, sport, and other leisure-time

physical activities, together resulting in a global physical activity score. A score of 9-16

indicates a moderate level of daily physical activity, whereas a score < 9 depicts low levels

of daily physical activity and is associated with a sedentary lifestyle.

Anthropometric measurements and body composition.

Height and weight were measured according to standardized methods (16). Dual

energy X-ray Absorptiometry (DEXA) provided regional assessment of fat, fat-free mass

and total thigh muscle mass (sum of both legs) (General Electric Healthcare, Chicago, IL).

Measurement of mid-thigh muscle cross-sectional area

A computed tomography (CT) of the right thigh halfway between the pubic

symphysis and the inferior condyle of the femur was performed using a fourth-generation

Toshiba Scanner 900S (Toshiba). Computed tomography was used to quantify muscle

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

63

cross-sectional area mass in a more specific manner than anthropometric measurements

(39).

Muscle biopsy and muscle specimen analyses

After 30 minutes of rest in the supine position, a needle biopsy of the quadriceps

was performed as described by Bergström and routinely done in our laboratory (6, 23).

Muscle specimens were frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for future analysis.

Protein extraction and Western blotting

Cytoplasmic protein extraction was performed with ≈ 30 mg of muscle. Muscle

samples were then homogenised using a Polytron PowerGen 125 (Omni International,

Marietta, GA, USA). Protein content was determined by a DC protein essay (BioRad,

Mississauga, ON, Canada) based on a modified Lowry method. Electrophoresis was

performed using 10-15 % SDS PAGE gels. After a 3-hour protein transfer in cold (4°C)

buffer, nitrocellulose membranes were blocked for 1 hour with 5% non-fat dry milk in

TBS. The membranes were then incubated overnight at 4°C using the primary antibody

phosphorylated-p38 MAPK (monoclonal rabbit anti-human [Thr180/Tyr182] Cell

Signaling technology, Danvers, MA, USA cat. no. 4511), p38 (polyclonal rabbit anti-

human, Cell Signaling technology, Danvers, MA, USA cat. no. 9212), phosphorylated-

ERK 1/2 (monoclonal rabbit anti-human [Thr202/Tyr 204], Cell Signaling technology,

Danvers, MA, USA cat. no. 4376), ERK (monoclonal rabbit anti-human, Cell Signaling

technology, Danvers, MA, USA cat. no. 4695), phosphorylated-JNK (monoclonal rabbit

anti-human [Thr183/Tyr185], Cell Signaling technology, Danvers, MA, USA cat. no.

4668), JNK (monoclonal rabbit anti-human, Cell Signaling technology, Danvers, MA, USA

cat. no. 9258). For p38, ERK 1/2 and JNK the antibodies that were used detected all protein

isoforms (p38α, -β and -γ, Erk1/Erk2 and SAPK/JNK). MuRF1 (polyclonal rabbit anti-

human, GeneTex Inc., Irvine CA, USA cat. no. GTX110475), ubiquitin (mouse

monoclonal anti-human, Cell Signaling technology, Danvers, MA, USA cat. no. 3936),

polyubiquitin (polyclonal rabbit anti-human Lysine 48-linkage, Cell Signaling technology,

Danvers, MA, USA cat. no. 4289) and 4-HNE (polyclonal rabbit anti-HNE-Michael [4-

Hydroxynonenal] Adducts, Reduced, Calbiochem, San Diego, CA, USA cat. no. 393207).

The antibody against MAFbx/Atrogin was developed in our centre as previously reported

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

64

(11, 12). The membranes were then washed 3 x 20 minutes with TBS and incubated for

1 hour at room temperature with the secondary antibody and again washed as above.

Secondary antibodies used were goat anti-rabbit IgG and horse anti-mouse IgG (Cell

Signaling technology, Danvers, MA, USA). Finally, the membranes were treated for 5

minutes with ECL Plus (GE Healthcare, Baie D’Urfé, QC, Canada) to detect

chemiluminescence substrates on X-ray exposed over a nitrocellulose membrane. For

protein oxidation measurements, the OxyBlot® kit was used to detect carbonyl groups

according to the manufacturer’s protocol (Millipore, Billeria, MA, USA). All protein

contents were normalized to α-tubulin (Sigma, Oakville, ON, Canada) except for

polyubiquitin, which was normalized according to the intensity of Amido black staining

(2). All proteins were referenced to an optical density quantity dependant curve at the end

of each SDS PAGE gels. Phosphorylated to total protein level ratios were individually

calculated and averaged per group for comparison.

Real-Time PCR

Total RNA extraction was performed from ≈ 15 mg of muscle using a commercially

available preparation (TRIzol® Reagent) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). One μg of

RNA was reverse transcribed to cDNA using QuantitectTM Reverse Transcription Kit

(Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Real time PCR were performed in a Rotor-GeneTM

6000 (Corbett Life Science, San Francisco, CA, USA) using QuantitectTM SYBR® Green

PCR Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). At the end of the PCR amplifications, the

samples were subjected to a melting curve analysis. The comparative threshold cycles

(∆CT) values for p38, ERK 1/2, JNK, MAFbx/Atrogin and MuRF1 were normalized for

RPLPO, 18s reference genes and analyzed using the 2-∆Ct method (22). All qPCR runs were

performed in duplicate to ensure quantitative accuracy. Specific primers are given in Table

1. The p38 primer detects p38α, ERK detects ERK2 and JNK detects JNK1.

Fiber typing

Five (5) μm cryosections were prepared from frozen muscle samples. Sections were

fixed for 10 minutes with acetone/methanol (60/40) at –20oC, washed 10 minutes in PBS

(Na2HPO4 58 mM, NaH2PO4 17 mM, NaCl 68 mM), blocked for 5 minutes with hydrogen

peroxyde 3%, washed for another 10 minutes in PBS, and then blocked in horse serum for

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

65

1 hour. Muscle was immunohistochemically stained using monoclonal anti-skeletal myosin

fast (Sigma, Oakville, ON, Canada) incubated overnight at 4oC with 1:200 dilution.

Cryosections were washed 10 minutes in PBS just before adding 1:50 dilution of

biotinylated antibody IgG from VECTASTAIN Elite ABC system (Vector Laboratories,

Burlington, ON, Canada). The immunoreactivity was visualized by AEC chromogen

substrate (Dako, Burlington, ON, Canada) that detects peroxydase activity. Cryosections

were then counterstained with Mayer’s Hematoxylin. Muscle fibers were classified

according to the staining intensity: type I (non-stained) and type II (stained). All muscle

sections were magnified and transferred to an image analysing system (Image Pro Plus 4.5

for Windows, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA). All fibers were counted and

classified to obtain the fiber-type composition for each subject.

Immunohistochemical assays

Muscle tissue was cut in 5 µm consecutive sections on a cryostat and prepared like the

cryosections for fiber typing. Sections were then incubated overnight at 4°C with

monoclonal mouse anti-human SAA11 diluted 1:10 (Calbiochem, San Diego, CA, USA

cat. no. ST1506), polyclonal rabbit anti-human Il-6 diluted 1:10 000 (Genetex, Irvine, CA,

USA cat. no. GTX26672), polyclonal rabbit anti-human Il-8 diluted 1:1000 (Bender Med

System, San Diego, CA, USA cat. no. BMS136), monoclonal rabbit anti-human TNF-α

diluted 1:40 (Millipore, Billerica, MA, USA cat. no. 04-1114), monoclonal rabbit anti-

human CD45R diluted 1:10 (Pharmingen, Mississauga, ON, Canada cat. no. 555904).

Cryosections were then treated exactly like fiber typing immunohistochemistry with

VECTASTAIN Elite ABC system (described above) and AEC chromogen substrate.

Positive and negative assays were used to ensure specific staining stated in the

manufacturer’s protocol. A blinded evaluator randomly selected 50 muscle fibers to be

analysed for each specific antibody described above. Two evaluators then counted all

specific stains to get the total stain count which was then averaged between the two

evaluators and divided by the number of fibers to obtain the stains/fiber ratio.

Representative examples of the inflammatory immunohistochemical stains are provided in

Figure 1.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

66

STATISTICAL ANALYSIS

Results are expressed as mean (± SEM). Between-group comparisons were done

using unpaired Student’s t tests, while normality for all data was assessed with a Shapiro-

Wilk test. Possible relationships were evaluated using Pearson’s correlations. Results were

considered significant if p values were less than 0.05.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

67

3.5 Results

Subjects’ characteristics

Anthropometric characteristics and pulmonary function data are provided in Table

2. On average, patients with COPD had moderate to severe airflow obstruction, reduced

diffusion capacity and mild hypoxemia. Total fat-free mass and fat-free mass index were

significantly lower in patients with COPD compared to healthy controls.

Muscle characteristics

Mid-thigh muscle cross sectional area was smaller in COPD compared to controls.

In COPD, mid-thigh muscle cross-sectional areas ranged from severe atrophy (47 cm2) to

normal value (102 cm2). Six patients exhibited a mid-thigh muscle cross-sectional area < 70

cm2, a value that is associated with poor survival (24). Patients with COPD also exhibited a

smaller proportion of type I fibers with a reciprocal increase in type II fiber proportion

(table 2).

MAPK pathway: Phosphorylated and total protein levels and mRNA levels

Phosphorylated to total protein ratios for p38 MAPK, ERK1/2 and JNK within the

quadriceps are illustrated in Figures 2 (panels A to C). Increases in muscle phosphorylated

to total p38 MAPK ratio (215%; p = 0.02) and phosphorylated to total ERK 1/2 ratio

(385%; p = 0.01) were observed in COPD in comparison to controls. However, no

statistically significant difference between groups was seen for phosphorylated to total JNK

ratio (153%; p = 0.23). The mRNA expression of p38 MAPK α (253%; p = 0.04) and

ERK2 (384%; p = 0.02) were significantly elevated in patients with COPD compared to

controls, while JNK1 (171 %; p = 0.52) mRNA levels did not show any differences

between groups (figure 3 A, B and C).

Total protein content of MAFbx/Atrogin tended to be elevated in patients with

COPD (170%; p = 0.08) (figure 4A) while MuRF total protein levels was similar between

groups (figure 4B). MAFbx/Atrogin mRNA level was significantly elevated in patients

with COPD (364%; p = 0.04, Figure 4C). A similar tendency was observed for MuRF1, but

this did not reach statistical significance (201%; p = 0.28, figure 4D). Total ubiquitinated

proteins were similar between groups (figures 4E) while poly-ubiquitinated proteins levels

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

68

were significantly elevated in patients with COPD (155%; p = 0.02, figure 4F). In all

subjects, there was a negative correlation between the phosphorylated to total p38 MAPK

ratio (Pearson’s r=-0.45; p < 0.05) and the phosphorylated to total ERK1/2 ratio (Pearson’s

r=-0.47; p < 0.05) and mid-thigh muscle cross sectional area (figure 5A and B). In addition,

there were significant correlations between the phosphorylated to total p38 MAPK ratio

(Pearson’s r=0.44; p < 0.05) and the phosphorylated to total ERK1/2 ratio (Pearson’s

r=0.57; p < 0.05) with MAFbx/Atrogin (figure 5C and D). Finally, a correlation was

observed between the phosphorylated to total ERK1/2 ratio (Pearson’s r=0.55; p < 0.05)

and the polyubiquitinated proteins levels (figure 5E).

Muscle oxidative stress and inflammatory markers

Immunohistochemical assays revealed similar muscle levels for IL-6, IL-8, TNF-α,

SAA11 and CD45R in both groups (Table 3). Also depicted in table 3, lipid peroxidation

(4-HNE) and protein carbonylation levels (OxyBlot®) measured in muscle samples were

similar between groups.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

69

3.6 Discussion

In this study, the extent of activation of several MAPKs was assessed in the context of their

possible contribution to the development of muscle atrophy in patients with COPD. The

main finding was the greater proportion of phosphorylated proteins levels of p38 MAPK

and ERK 1/2 in the quadriceps of patients with moderate to severe COPD compared to

healthy controls. The presence of an elevated proteolytic activity in the muscles of these

patients was supported by the mRNA overexpression of MAFbx1/Atrogin and increased

muscle protein polyubiquitination in COPD patients. Moreover, significant correlations

were found between quadriceps phosphorylated protein levels of p38 MAPK and ERK 1/2

with mid-thigh muscle cross sectional area, MAFbx1/Atrogin and polyubiquitin. Although

the origin of this activation of p38 MAPK and ERK 1/2 in these patients could not be

confirmed in the absence of evidence for muscle inflammation and oxidative stress, our

results nevertheless highlight the abnormal regulation of key signalling proteins that could

be involved in the regulation of muscle mass in patients with stable COPD.

MAPKs signalling

While the activity of the MAPKs responds to several distinct stresses, convincing

evidence shows that p38 MAPK and ERK are contributors to the development of skeletal

muscle atrophy through activation of proteolysis (18, 30, 40). Specifically, MAFbx/Atrogin

expression is upregulated by inflammatory stresses in a p38 MAPK-dependent manner in

culture myotubes (21). Recent findings indicate that the blockade of MAFbx/Atrogin gene

induction can be achieved with the inhibition of p38 MAPK (18). In addition, ERK

activation increases the expression of the MAFbx/Atrogin in C2C12 cells, suggesting an

upregulation of the proteasome activity and a downregulation of the myogenic process (27).

Although the MAPKs (p38 MAPK, ERK and JNK) induce transcriptional factors such as

AP-1, p53, and c-Myc and many other nontranscriptional factors involved in muscle cell

degradation, the specific activation of these factors remain elusive (30). Thus our findings

of increased levels of activation of p38 MAPK and ERK 1/2, muscle protein

polyubiquitination levels and of MAFbx1/Atrogin mRNA overexpression in patients with

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

70

COPD are consistent with cell and animal experiments in suggesting a potential

contribution of this pathway in the regulation of skeletal mass in this disease. This

statement is further supported by the correlations between p38 MAPK and ERK 1/2 with

MAFbx1/Atrogin, polyubiquitin and mid-thigh muscle cross-sectional area.

Apart from its involvement in the regulation of muscle mass, the activation of the

various MAPKs signalling pathway may contribute to other muscle phenotypic

manifestations commonly seen in COPD. Increased levels of ERK1/2 have been associated

with type II fiber predominant muscle phenotype that is commonly seen in COPD (14, 38).

For instance, p38 MAPK overexpression can decrease GLUT4 expression and contraction-

stimulated glucose transport (17). This is of interest because a reduction in GLUT4

transporters and glucose transport/utilization in COPD have been previously reported (15,

35).

One recent study measuring the phosphorylated levels of p38 MAPK and other

downstream targets of the MAPKs signalling pathway in the quadriceps of patients with

COPD showed no significant difference in phosphorylated p38 MAPK levels compared to

healthy controls (34). Discrepancies between these and our results are likely to be related to

different methodologies used to explore the effectors of the MAPK signalling pathway and

to differences in study populations.

Mechanisms of MAPKs signalling pathway upregulation

On the basis that several studies have shown that pro-inflammatory cytokines like

TNF-α can stimulate muscle proteolysis and lead to atrophy, we investigated whether the

activation of p38 MAPK and ERK 1/2 was driven by muscle inflammation or oxidative

stress. A low level of systemic and/or muscle inflammation has been proposed as a

potential trigger of muscle atrophy in COPD (10, 13). For example, patients with COPD

who fail to gain weight in response to nutritional support present high circulating levels of

TNF-α, which can activate all three major MAPKs signalling pathways in skeletal muscle,

thus possibly contributing to the muscle protein catabolic state (8).

Oxidative stress is also associated with loss of muscle mass in COPD (5). Oxidative

stress within skeletal muscle fibers activates redox-sensitive transcription factors and

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

71

protein kinases, including p38 MAPK, ERK1/2, and JNK (30). In the current study, we

found that p38 MAPK and ERK 1/2 activation as well as MAFbx/Atrogin levels were

elevated in patients with COPD but no apparent evidence of muscle inflammation and

oxidative stress could be observed.

There are inconsistencies regarding the presence of muscle inflammation and

oxidative stress in patients with COPD across studies (1, 26, 28, 32), including ours. A

definitive conclusion about the significance of inflammation and/or oxidative stress to the

COPD-related atrophying process cannot be currently reached. Our view is that this process

is likely to be multifactorial and that the relative contribution of each individual factor is

likely to vary in time and from one patient to the other. One possibility is that intermittent

inflammatory or oxidative bursts occurring during an acute COPD exacerbation or during

acute immobilization and that cannot be detected during a stable phase of the disease, could

be detrimental to skeletal muscle maintenance in patients with COPD, although one report

does not support this contention (9).

Even if not all mRNAs translate into proteins, our results of the greater expression

of p38 MAPK and ERK 1/2 mRNA show that the cellular environment is prepared to

produce a larger amount of those proteins, if necessary. This could be relevant for

situations requiring rapid inflammatory or oxidative responses.

Limitations

This study has the merit of reporting on molecular mechanisms that have been

convincingly associated with the development of muscle atrophy in cells and hindlimb

immobilized animals (7, 21, 25). However, a number of methodological considerations and

potential limitations need to be taken into account regarding its interpretation. First,

although patients with COPD clearly exhibited a loss of muscle mass, we cannot ascertain

whether they were actively loosing muscle mass at the time of experimentation. Another

limitation that is intrinsic to this type of human experimentation is the descriptive nature of

the study. As such, our results do not confirm a causal relationship between the activation

of the p38 MAPK and ERK 1/2 and the reduction of muscle mass, although this was

suggested from correlational analyses. Future mechanistic experiments or pharmacological

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

72

manipulations of these MAPKs pathways are necessary to address a possible causality

between these observations. Furthermore, several isoforms and expression patterns of the

MAPKs exist; however, dissecting of the specific role of each subunit in the COPD-related

atrophying process appeared premature and was beyond the scope of this investigation (25,

30). As such, antibodies detecting all protein isoforms were used in the western blot

analyses. Lastly, we acknowledge that some discrepancies exist between our protein and

mRNA results. Apart from biological explanations for this phenomenon (see previous

paragraph), some methodological issues could contribute to these discrepancies; while the

primers that were used for PCR analyses were specific for certain mRNAs, the antibodies

that were used for the Western Blot analyses covered all the different isoforms of the

proteins of interest.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

73

3.7 Conclusion

This study demonstrates elevated phosphorylation levels of p38 MAPK and ERK1/2

in the quadriceps of patients with COPD compared to healthy aged-matched controls.

These intracellular signalling events were associated with increased levels of

MAFbx/Atrogin and protein polyubiquitination. As such, the present results support the

hypothesis that p38 MAPK and ERK1/2 could be potentially involved in the regulation of

muscle mass in COPD.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors acknowledge the help of Alexandra Porlier, Vera Askerov, Marthe

Bélanger, Marie-Josée Breton, Brigitte Jean and Josée Picard in accomplishing this study.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

78

3.9 Tables

Table 1. Primer sequences used for qPCR analyses

Target

mRNA

PCR primer sequence 5’→ 3’

p38 MAPK Forward Reverse

CAGGGCCACCTTCTTGCCCG CTGTGTGCCGAGCCAGTCCA

ERK 1/2 Forward Reverse

GCCTGGCCCGTGTTGCAGAT TGGGTGGGCCAGAGCCTGTT

JNK Forward Reverse

GCACCCGAGGTCATCCTTGGC GGAGAGGGCTGCCCCCGTAT

MAFbx/Atrogin1 Forward Reverse

GCAGCTGAACAACATTCAGATCAC CAGCCTCTGCATGATGTTCAGT

MuRF1 Forward Reverse

CCTGAGAGCCATTGACTTTGG CTTCCCTTCTGTGGACTCTTCCT

18s Forward Reverse

ACCGGCGCAAGACGAACCAG GCCGGGTGAGGTTTCCCGTG

RPLPO Forward Reverse

TCTACAACCCTGAAGTGCTTGATATC GCAGACAGACACTGGCAACATT

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

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Table 2. Characteristics of study subjects

Values are mean ± SEM BMI, body mass index; FEV1, forced expiratory volume in 1 sec; FEV1/FVC, FEV1 to

forced vital capacity (FVC) ratio; DLco, diffusing capacity of carbon monoxyde; MTCSA, mid-thigh muscle cross-sectional area. * Versus Controls, p ≤ 0.05

CONTROLS

(n = 9)

COPD

(n = 18)

Age (years) 66 ± 3 65 ± 1 Height (cm) 172 ± 2 170 ± 1 BMI (kg/m

2) 28.7 ± 1.8 25.8 ± 0.7

Fat-free mass (kg) 58.7 ± 1.7 50.1 ± 0.7* Fat-free mass index (kg/m2) 19.8 ± 0.5 17.5 ± 0.5* Fat mass (kg) 21.4 ± 1.1 23.3 ± 1.4 Pulmonary function FEV1 (L) 3.13 ± 0.09 1.04 ± 0.05* FEV1 (% predicted) 104 ± 2 34 ± 2* FEV1/FVC (%) 74 ± 1 34 ± 1* DLCO (% predicted) 93 ± 2 49 ± 2* PaCO2 (mm Hg) - 42 ± 1 PaO2 (mm Hg) - 74 ± 1 Physical activity monitoring Voorrips (score) 5.8 ± 0.5 3.1 ± 0.2* Steps (steps/day) 5836 ± 413 3456 ± 764 Muscle characteristics MTCSA (cm2) 114.7 ± 4.1 79.9 ± 3.9* Total thigh muscle mass (kg) 19.9 ± 1.2 16.5 ± 0.5* Type I muscle fibers (% of total fibers) 51 ± 17 35 ± 15* Type II muscle fibers (% of total fibers) 49 ± 17 65 ± 15*

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Table 3. Muscle oxidative stress and inflammatory markers Values are mean ± SEM TNF-α, tumor necrosis factor alpha, IL-6, interleukin 6; IL-8, interleukin 8; SAA11, serum amyloid A1; CD45R, cluster of differentiation 45 antigen receptor; Oxyblot, protein carbonylation; 4-HNE, trans-4-hydroxy-2-nonenal.

CONTROLS (n = 9)

COPD (n = 18)

Inflammatory markers TNF-α (stains/fiber) 41.0 ± 4.7 40.6 ± 2.1 IL-6 (stains/fiber) 7.0 ± 2.3 6.0 ± 1.8 IL-8 (stains/fiber) 9.8 ± 2.8 8.2 ± 1.5 SAA11 (stains/fiber) 55.8 ± 7.3 46.1 ± 5.1 CD45R (stains/fiber) 3.5 ± 0.8 3.6 ± 0.4 Oxidative stress markers Oxyblot® (fold increase from CTRL) 1.00 ± 0.03 1.03 ± 0.03 4-HNE (fold increase from CTRL) 1.00 ± 0.09 1.02 ± 0.04

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

81

3.10 Figures Legend FIGURE 1. Examples of immunohistochemical staining. Isotypical control (panel A), positive staining for SAA11 (panel B) and positive staining for TNF-α (panel C) on muscle cryosections are provided. Arrows point to area of positive staining. FIGURE 2. Group mean values for phosphorylated to total p38 MAPK ratio (panel A), phosphorylated to total ERK 1/2 ratio (panel B), phosphorylated to total JNK ratio (panel C) in the quadriceps of healthy controls and patients with COPD. Bands were normalized according to their correspondent α-tubulin for the cytoplasmic protein content. FIGURE 3. p38 MAPK α (panel A), ERK2 (panel B) and JNK1 (panel C) mRNA expression in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Data are presented in arbitrary units (A.U.) FIGURE 4. Representative Western blots and group mean values for MAFbx/Atrogin (panel A) and MuRF (panel B) total protein content in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). MAFbx/Atrogin (panel C) and MuRF (panel D) mRNA expression in the quadriceps of healthy controls and patients with COPD. Total ubiquitinated (panel E) and polyubiquitinated (panel F) protein content in the quadriceps of healthy controls and patients with COPD. A.U. = arbitrary units.

FIGURE 5. Correlation between phosphorylated to total ERK ratio and mid-thigh muscle cross-sectional area (panel A), phospho-p38/total p38 and mid-thigh muscle cross-sectional area (panel B), phosphorylated to total ERK ratio and MAFbx/Atrogin (panel C), phosphorylated to total p38 MAPK ratio and MAFbx/Atrogin (panel D) and phosphorylated to total ERK ratio and polyubiquitinated protein levels (panel E) in healthy controls and patients with COPD. A.U. = arbitrary units.

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

82

3.11 Figures

Figure 1

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

83

Figure 2

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

84

Figure 3

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

85

Figure 4

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CHAPITRE III. MAPK Signalling In The Quadriceps Of Patients With COPD

86

Figure 5

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CHAPITRE IV

SAA1 EXPRESSION IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH COPD

Article en préparation pour The American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

89

4.1 Page Titre

SAA1 EXPRESSION IN THE QUADRICEPS OF PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONAIRY DISEASE

Authors: Bruno B. LEMIRE1, Annie DUBÉ1, Marie-Eve THÉRIAULT1, Yohan BOSSÉ1,2, Richard DEBIGARÉ1 and François MALTAIS1

Affiliation :

1) Centre de recherche, Institut Universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, Canada. 2) Department of Molecular Medicine, Laval University, Québec, Canada.

B B. Lemire is the recipient of a PhD training award from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Y. Bossé is a research scholar from the Heart and Stroke Foundation of Canada. R. Debigaré is a Research Scholar of the Fonds de la Recherche en Santé du Québec. F. Maltais holds a GSK/CIHR Research Chair on COPD at Université Laval. This work has been supported by CIHR grant MOP-84091. Word count: Address of correspondence: Dr François Maltais

Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec

2725 Chemin Ste-Foy Québec, Québec G1V 4G5 CANADA Tel: 418-656-4747 Fax: 418-656-4762

E-mail: [email protected]

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

90

4.2 Résumé

Plusieurs études ont établi un lien entre l'inflammation systémique et les

changements physiologiques et histologiques observés dans les muscles squelettiques des

patients atteints de la MPOC. Bien que certains résultats énoncés dans la littérature soient

contradictoires quant à l’absence ou la présence d'inflammation, il n’en demeure pas moins

que l'inflammation pourrait être une des causes principales de la dysfonction musculaire

périphérique dans la MPOC. Le Sérum Amyloïde A1 (SAA1) est connu pour être impliqué

dans la dégradation des protéines musculaires. Il a récemment été suggéré comme étant un

nouveau biomarqueur de l'inflammation lors des exacerbations aiguës de la MPOC. Nous

voulions étudier de manière plus approfondie les niveaux d'expression musculaire de SAA1

chez les patients atteints de MPOC modérée à sévère ainsi que pendant une exacerbation de

la maladie. Pour y arriver, des biopsies du quadriceps chez 16 patients atteints de la MPOC

et 7 sujets sains appariés pour l’âge ont été obtenues. Des analyses génétiques et

transcriptionnelles avec des puces à ADN et du PCR en temps réel ont été effectuées. Les

résultats démontrent une augmentation de l'expression du gène SAA1 de 2,5 fois et une

augmentation des niveaux d’ARNm de 66 fois dans le quadriceps des patients atteints de la

MPOC en comparaison avec les sujets sains. De plus, un groupe de validation de 11

patients atteints de la MPOC et de 10 sujets sains appariés pour l’âge a aussi été analysé

pour connaître les niveaux d'ARNm de SAA1 par PCR en temps réel ainsi que de TNF-α,

IL-6 et IL-8 à des fins de comparaison. Les résultats démontrent une augmentation de

l’ARNm de 19 fois dans le quadriceps des patients atteints de la MPOC en comparaison

avec les sujets sains. Aucune différence n’a été détectée pour le TNF-α, IL-6 et IL-8. Enfin,

les résultats de 7 patients hospitalisés pour une exacerbation de leur MPOC démontrent une

impressionnante augmentation de l'ARNm de SAA1 de 36 542 fois en comparaison avec

les sujets sains. Cette étude met en évidence un rôle possible de SAA1 comme marqueur de

l’inflammation musculaire chez la MPOC et suggère qu’il pourrait être un facteur

important dans la dysfonction musculaire chez la MPOC.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

91

4.2 Abstract

Several reports have linked systemic inflammation with the physiological and histological

changes observed in the skeletal muscles of patients with COPD. Although results have

been inconsistent with the presence or not of inflammation, the possibility remains that

inflammation may be a key mediator of limb muscle dysfunction in COPD. Serum amyloid

A1 (SAA1), an acute phase protein, has been suggested to be a novel biomarker of

inflammation during acute exacerbations in COPD and has been known to be elevated

during cachexia as well as being involved in protein degradation. We investigated SAA1

muscle expression levels in patients with moderate to severe COPD under stable condition

and during an exacerbation of the disease. Sixteen (16) patients with COPD and 7 age-

matched healthy controls had a biopsy of the quadriceps. Tissue was analyzed by gene Chip

analysis and qPCR. Results indicate a 2.5-fold increase in SAA1 gene expression and a 66-

fold increase in SAA1 mRNA expression in the quadriceps of patients with COPD. A

validation group of 11 COPD and 10 age-matched healthy controls were also analyzed for

SAA1, TNF-α, IL-6 and IL-8 mRNA expression. Results showed a 19-fold increase in

quadriceps SAA1 mRNA expression in patients with COPD compared to controls while no

differences were seen in TNF-α, IL-6 and IL-8. Finally, a 36 542-fold increase in

quadriceps SAA1 mRNA expression was seen in 7 exacerbated patients compared to

healthy controls. This study highlights a possible role of SAA1 expression as a marker

and/or a contributor to limb muscle dysfunction in COPD.

Keywords: muscle dysfunction, COPD, SAA1, muscle wasting

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

92

4.3 Introduction

Chronic obstructive pulmonary disease COPD) is associated with an array of

systemic manifestations among which limb muscle atrophy has been the subject of detailed

researches (11, 13, 19, 34). Inflammation has been proposed to be a key mechanism in the

initiation and perpetuation of muscle loss in several animal and human models of cachexia

(15, 30). However in COPD, neither convincing nor consistent evidence of muscle

inflammation has emerged (3, 27) and the search for an inflammatory mediator that could

orchestrate the signalling cascades involved in limb muscle protein degradation in COPD

has lead to disappointing results.

Serum amyloid A1 (SAA1), an acute phase protein, is a multifunctional

apolipoprotein involved in cholesterol transport and metabolism. It is one of the typical

inflammatory markers because of its role in the modulation of numerous immunological

responses and its ubiquitous presence in inflammatory diseases (29, 32, 35), such as in

COPD (7, 21). Recently, SAA1 has been proposed as a novel biomarker of inflammation

during acute exacerbations in COPD (7). The biological functions of SAA1 have not been

fully defined, although recent reports indicate that SAA1 induces pro-inflammatory

cytokine expression (17), can modify receptors of pro-resolving signals of inflammation

thus preventing tissue healing in lungs (6) and contributes to muscle protein degradation in

L6 myotubes (36). While the most abundant production of SAA1 comes from the liver,

extra hepatic sources of SAA1 involve a wide range of tissues including kidney, stomach,

spleen, heart, brain and skeletal muscle (10, 32). SAA1 muscle gene expression is elevated

during cancer cachexia and in this model the muscles could provide a large fraction of the

serum acute phase proteins such as SAA1(5). SAA1 could mediate the inflammatory

response through Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) and the

Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) activation (5).

In 2008, we reported the mRNA expression profile of the quadriceps in a small

sample of patients with COPD (13). An intriguing finding was the 21.2 fold increase in the

SAA1 mRNA expression level in the quadriceps of patients with stable COPD compared to

age-matched healthy controls. This was, by far, the most upregulated gene found in this

exploratory experiment. This finding was corroborated by a subsequent muscle gene

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

93

expression study involving reporting a 1.9 fold increase in SAA1 in 6 patients with COPD

in comparison with 5 healthy controls (26).

Since SAA1 is a marker of inflammation that is increased during cellular stress and

might precede a cascade of metabolic events detrimental to skeletal muscle, this

investigation aimed at; 1) evaluating quadriceps gene and mRNA SAA1 expression in a

discovery study of patients with COPD in comparison to healthy age-matched subjects; 2)

validating the mRNA expression of SAA1 in a validation study and comparing these results

with other intramuscular cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-8) and finally; 3) obtaining

preliminary data on the mRNA expression of SAA1 in patients with COPD suffering from

an acute exacerbation.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

94

4.4 Methods

Subjects

Patients with moderate to severe COPD and healthy age-matched controls were

recruited; 16 and 7, respectively for the discovery study (COPD DIS) and 11 and 10,

respectively for the validation study (COPD VAL). The diagnosis of COPD was based on

spirometry showing moderate to severe irreversible airflow obstruction (forced expiratory

volume in 1 second [FEV1] < 80% predicted value, and FEV1/ forced vital capacity [FVC]

< 70%). All patients with COPD were in a stable condition at the time of the study without

any acute exacerbation of their disease or exposure to systemic corticosteroids within 2

months of their participation in the study. None of the patients was receiving long-term

oxygen therapy. Patients with COPD and healthy controls were excluded if they presented

any medical condition, other than COPD (in the case of patients with COPD), likely to

influence muscle and biochemical testing (i.e. cardiovascular, neurological,

musculoskeletal, locomotor or other respiratory diseases). In both groups, only ex-smoker

sedentary males who had stopped for at least 6 months were included. In the exacerbation

study, seven patients (COPD EXA) were recruited within a range of 48 hours of the

exacerbation onset and before systemic corticosteroids and antibiotics were initiated. The

institutional ethics committee approved the research protocol and a signed informed

consent was obtained from each subject.

Study design

After reviewing medical history and familiarization with the study procedures,

participants filled out a physical activity questionnaire (33). Anthropometric measurements,

bioelectrical impedance, pulmonary function testing, computed tomographies of the thigh

were performed in all participants with the exception of the 7 exacerbated patients. A

needle biopsy of the quadriceps was then performed after 30 minutes of rest in the supine

position.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

95

Anthropometric measurements and body composition.

Height and weight were measured according to standardized methods (14). Dual

energy X-ray Absorptiometry (DEXA) provided regional assessment of fat, fat-free mass

and total thigh muscle mass (General Electric Healthcare, Chicago, IL).

Pulmonary function testing

Standard pulmonary function tests including spirometry, lung volumes, and carbon

monoxide diffusion capacity were obtained according to previously described guidelines (2).

Results were related to previously publish normal values (24).

Measurement of mid-thigh muscle cross-sectional area

A computed tomography (CT) of the right thigh halfway between the pubic

symphysis and the inferior condyle of the femur was performed using a fourth-generation

Toshiba Scanner 900S (Toshiba). Computed tomography was used to quantify muscle

cross-sectional area mass in a more specific manner than anthropometric measurements

(28).

Systemic inflammation markers The antecubital venous blood was centrifuged for 10-min, plasma was aliquoted,

and stored at -80°C until further analysis. Commercial ELISA kits (R&D Systems Inc,

Minneapolis, MN, USA and Invitrogen, Ontario, Canada) were used to measure the plasma

levels of systemic inflammatory markers (TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, SAA1).

Muscle biopsy and muscle specimen analyses

Needle biopsies of the quadriceps were performed as described by Bergström and

routinely done in our laboratory (4, 18). Muscle specimens were frozen in liquid nitrogen

and stored at -80°C for future analysis.

Quantitative Real-Time PCR

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

96

Total RNA extraction was performed from ≈ 15 mg of muscle using a commercially

available preparation (TRIzol® Reagent) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). One μg of

RNA was reverse transcribed to cDNA using QuantitectTM Reverse Transcription Kit

(Qiagen, Mississauga, ON, Canada). qPCR were performed in a Rotor-GeneTM 6000

(Corbett Life Science, San Francisco, CA, USA) using QuantitectTM SYBR® Green PCR

Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). At the end of the qPCR amplifications, the

samples were subjected to a melting curve analysis. The comparative threshold cycles

(∆CT) values for SAA1, TNF-α, IL-6 and IL-8 were normalized with RPLPO or 18s

reference genes and analyzed using the 2-∆Ct method (22). All qPCR runs were performed

in duplicate to ensure quantitative accuracy. Specific primers are given in Table 1. All

qPCR runs were performed in duplicate to ensure quantitative accuracy.

Microarray analysis

We performed microarray analysis using the HumanWG-6 v3.0 expression

BeadChips (Illumina, San Diego, California) with the total muscle RNA that was extracted

from muscle specimens. The false discovery rate (FDR) and the fold change threshold were

set at 5% and 2.0, respectively.

Statistical analysis

Data are expressed as the mean ± standard error of the mean and were analyzed

using a statistical package program SAS version 9.01. Between-group comparisons were

done using a Mann-Whitney test, while normality for all data was assessed with a Shapiro-

Wilk test. Pearson’s correlation analysis was done for any relevant associations. Results

were considered significant if p values were less than 0.05.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

97

4.5 Results

Subjects’ characteristics

Anthropometric characteristics and pulmonary function data are provided in Table

2, 3 and 4 for all study groups. On average, patients with COPD had moderate to severe

airflow obstruction, reduced diffusion capacity and mild hypoxemia. Physically, they were

also significantly lighter than the age-matched healthy controls, explained mostly by the

decrease in lean muscle mass (table 2).

Muscle characteristics

Mid-thigh muscle cross sectional area was smaller in COPD compared to controls

for both the discovery and validation studies. In the discovery study, patients’ mid-thigh

muscle cross-sectional areas ranged from severe atrophy (47 cm2) to normal value (104

cm2). Three patients exhibited a mid-thigh muscle cross-sectional area < 70 cm2, a value

that is associated with poor survival (23). In the validation study, patients’ mid-thigh

muscle cross-sectional areas ranged from severe atrophy (59 cm2) to normal value (118

cm2) while two patients exhibited a mid-thigh muscle cross-sectional area < 70 cm2.

Systemic inflammation markers IL-6, IL-8, TNF-α, CRP (C-reactive protein) and SAA1 proteins assays were

performed in the validation and for exacerbation group of patient. IL-8 (p = 0.01) and CRP

(p = 0.03) were significantly elevated in the COPD EXA group compared to healthy

controls. In addition, SAA1 was significantly elevated in the COPD EXA group compared

to healthy controls (p = 0.02) (Figure 4).

Gene and mRNA analysis

In the discovery study, the muscle microarray analysis showed a 2.5 fold elevation

in SAA1 (q value = 0, false discovery rate of 0%) in patients with COPD DIS compared to

healthy controls. These results were verified by qPCR, where the expression of SAA1 was

65.8-fold (p = 0.004) greater in COPD DIS compared to healthy controls (table 5).

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

98

In the validation study, the SAA1 mRNA expression was 19.3 fold (p = 0.0006)

greater in the COPD VAL group compared to controls (table 5, figure 1). In addition, TNF-

α (p = 0.88), IL-6 (p = 0.87) and IL-8 (p = 0.88) did not show any difference in mRNA

expression between groups (figure 2).

During exacerbation, the SAA1 mRNA expression averaged 36 542-fold (p =

0.0002) increase in COPD EXA patients compared to controls in this study (figure 1).

However, TNF-α (p = 0.60), IL-6 (p = 0.77) and IL-8 (p = 0.32) mRNA expression was

similar between groups (figure 2).

Finally, Pearson’s analysis between the quadriceps mRNA expression (fold from

CTRL) and the mid-thigh cross-sectional area (MTCSA) in all study participants showed a

significant negative correlation of r = -0.35 (p ≤ 0.05) (figure 3).

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

99

4.6 Discussion

This investigation quantified SAA1 at the gene and the mRNA levels in the

quadriceps of patients with COPD compared to age-matched healthy controls. We validated

findings of the discovery study in a validation study and provided preliminary data about

SAA1 levels during an acute COPD exacerbation. Our results confirm that the gene

expression and mRNA levels of SAA1 are increased in the muscle tissue of patients with

stable COPD (13, 26). The results also show an impressive SAA1 quadriceps mRNA

expression during an exacerbation while other muscle cytokine expression such as TNF-α,

IL-6 and IL-8 were not significantly modified. A similar pattern was seen in systemic

inflammation in these patients.

Increased muscle SAA1 mRNA levels following an acute exercise bout has been

reported without seeing any increases in plasma SAA1 levels (9), confirming the intrinsic

capacity of the muscle to produce this protein. Although not all available mRNA

synthesized in a given cell is necessarily translated into protein (16), the abundance in

SAA1 mRNA could act as a reservoir for an acute response when the organism is being

stressed or may be produced under conditions that do not evoke the systemic acute-phase

response and could play a role related to the site of expression (32).

In the case where systemic inflammation is known to be present, albeit during a

COPD exacerbation, SAA1 systemic levels are rapidly increased in patients with COPD

and could be involved in the inflammation imbalance that ‘opposes anti-inflammatory and

pro-resolution pathways’ during these events (7, 8). This study again demonstrates that

systemic levels of SAA1 are elevated in exacerbated patients while IL-6 and TNF-α were

not (figure 4).

Specifically to the peripheral muscles, only scant and unconvincing data supporting

the presence of quadriceps inflammation in COPD have been reported (1, 20, 25). Our own

findings (13) are corroborated by others (3) who did not find evidence of quadriceps

inflammation in COPD, even in the presence of muscle wasting or during periods of acute

exacerbation when inflammatory bursts should be expected (12). In this context, the present

investigation is relevant because it provides a robust observation of the presence of an acute

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

100

phase inflammatory marker within a limb muscle in patients with COPD. The lack of

significant changes in other pro-inflammatory cytokines in the face of an elevated SAA1

also raises the hypothesis of specificity in the nature of muscle inflammation occurring in

COPD.

Bozinovski et al. eloquently demonstrated that SAA1 could in fact be a potential

biomarker for acute exacerbations in COPD, but its presence in peripheral muscles had, to

the best of our knowledge, never been investigated. Therefore, these and our results merit

further investigation on the possible contribution to the development of muscle dysfunction

in COPD. However, our Pearson’s analysis showed a significant negative correlation

between the SAA1 quadriceps expression and the MTCSA of our study subjects, raising a

possibility that SAA1 could play a role in muscle atrophy in COPD, as it is already known

to be a candidate pathogenic mediator in the mechanism for defective resolution in lung

tissue in COPD (8).

Although not investigated in the present study, cellular and animal data support a

possible mechanistic role of SAA1 in the development of muscle atrophy. In L6 myotubes,

SAA1 in combination with IL-6 has been associated with a decreased IGF-1 signalling and

an increased protein degradation (36). SAA1 accumulates in the quadriceps and

gastrocnemius of cachectic mice in association with up-regulation in the proteasome, IL-6

and MAPKs signalling pathways (5), suggesting the possible involvement of SAA1 on

protein regulation cellular signalling in muscle.

The SAA1 mRNA upregulation may be even more relevant during the course of an

exacerbation, a period during which patients with COPD are vulnerable to the deterioration

of muscle function (31). In this context, the dramatic elevation of SAA1 suggests that this

protein is not a mere bystander but could be involved in the regulation of the inflammatory

process. We acknowledge the preliminary nature of our study but the consistencies across

the discovery and validation studies as well as the findings in the exacerbated patients

provide a plausible target for the investigation of inflammation as a mechanism of limb

muscle atrophy in COPD.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

101

4.7 Conclusion

This study provides solid evidence that inflammation is increased within the

quadriceps of patients with COPD. The possibility exists that SAA1 expression may exert a

pathogenic role in the development of limb muscle dysfunction in COPD. SAA1 may also

become a valuable biomarker of the muscle inflammation in this disease. Further

mechanistic studies are needed to elucidate the role of SAA1 in muscle inflammation and

atrophy in COPD.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors acknowledge the help of Dr Steeve Provencher, Dr Julie Milot, Sana

Chambah, Fernanda Ribeiro, Marthe Bélanger, Marie-Josée Breton, Brigitte Jean and Josée

Picard in accomplishing this study.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

102

4.8 References

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

103

13. Debigaré R, Maltais F, Côté CH, Michaud A, Caron MA, Mofarrahi M, Leblanc P, and Hussain SN. Profiling of mRNA expression in quadriceps of patients with COPD and muscle wasting. Copd 5: 75-84, 2008. 14. Heymsfield SB WP. Nutritional assessment by clinical and biochemical methods. In: Modern nutrition in health and disease. Philadelphia: Lea & Febiger, 1994, p. pp. 812-841. 15. Lenk K, Schuler G, and Adams V. Skeletal muscle wasting in cachexia and sarcopenia: molecular pathophysiology and impact of exercise training. J Cachexia Sarcopenia Muscle 1: 9-21, 2010. 16. Maier T, Guell M, and Serrano L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett 583: 3966-3973, 2009. 17. Malle E, Sodin-Semrl S, and Kovacevic A. Serum amyloid A: an acute-phase protein involved in tumour pathogenesis. Cell Mol Life Sci 66: 9-26, 2009. 18. Maltais F, LeBlanc P, Whittom F, Simard C, Marquis K, Bélanger M, Breton MJ, and Jobin J. Oxidative enzyme activities of the vastus lateralis muscle and the functional status in patients with COPD. Thorax 55: 848-853, 2000. 19. Montes de Oca M, Loeb E, Torres SH, De Sanctis J, Hernandez N, and Talamo C. Peripheral muscle alterations in non-COPD smokers. Chest 133: 13-18, 2008. 20. Montes de Oca M, Torres SH, De Sanctis J, Mata A, Hernandez N, and Talamo C. Skeletal muscle inflammation and nitric oxide in patients with COPD. Eur Respir J 26: 390-397, 2005. 21. Nussbaumer-Ochsner Y, and Rabe KF. Systemic manifestations of COPD. Chest 139: 165-173, 2011. 22. Quanjer PH, and Furberg CD. GOLD COPD stage I is not associated with increased risk of death. Respiratory Medicine 106: 153, 2012. 23. Quanjer PH, Schouten JP, Miller MR, and Ruppel G. Avoiding bias in the annualized rate of change of FEV1. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 175: 291-292; author reply 292, 2007. 24. Quanjer PH, Tammeling GJ, Cotes JE, Pedersen OF, Peslin R, and Yernault JC. Lung volumes and forced ventilatory flows. Report Working Party Standardization of Lung Function Tests, European Community for Steel and Coal. Official Statement of the European Respiratory Society. Eur Respir J Suppl 16: 5-40, 1993. 25. Rabinovich RA, Figueras M, Ardite E, Carbo N, Troosters T, Filella X, Barbera JA, Fernandez-Checa JC, Argiles JM, and Roca J. Increased tumour necrosis factor-alpha plasma levels during moderate-intensity exercise in COPD patients. Eur Respir J 21: 789-794, 2003. 26. Radom-Aizik S, Kaminski N, Hayek S, Halkin H, Cooper DM, and Ben-Dov I. Effects of exercise training on quadriceps muscle gene expression in chronic obstructive pulmonary disease. J Appl Physiol 102: 1976-1984, 2007.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

104

27. Sin DD, and Reid WD. Is inflammation good, bad or irrelevant for skeletal muscles in COPD? Thorax 63: 95-96, 2008. 28. Sipila S, and Suominen H. Muscle ultrasonography and computed tomography in elderly trained and untrained women. Muscle Nerve 16: 294-300, 1993. 29. Sun Y, Zhang P, Li X, Zhang H, Li J, Liu G, and Guo J. A novel nonsense mutation Y652X in the S6/pore region of human ether-go-go gene found in a long QT syndrome family. Scand Cardiovasc J 43: 181-186, 2009. 30. Tisdale MJ. Biomedicine. Protein loss in cancer cachexia. Science 289: 2293-2294, 2000. 31. Troosters T, Probst VS, Crul T, Pitta F, Gayan-Ramirez G, Decramer M, and Gosselink R. Resistance training prevents deterioration in quadriceps muscle function during acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 181: 1072-1077, 2010. 32. Urieli-Shoval S, Linke RP, and Matzner Y. Expression and function of serum amyloid A, a major acute-phase protein, in normal and disease states. Curr Opin Hematol 7: 64-69, 2000. 33. Voorrips LE, Ravelli AC, Dongelmans PC, Deurenberg P, and Van Staveren WA. A physical activity questionnaire for the elderly. Med Sci Sports Exerc 23: 974-979, 1991. 34. Wagner PD. Possible mechanisms underlying the development of cachexia in COPD. Eur Respir J 31: 492-501, 2008. 35. Wang W, Wang J, Li J, Mao L, Guo F, and Zhang B. New mutation of the patched homologue 1 gene in a Chinese family with naevoid basal cell carcinoma syndrome. Br J Oral Maxillofac Surg 47: 366-369, 2009. 36. Zhang L, Du J, Hu Z, Han G, Delafontaine P, Garcia G, and Mitch WE. IL-6 and serum amyloid A synergy mediates angiotensin II-induced muscle wasting. J Am Soc Nephrol 20: 604-612, 2009.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

105

4.9 Figure Legend

Table 1. Primer sequences used for qPCR analyses Target mRNA

PCR primer sequence 5’→ 3’

SAA1 Forward Reverse

CTC CTT GGT CCT GGG TGT C TTG TCT GAG CCG ATG TAA TTG G

TNF-α Forward Reverse

ACCACGCTCTTCTGCCTGCTG TCTGGTAGGAGACGGCGATGC

IL-8 Forward Reverse

ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT

IL-6 Forward Reverse

CTGGGGCTGCTCCTGGTGTTG AGGCTGGCATTTGTGGTTGGG

18s Forward TTGACGGAAGGGCACCACCAG Reverse GCACCACCACCCACGGAATCG PPIA Forward ACGTGGTATAAAAGGGGCGGGAGG Reverse ACACGGTTTTCCTCGGCGGTG RPLPO Forward

Reverse TCTACAACCCTGAAGTGCTTGATATC GCAGACAGACACTGGCAACATT

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

106

Table 2. Characteristics of study subjects in the discovery study Values are mean ± SEM BMI, body mass index; FEV1, forced expiratory volume in 1 sec; FEV1/FVC, FEV1 to forced vital capacity (FVC) ratio; DLco, diffusing capacity of carbon monoxyde; MTCSA, mid-thigh muscle cross-sectional area. * Versus Controls, p ≤ 0.05 † Versus Controls, p ≤ 0.10

CONTROLS (n = 7)

COPD (n = 16)

Age (years) 68 ± 2 64 ± 1 Weight (kg) 88.8 ± 3.8 73.5 ± 3.9* BMI (kg/m

2) 30 ± 1 26 ± 2†

Fat-free mass (kg) 60.7 ± 2.8 49.1 ± 1.4* Fat-free mass index (kg/m2) 20 ± 1 17 ± 0.4* Fat mass (kg) 24.8 ± 2.3 20.8 ± 2.5 MTCSA (cm2) 118.5 ± 3.9 84.4 ± 4.2* Pulmonary function FEV1 (L) 3.1 ± 0.2 1.1 ± 0.2* FEV1 (% predicted) 104 ± 4 35.6 ± 3.6* FEV1/FVC (%) 75 ± 2 35 ± 2* DLCO (% predicted) 95 ± 4 49 ± 4* PaCO2 (mm Hg) N/A - 43.1 ± 1.8 PaO2 (mm Hg) N/A - 72.8 ± 2.1

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

107

Table 3. Characteristics of study subjects in the validation study

Values are mean ± SEM BMI, body mass index; FEV

1, forced expiratory volume in 1 sec; FEV1/FVC, FEV1 to forced vital capacity (FVC) ratio; DLco, diffusing capacity of carbon monoxyde; MTCSA, mid-thigh muscle cross-sectional area. * Versus Controls, p ≤ 0.05

CONTROLS (n = 10)

COPD (n = 11)

Age (years) 64 ± 3 68 ± 2 Weight (kg) 75.3 ± 3.8 80.4 ± 5.7 BMI (kg/m

2) 27 ± 1 27 ± 2

Fat-free mass (kg) 54.6 ± 2.4 50.6 ± 1.8 Fat-free mass index (kg/m2) 19 ± 0.5 17 ± 1* Fat mass (kg) 18.5 ± 1.8 24.5 ± 4.1 MTCSA (cm2) 108.5 ± 6.3 84.3 ± 5.2* Pulmonary function FEV1 (L) 3.4 ± 0.2 1.3 ± 0.1* FEV1 (% predicted) 117 ± 6 45 ± 3* FEV1/FVC (%) 79 ± 1 38 ± 3* DLCO (% predicted) 99 ± 5 61 ± 6* PaCO2 (mm Hg) N/A - 39.5 ± 1.7 PaO2 (mm Hg) N/A - 73.7 ± 2.8

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

108

Table 4. Characteristics of the exacerbated patients with COPD Values are mean ± SEM BMI, body mass index; FEV1, forced expiratory volume in 1 sec; FEV1/FVC, FEV1 to forced vital capacity (FVC) ratio. * Versus all study Controls, p ≤ 0.05

COPD (n = 7)

Age (years) 66 ± 2 Weight (kg) 65.0 ± 6.0 BMI (kg/m

2) 26 ± 3

Pulmonary function FEV1 (L) 1.4 ± 0.2* FEV1 (% predicted) 44 ± 8* FEV1/FVC (%) 54 ± 3*

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

109

Table 5. mRNA expression of SAA1 by microarrays in all study subjects

Values are fold from controls All values are presented as fold

from their respective age-matched controls, except for exacerbated COPD as they are presented as fold from all controls. * p ≤ 0.05 from CTRL

q-value p-value Fold from CTRL COPD discovery group (n=16)

mRNA expression by microarrays 0 2.5 mRNA levels 0.004 65.8*

COPD validation group (n=11)

mRNA levels 0.0006 19.3* COPD exacerbated group (n=7)

mRNA levels 0.0002 36 542*

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

110

4.10 Figure Legend

FIGURE 1. Quadriceps mRNA expression (fold from CTRL) of SAA1 in clinically stable COPD for the discovery group (COPD DIS), in clinically stable COPD for the validation group (COPD VAL) and exacerbated COPD (COPD EXA). Doted line represent CTRL values set at 1. COPD DIS vs. respective CTRL, p = 0.004; COPD VAL vs. respective CTRL, p = 0.0006; COPD EXA vs. all study CTRL, p = 0.0002. FIGURE 2. Quadriceps mRNA expression (fold from CTRL) (A) IL-6 (B) IL-8 and (C) TNF-α in clinically stable COPD for the validation group (COPD VAL) and exacerbated COPD (COPD EXA). Doted line represent CTRL values set at 1. FIGURE 3. Pearson’s correlation between the quadriceps mRNA expression (fold from CTRL) and the Mid-thigh cross-sectional area (MTCSA) for all study participants. Black circles = COPD, grey circle = healthy controls. Pearson’s correlation of -0.35, p ≤ 0.05 FIGURE 4. Proteins blood levels (ng/ml) for (A) IL-6 (B) IL-8 and (C) TNF-α (D) CRP (C-reactive proteins) and (E) SAA1 in healthy controls (CTRL), clinically stable COPD for the validation group (COPD VAL) and exacerbated COPD (COPD EXA).

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

111

4.11 Figures Figure1

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

112

Figure 2.

A

B

C

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

113

Figure 3.

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CHAPITRE IV. SAA1 Expression in the Quadriceps of Patients with COPD

114

Figure 4.

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115

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116

CHAPITRE V

QUADRICEPS METABOLISM DURING CONSTANT WORKRATE CYCLING EXERCISE IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY

DISEASE

Article publié dans the Journal of Applied Physiology

Saey D*, Lemire BB*, Gagnon P, Bombardier E, Tupling AR, Debigaré R, Côté CH, and Maltais F. Quadriceps metabolism during constant workrate cycling exercise in chronic obstructive pulmonary disease. J Appl Physiol 110: 116-124, 2011

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

117

5.1 Page titre

QUADRICEPS METABOLISM DURING CONSTANT WORKRATE CYCLING EXERCISE IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Authors: Didier SAEY1, Bruno B. LEMIRE1, Philippe GAGNON1, Éric BOMBARDIER2, A. Russell TUPLING2, Richard DEBIGARÉ1, Claude H. CÔTÉ3, and François MALTAIS1

Affiliation :

1Centre de recherche, Institut Universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, Canada. 2Department of Kinesiology, University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada 3Centre de recherche du CHUQ, Pavillon CHUL, Université Laval, Québec, Canada DS and BBL contributed equally to this work. B B. Lemire is the recipient of a Ph.D. training award from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). F. Maltais holds a GSK/CIHR Research Chair on COPD at Université Laval. This work has been supported by CIHR grant MOP-84091. Running head: Quadriceps metabolism during exercise in COPD Word count: 4292 Address of correspondence: Dr François Maltais Institut Universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec 2725 Chemin Ste-Foy Québec, Québec G1V 4G5 CANADA Tel: 418-656-4747 Fax: 418-656-4762 E-mail: [email protected]

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

118

5.2 Résumé La modification du métabolisme dans les muscles périphériques des patients atteints de la

MPOC contribue potentiellement à l'intolérance à l’effort dans cette maladie. Cette étude a examiné

le métabolisme énergétique du quadriceps, de la dégradation du glycogène à l'accumulation de

lactate, pendant un exercice fait jusqu’à épuisement chez des patients atteints de la MPOC. Nous

avons mesuré, chez 12 patients atteints de la MPOC et 10 sujets sains appariés pour l’âge, 1) les

niveaux de substrats énergétiques et les produits de la glycolyse (glycogène, glucose, pyruvate,

lactate) et les marqueurs intermédiaires de la glycolyse (glucose-6-phophate, glucose-1-phophate,

fructose-6-phosphate) et 2) l'activité des enzymes impliquées dans la régulation de la glycolyse

(phosphofructokinase, lactate déshydrogénase) avant et après un exercice de charge constante sur

ergocycle à 80% du maximum fait jusqu’à épuisement. L’intensité de l'exercice (p < 0,01), la durée

(p = 0,049) et le travail total (p < 0,01) étaient significativement abaissés chez les patients atteints

de la MPOC. Les variations de substrats énergétiques et les produits finaux de la glycolyse après

l’exercice sur ergocycle étaient similaires chez les patients atteints de la MPOC et les sujets sains.

Le niveau de glucose-6-phophate (p = 0,036) et de fructose-6-phosphate (p = 0,042) étaient

significativement plus élevés chez les patients atteints de la MPOC après l'exercice. Les enzymes de

la glycolyse, le phosphofructokinase (p < 0,01) et le lactate déshydrogénase (p = 0,02), étaient aussi

plus élevés chez les patients atteints de la MPOC. L'utilisation du glycogène musculaire (p = 0,022)

et l'accumulation du lactate musculaire (p = 0,025) par unité de travail étaient plus élevés chez les

patients MPOC. En conclusion, l'exercice fait jusqu’à épuisement induit des changements

métaboliques d’ampleur similaire dans le quadriceps des patients atteints de MPOC et des sujets

sains appariés pour l’âge. Par contre, ces évènements intramusculaires surviennent à une charge de

travail beaucoup plus faible et plus rapidement chez les patients atteints de la MPOC. Nos données

suggèrent une plus grande dépendance à la glycolyse au cours de l'exercice chez la MPOC, ce qui

pourrait contribuer à l'intolérance à l’effort dans cette maladie.

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

119

5.2 Abstract Impaired resting metabolism in peripheral muscles potentially contributes to exercise intolerance in

COPD. This study investigated the cytosolic energy metabolism of the quadriceps, from glycogen

degradation to lactate accumulation, in exercising patients with COPD, in comparison to healthy

controls. We measured, in 12 patients with COPD and 10 control subjects, resting and post-cycling

exercise quadriceps levels of 1) energy substrates and end-products of glycolysis (glycogen,

glucose, pyruvate, lactate) and intermediate markers of glycolysis (glucose-6-phophate, glucose-1-

phophate, fructose-6-phosphate) and 2) the activity of key enzymes involved in the regulation of

glycolysis (phosphofructokinase, lactate dehydrogenase). Exercise intensity (p < 0.01), duration (p

= 0.049) and total work (p < 0.01) were reduced in patients with COPD. The variations in energy

substrates and end-products of glycolysis after cycling exercise were of similar magnitude in

patients with COPD and controls. Glucose-6-phophate (p = 0.036) and fructose-6-phosphate (p =

0.042) were significantly elevated in patients with COPD after exercise. Phosphofructokinase (p <

0.01) and lactate dehydrogenase (p = 0.02) activities were greater in COPD. Muscle glycogen

utilization (p = 0.022) and lactate accumulation (p = 0.025) per unit of work were greater in COPD.

We conclude that cycling exercise induced changes in quadriceps metabolism in patients with

COPD that were of similar magnitude to those of healthy controls. These intramuscular events

required a much lower exercise workload and time to occur in COPD. Our data suggests a greater

reliance on glycolysis during exercise in COPD which may contribute to exercise intolerance in

COPD.

Word count: 247

Keywords: COPD, exercise, cycle ergometer, muscle metabolism, muscle biopsy

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

120

5.3 Introduction

Exercise limitation is a hallmark feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).

The contribution of peripheral muscle dysfunction to exercise intolerance in COPD is still debated

(11). While appreciating the complex nature of exercise intolerance in COPD (34), our group has

reported that peripheral muscle fatigue reduces exercise capacity in this disease (13, 39). We

showed that the occurrence of quadriceps fatigue prevents bronchodilation to translate into

improved exercise capacity (39) and that the pre-induction of quadriceps fatigue reduces the

endurance during constant workrate exercise (13). Susceptibility to muscle fatigue in COPD is

assumed to be related to the reduction in the proportion of fatigue-resistant slow-twitch muscle

fibers and in oxidative enzyme activity (16, 48). These phenotypic and enzymatic muscle changes

modify muscle energy metabolism during exercise resulting in premature muscle acidosis, lactate

accumulation and fatigue (9, 29, 49).

Under resting conditions, the peripheral muscle metabolic profile of patients with COPD

shows low concentration of high-energy phosphates such as ATP and creatine phosphate as well as

lower aerobic enzyme activity such as citrate synthase (CS) compared with aged-matched healthy

controls (12, 19, 23). In addition, intermediate markers of glycolysis, namely glucose-6-phosphate,

glucose-1-phosphate, and fructose-6-phosphate as well as phosphofructokinase (PFK) and lactate

dehydrogenase (LDH) activities were shown to be elevated in resting COPD muscle (19, 23).

Together, these findings suggest an impaired muscle oxidative capacity with a reduction in

phosphorylation potential and a greater reliance on glycolysis at rest that may well contribute to the

exercise intolerance in COPD.

In healthy humans, a greater reliance on glycolysis during exercise is associated with

premature lactate accumulation (47), muscle acidosis (41) ultimately translating into early exercise

cessation. In this regard, little is known about muscle metabolism in response to exercise in patients

with COPD. Studies using nuclear magnetic resonance spectroscopy on the forearm and calf

muscles reported greater decline in muscle intracellular pH and in the creatine phosphate/inorganic

phosphate ratio, suggesting an impaired aerobic capacity during exercise in patients with COPD

(26, 45, 49). Steiner et al. observed that adenine nucleotides, as well as lactate and creatine

phosphate were modulated in a similar fashion in patients with COPD compared to aged-matched

healthy controls during constant workrate cycling exercise of similar duration but of lower intensity

(44). Although this study provided good insight into the local muscle metabolic stress experienced

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

121

by patients with COPD during cycling exercise, the metabolic abnormalities that might contribute to

exercise limitation in COPD were not explored. In fact, no data is yet available on the extent of the

metabolic perturbations occurring in the quadriceps of patients with COPD during exercise done

until exhaustion.

The aim of the present study was to investigate, in a comprehensive fashion, the behavior

of the quadriceps cytosolic energy metabolism, from glycogen degradation to lactate accumulation,

in exercising patients with COPD, in comparison to healthy controls of similar age. To reach this

objective, we measured in the quadriceps 1) several energy substrates and end-products of

glycolysis (glycogen, glucose, pyruvate, lactate) and intermediate markers of glycolysis (glucose-6-

phosphate, glucose-1-phosphate, and fructose-6-phosphate) and 2) the activity of key enzymes

involved in the regulation of glycolysis (LDH, PFK, HK) and of the citric acid cycle (CS, 3-

hydroxyacyl CoA dehydrogenase [HADH]) at rest and immediately following cycling exercise in

patients with COPD and healthy controls. Because impaired energy metabolism could compromise

ATP resynthesis, we also evaluated the changes in intramuscular high energy phosphate compounds

(ATP, creatine phosphate, creatine, inorganic phosphate) during exercise. To provide a clinically

meaningful interpretation of these intramuscular processes, we also obtained detailed physiological

responses during exercise in these individuals.

We reasoned that if muscle metabolic abnormalities were important contributors to exercise

tolerance in COPD, the exercise-induced production of glycolytic end-products such as lactate and

pyruvate and intermediate markers of glycolysis such as glucose-6-phosphate, glucose-1-phosphate

and fructose-6-phosphate as well as glycogen utilization should be equal or greater in patients with

COPD despite lower exercise intensity, duration and total work in comparison with healthy

controls. Conversely, if exercise was primarily limited by ventilation and dyspnea, the degree of

metabolic stress occurring during exercise should be less in patients with COPD.

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

122

5.4 Methods

Subjects

Twelve patients with moderate to severe COPD and ten healthy aged-matched controls participated

in this study. The diagnosis of COPD was based on spirometry showing moderate to severe

irreversible airflow obstruction (post-bronchodilator forced expiratory volume in 1 second (FEV1) <

80% predicted value, and FEV1/ forced vital capacity < 70%) (36) and current or past smoking

history of at least 20 pack years. In both groups, subjects were excluded if they presented any

medical condition, other than COPD, likely to influence muscle and exercise testing (i.e.

cardiovascular, neurological, musculoskeletal, locomotor or other respiratory diseases). Only males

were included in the present study in order to minimize measurement variability. The research

protocol was approved by the institutional ethics committee and a signed informed consent was

obtained from each subject.

Study design

After reviewing medical history and familiarization with the study procedures, subjects filled out a

physical activity questionnaire (46). Anthropometric measurements, pulmonary function testing,

mid-thigh cross-sectional area by computed tomography and a symptom-limited incremental cycle

exercise test were performed. Within 1 week, subjects returned to the laboratory for a constant

workrate cycle exercise bout performed at 80% of their peak work rate until they reached the point

of exhaustion. Vastus lateralis biopsies were obtained before and exactly 1 minute after constant

workrate cycle exercise. After the post-exercise biopsy, patients sat down to recuperate. Quadriceps

force was then measured 15 minutes post exercise to quantify the degree of muscle fatigue

occurring with exercise.

Pulmonary function testing

Standard pulmonary function tests including spirometry, lung volumes, and carbon monoxide

diffusion capacity were obtained in all subjects during the initial evaluation according to previously

described guidelines (4). Results were related to previously publish normal values (15, 25). Maximum

voluntary ventilation (MVV) was estimated by multiplying FEV1 by 35 (14).

Physical activity score

The level of physical activity in daily living was assessed with the activity questionnaire described

by Baecke et al. (5) adapted for elderly individuals (46) and used in patients with COPD (43) called

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

123

Vorrips score. The questionnaire attributes a score for household, sport, and other leisure-time

physical activities, together resulting in a global physical activity score (Table 1). A score of 9-16

indicates a moderate level of daily physical activity, whereas a score < 9 depicts low levels of daily

physical activity and is associated with a sedentary lifestyle.

Incremental exercise testing

Patients were seated on an electrically braked ergocycle (Quinton Corival 400; A.H. Robins,

Seattle, WA) and connected to the respiratory circuit through a mouthpiece. During exercise, a 12-

lead electrocardiogram was recorded continuously and arterial pressure was monitored using an

automatic arm blood pressure monitor (Quinton Automated BP model 410; A.H. Robins, Seattle,

WA). Heart rate was computed from standard ECG leads (42). The respiratory circuit consisted of a

pneumotachograph, O2 and CO2 analyzers, and mixing chamber (Sensor Medics, Vmax Legacy,

Yorba Linda, CA). After 5 minutes of rest, a progressive stepwise exercise test was performed up to

the individual maximal capacity. Each exercise step lasted 1 minute and increments of 10 watts

were used. Minute ventilation ( EV ), oxygen uptake ( 2OV ), and carbon dioxide production

( 2COV ) were measured at rest and during exercise, on a breath-by-breath basis.

Constant workrate cycle exercise

After 5 minutes of rest and 1 minute of warm-up with unloaded pedaling, a constant workrate cycle

exercise bout was performed until exhaustion at an intensity corresponding to 80% of the peak

workrate achieved during the incremental exercise test. Patients were asked to pedal at 60 RPM and

standardized encouragement was provided during exercise. Similarly to the incremental test,

subjects were connected to the respiratory circuit through a mouthpiece and wore a nose clip during

the test. EV , 2OV and 2COV were measured at rest and during exercise on a breath-by-breath

basis. Heart rate was monitored by an electrocardiograph (Cardiosoft program-Corina, USA) and

blood pressure by an automated blood pressure monitor (Quinton 410, Quinton, Botmhell, WA).

Oxygen pulse saturation (SpO2) was measured by a pulse oximeter (OSM2 Hexoximeter;

Radiometer, Copenhagen, Denmark). The perception of dyspnea and leg fatigue were assessed at

end-exercise using the modified 10-point Borg scale (8).

Quadriceps strength measurements

Muscle strength was measured during maximal voluntary contraction of the quadriceps and

potentiated quadriceps twitch force as previously reported by our group (13). Subjects were seated

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

124

in a recumbent chair (N-K 330 Exercise Table, N-K Products, Elsinore, CA) with 90° knee flexion

and right ankle attached to a strain gauge (Hewlett-Packard). The strain gauge was systematically

adjusted perpendicularly to the leg. The strain gauge signal was amplified (Model 8811A

amplifiers; Hewlett-Packward), transformed by an analog transducer (Biopac), and linked to a

computer for data analysis. Maximal voluntary contraction was recorded during a 3-second

isometric maximal contraction. Maximal voluntary contraction maneuvers were separated by 60

seconds and reported values correspond to the mean of the three strongest contractions. Verbal

encouragement was provided during each maneuver. Potentiated quadriceps twitch force was

systematically measured three seconds after the end of the maximal voluntary contraction

maneuver. The femoral nerve was stimulated through a 70 mm figure-of-eight coil powered by a

double Magstim stimulator (Magstim Co Ltd., Whitland, Dyed,Wales, UK). For analysis, the mean

of the two highest values was calculated. In order to ensure that the magnetic stimulation was

supramaximal, a quadriceps twitch force/power output relationship was obtained as previously

published ensuring that a plateau in quadriceps twitch force was obtained in each subject (39).

Measurement of mid-thigh muscle area

A computed tomography (2) of the right thigh halfway between the pubic symphysis and the

inferior condyle of the femur was performed using a fourth-generation Toshiba Scanner 900S

(Toshiba) as routinely done in our laboratory (38). Each image was 5-mm thick and was taken at

120 kV and 200 mA with a scanning time of 1 s while the subject was lying in the supine position.

The mid-thigh muscle cross-sectional area (MTCSA) was obtained by measuring the surface area of

the tissue with a density of 40 to 100 Hounsfield units (HU). This range of density was chosen

because it corresponds to the density of muscle tissue (24). Computed tomography was used to

estimate muscle mass because it is more specific than anthropometric measurements. For instance,

the age-related fat infiltration of the muscles, which cannot be detected with anthropometric

measurements, can be identified by computed tomography because of the fat specific density.

Muscle biopsy

Needle biopsies of the vastus lateralis were performed as described by Bergström (6) and routinely

done in our laboratory (30). The post-exercise biopsy was performed through the same incision as

the pre-exercise biopsy allowing a fast access to the muscle. Immediately following exercise, the

leg of the subject was quickly stabilized on a footstool and the post-exercise biopsy was then taken

while the patient was still seating on the cycle ergometer. This method allowed the post-exercise

biopsy to be obtained at one-minute post-exercise in each subject. Muscle specimens were frozen in

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

125

liquid nitrogen exactly one minute after the end of exercise and stored at - 80°C for future analysis.

Quadriceps fiber typing and enzymatic activities associated with oxidative capacity and glycolysis

were analyzed from pre-exercise biopsies only.

Fiber Typing and surface areas: Muscle sections were stained to detect myofibrillar adenosine

triphosphatase activity according to the single step ethanol modified technique (28). The medium

contained 20 mM Na barbital, 10 mM CaCl2, 5 mM MgCI2, 5 mM NaN3, 1.0 mM ATP at 21°C,

17%-18% ethanol and pH 9.4. At 37°C, ethanol concentrations were reduced to 7.5%-8.5%. The

incubation time was 40 to 60 min at room temperature. The proportion of types I (non-stained), IIa

(lightly stained), and IIx (darkly stained) fibers was assessed and calculated as the number of fibers

of each type divided by the total number of muscle fibers. The mean cross-sectional area for each

subject was measured by averaging the cross-sectional areas of 120 randomly selected fibres (7).

Enzymatic Activity: Quadriceps muscle activity of LDH, PFK, hexokinase (HK), CS and HADH

were assessed using spectrophotometric techniques as previously described (30, 50). The reaction

media used to measure enzymatic activities were tris-HCl 15 mM (pH 8.0) containing DTNB 0.016

mM, acetyl-CoA 0.1 M, and sodium oxaloacetate 0.038 mM for citrate synthase and

triethanolamine 100 mM (pH 7.0) containing EDTA 5 mM, NADH 0.17 mM, KCN 1 mM, and

acetyl-CoA 0.1 mM for 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase. Each assay was done in duplicate and

the average of the two values is reported. The coefficient of variation between duplicate

measurements of enzymatic activities varied from 1.6% to 13.1%.

Metabolite and substrate measurements From pre and post-exercise biopsies, following subsequent

freeze drying, powdering and extraction (20, 21), samples were analyzed for glycogen, glucose,

pyruvate and lactate as well as intermediate markers of glycolysis such as glucose-6-phosphate,

glucose-1-phosphate and fructose-6-phosphate. We also analyzed tissue samples for adenosine

triphosphate, creatine phosphate, creatine and inorganic phosphate. For the HPLC ATP assay,

approximately 5 mg of freezedried tissue were extracted in perchloric acid (PCA, 0.5M) and

neutralized by the addition of 2.3 M K2HPO4. The neutralized sample was centrifuged, and an

aliquot was used for HPLC analysis. A Waters Alliance system was used consisting of a Waters

2690 Separations Module for solvent delivery and auto sampling and a Waters 996 Photo Diode

Array Detector. The detector wavelength for monitoring the eluate was 254 nm. All measurements

were conducted at room temperature by means of a reverse-phase column (Supelcosil LC-18-T 2

cm x 4.6 mm). The solvent system consisted of two buffers: Buffer A (150 mM potassium

dihydrogen orthophosphate, 150 mM potassium chloride, pH 6.0, was filtered through a .45 m

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

126

filter) and Buffer B (80% Buffer A, 15% methanol, 5% Acetonitrile). During the total 20min run

time, a gradient was applied at a constant flow of 1ml/min starting with 100% Buffer A and

increasing Buffer B to a max of 40% over the first 6 min and returning to 0% by 12 min. All

standards were obtained from Sigma Chemical and dissolved in ultra pure water. Nucleotide

concentrations were detected from the peak height of the chromatogram. All nucleotide values were

expressed in millimoles per kilogram of dry weight. All other measurements were accomplished

using fluorometric procedures (27) as described in detail previously (22). The coefficient of

variation between duplicate measurements for the energy substrates and end-products of glycolysis

(glycogen, glucose, pyruvate and lactate) and intermediate markers of glycolysis (glucose-6-

phosphate, glucose-1-phosphate and fructose-6-phosphate) varied from 2 % to 12%. The coefficient

of variation between duplicate measurements for the high-energy phosphate compounds (adenosine

triphosphate, creatine phosphate, creatine and inorganic phosphate) varied from 1% to 3%.

Statistical analysis

Data are expressed as the mean ± standard error of the mean and were analyzed using a

statistical package program SAS version 9.01. A p value of < 0.05 was considered statistically

significant, while a p value between 0.05 and 0.10 was considered to show a statistical trend.

Glycogen, glucose, pyruvate, lactate, glucose-6-phophate, glucose-1-phosphate and fructose-6-

phosphate values were log transformed to obtain normal distribution for analysis. Student’s

unpaired t-test was performed to compare patient characteristics as well as resting intramuscular

data. The effect of exercise on energy substrates, intermediate markers of glycolysis and high-

energy phosphate compounds were compared using a mixed-model analysis of variance on the

percentage changes with adjustment for baseline levels. To allow comparison of the glycolytic

substrates variation in response to exercise between groups cycling for different duration and at

different absolute intensities, the changes in glycogen, glucose and lactate were corrected for the

total cycle work that was performed during constant workrate cycle exercise (44). Pearson

correlation coefficients were used to evaluate relationships between MTCSA and the mean fiber

cross-sectional area.

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

127

5.5 Results

Subjects’ characteristics Anthropometric characteristics and pulmonary function are provided in table 1. Patients

with COPD had moderate-to-severe airflow obstruction. Both groups were well matched for body

mass index and levels of physical activity in daily living as assessed by the Voorrips scores.

Exercise capacity

End-exercise values for the incremental and constant workrate cycling exercises are

presented in table 2. Exercise intensity, duration and total cycle work were significantly lower in

COPD. The perception of dyspnea and leg fatigue at the end of incremental and constant workrate

exercises were similar between both groups. The physiological measurements during constant

workrate exercise are depicted in figure 1. As a result of a greater mean exercise

intensity, , , respiratory exchange ratio and lactate were greater (p < 0.05) in controls from

the 25% duration of exercise until the end of exercise. When expressed as a % of maximum

voluntary ventilation, was larger in patients with COPD who also exhibit a lower inspiratory

capacity throughout exercise than controls. In addition, despite a greater fall in SpO2 induced by

exercise in COPD compared to healthy subjects (-3 ± 3 % vs -1 ± 3 % p < 0.05), no difference was

observed between the two groups for the decrease in PaO2 (-7.41 ± 11.78 vs -5.29 ± 23.32 mmHg).

Quadriceps fatigue

The fall in muscle voluntary contraction and potentiated quadriceps twitch force during

exercise, expressed as % of baseline values, were significant and of similar magnitude between both

groups (Figure 2).

Muscle characteristics and metabolism

Muscle characteristics and resting energy substrates data are provided in table 3. Patients

with COPD displayed a smaller midthigh muscle cross sectional area and proportion of type I

fibers. The mean fiber cross-sectional areas averaged 4489 ± 239 µm2 in patients with COPD and

5281 ± 344 µm2 in healthy controls. Although this difference did not reach statistical significance (p

= 0.13), the 15% reduction in mean fiber size in COPD is consistent with the 20% reduction in

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

128

MTCSA. Also, the mean fiber size significantly correlated with MTCSA (r = 0.73, p < 0.01). PFK

and LDH enzyme activities were greater in COPD, while oxidative enzyme activities were similar

between COPD and controls. Resting levels of glycogen and lactate were significantly greater in

COPD, while glucose and creatine phosphate showed a trend to be greater in COPD.

Quadriceps metabolism at the end of constant workrate cycle exercise

The influence of exercise on energy substrates and end-products of glycolysis in the

quadriceps expressed in percent difference from baseline values were of similar magnitude between

both groups (figure 3A). However, the exercise-induced increase in glucose-6-phophate and

fructose-6-phosphate, two intermediate markers of glycolysis, was significantly greater in COPD

(figure 3B). Exercise-induced changes in high-energy phosphate compounds were also of similar

magnitude between both groups (figure 3 C). These conclusions remained essentially unchanged

when the absolute changes in the different variables were used in the analyses instead of the relative

changes except for the absolute differences in glucose-6-phophate and fructose-6-phosphate

between COPD and healthy controls that were of borderline statistical significance (p = 0.09 and p

= 0.12, for G-6-P and F-6-P, respectively). In order to account for the difference in total cycle work

between COPD patients and controls, the exercise-induced changes in glycogen, glucose and lactate

were adjusted by dividing them by total cycle work performed (figure 3D). A greater utilization in

muscle glycogen and greater accumulation of lactate were found in COPD compared to controls

while glucose did not differ statistically between groups (p = 0.224).

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

129

5.6 Discussion

The main findings of this study are that the extent of changes in quadriceps metabolism and

falls in quadriceps force generating capacity after a constant workrate cycle exercise done until

exhaustion were similar in patients with COPD and age-matched controls despite a much lower

total work performed by the former group. These intramuscular events were reached an average of

2.27 minutes faster and for 468 Watts*min lesser total work in COPD compared to controls. Taking

into account the amount of work performed, our data shows an increased utilization of glycogen and

accumulation of lactate in COPD patients. Moreover, key intermediate markers of glycolysis in the

quadriceps of patients with COPD show significant increases after exercise. These results support

the greater reliance on glycolysis during exercise in patients with COPD. The fact that patients with

COPD reached similar metabolic perturbations and exhibited similar levels of quadriceps fatigue

compared to controls suggests that the metabolic events taking place within the contracting muscles

are tightly regulated during exercise.

The present study permitted investigation of whether cycle exercise done until exhaustion

would be sufficient to stress the contractile limb muscles of patients with COPD. In the presence of

classical evidence of ventilatory limitation such as high dyspnea scores, a /MVV > 1 and

dynamic hyperinflation, it is remarkable that patients with COPD experienced similar decreases in

quadriceps force post-exercise concurrently with similar intramuscular accumulation of inorganic

phosphate and lactate compared with healthy controls. These observations are consistent with the

notion that the degree of peripheral muscle fatigue and metabolic perturbations occurring during

exercise are tightly regulated (1) and may contribute to exercise limitation in health and chronic

diseases such as COPD (13). According to this theory, feedback signals originating in the fatigued

muscles inhibit motor cortical output, thus preventing subsequent locomotor recruitment and the

development of dangerous and potentially irreversible fatigue (1). We previously reported that

patients with COPD developing contractile fatigue of the quadriceps during cycling exercise

stopped exercising at the same level of quadriceps fatigue (within 5%), regardless of whether they

received a placebo or a bronchodilator before exercise (39). Although this was not tested, our

findings are consistent with the concept that the central nervous system integrates information

originating from the peripheral muscles to determine the duration of exercise and the degree of

muscle fatigue (2, 33).

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

130

One objective of the present study was to investigate the quadriceps glycolytic metabolism

response to a constant workrate cycle exercise done until exhaustion in patients with COPD. When

reported per total cycle work, glycogen utilization and lactate accumulation were greater in COPD

compared to controls. These results support the fact that a greater amount of glycogen had to be

used for a lesser intense and shorter duration exercise in COPD compared to controls although the

source of this greater muscle glycogen utilization could not be ascribed specifically to the glycolytic

or aerobic (citric acid cycle) metabolism. On the other hand, muscle lactate accumulation is specific

to cytosolic glycolysis. The greater accumulation of lactate per workload in COPD therefore reflects

either or both; 1) a decreased utilization of lactate/pyruvate as a substrate by the aerobic

metabolism; 2) a greater utilization of cytosolic glycolysis during exercise. There were also larger

increases in glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate during exercise along with increased

phosphofructokinase activity in patients with COPD. Taking into account the mitochondrial

abnormalities reported in COPD (37), our overall interpretation is that there is a greater reliance on

glycolysis during exercise in COPD, acting as a compensatory mechanism to sustain energy

demands.

In contrast with our initial hypothesis, glucose accumulation per workload was not

increased in patients with COPD (fig. 3D). Two non mutually exclusive avenues could explain this

observation: 1) the reported lower concentration of muscle GLUT4 transporters in COPD (19)

could lessen the amount of blood glucose entering the exercising muscle and thus explain the

similar accumulation of muscle glucose per workload between COPD patients and controls; 2) the

utilization of muscle glucose could possibly be greater in COPD given the higher glycolytic activity

in patients with COPD.

In contrast to previous studies (12, 19, 23, 35) there were no major differences in resting

metabolites between patients with COPD and controls. The non significant difference in resting

ATP between the two groups is in accordance with Wuyam et al. (49). In contrast to previous

studies showing that resting phosphagen energy content was slightly decreased in COPD (12, 19,

23), we, and previous investigators (44), found no differences in high energy phosphate between

COPD and controls, suggesting that the greater resting muscle glycogen, glucose and some

intermediate markers of glycolysis in COPD could serve to preserve resting ATP levels in patients

with COPD.

The investigation of the mechanisms responsible for the current muscle metabolic findings

was beyond the scope of this study. Although physical inactivity is often quoted as an important

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

131

mechanism for the peripheral muscle abnormalities in COPD, the level of daily life activities as

assessed by a physical activity questionnaire was similar between patients and healthy controls. The

greater reliance on glycolysis in COPD could, in part, be explained by the increase type IIa fibre

proportion in these individuals. These fibres are characterized by a greater potential for high-energy

phosphate and glycolysis than type I muscle fibers (18). Moreover, this glycolytic reliance could

possibly involve the lactate and glucose transporters whose activity can be altered in COPD (19).

Since these transporters are crucial for lactate removal and glucose entry in skeletal muscle, they

could influence the relative contribution of the glycolytic pathway to the total energy expenditure

during exercise. Targeting these transporters may be of great interest in future rehabilitation studies.

Apart from these intrinsic muscle changes, we cannot exclude that impairment in muscle

perfusion and oxygenation could have influenced muscle metabolism during exercise in COPD

(31). In one study, a 25% increase in quadriceps work capacity was observed while breathing 100%

oxygen in comparison to room air breathing during localized knee extensor exercise in patients with

COPD and modest exercise-induced oxygen desaturation (38). More recently, the effects of

respiratory muscle unloading and of supplemental oxygen on the degree of quadriceps fatigue

during cycling exercise were evaluated in patients with COPD whose end-exercise SaO2 averaged

87% (3). By reducing the work of breathing and improving oxygenation with respiratory muscle

unloading or supplemental oxygen during exercise, a 30% reduction in the amount of quadriceps

fatigue occurring during exercise was reported in comparison to the same exercise without

respiratory assistance. Although limb blood flow was not measured in this study, this attenuation of

muscle fatigue with ventilatory support and improved oxygenation could be due to a redistribution

of blood flow and oxygen from the respiratory muscles to the limb muscles. The authors concluded

that quadriceps fatigue in exercising patients with COPD is in part related to insufficient O2

transport to the limb muscles but that the bulk of fatigue is related to intrinsic muscles changes. Our

data does not allow making inference about the proportion of the metabolic changes occurring

during exercise within the COPD quadriceps that could be ascribed to possible impairments in

muscle perfusion and oxygenation. Additional experiments involving manipulations in oxygen

delivery to muscles would be required to address this issue.

Methodological considerations

Constant workrate cycle exercise was performed at 80% of peak incremental workload in

order to reach exhaustion within 8-10 minutes in most subjects. The end-exercise results showed

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

132

similar Borg scale rating for leg fatigue and dyspnea in both groups. Moreover, similar heart rate,

2OV and EV values at the end of the constant workrate cycle exercise and incremental exercise

indicate that the effort was maximal/near maximal in both groups.

The reductions in MTCSA and in the proportion of type I fibers found in patients with

COPD were consistent with the results of larger studies (17, 32) suggesting that this small patient

population was representative of the expected degree of muscle atrophy and morphometric changes

for a moderate to severe COPD population. The observation of a similar CS and HADH activity

between COPD and healthy controls was somewhat unexpected given the bulk of data showing that

the quadriceps oxidative capacity is reduced in patients with COPD (23, 30). Since these enzyme

activities are markedly influenced by the level of physical activity, one possible explanation for this

finding is the fact that both groups were well matched for daily physical activity levels.

Potential clinical implications

Greater reliance on glycolytic metabolism during submaximal exercise leads to

accumulation of lactate (47) and decrease in plasma pH levels (41), which ultimately translates into

early cessation of exercise (40). Although the relative exercise intensity at which this study was

performed was relatively high, patients with COPD frequently engage in daily life activities as

stairs climbing or fast walking, whose absolute intensities are similar to those used in this study

(~85 watts). Thus, the observation that the quadriceps undergoes important metabolic perturbations

reported in COPD may be clinically relevant because they may occur in daily life, potentially

contributing to exercise limitation in this disease.

Our data also supports the relevance for the implementation of therapeutic strategies such as

aerobic-based activities, to reduce early variations in muscle metabolites and reliance on glycolysis

while improving the muscle oxidative capacities (i.e. β-oxidation and oxidative phosphorylation)

during submaximal exercise, ultimately resulting in improvements in functional capacities of COPD

patients.

5.7 Conclusion

We conclude that constant work cycle exercise performed until exhaustion induced

significant changes in quadriceps metabolites and energy substrates in patients with COPD. These

intramuscular events were of similar magnitude to those occurring in age and activity level matched

healthy controls but they required a much lower exercise workload and time to take place in patients

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

133

with COPD. Taking into account the greater glycogen utilization and lactate accumulation per unit

of work, the increases of intermediate markers of glycolysis and the increased glycolytic enzyme

activity, our data suggest a greater reliance on glycolysis during exercise in COPD which may

contribute to exercise intolerance and impair the activity of daily living in COPD.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors acknowledge the help of Marthe Bélanger, Marie-Josée Breton, Brigitte

Jean and Josée Picard in accomplishing this study and are grateful to Eric Nadreau (M.Sc.)

for his technical support during the exercise testing. The authors also thank Serge Simard

for statistical assistance and Dre Annie Dubé for her helpful suggestions on the manuscript.

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

134

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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17. Gosker HR, Zeegers MP, Wouters EF, Schols AM. Muscle fibre type shifting in the vastus lateralis of patients with COPD is associated with disease severity: a systematic review and meta-analysis. Thorax 62: 944-949, 2007. 18. Green HJ. Mechanisms of muscle fatigue in intense exercise. J Sports Sci 15: 247-256, 1997. 19. Green HJ, Burnett ME, D'Arsigny CL, O'Donnell DE, Ouyang J, Webb KA. Altered metabolic and transporter characteristics of vastus lateralis in chronic obstructive pulmonary disease. J Appl Physiol 105: 879-886, 2008. 20. Green HJ, Sutton J, Young P, Cymerman A, Houston CS. Operation Everest II: muscle energetics during maximal exhaustive exercise. J Appl Physiol 66: 142-150, 1989. 21. Harris RC, Hultman E, Nordesjo LO. Glycogen, glycolytic intermediates and high-energy phosphates determined in biopsy samples of musculus quadriceps femoris of man at rest. Methods and variance of values. Scand J Clin Lab Invest 33: 109-120, 1974. 22. Hintz CS, Chi MM, Fell RD, Ivy JL, Kaiser KK, Lowry CV, Lowry OH. Metabolite changes in individual rat muscle fibers during stimulation. Am J Physiol 242: C218-228, 1982. 23. Jakobsson P, Jorfeldt L, Henriksson J. Metabolic enzyme activity in the quadriceps femoris muscle in patients with severe chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 151: 374-377, 1995. 24. Kelley DE, Slasky BS, Janosky J. Skeletal muscle density: effects of obesity and non-insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Clin Nutr 54: 509-515, 1991. 25. Knudson RJ, Slatin RC, Lebowitz MD, Burrows B. The maximal expiratory flow-volume curve. Normal standards, variability, and effects of age. Am Rev Respir Dis 113: 587-600, 1976. 26. Kutsuzawa T, Shioya S, Kurita D, Haida M, Ohta Y, Yamabayashi H. 31P-NMR study of skeletal muscle metabolism in patients with chronic respiratory impairment. Am Rev Respir Dis 146: 1019-1024, 1992. 27. Lowry O, Passonneau J. A flexible system of enzymatic analysis. New York: Academic Press 1972. 28. Mabuchi K, Sreter FA. Actomyosin ATPase. II. Fiber typing by histochemical ATPase reaction. Muscle Nerve 3: 233-239, 1980. 29. Maltais F, LeBlanc P, Simard C, Jobin J, Bérubé C, Bruneau J, Carrier L, Belleau R. Skeletal muscle adaptation to endurance training in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 154: 442-447, 1996. 30. Maltais F, LeBlanc P, Whittom F, Simard C, Marquis K, Bélanger M, Breton MJ, Jobin J. Oxidative enzyme activities of the vastus lateralis muscle and the functional status in patients with COPD. Thorax 55: 848-853, 2000. 31. Maltais F, Simon M, Jobin J, Desmeules M, Sullivan MJ, Bélanger M, Leblanc P. Effects of oxygen on lower limb blood flow and O2 uptake during exercise in COPD. Med Sci Sports Exerc 33: 916-922, 2001. 32. Marquis K, Debigaré R, Lacasse Y, LeBlanc P, Jobin J, Carrier G, Maltais F. Midthigh muscle cross-sectional area is a better predictor of mortality than body mass index in

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

136

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

138

5.9 Tables Table 1. Participant characteristics

COPD (n=12) Controls (n=10) Age (yrs) 65 ± 2 69 ± 2

Weight (kg) 74 ± 4 77 ± 4

Height (cm) 168 ± 1 170 ± 2

Body mass index (kg/m2) 26 ± 2 27 ± 1

Smoking history (pack years) 45 ± 1* 18 ± 7

Voorrips score 8.7 ± 1.2 9.0 ± 1.4

FEV1 (L) 1.3 ± 0.1* 2.9 ± 0.5

FEV1 (% predicted) 45 ± 3* 103 ± 4

FVC (L) 2.9 ± 0.2* 3.9 ± 0.2

FVC (% predicted) 79 ± 5* 107 ± 5

FEV1/FVC (%) 46 ± 3* 74 ± 2

TLC (% predicted) 105 ± 4 99 ± 6

RV (% predicted) 127 ± 15* 93 ± 8

DLCO (% predicted) 65.5 ± 4.1* 85.7 ± 6.6

Values are mean ± SE FEV1, forced expiratory volume in 1sec; FVC, forced vital capacity; RV, residual volume; TLC, total lung capacity; FRC, functional residual volume; DLco, diffusing capacity for carbon monoxyde * p < 0.05, versus controls

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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Table 2. End-exercise values for the incremental and constant work cycle exercises

Values are mean ± SEM SpO2, oxygen pulse saturation; PaO2, partial pressure of oxygen in arterial blood * p < 0.05 versus controls

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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Table 3. Mid-thigh cross sectional area, enzymatic activity, fiber type distribution, energy substrates, end-products of glycolysis and high-energy phosphate compounds. COPD (n=12) Controls (n=10)

MTCSA (cm2) 79 ± 3* 99 ± 7 Glycolytic activity LDH (µmol/min/g muscle) 74.4 ± 2.5* 43.7 ± 4.2 PFK (µmol/min/g muscle) 48.9 ± 1.1* 23.1 ± 1.0 HK (µmol/min/g muscle) 0.7 ± 0.1* 0.9 ± 0.1 Oxidative activity CS (µmol/min/g muscle) 12.6 ± 0.3 13.3 ± 0.6 HADH (µmol/min/g muscle) 4.8 ± 0.2 4.7 ± 0.3 Fiber type distribution Type I fibers (% total fibers) 39 ± 2* 56 ± 5 Type IIa fibers (% total fibers) 38 ± 3* 25 ± 5 Type IIx fibers (% total fibers) 23 ± 3 19 ± 4 Energy substrates, end-products of glycolysis and high-energy phosphate compounds

Gly (mmol/ kg of dry weight) 254.6 ± 20.8* 178.7 ± 11.7 Glu (mmol/ kg of dry weight) 3.1 ± 0.4‡ 1.9 ± 1.3 PY (mmol/ kg of dry weight) 0.2 ± 0.02 0.3 ± 0.03 La (mmol/ kg of dry weight) 10.2 ± 1.3* 6.2 ± 5.6 ATP (mmol/ kg of dry weight) 19.9 ± 0.6 18.9 ± 1.2 CP (mmol/ kg of dry weight) 75.8 ± 5.9† 60.3 ± 7.7 CR (mmol/ kg of dry weight) 49.7 ± 3.5 54.7 ± 5.8 Pi (mmol/ kg of dry weight) 32.1 ± 1.6 33.7 ± 4.7

Values are mean ± SE MTCSA; midthigh muscle cross-sectional area; LDH, lactate dehydrogenase; PFK, phosphofructokinase; HK, hexokinase; CS, citrate synthase; HADH, hydroxyacyl-C enzyme-A dehydrogenase; Gly, glycogen; Glu, glucose; PY, pyruvate; La, lactate; A adenosine triphosphate; CP, creatine phosphate; CR, creatine; Pi, inorganic phosphat

* p < 0.05 versus controls

† p = 0.06 versus controls ‡ p = 0.05 versus controls

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

141

5.10 Figures Legend FIGURE 1. Physiological measurements during constant workrate exercise in COPD and controls. Values are means ± SE. Ventilation ( ), ventilation/maximal voluntary ventilation ( /MVV), oxygen consumption ( ), respiratory exchange ratio (RER), respiratory rate (RR), inspiratory capacity (IC), blood lactate, heart rate (HR). Values are mean ± SE. * p < 0.05 versus controls FIGURE 2. The fall in maximal voluntary contraction (MVC) and in twitch force (TwQ) of the quadriceps in COPD and controls 15 minutes post constant workrate cycle exercise. Values are mean ± SE. * p < 0.05 versus baseline FIGURE 3. Percent change from baseline in quadriceps glycogen (Gly), glucose (Glu), pyruvate (Py) and lactate (La) after constant workrate cycle exercise in COPD and controls (panel A). Percent change from baseline in quadriceps glucose-6-phosphate (G-6-P), gluocose-1-phosphate (G-1-P) and fructose-6-phosphate (F-6-P) after constant workrate cycle exercise in COPD and controls (panel B). Percent change from baseline in quadriceps adenosine triphosphate (ATP), creatine phosphate (CP) creatine (CR) and inorganic phosphate (Pi) after constant workrate cycle exercise in COPD and controls (panel C). Quadriceps glycogen utilization, glucose and lactate accumulation per unit of total cycle work during constant workrate cycle exercise in COPD and controls (panel D). Values are mean ± SE. * p < 0.05 versus baseline

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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5.11 Figures Figure 1

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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Figure 2

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CHAPITRE V. Quadriceps Metabolism during Constant Workrate Cycling Exercise in COPD

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Figure 3

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145

CHAPITRE VI

THE ACTIVATION OF SIGNALLING PATHWAYS INVOLVED IN MUSCLE MASS REGULATION AFTER AN ACUTE BOUT OF

RESISTANCE TRAINING EXERCISE IN PATIENTS WITH COPD

Article en préparation pour The Journal of Applied Physiology

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

146

6.1 Page titre THE ACTIVATION OF SIGNALLING PATHWAYS INVOLVED IN MUSCLE MASS REGULATION AFTER AN ACUTE BOUT OF RESISTANCE TRAINING EXERCISE IN PATIENTS WITH COPD Authors: Bruno B. LEMIRE, Annie DUBÉ, Marie-Eve THÉRIAULT, Richard DEBIGARÉ, Claude H. CÔTÉ, and François MALTAIS

Affiliation :

Centre de recherche, Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, Canada.

B B. Lemire is the recipient of a PhD training award from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). F. Maltais holds a GSK/CIHR Research Chair on COPD at Université Laval. This work has been supported by CIHR grant MOP-115136. Running head: Intramuscular signaling in the quadriceps of patients with COPD Word count: Address of correspondence: Dr François Maltais

Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec

2725 Chemin Ste-Foy Québec, Québec G1V 4G5 CANADA Tel: 418-656-4747 Fax: 418-656-4762

E-mail: [email protected]

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

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6.2 Résumé

La faiblesse et l’atrophie musculaire sont des conséquences importantes de la MPOC. Bien

que l’exercice en résistance semble augmenter la force musculaire chez les patients atteints de la

MPOC, la réponse à l’exercice semble être sous-optimale dans cette population. Un dérèglement

des voies de signalisation impliquées dans la régulation de la masse musculaire pourrait jouer un

rôle important dans ce phénomène. Nous avons étudié l'impact d’une séance d'entraînement en

résistance sur les principales voies de signalisation impliquées dans la régulation de la masse

musculaire chez une population atteinte de la MPOC. Les niveaux de phosphorylation de protéines

clés (AKT, p70S6K, mTOR, GSK-3β, p38 MAPK, ERK 1/2) ainsi que des E3 ligases impliquées

dans la dégradation des protéines (Atrogin1 et MuRF), en plus des niveaux d’ARNm des cytokines

(TNF- α, IL-8, IL-6) ont été mesurés avant et après une séance d’entraînement aiguë chez 11

patients atteints de la MPOC (VEMS 45 ± 2% de la valeur prédite) et 10 sujets sains appariés pour

l’âge (CTRL). Tous les exercices ont été effectués à 80% du maximum pour 2 séries de 12

répétitions de « squat », « leg press » et « leg extension ». Des biopsies du quadriceps ont été

obtenues avant et 2 heures après la session d’exercice. Les niveaux de phosphorylation et de

protéines totales ont été mesurés par immunobuvardage alors que les variations en ARNm des

cytokines ont été analysées par PCR en temps réel. Après l’exercice, le ratio

phosphorylation/protéine totale d’AKT était augmenté de 208 ± 23% chez les CTRL, alors qu'une

réponse de 83 ± 15% a été mesurée chez les MPOC (p = 0,02). De plus, ce ratio p70S6K était

augmenté de 308 ± 119% chez les CTRL et seulement de 119 ± 32% chez les MPOC (p = 0,01). Le

ratio phosphorylation/protéine totale de la p38 MAPK était quant à lui significativement différent

entre les groupes (p = 0,01), alors qu’il était de 43 ± 12% pour les MPOC et de 130 ± 32 % pour les

CTRL. Dans l'ensemble, nos données montrent que le ratio phosphorylation/protéine totale des

protéines associées à l’hypertrophie (p70S6K, AKT) était moins augmenté chez la MPOC, tandis que

ce ratio chez la p38 MAPK était significativement diminué chez la MPOC par rapport aux sujets

sains après la session d’exercice en résistance.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

148

6.2 Abstract

Muscle weakness and atrophy are important consequences of chronic obstructive

pulmonary disease (COPD). Although resistance training increases strength in patients with COPD,

the response to training appears to be suboptimal in this population. A dysregulation in the

signalling pathways involved in the regulation of muscle mass could play an important role in this

phenomenon. Thus, we investigated the impact of an acute bout of resistance training on key

signalling proteins involved in the regulation of muscle mass in a COPD population. We measured

the phosphorylation status of key quadriceps signalling proteins (AKT, p70s6k, mTOR, GSK-3β, p38

MAPK, ERK 1/2) as well as E3 ligases involved in protein degradation (Atrogin1 and MuRF) and

cytokines mRNA expression (TNF-α, IL-8, IL-6) before and after an acute bout of resistance

training session in 11 patients with COPD (FEV1: 45 ± 2% of predicted) and 10 age-matched

healthy controls. All exercises were done at 80% of max for 2 sets of 12 repetitions of squats, leg

press and leg extension and was chosen to mimic a normal resistance training session of a normal

rehabilitation session for COPD patients. Biopsies of the quadriceps were obtained before and 2

hours after exercise. The phosphorylated and total protein levels were analyzed by western blotting

while cytokines were analyzed qPCR by. After exercise, the phosphorylated to total AKT ratio were

increased by 208 ± 23% in CTRL, while a response of 83 ± 15% was measured in COPD (p=0.02),

In addition, the phosphorylated to total p70s6k ratio were increased by 308 ± 119% in CTRL and by

only 119 ± 32% in COPD (p=0.01). Moreover, the exercise response for the phosphorylated to total

p38 MAPK ratio was significantly different between groups (p=0.01) as this ratio was reduced by

43 ± 12% in COPD (p<0.01), while CTRL showed an increase of 130 ± 32%. Overall, our data

shows that the ratios of kinases associated with hypertrophy (p70s6k, AKT) were less

phosphorylated in COPD, while p38 MAPK was significantly decreased in COPD compared to

controls after an acute bout of resistance exercise.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

149

6.3 Introduction Muscle dysfunction is one of the systemic manifestations of Chronic Obstructive

Pulmonary Disease (COPD). Among the muscle abnormalities associated with this dysfunction,

skeletal muscle atrophy is often present in patients with COPD (26). Although the origin of this

muscle atrophy is not well defined, it greatly contributes to exercise intolerance, muscle weakness

and poor quality of life of those patients (38).

Resistance training exercise is known to reverse the above-mentioned consequences, at least

in healthy subjects. In comparison, the improvements in muscle strength in patients in COPD

patients participating in an 8-week rehabilitation program shows minor gains that reached 70% of

healthy controls baseline values (13). In a 10-week study of resistance training with and without the

use of testosterone, exercising patients with COPD on placebo only gained 0.1 kg of lean mass

compared with 2.3 kg in non-exercising COPD patients using steroids and 3.3 kg in exercising

COPD patients using steroids (5). In all transparency, other studies have shown similar increases in

thigh lean mass as well as in quadriceps strength between COPD and healthy controls after 8 weeks

of highly controlled resistance training (32), albeit showing an exercise-induced inflammatory

muscle infiltration in patients with COPD at lower exercise intensities suggesting that this response

may occur during daily activities and may contribute to the low-grade inflammation involved in

skeletal muscle wasting and dysfunction in COPD.

Numerous factors can limit the gains in muscle and strength in patients with COPD. Our

group and others has shown that a signalling pathways (AKT, p70s6k, MAPK) involved in muscle

mass maintenance were irregular and/or chronically overexpressed in COPD (11, 24, 37, 41). Thus,

this abnormal intramuscular signalling could contribute to the suboptimal response in rehabilitation

training in COPD, at least for resistance training outcomes such as muscle mass gains.

Key signalling pathways involved in the regulation of protein translation in skeletal muscle

are activated immediately following a single bout of resistance exercise (16). Thus, resistance

exercise induce acute increases in the phosphorylation of protein kinase B (AKT) and the

mammalian target of rapamycin (mTOR) and its downstream targets p70S6 kinase (p70S6k) and

glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), which are known to regulate the initiation of skeletal

muscle protein translation (6, 9, 13, 17, 30, 45). Moreover, the acute increase in the phosphorylation

of p70S6k following an initial bout of resistance training is closely correlated with the increase in

human skeletal muscle mass after a few months of continuous resistance training (45). While in

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

150

vitro, the acute phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK appears to be linked to the

phosphorylation of p70S6k (8), evidences show that the MAPKs could also be linked to protein

muscle degradation in certain condition of cellular stress (25, 32).

The ATP-dependent ubiquitin-proteasome system predominates under conditions of muscle

wasting (33). Two of the muscle-specific ubiquitin ligase genes, muscle atrophy F-box (MAFbx,

aka Atrogin1) and muscle ring finger 1 (MuRF), are known to regulate this proteasome system and

are markedly induced in diverse models of muscle atrophy (20). Atrogin1 and MuRF are regulated

by the PI3-kinase/AKT pathway. AKT phosphorylates the forkhead box class O (FoxO)

transcription factors and inhibits their nuclear transport. Under condition of muscle atrophy, the

deactivation of AKT results in the nuclear accumulation of FoxO factors, which in turn induce the

transcription of Atrogin1 and MuRF leading to an increase in protein degradation (43). In addition,

inflammation-induced ERK 1/2 activation has been shown to increase the expression of muscle

Atrogin1, suggesting that ERK 1/2 could play a crucial role in the pathogenesis of muscle atrophy

(36). Moreover, p38 MAPK is also to mediate oxidative stress-induced Atrogin1 gene expression

and ubiquitin-conjugating activity in skeletal muscle (25).

Overall, these events collectively lead to the formation of the translation initiation complex

and activate protein synthesis as well as protein degradation, which makes up the delicate balance

of muscle mass maintenance in human skeletal muscle.

Thus, we investigated the acute intramuscular cellular response to an acute resistance

training exercise session in patients with COPD to gain data regarding the kinase and transcriptional

responses of a number of important mediators within the skeletal muscle of patients with COPD.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

151

6.4 Methods Subjects

Eleven (11) patients with moderate to severe COPD and 10 healthy aged-matched

controls participated in this study. The diagnosis of COPD was based on spirometry

showing moderate to severe irreversible airflow obstruction (forced expiratory volume in 1

second (FEV1) < 80% predicted value, and FEV1/ forced vital capacity (FVC) < 70%) (37,

38). All patients with COPD were in a stable condition at the time of the study without any

acute exacerbation of their disease or exposure to systemic corticosteroids within 2 months

of their participation in the study. No patients were receiving long-term oxygen therapy. In

both groups, subjects were excluded if they presented any medical condition, other than

COPD, likely to influence muscle and biochemical testing (i.e. cardiovascular,

neurological, musculoskeletal, locomotor or other respiratory diseases). Only male ex-

smokers for at least 6 months were included in the present study in order to minimize

measurement variability. The research protocol was approved by the institutional ethics

committee and a signed informed consent was obtained from each subject.

Study design After reviewing medical history and familiarization with the study procedures, subjects

filled out a physical activity questionnaire (45). Anthropometric measurements, pulmonary function

testing, mid-thigh cross-sectional area by computed tomography (CT scan) and a body composition

assessment by dual energy X-ray Absorptiometry (DEXA) and exercise familiarization and testing

were performed. Subjects were also given a pedometer for a period of 7 days in order to measure

physical activity in daily living. Subjects then returned to the laboratory for a vastus lateralis

biopsies at rest. Three days later (72 hours), the participants came back to the laboratory for the

acute resistance exercise bout and the post-exercise muscle biopsy.

Pulmonary function testing

Standard pulmonary function tests including spirometry, lung volumes, and carbon

monoxide diffusion capacity were obtained in all subjects during the initial evaluation

according to previously described guidelines (1). Results were related to previously publish

normal values (18, 22).

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

152

Physical activity measurement and score The level of physical activity was assessed with a multisensor wearable device worn on the

right arm designed to collect and analyze a broad range of data from the body and its movement

(SenseWear Armband) for at least 7 days. The level of physical activity in daily living was also

assessed with the Voorrips physical activity questionnaire described by Baecke et al. (2) adapted for

elderly individuals (45) and used in patients with COPD (43). The questionnaire attributes a score

for household, sport, and other leisure-time physical activities, together resulting in a global

physical activity score. A score of 9-16 indicates a moderate level of daily physical activity,

whereas a score < 9 depicts low levels of daily physical activity and is associated with a sedentary

lifestyle.

Exercise testing

Each participant was given instruction on the three resistance training exercises. A qualified

kinesiologist evaluated the 1 repetition maximum in all participants and determined the proper

weight that should be used for 12 repetitions. This was calculated to be around 80% of max for all

participants.

Muscle biopsy

A needle biopsies of the vastus lateralis were performed as described by Bergström (3) and

routinely done in our laboratory (27). Muscle specimens were frozen in liquid nitrogen exactly one

minute after the end of exercise and stored at - 80°C for future analysis. In resting condition the pre-

exercise muscle biopsy was done three days prior the exercise session in order for the quadriceps to

heal properly and not compromise the exercise session and to avoid the unnecessary measurements

of the inflammatory surge post-biopsy in the muscle tissue.

Exercise session

The exercise session consisted of 3-resistance exercise that primarily focused on leg

exercises. Two sets of 12 repetitions of standing dumbbell squats, leg press and leg extension were

performed in a controlled manner to resemble a typical training program session in a rehabilitation

center. Participants were allowed a 1-minute break between sets.

Anthropometric measurements and body composition

Height and weight were measured according to standardized methods (19). Dual energy X-

ray Absorptiometry (DEXA) provided regional assessment of fat and fat-free mass (General

Electric Healthcare, Chicago, IL).

Measurement of mid-thigh muscle cross-sectional area

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

153

A computed tomography (CT) of the right thigh halfway between the pubic symphysis and

the inferior condyle of the femur was performed using a fourth-generation Toshiba Scanner 900S

(Toshiba). Each image was 5-mm thick and was taken at 120 kV and 200 mA with a scanning time

of 1 s while the subject was lying in the supine position. The mid-thigh muscle cross-sectional area

(MTCSA) was obtained by measuring the surface area of the tissue with a density of 40 to 100

Hounsfield units (HU). This range of density was chosen because it corresponds to the density of

muscle tissue (21). Computed tomography was used to estimate muscle mass because it is more

specific than anthropometric measurements. For instance, the age-related fat infiltration of the

muscles, which cannot be detected with anthropometric measurements, can be identified by

computed tomography because of the fat specific density.

Blood sampling and analysis

Arterial blood was drawn from a radial artery and PaO2 was then analyzed with a blood gas

analyser (AVL995; AVL Scientific, Roswell, GA) only in patients with COPD. The antecubital

venous blood was centrifuged for 15 minutes, plasma was aliquoted, and stored at -80°C until

further analysis. Commercial ELISA kits (R&D Systems Inc, Minneapolis, MN, USA) for TNF-α,

IL-6 AND IL-8 were used to measure the plasma levels of systemic inflammatory markers (TNF-α,

IL-6, IL-8).

Skeletal Muscle and Data Analysis

Protein extraction and Western blotting

Cytoplasmic protein extraction was performed with ≈ 30 mg of muscle. Muscle samples

were washed for 1 minute in PBS 1X to remove all excess blood. Muscle samples were then

homogenised using a Polytron PowerGen 125 (Omni International, Marietta, GA, USA). Protease

inhibitor cocktails for mammalian cell and tissue extracts (Sigma, Oakville, Ontario, Canada) and

phosphatase inhibitor cocktails I and II (Sigma, Oakville, ON, Canada) was added to the extraction

buffer containing 5 mM Tris pH 8, 1 % glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 1 mM β-

mercaptoethanol. Protein content was determined by a DC protein essay (BioRad, Mississauga,

Ontario, Canada) based on a modified Lowry method. Electrophoresis was performed using 12 %

SDS PAGE gels. After a 3-hour protein transfer in cold (4°C) buffer, nitrocellulose membranes

were blocked for 1 hour with BSA 5% in TBS-T (Tris 10 mM pH 8, NaCl 150 mM containing 0,1%

Tween-20). The membranes were then incubated overnight at 4°C using the primary antibodies

(phosphorylated-p38, p38, phosphorylated-ERK 1/2, ERK 1/2, MuRF, phosphorylated-AKT, AKT,

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

154

phosphorylated-mTOR, mTOR, phosphorylated-p70s6k and p70s6k, phosphorylated-GSK-3β and

GSK-3β (Cell Signaling technology , Danvers, MA, USA) diluted 1:5000 in BSA 5%. The

antibodies against Atrogin1, was developed in our centre as previously reported (10, 11, 24). The

membranes were then washed 3 x 20 minutes with TBS-T and incubated for 1 hour at room

temperature with the secondary antibody IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG (H+L) (Mandel,

Guelph, ON, Canada cat. no. LIC-926-32211) diluted 1:10 000 in BSA 5% and again washed as

above. Finally, all protein contents were normalized to α-tubulin (Sigma, Oakville, ON, Canada cat.

no. T5168) with secondary antibody IRDye 800CW goat anti-mouse IgG (H+L) (Mandel, Guelph,

ON, Canada cat. no. LIC-926-32220). Quantification was performed using infrared imaging system

(Odyssey, LI-COR : Mandel, Guelp, ON Canada).

Real-Time PCR

Total RNA extraction was performed from ≈ 15 mg of muscle using a commercially

available preparation (TRIzol® Reagent, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada). One μg

of RNA was reverse transcribed to cDNA using QuantitectTM Reverse Transcription Kit

(Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada). Real time PCR were performed in a Rotor-GeneTM

6000 (Corbett Life Science, San Francisco, CA, USA) using QuantitectTM SYBR® Green

PCR Kit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada). All protocols consisted of one denaturing

cycle at 90°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of denaturing at 90°C for 30 seconds,

annealing at 60°C for 60 seconds and elongation at 72°C for 60 seconds followed by final

elongation at 72°C for 5 minutes. At the end of the PCR amplifications the samples were

subjected to a melting curve analysis. The comparative threshold cycles (∆CT) values for

TNF-α, IL-6, IL-8 were normalized for RPLPO and 18s human reference genes and

analyzed using the 2-∆Ct method (26). All qPCR runs were performed in duplicate to ensure

quantitative accuracy. PCR primer sequences are provided in table 1.

STATISTICAL ANALYSIS

Results are expressed as mean (± SEM). Baseline value and between-group comparisons of

% changes from baseline were done using unpaired Student’s t tests, while normality for all data

was assessed with a Shapiro-Wilk test. Possible relationships were evaluated using Pearson’s

correlations. Results were considered significant if p values were less than 0.05.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

155

6.5 Results Subjects’ characteristics

Anthropometric characteristics and pulmonary function data are provided in Table 2. On

average, patients with COPD had moderate to severe airflow obstruction, reduced diffusion capacity

and mild hypoxemia. Total fat-free mass and fat-free mass index were lesser in patients with COPD

compared to healthy controls.

Muscle characteristics

Mid-thigh muscle cross sectional area was smaller in COPD compared to controls. In

COPD, mid-thigh muscle cross-sectional areas ranged from severe atrophy (60 cm2) to normal

value (117 cm2). Only two patients exhibited a mid-thigh muscle cross-sectional area < 70 cm2, a

value that is associated with poor survival (29).

Phosphorylated to total protein ratio levels

Baseline values for AKT (figure 1, panel C) and p38 MAPK (figure 2, panel A) were

significantly greater in COPD compared to controls. In addiction, ERK ½ (figure 2, panel B),

Atrogin1 (figure 3, panel A) and MuRF (figure 3, panel C) showed a trend to elevated in our COPD

patients.

Percent (%) changes from baseline values were significantly elevated in controls for AKT

(p=0.02, figure 1, panel D), p70s6k (p=0.01, figure 1, panel F), and Atrogin1 (p=0.03, figure 3, panel

B). In addition, % change from baseline values for mTOR showed a trend to be elevated in controls

(p=0.10, figure 1, panel B). In COPD, % changes from baseline values showed a significant

decrease in p38 MAPK (p<0.01, figure 2, panel B), while a trend for an increase GSK-3β (p=0.06,

figure 1, panel H) was observed post-exercise.

Between groups comparison of the % changes from baseline values revealed significant

differences for the exercise response of AKT (p=0.02, figure 1, panel B), p70s6k (p=0.03, figure 1,

panel F), p38 MAPK (p=0.01, figure 2, panel B) and Atrogin1 (p=0.01, figure 3, panel B), while

ERK 1/2 showed a similar response than p38 MAPK but was not significant (p=0.11, figure 2,

panel D).

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

156

Systemic inflammatory markers

As depicted in table 3, no baseline systemic inflammatory markers were different between

groups. Only IL-6 was significantly elevated from baseline values after exercise in the control

group.

Local inflammatory markers

As depicted in figure 4, no difference for baseline value of local inflammatory markers

were seen. All % change from baseline for inflammatory markers were influence with exercise and

this, in a similar fashion for both groups, except for IL-8 (p=0.03, figure 4, panel D), which was

significantly elevated in controls.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

157

6.6 Discussion The main finding of this study is that the cellular response of key signalling proteins

involved in muscle mass regulation are differently activated in patients with COPD compared to

age-matched healthy controls. The phosphorylation levels of 3 pro-synthesis proteins were elevated

in healthy controls while at the opposite, GSK-3β, a dominant negative pro-synthesis protein, was

significantly elevated in our COPD patients. In addition, the fact that the exercise response of the

E3 ligase Atrogin1 was significantly elevated by exercise in our controls, while the p38 MAPK was

significantly reduced in our COPD group, adds to the evidence that the cellular response of patients

with COPD to resistance training might be different than their age-matched healthy controls

counterparts. Taken into account that the mRNA expression of inflammatory markers known to be

elevated with resistance training exercise were similarly increased with exercise in both groups, this

shows that a similar cellular stress caused by resistance exercise can elicits a different cellular

response in COPD compared to healthy controls.

Our goal was to evaluate the cellular response of patients with COPD to a ‘typical’ training

regiment at our rehabilitation center. The exercises were chosen because they are included in the

rehabilitation program for patients with COPD. Since we measured the quadriceps response, we

only focused on exercises for the lower body with a ‘typical’ intensity of around 80% of max.

The typical response to resistance training involves the phosphorylation of key signalling

proteins involved in muscle mass regulation from 1 to 24 hours post-exercise (33). Of course, this

varies across studies depending on intensities, duration and population studied (6, 9, 15, 28, 43).

However, a ‘typical’ general response to resistance training can be established from the literature in

order to compare the response to exercise in COPD to healthy controls.

Masher et al. (2008) showed increased phosphorylation of mTOR and p70s6k from 15

minutes to 2 hours post-exercise in young healthy controls, while no change in Atrogin1 and a

decrease in MuRF mRNA expression was recorded. Since the exercise intensity and volume of this

study was very high (4 series, 10 reps, 80% of max) and done by young healthy controls, the direct

comparison with our results is difficult. Our results show that our healthy controls increased p70s6k

about 3 fold, while Mascher et al. (2008) show increases of between 6 to 15 fold from baseline

depending on the phosphorylation site. Our results are more in the range of Dreyer et al. that

showed significant increases in AKT, mTOR and p70s6k in a mixed population of healthy controls in

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

158

the range of 1.5 to 3 fold increases (12). Although the volume of the exercise session was greater

than ours (8 series, 10 reps), the intensity was lesser at 70% of max, which brings the question that

maybe it is the intensity that drives the cellular response to resistance training exercise as the

volume as already shown to be important at least for p70s6k and the ribosomal protein S6 (43).

It is known that the cellular response to exercise is different between E3 ligases Atrogin1

and MuRF (29). Mascher et al. (2008) show decreases in the mRNA expression of Atrogin1 48

hours post-exercise while showing an increase in MuRF mRNA expression 2 hours post-exercise.

Another study by Coffee et al. (2007) showed increases in Atrogin1 mRNA expression at 24 hours

post-exercise while no significant changes were recorded for MuRF (7). However, we show

increases in Atrogin1 in our healthy controls while our COPD do not show any changes with

exercise. As well, no change for MuRF was recorded in both groups. Since our results our protein

measurements and not mRNA, this could be a source of discrepancy. However, this is still an

indication of the difference in cellular response to exercise in COPD patients.

Another interesting point of comparison is the studies investigating the exercise response of

older versus younger individuals. A study comparing the MAPK response to resistance training

exercise showed that resting levels of p38 MAPK and ERK 1/2 were elevated in the quadriceps of

older individuals compared to younger males (45). After exercise, the phosphorylation levels were

increased in younger males and were decreased in the older individuals, similarly to our data,

except our groups were matched for age. This could be an indication that the resting COPD muscle

is under ‘cellular stress’ and this is reflected in the response to exercise in patients with COPD. It is

known that the myofribrillar protein synthesis (measured by the fractional synthetic rate) is lesser in

older individual 1 to 2 hours after exercise and this seems to be related to the phosphorylation levels

of p70s6k (21). We did not measure the protein synthesis rate in our study, but the p70s6k values seem

to indicate that our COPD patients would have a tapered down response of this protein synthesis

rate post-exercise. However, more muscles post-exercise muscle biopsies and a direct measurement

would be needed to confirm this statement.

Although we chose to exercise our groups at similar % of maximum capacity, results might

be influenced by the total amount of work done during exercise. Volume and intensity of resistance

training exercise has been shown to influence the molecular response to exercise (4, 43), especially

in COPD where post-exercise inflammatory cells infiltration is associated with the intensity of work

performed (32). Are results showing similar increases in inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-

8) in both groups are in line with Menon et al. showing similar increases in inflammatory cell

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

159

response after an acute bout of resistance training exercise in COPD. We acknowledge that this is

part of the normal muscle inflammatory response to resistance training exercise, however this seems

to happen at much lower total workload in COPD, albeit at the same % of maximum capacity. This

could simply be a reflection of an untrained, deconditioned muscle response to exercise as often

seen in COPD response to exercise.

Limitations

This study has the merit of reporting on molecular mechanisms that have been convincingly

associated with the muscle mass maintenance in response to resistance training exercise (6, 40).

However, a number of methodological considerations and potential limitations need to be taken into

account regarding its interpretation. First, only one muscle biopsy was taken in the post-exercise

phase. This was chosen because of the fragility of our COPD population and the burden associated

with multiple muscle biopsies in a short amount of time. Another limitation that is intrinsic to this

type of human experimentation is the descriptive nature of the study. As such, our results show that

baseline values are different between COPD and controls, but no mechanisms is able (for now) to

pinpoint the cause of this resting signalling abnormalities in the quadriceps of patients with COPD.

Future mechanistic experiments or pharmacological manipulations of these signalling pathways are

necessary to address a possible causality between these observations. Furthermore, several isoforms

and expression patterns of the key proteins measured in this study exist; however, dissecting of the

specific role of each subunit in the COPD response to resistance training exercise appeared

premature and was beyond the scope of this investigation. As such, antibodies detecting all protein

isoforms were used in the western blot analyses.

6.7 Conclusion This study shows that the cellular response of key proteins involved in muscle mass

maintenance is different in COPD compared to age-matched healthy controls following a single

bout of resistance training exercise and could be involved in the COPD-related exercise intolerance.

Although the information gained from acute exercise is typically less clinically relevant than that

obtained from training studies; these investigations can provide a wide range of valuable

information concerning biological targets in training studies.

We acknowledge that pulmonary rehabilitation is the best tool to treat our patients with

COPD and the benefits outweigh the less than optimal response to exercise, however, our study

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

160

shows that care should be taken to make sure that appropriate and specific resistance training

exercises should be put in place to ensure better cellular response to exercise thus hopefully

translating into better quality of life outcomes for patients with COPD.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors acknowledge the help of Marthe Bélanger, Marie-Josée Breton, Brigitte

Jean, Josée Picard, Philippe Gagnon and Vincent Mainguy in accomplishing this study.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

161

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

163

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

164

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

165

6.9 Tables Table 1. Primer sequences used for qPCR analyses

T

NF-α, tumor necrosis factor alpha; IL-6, Interleukine 6; IL-8, Interleukine 8; RPLPO, acidic ribosomal phosphoprotein PO.

Target mRNA

PCR primer sequence 5’→ 3’

TNF Forward Reverse

ACCACGCTCTTCTGCCTGCTG TCTGGTAGGAGACGGCGATGC

IL-8 Forward Reverse

ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT

IL-6 Forward Reverse

CTGGGGCTGCTCCTGGTGTTG AGGCTGGCATTTGTGGTTGGG

18s Forward Reverse

CGCACGGCCGGTACAGTGAA GGGAGAGGAGCGAGCGACCA

RPLPO Forward Reverse

TCTACAACCCTGAAGTGCTTGATATC GCAGACAGACACTGGCAACATT

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

166

Table 2. Characteristics of study subjects

Values are mean ± SEM BMI, body mass index; FEV1, forced expiratory volume in 1 sec; DLco, diffusing capacity of carbon monoxyde; FEV1/FVC, ratio of forced expiratory volume in 1 sec on forced vital capacity; PaCO2, arteriole partial pressure of carbon dioxide; PaO2, arteriole partial pressure of oxygen; MTSCA, mid-thigh cross-sectional area * Versus Controls, p ≤ 0.05 † p = 0.07

CTRL (n = 10)

COPD (n = 11)

Age (years) 65 ± 2 67 ± 1 Weight (kg) 78.5 ± 2.3 78.2 ± 3.7 BMI (kg/m

2) 28 ± 1 27 ± 1

Fat-free mass (kg) 55.6 ± 1.2 49.8 ± 1.1† Fat-free mass index (kg/m2) 19.5 ± 0.3 17.0 ± 0.3* Fat mass (kg) 19.9 ± 1.2 23.2 ± 2.3 Pulmonary function FEV1 (L) 3.38 ± 0.09 1.32 ± 0.06* FEV1 (% of predicted) 118 ± 3 45 ± 2* FEV1/FVC (%) 79 ± 1 38 ± 1* DLCO (% of predicted) 103 ± 2 60 ± 3* PaCO2 (mmHg) - 39.5 ± 0.9 PaO2 (mmHg) - 73.8 ± 1.5 Physical activity monitoring Voorrips (score) 6.9 ± 0.6 4.2 ± 0.6† Steps (steps/day) 8268 ± 842 3807 ± 386* Muscle characteristics MTCSA (cm2) 113.8 ± 3.8 86.2 ± 2.6*

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

167

Table 3. Systemic markers of inflammation and % change from baseline after exercise

Values are mean ± SEM TNF-α, tumor necrosis factor alpha; IL-6, interleukin 6; IL-8, interleukin 8; * Versus baseline values, p ≤ 0.05

CTRL (n = 10) COPD

(n = 11) Baseline Change from

baseline (%) Baseline

Change from baseline (%)

TNF-α (pg/ml) 1.88 ± 0.34 99 ± 5 1.71 ± 0.12 99 ± 3 IL-6 (pg/ml) 2.03 ± 0.36 145 ± 18* 3.32 ± 0.53 118 ± 17

IL-8 (pg/ml) 4.35 ± 0.61 123 ± 77 6.37 ± 0.76 88 ± 9

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

168

6.10 Figures Legends FIGURE 1. Phosphorylated to total protein ratios at baseline and after exercise for mTOR (panel A and B), AKT (panel C and D), p70s6k (panel E and F) and GSK-3β (panel G and H) in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Data are presented in arbitrary units (A.U.) and percent change from baseline. †, 0.05 < p < 0.10 versus baseline value. *, p < 0.05 versus baseline value. FIGURE 2. Phosphorylated to total protein ratios at baseline and after exercise for p38 MAPK (panel A and B) and ERK 1/2 (panel C and D) in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Data are presented in arbitrary units (A.U.) and percent change from baseline. *, p < 0.05 versus baseline value. FIGURE 3. Total protein content levels at baseline and after exercise for Atrogin1 (panel A and B) and MuRF (panel C and D) in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Data are presented in arbitrary units (A.U.) and percent change from baseline. *, p < 0.05 versus baseline value. FIGURE 4. mRNA expressions at baseline and after exercise for TNF-α (panel A and B), IL-8 (panel C and D) and IL-6 (panel E and F) in the quadriceps of healthy controls and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Data are presented in arbitrary units (A.U.) and percent change from baseline. †, 0.05 < p < 0.10 versus baseline value. *, p < 0.05 versus baseline value

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

169

6.11 Figures Figure 1.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

170

Figure 2.

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

171

Figure 3

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CHAPITRE VI. The Activation of Signalling Pathways Involved in Muscle Mass Regulation after an Acute Bout of Resistance Training Exercise in Patients with COPD

172

Figure 4

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CHAPITRE VII

DISCUSSION GÉNÉRALE

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CHAPITRE VII. Discussion générale

174

Cette thèse a pour but d’ajouter aux connaissances de la dysfonction

musculaire périphérique dans la MPOC, en démontrant dans un premier temps,

des mécanismes cellulaires possiblement impliqués dans l’atrophie musculaire

dans cette maladie (chapitre 3 et 4). Dans un deuxième temps, cette thèse s’est

penchée sur l’étude du métabolisme musculaire à la suite d’un exercice en

endurance puisque des altérations métaboliques sont possiblement impliquées

dans l’intolérance à l’exercice dans la MPOC (chapitre 5). Troisièmement, l’étude

de la réponse cellulaire suite à un exercice en résistance pourrait nous aider à

comprendre pourquoi la réponse à l’entraînement en résistance est sous-optimale

chez les patients atteints de la MPOC (chapitre 6). Les résultats de chaque étude ont fait l’objet de discussions spécifiques

dans chacun des articles scientifiques. Par contre, certaines discussions

concernant les principales conclusions de ces études sont de mises dans cette

discussion générale. Étant donné qu’en science, les questions sont presqu’aussi

importantes que les réponses, voici quelques points de discussion qui méritent une

attention spéciale.

Étude 1 (chapitre 3)

Étant donné que la dysfonction des muscles périphériques associée à la

MPOC est liée au stress inflammatoire et au stress oxydant et que la voie de

signalisation des MAPK (p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK) est activée lors de ces

stress, nous avions posé l’hypothèse que l’activation des MAPK serait augmentée

dans le quadriceps des patients atteints de MPOC. Nos résultats, tant pour la

phosphorylation que pour les niveaux d’ARNm, ont démontré que les principales

kinases de cette voie de signalisation étaient augmentées dans le quadriceps des

patients atteints de la MPOC. Cette affirmation est appuyée par l’augmentation

d’une E3 ligase, Atrogin1, impliquée dans la dégradation protéique ainsi que par

une augmentation du ratio phosphorylation/protéine totale de la p38 MAPK. À la

lumière de ces résultats, nous pouvons poser la question suivante :

Est-ce que les MAPK jouent un rôle important dans la dysfonction des muscles

périphériques dans la MPOC?

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CHAPITRE VII. Discussion générale

175

La littérature abonde concernant l’activation des MAPK dans le muscle

squelettique suite à un stress cellulaire provenant de stress mécanique, oxydant,

et inflammatoire et de même que lors de l’immobilisation (35, 94, 98, 157). Il est

clair que l’activation des MAPK est d’une importance capitale pour la réponse

musculaire aux stress externes. Par contre, les nombreuses influences sur de

multiples facteurs de transcription rendent très compliquée la compréhension de

cette voie de signalisation. Cela étant, l’activation chronique de la voie des MAPK

pourrait être dommageable à long terme dans le cadre d’une pathologie comme la

MPOC (Figure 12).

Figure 12. Mécanismes cellulaires proposés pour la voie des MAPK. Adapté de Kramer et al. 2007 et de Gehart et al. 2010.

Adapté de Kramer et al. 2007 et de Gehart et al. 2010 (64, 98)

Dans le cadre de notre étude où aucun stimulus externe n’a été appliqué à

nos patients, nous pourrions conclure que l’augmentation de la phosphorylation et

des niveaux d’ARNm des MAPK dans le quadriceps des patients MPOC pourraient

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CHAPITRE VII. Discussion générale

176

être causées par une exposition chronique à un stress cellulaire non défini jusqu’à

présent. Cependant, la littérature ne cesse de produire des données incriminant

les MAPK dans le processus atrophique (voir chapitre 3). Par exemple, la p38

MAPK est un médiateur important dans la réponse au stress oxydant qui induit

l'expression des gènes d’Atrogin1 et MuRF ainsi que l’activité du protéasome, ce

qui favorise une dégradation des cellules musculaires (90, 114). Notre étude ne

permet pas de cibler spécifiquement l’implication des MAPK dans le

développement de la dysfonction musculaire chez la MPOC mais servira

certainement à stimuler la recherche sur cette voie de signalisation et sur ses

impacts dans le muscle squelettique. Des études futures comparant la réponse

des MAPK aux effets aigus versus chroniques seront de mise pour élucider la

contribution exacte des MAPK.

Étude 2 (chapitre 4)

Étant donné qu’il n’existe pas de consensus sur le fait que l’inflammation

soit présente ou pas dans les muscles périphériques des patients atteints de

MPOC et qu’il n’existe pas de biomarqueur de la dysfonction musculaire pour cette

maladie, nous avions posé l’hypothèse que le SAA1 pourrait être augmenté dans

le quadriceps des patients atteints de la MPOC. Celui-ci pourrait être une des

causes de la dysfonction des muscles périphériques chez ces patients. Nos

résultats tant au niveau de l’expression des gènes que des niveaux d’ARNm

démontrent une augmentation de SAA1 dans le quadriceps des patients atteints de

la MPOC. Tant nos groupes expérimentaux (analyse génétique et

transcriptionnelle) que nos groupes de validation ont démontré que l’expression du

SAA1 était élevée de façon significative dans le muscle des patients atteints de la

MPOC. De plus, nous avons présenté les données préliminaires de sept (7)

patients MPOC présentant une exacerbation qui font état d’une fulgurante

expression du SAA1. Le SAA1 est aussi plus spécifique et sensible que la CRP

pendant les épisodes d’exacerbations et le lien avec l’apparition du SAA1 dans le

sang et la sévérité de l’exacerbation chez la MPOC a déjà été établi (23). De plus,

SAA1 a été associé à plusieurs maladies inflammatoires et aux infections virales,

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CHAPITRE VII. Discussion générale

177

incluant les infections respiratoires (124, 205, 223). Comme l’étude du chapitre 4

l’a clairement établi, il est d’une importance capitale de déterminer son influence

spécifique sur les voies de signalisation et ainsi déterminer son action sur la

physiologie humaine, plus spécifiquement dans le cadre de cette thèse, le muscle

squelettique. SAA1 a récemment été rapporté comme jouant un rôle dans la

dégradation protéique (224) pouvant contribuer à la cachexie (19). Des études

mécanistiques sont présentement en cours dans notre laboratoire pour déterminer

son influence sur des voies de signalisation spécifiques.

Est-ce que le SAA1 joue un rôle important dans la dysfonction des muscles

périphériques dans la MPOC?

SAA1 est encore très peu connu, mais les données préliminaires

accumulées par plusieurs groupes de recherche sur différentes cohortes de

patients sont très convaincantes. Des données préliminaires (non présentées dans

cette thèse, voir figure en Annexe A) démontrent que l’expression d’Atrogin1 et

MuRF impliqués dans la dégradation protéique sont induits par le SAA1 en culture

cellulaire chez des myotubes C2C12. À date, aucune cytokine inflammatoire n’a

démontré d’élévation plus convaincante que SAA1 dans le quadriceps des patients

atteints de la MPOC. Le futur nous dira si SAA1 est simplement un marqueur

inflammatoire ou un joueur important dans la pathogène de la dysfonction

périphérique dans la MPOC.

Étude 3 (chapitre 5)

Étant donné que l’intolérance à l’exercice est un problème majeur dans la

MPOC et que celle-ci est reliée à un désordre métabolique des muscles

périphériques, nous avons posé l’hypothèse que lors d’un exercice fait jusqu’à

épuisement, les produits de la glycolyse seraient égaux ou plus élevés chez des

patients MPOC en comparaison avec des sujets sains appariés pour l’âge et ce

malgré une intensité et une durée d’exercice plus courtes. Nos résultats

démontrent qu’un exercice fait sur ergocycle jusqu’à épuisement induit des

changements métaboliques et de substrats énergétiques d’importance dans le

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CHAPITRE VII. Discussion générale

178

quadriceps des patients atteints de la MPOC. Ces changements étaient similaires

en comparaison avec les sujets sains, mais sont survenus plus rapidement, et ce,

pour une intensité considérablement plus faible. En tenant compte du ratio

d’utilisation du glycogène et de production du lactate par unité de travail, il semble

que les patients atteints de la MPOC aient une plus grande dépendance à la

glycolyse pendant l’exercice, ce qui pourrait contribuer à l’intolérance à l’exercice

chez cette population. Une revue de la littérature sur la dysfonction des muscles

périphériques chez la MPOC en 2009 démontrait que la plupart des anomalies

musculaires tant au niveau clinique (réduction de l’endurance, augmentation de la

fatigue), structural (réduction des capillaires sanguins) que métabolique (diminution

des enzymes oxydatifs) étaient associées à une réduction de la capacité oxydative

du muscle squelettique dans la MPOC. Par contre, jusqu’ici le métabolisme

glycolytique a peu été étudié dans la MPOC (129).

Est-ce que le métabolisme glycolytique joue un rôle important dans l’intolérance à

l’exercice en endurance dans la MPOC?

Nos résultats démontrent une tendance de compensation énergétique vers

la glycolyse, du moins pour un effort fait jusqu’à épuisement, dans le muscle des

patients atteints de la MPOC. Nous proposons donc que ceci pourrait contribuer à

l’intolérance à l’exercice dans la MPOC puisque pour un exercice sous-maximal,

une plus grande dépendance au système glycolytique est associée à une plus

grande accumulation de lactate sanguin et à la formation d’acidose musculaire

(174) se traduisant par une cessation précoce de l’exercice. Ce phénomène

pourrait être causé par le changement de fibres musculaires de type I (oxydatives)

vers des fibres de type II (glycolytiques) et/ou par un mécanisme compensatoire dû

au fait que la capacité oxydative musculaire est réduite dans la MPOC.

Étude 4 (chapitre 6)

Étant donné que la faiblesse et la perte de masse maigre sont des

conséquences majeures de la MPOC influençant grandement la survie et la qualité

de vie des patients et que l’exercice en résistance, connu pour améliorer la force et

la masse musculaire, ne semble pas produire d’aussi bons résultats chez les

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CHAPITRE VII. Discussion générale

179

patients atteints de la MPOC par rapport à des individus sains, nous avons posé

l’hypothèse que la réponse moléculaire et cellulaire à l’exercice en résistance

serait différente chez les patients MPOC en comparaison avec des sujets sains

appariés pour l’âge. Nos résultats démontrent que les protéines associées à la

synthèse protéique (p70s6k, AKT) sont augmentées de façon significative par un

exercice musculaire chez les sujets sains alors qu’elles ne le sont pas chez les

patients MPOC. De plus, les MAPK, connues pour être modulées avec l’exercice,

semblent être diminuées chez des patients MPOC après l’exercice en

comparaison avec les sujets sains. De plus, les facteurs inflammatoires

normalement augmentés avec l’exercice en résistance l’étaient dans les deux

groupes, démontrant que le stress inflammatoire est présent après l’exercice chez

les patients MPOC, mais que la réponse des protéines clés ne semble pas être

semblable à celle des sujets sains.

Est-ce que la signalisation intramusculaire joue un rôle important dans la réponse

inadéquate des patients MPOC à l’exercice en résistance ?

Les anomalies de la signalisation musculaire dans les muscles

périphériques des patients atteints de la MPOC sont de plus en plus rapportées et

répertoriées. Que ce soit au niveau métabolique ou structural, la biochimie

musculaire est certainement affectée par la maladie. Les E3 ligases sont

augmentées (49, 110, 153), les MAPK sont modulées (110, 166), les transporteurs

glycogéniques (75) sont diminués et la signalisation IGF-1/AKT semble être

défectueuse (49). La signalisation intramusculaire dans la MPOC est certainement

influencée par une ou des sources de stress cellulaire encore méconnues. Une

des plus frappantes comparaisons en ce qui a trait à la réponse moléculaire et

cellulaire peut être faite avec l’étude de Williamson et al. 2003 (219). Ces auteurs

démontrent que la p38 MAPK, ERK1/2 et JNK sont légèrement augmentés dans le

muscle au repos de personnes plus âgées en comparaison avec des sujets plus

jeunes. Après une session d’exercice en résistance, la phosphorylation des MAPK

est légèrement augmentée dans le muscle des jeunes mais est diminuée dans le

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CHAPITRE VII. Discussion générale

180

muscle des sujets plus âgés. Cette réponse est similaire à ce que nous avons

démontré dans notre étude (chapitre 6). Étant donné que nos participants à l’étude

étaient tous appariés pour l’âge, nous émettons l’hypothèse que le muscle MPOC

se comporte comme s’il était victime d’un vieillissement prématuré en comparaison

avec les sujets sains. D’autre part, il semble que nos sujets sains répondent de

façon classique à l’exercice en résistance avec une augmentation de la

phosphorylation des protéines pro-synthèse alors qu’aucun changement n’a pu

être observé dans notre groupe de MPOC. Il sera important de poursuivre ce type

d’investigation, mais à plus long terme, pour mettre en relation les gains de masse

maigre et de force avec les changements biochimiques obtenus avec l’exercice en

résistance dans la MPOC. La poursuite de telles études permettra de mieux

comprendre la réponse à l’exercice dans la MPOC mais aussi d’établir de

nouvelles façons de s’entraîner en réhabilitation musculaire afin d’améliorer la

survie et la qualité de vie de nos patients.

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CHAPITRE VIII

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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CHAPITRE VIII. Conclusions et perspectives

182

Ma contribution, aussi petite soit-elle, au monde de la science se résume

simplement aux travaux présentés dans cette thèse, mais ont permis d’illustrer

que:

Les kinases p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK, membres de la grande famille des

MAPK, semblent être activées de façon chronique dans le quadriceps des patients

atteints de la MPOC;

Les niveaux d’ARNm de l’apolipoprotéine SAA1, une protéine de phase

aiguë, est augmentée de façon importante dans le quadriceps des patients atteints

de la MPOC;

Les patients présentant une MPOC démontrent une perturbation

métabolique lors d’exercice en endurance fait jusqu’à épuisement et ce, en

démontrant une plus grande dépendance au système glycolytique;

Les patients présentant une MPOC possèdent une réponse cellulaire

différente à l’exercice en résistance en comparaison aux sujets sains. Les patients

ont une moins bonne réponse des protéines qui sont impliquées dans la

modulation de la masse musculaire.

Ces découvertes amènent plus de questions que de réponses, mais n’est-

ce pas le but d’un doctorat! Plusieurs perspectives découlent de ces travaux. En

particulier, un lien intéressant peut être fait entre les études 1 et 2. L’étude 1

(chapitre 3) fait la démonstration que les MAPK sont élevées dans le quadriceps

de patients MPOC, témoignant ainsi d’une signalisation musculaire anormale au

repos chez les patients MPOC. Le stress oxydant, l’inflammation, le traitement

pharmacologique, l’inactivité musculaire et même le stress mécanique sont parmi

les causes possibles pour expliquer ce dérangement de la signalisation musculaire

dans la MPOC.

Alors voilà que l’étude 2 (chapitre 4) nous fait découvrir un facteur qui

pourrait être important dans le développement de la dysfonction des muscles

périphériques dans la MPOC. Les niveaux de SAA1 qui est augmentée dans le

quadriceps de plusieurs groupes de patients MPOC pourrait avoir des influences

sur les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la dysfonction des muscles

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CHAPITRE VIII. Conclusions et perspectives

183

périphériques chez cette population. Étant donné que les études 1 et 2 sont

principalement descriptives, ces découvertes fortuites mèneront à plusieurs études

mécanistiques en culture cellulaire servant à démontrer l’implication du SAA1 dans

la dégradation protéique et son influence dans le développement de la

myogenèse. Entre autres, nous voulons évaluer l’influence qu’aurait SAA1 sur la

voie de signalisation des MAPK, IGF-1/AKT, JAK/STAT et la myostatine, tous

ayant un rôle d’important dans la biochimie du muscle squelettique.

Les études 3 et 4 (chapitre 5 et 6) démontrent bien une différence de la

réponse cellulaire et moléculaire à l’exercice en endurance et en résistance chez

les patients MPOC. Cela dit, une perspective intéressante sera d’évaluer les

changements métaboliques et signalétiques après un entraînement à long terme

pour ainsi apprécier l’impact des différentes réponses biochimiques sur les

résultats cliniques des patients atteints de la MPOC. Est-ce qu’une signalisation

pro-synthèse réduite après l’exercice chez les patients MPOC pourrait expliquer

une moins bonne prise de masse maigre ou de force musculaire? Est-ce qu’un

entraînement en endurance à long terme pourrait faire en sorte que le système

glycolytique serait moins utilisé et donc permette une meilleure tolérance à

l’exercice?

Évidemment, plusieurs autres questions pourraient être posées. Cependant,

il y a un point important qui constamment est revenu tout au long de mes études

doctorales. C’est l’inactivité physique et la sédentarité des patients MPOC. Après

mes 4 ans de doctorat, je me rends à l’évidence que l’inactivité physique est peut-

être le point le plus important à considérer non seulement dans la MPOC mais

dans toutes autres maladies chroniques. La littérature abonde de données qui

s’apparentent aux données dans la MPOC, tant au niveau systémique, musculaire

que cardiovasculaire, incriminant l’inactivité physique comme cause première des

dysfonctionnements métaboliques et signalétiques chez l’humain. Cela dit, des

efforts ont été déployés dans tous mes travaux afin d’apparier les patients MPOC à

des sujets témoins pour le niveau d’activité physique. Les patients atteints de

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CHAPITRE VIII. Conclusions et perspectives

184

MPOC sont grandement sédentaires et je spéculerai qu’au-delà de l’atteinte

primaire aux poumons, de l’inflammation systémique, du traitement

pharmacologique et du stress oxydant, c’est le bas niveau d’activité physique qui

amène, à mon avis, les plus grandes détériorations physiologiques dans la MPOC.

Cette question perdure depuis longtemps, elle ne cessera jamais d’être présente et

elle devrait servir, comme elle l’est présentement, de base primordiale non

seulement de prévention mais aussi de traitement global de la MPOC.

Le défi demeurera toujours de changer les habitudes de vie sédentaire des

patients atteints de la MPOC.

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201

ANNEXES

Annexe A

Niveaux d’ARNm d’Atrogin1 et de MuRF dans des myotubes C2C12 à la suite d’une stimulation avec 2 μg de Sérum Amyloïde A (SAA1) recombinant ainsi qu’un contrôle positif soit une stimulation avec 50 ug de lipopolysaccharide (LPS) (n=2). Thériault M-E et al. 2012, résultats non-publiés