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Gérard LIZARD - INSERM EA7270 - Equipe ‘Biochimie du Peroxysome, inflammation et Métabolisme Lipidique’ Faculté des Sciences Gabriel 6, Bd Gabriel 21000 Dijon - FRANCE Rabat, 29 novembre 2018 CytoMagh 2018 Métabolisme Lipidique et Mort Cellulaire Université de Bourgogne Gérard Lizard

Métabolisme Lipidique et Mort Cellulaire€¦ · ORGANELLES INVOLVED IN CELL DEATH Organelles Apoptosis Autophagy Necrosis / Necroptosis - Mitochondria + + (mitophagy) + - Lysosomes

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Page 1: Métabolisme Lipidique et Mort Cellulaire€¦ · ORGANELLES INVOLVED IN CELL DEATH Organelles Apoptosis Autophagy Necrosis / Necroptosis - Mitochondria + + (mitophagy) + - Lysosomes

Gérard LIZARD - INSERM

EA7270 - Equipe ‘Biochimie du Peroxysome, inflammation et Métabolisme Lipidique’

Faculté des Sciences Gabriel

6, Bd Gabriel

21000 Dijon - FRANCE

Rabat, 29 novembre 2018

CytoMagh 2018

Métabolisme Lipidique et Mort Cellulaire

Université de Bourgogne

Gérard Lizard

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ORGANELLES INVOLVED IN CELL DEATH

Organelles Apoptosis Autophagy Necrosis /

Necroptosis

- Mitochondria + +

(mitophagy) +

- Lysosomes + / - + + / -

- Endoplasmic-

reticulum (ER) + / - +

+ / -

- peroxisome ? +

(pexophagy)

?

Bröker LE et al. Clin Cancer Res 2005, 11: 3155-3162. Gérard Lizard,

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CONNECTION BETWEEN LYSOSOME AND MITOCHONDRIA

Necrosis/necroptosis

Tang PS et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008, 294: 632-641. Gérard Lizard,

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apoptosis

Different pathways can co-exist in the same cell

and can be switched on by specific stimuli

Fiers W et al. Oncogene 1999, 18: 7719-7730.

Golstein P & Kroemer G 2005, 12: 1490-1495.

necroptosis

necroptosis

Gérard Lizard

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SWITCHING FROM APOPTOSIS TO NECROPTOSIS

Galluzi & Kroemer G Cell 2008, 135: 1161-1163; Hitomi J et al. Cell 2008, 135: 1311-1323. Gérard Lizard,

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Sequences of autophagy

Three types of autophagy: -Macroautophagy -Microautophagy -Chaperone-mediated autophagy

Gérard Lizard Klionsky et al., Autophagy 2012 8:4, 445-544

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7

Rupture de l’équilibre RedOx et induction de mort cellulaire

Implication du peroxysome et de la mitochondrie

Lismont C, Nordgren M, Van Veldhoven PP, Fransen M. Front Cell Dev Biol. 2015, 27;3:35.

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8

Relations peroxysome / mitochondrie

Implication dans le contrôle de l’équilibre RedOx et l’activation de la mort cellulaire

Lismont C, Nordgren M, Van Veldhoven PP, Fransen M. Front Cell Dev Biol. 2015, 27;3:35.

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Lipids and Cell Death

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM http://slideplayer.fr/slide/1165755/

Les lipides : structures et classification

Basé sur la structure chimique, on distingue

Acides gras

Lipides simples

- glycérides

- stérols et stéroïdes

- cérides (esters d’alcools gras + acides gras)

Lipides complexes

- phospholipides

- sphingolipides

- plasmalogènes

Lipides isopréniques

- carbures isopréniques (polymères d’isoprènes: terpènes)

- quinones et vitamines liposolubles

Insolubles dans l’eau, solubles dans les solvants organiques apolaires (groupements chimiques communs: -CH=CH-; -CH2-; -CH3-)

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Biosynthèse des céramides

Galadari S, Rahman A, Pallichankandy S, Thayyullathil F. Tumor suppressive functions of ceramide:

evidence and mechanisms. Apoptosis. 2015;20(5):689-711.

GCS: glucosylceramide synthase

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Céramides : cibles thérapeutiques

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Galadari S, Rahman A, Pallichankandy S, Thayyullathil F. Tumor suppressive functions of ceramide:

evidence and mechanisms. Apoptosis. 2015;20(5):689-711.

Céramides : effecteurs et cibles moléculaires

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Céramides : inducteurs d’apoptose / activité anti-tumorale

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Galadari S, Rahman A, Pallichankandy S, Thayyullathil F. Tumor suppressive functions of ceramide:

evidence and mechanisms. Apoptosis. 2015;20(5):689-711.

CAPPs: CDase SK Sphingosine-1-phosphate Ceramide

TXNIP: Thioredoxin-interacting protein

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Huang WC, Chen CL, Lin YS, Lin CF. Apoptotic sphingolipid ceramide in cancer

therapy.

J Lipids. 2011;2011:565316.

Anticorps anti-céramides

Hoechst

Cellule

normale

Cellule

pré-apoptotique

Cellule

apoptotique

Exp

res

sio

n d

e c

éra

mid

es

Stimuli apoptotique : génération de céramides

(détection par immunofluorescence)

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Céramides : autophagie cytoprotectrice et léthale

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Dany M, Ogretmen B. Ceramide induced mitophagy and tumor

suppression. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(10 Pt B):2834-45.

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Tumor supression

Céramides : régulation de la mitophagie

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM Dany M, Ogretmen B. Ceramide Biochim Biophys Acta. 2015;1853(10 Pt B):2834-45.

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Sphingosine 1 kinase / Sphingosine 1 phosphate (S1P) :

facteur de risque associé à plusieurs cancers

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Cer: ceramide

Sph: sphingosine

S1P: sphingosine 1 phosphate

Sph Ks: sphingosine 1 kinase

Aoyagi T, Nagahashi M, Yamada A, Takabe K. The role of sphingosine-1-phosphate in breast cancer

tumor-induced lymphangiogenesis. Lymphat Res Biol. 2012;10(3):97-106.

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Synthèse de novo de phosphatidylcholine : voie de Kennedy

http://fr.slideshare.net/michielvds/heidelberg-17113935

Gibellini F & Smith TK Life 2010, 62(6): 414-428.

Huang C & Freter C Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 924-949

Voie de Kennedy

PE

PS

MORT

CELLULAIRE

PROLIFERATION

CELLULAIRE

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Olkkonen VM et al. J Steroid Biochem Mol Biol. 2015 Dec 28. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.12.026.

Activités pro-tumorales des oxystérols ??????

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Oxystérols et cancer

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Nelson ER, Chang CY, McDonnell DP. Cholesterol and breast cancer

pathophysiology. Trends Endocrinol Metab. 2014;25(12):649-55. Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Cancer du sein :

implication du cholestérol et du 27-hydroxycholestérol

Obésité → cholestérol → 27-hydroxycholestérol (27HC) → Récepteurs aux oestrogènes (ER)

Prolifération tumorale / métastases

(activité pro-tumorale)

CYP27A1

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Stryjkowska-Góra A, Karczmarek-Borowska B, Góra T, Krawczak K. Statins and cancers. Contemp Oncol

(Pozn). 2015;19(3):167-75. Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Statines et cancer

Activités anti-tumorales théoriques

des statines

Activités anti-tumorales réelles à

établir

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Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

Implication du cholestérol et de ses dérivés oxydés (7-cétocholestérol)

dans la cancérogénèse

Le cholestérol et les oxystérols sont impliqués dans la régulation

de la signalisation apoptotique (activités anti-tumorales)

Huang C & Freter C Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 924-949

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Tamoxifen et cancer du sein

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM

D8D71: 3β-hydroxystérol-Δ8-Δ7-isomérase

DHCR7: 3β-hydroxystérol- Δ7-réductase

AEBS: anti-estrogen binding site

ChEH: cholesterol ester hydrolase

Thèse de Doctorat 2015 – M. Voisin, Univ. Toulouse

Activité anti-tumorale

Activité pro-tumorale

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Oxydation des acides gras et carbonylation protéique

Gérard LIZARD : EA7270

Univ. Bourgogne Franche Comté / INSERM Grimsrud PA et al. Oxidative stress and covalent modification of protein with bioactive aldehydes. J Biol Chem;283(32):21837-41.

protein (lysine)

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AVAILABLE METHODS ALLOWING THE CHARACTERIZATION

OF APOPTOSIS, NECROSIS / NECROPOTOSIS, AND AUTOPHAGY

Gérard Lizard,

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Phosphatidylserine externalization : Annexin V-FITC / PI test

Apoptosis

Necrosis

(phosphatidylserines)

V A

N

Annexin V - FITC

PI (o

r 7A

AD

)

Control Treated

PI: propidium iodide

7 AAD: 7 amino actinomycin D

Viable (V)

Apoptotic (A)

Necrotic (N)

Annexine V PI Cells

Gérard Lizard,

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0

20

40

60

80

100

0 6 12 18 24

Time of treatment (hours) % c

ell

s w

ith

dep

ola

rize

d m

ito

ch

on

dri

a

control

7-ketocholesterol (40 µg/ml)

7b-hydroxycholesterol (20 µg/ml)

Control 7-ketocholesterol 7-hydroxycholesterol

Mitochondrial potential (FCM)

Gérard Lizard,

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Gérard Lizard,

CHARACTERIZATION OF AUTOPHAGY:

‘VISUAL’ CRITERIA - LIPOPHAGY

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7KC (50 µM, 24 h)

Control

EtOH (0.1%)

0.5 µm

1 µm

1 µm

1 µm

1 µm

ap

ap

ap: autophagosome; apl: autophagolysosome

1 µm

apl

0.1 µm

A

B

C

D

E

F

G

H apl

0.1 µm

Gérard Lizard

CHARACTERIZATION OF AUTOPHAGY:

ULTRASTRUCTURAL CRITERIA – Transmission Electron Microscopy

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CHARACTERIZATION OF AUTOPHAGY: BIOCHEMICAL CRITERIA Murine oligodendrocytes (158N) - autophagy and apoptosis (oxiapoptophagy)

Co

ntr

ol

EtO

H (

1%

)

α-c

yclo

dex

trin

(12

5 µ

M)

α-t

oco

ph

ero

l (4

00

µM

)

DH

A (

50

µM

)

7K

C (

50

µM

)

7K

C +

α-t

oco

7K

C +

DH

A

7K

C +α

-to

co+

DH

A

-OH

C (

50

µM

)

-OH

C +α

-to

co

-OH

C +

DH

A

-OH

C +

α-t

oco

+DH

A

24

S-O

HC

(5

M)

24

S-O

HC

-to

co

24

S-O

HC

+D

HA

24

S-O

HC

+ α

-to

co +

DH

A

Caspase -3 (35 kDa)

Cleaved Caspase -3 (17 kDa)

PARP (116 kDa)

Cleaved PARP (89 kDa)

β-Actin (42 kDa)

LC3-I (18 kDa)

LC3-II (16 kDa)

Bcl-2 (26 kDa)

Ratio LC3-II/LC3-I 0.6 0.5 3.8 0.8 0.6 0.7 1.7 1.3 1.2 1.3 3.4 1.7 1.2 0.9

EtO

H (

0.1

%)

EtO

H (

1.1

%)

α-c

yclo

dex

trin

+ E

tOH

(0

.1 %

)

α-c

yclo

dex

trin

+ E

tOH

(1

.1 %

)

0.6 0.6 0.6 0.6 0.7 0.5 0.4

Gérard Lizard,

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Etude du Métabolisme Lipidique : Utilisation du Nile Red

12 µm

Cellules U937 non traitées Cellules U937

traitées 7-cétocholestérol

° Excitation 488 nm

° Emission > 515 nm 12 µm

° Emission > 590 nm

° Excitation

534–558 nm 10 µm 10 µm

Nile Red

Gérard Lizard, EA7270

Dijon, France

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10 µm 10 µm

Fibroblastes humains : sujet normal Fibroblastes humains : patient X-ALD

LipidTOX (Réf H34158; Invitrogen)

* Lipides neutres : fluorescence verte * Lipides polaires : fluorescence rouge

Contrairement au Nile Red, l’extinction de fluorescence est faible

Microscopie confocale possible dans de bonnes conditions

Distinction des Lipides Neutres et polaires avec le LipidTOX

Gérard Lizard, EA7270

Dijon, France

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Sondes Cibles Utilisation Applications

Nile Red Lipides polaires et

neutres

Microscopie, cytométrie

en flux, analyse spectrale

Phospholipidose,

stéatose

HCS LipidTOX Lipides neutres et

phospholipides

Microscopie, analyse

spectrale

Phospholipidose,

stéatose

Filipine Cholestérol non estérifié Microscopie, cytométrie

en flux Hypercholestérolémie

BODIPY Lipides neutres Microscopie, cytométrie

en flux

Métabolisme des

lipides, radeaux

lipidiques

Laurdan Phospholipides

Polarisation de

fluorescence,

microscopie confocale

multiphotonique

Fluidité membranaire,

radeaux lipidiques

Mérocyanine 540

Phospholipides

Microscopie, cytométrie

en flux

Externalisation des

phosphatidylsérines

Cis-parinaric acid

Acides gras insaturé

Microscopie,

cytométrie en flux Peroxydation lipidique

DPH Lipides de la membrane

plasmique

Polarisation de

fluorescence Fluidité membranaire

Fluorochromes dédiés à l’analyse des lipides

Gérard Lizard, EA7270, Dijon, France