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Eric DANNAOUI Unité de Parasitologie-Mycologie, Laboratoire de microbiologie, HEGP EUCAST AFST (yeasts and moulds) network laboratories Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation

Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation · Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation. Introduction Recherche: Screening de nouvelles molécules

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Page 1: Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation · Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation. Introduction Recherche: Screening de nouvelles molécules

Eric DANNAOUI

Unité de Parasitologie-Mycologie, Laboratoire de microbiologie, HEGPEUCAST AFST (yeasts and moulds) network laboratories

Mycologie : antifongigramme , méthodes et interprétation

Page 2: Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation · Mycologie : antifongigramme, méthodes et interprétation. Introduction Recherche: Screening de nouvelles molécules

Introduction

� Recherche: Screening de nouvelles moléculesDétermination du spectre d’un nouvel ATFAssociation d’ATF

� Epidémiologie:Surveillance des résistances

� Clinique: Prédiction de l’efficacité thérapeutiqueAdaptation du traitement

Pourquoi tester la sensibilité des champignons aux antifongiques ?

Augmentation des besoins

� Augmentation de l’incidence des infections fongiques

� Pathogènes émergents et augmentation des résistances

� Nouveaux ATF commercialisés et en développement

Augmentation des besoins

� Augmentation de l’incidence des infections fongiques

� Pathogènes émergents et augmentation des résistances

� Nouveaux ATF commercialisés et en développement

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La résistance clinique est multifactorielle

Ne pas confondre résistance clinique et résistance microbiologique

PatientStatut immunitaireSite de l’infectionMatériel étrangerMauvaise observance

ChampignonRésistance microbiologiqueProduction de biofilmTaille de « l’inoculum »

Échec thérapeutique

AntifongiqueNature fungistatiquePosologiePharmacocinétiqueInteractions médicamenteuses

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Des CMI aux « Breakpoints » cliniques: trois étapes

Détermination des CMI: aspects techniques (EUCAST, CLSI)

Détermination des populations sauvages pour chaque espèce (ECOFFs/ECVs)

Détermination des seuils cliniques de sensibilité (CBs)

CMI

CB

ECOFF

S I R

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Les techniques: les grands principes, les méthodes

disponibles

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Il faut une technique

1. Reproductible, intra-lab et inter-lab

2. Capable de distinguer entre CMI basses et CMI hautespour un ATF et une espèce donnée

3. CMI hautes liées à échec clinique � définition des seuils

Les techniques in vitro : les besoins

No.

of i

sola

tes

Concentration (µg/ml)

Distribution of 5FC MICs for 69 Candidatropicalis recovered from blood cultures – EUCAST method

0

10

20

30

40

0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64

No.

of i

sola

tes

Concentration (µg/ml)Concentration (µg/ml)

Distribution of 5FC MICs for 69 Candidatropicalis recovered from blood cultures – EUCAST method

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Techniques disponibles : CLSI, EUCAST, Etest, autres

Les techniques in vitro

Technique Principe Avantages Inconvénients

CLSI -EUCAST

Microdilutionliquide

Méthode de Référence

Non commercialiséeLourd, CQ ++

CLSI Diffusion en gélose (disques)

Méthode de Référence

Pas de CMI

Sensititre Yeast one

Microdilutionliquide colorimétrique

StandardiséeCommercialisée

Kit

Etest Diffusion en gélose

CommercialiséeSimple, Validée

Chère

Autres Variable Certaines commercialisées

Peu validées

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Dilution en milieu liquide - microméthode : CLSI, EUCASTConcentration (mg/l)

Ant

ifong

ique

5FC

FCZ

PSZ

AMB

TER

ITZ

VRZ

CAS

128 64 8 0.25432 16 00.512 0.12

CMI

16 8 1 0.030.54 2 00.060.120.25 0.015

CMI

CMI

CMI

CMI

CMI

CMI

Nombreux paramètres�Milieu�Taille inoculum�Critère de CMI

�Temps d’incubation�Méthode de lecture

5FC : > 128 µg/ml

FCZ : 4 µg/ml

ITZ : 0.12 µg/ml

VRZ : 0.06 µg/ml

PSZ : 0.06 µg/ml

TER : 0.25 µg/ml

AMB : 0.5 µg/ml

CAS : 0.12 µg/ml

Les techniques in vitro

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8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,015 TPTN

Concentration d’antifongique (µg/ml)

Inhibition partielleEx : Candida / Azolés, 5FC

Inhibition complèteEx : Candida / AMB, CAS

Inhibition complète : CMI : >8 µg/mlInhibition partielle : CMI : 0.06 µg/ml

Importance majeure du critère de définition de la CMI

Dilution en milieu liquide : microméthode

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Paramètre CLSI - 2008(M27-A3)

EUCAST - 2011(E.Def 7.2)

Format Microdilution Microdilution

Milieu de culture RPMI + MOPS, pH 7.0 RPMI + MOPS + 2% glucose, pH 7.0

Inoculum final 0,5 à 2,5 x103 UFC /ml 0.5 to 2.5x105 UFC /ml

Incubation 48h (24h échino, +/-AMB, FCZ)

24h

Lecture Visuelle Spectrophotométrique

Détermination des CMI

Azolés, 5FC, et échino 50% d’inhibition 50% d’inhibition

AMB 100% d’inhibition 90% d’inhibition

Candida spp.Standardisation des techniques

A noter : convergence des techniques

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� La technique du Etest� Commercialisée� Standardisée� Simple d’utilisation� Bien adaptée au laboratoire de routine� Plus performante dans certains cas (AMB et Candida)

Les alternatives

� Mais…� Coûteuse� Parfois difficile à lire� Moins performante dans certains cas (5FC et Crypto)

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L’obtention d’une CMI:les particularités de lecture en

fonction des antifongiques

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Antifongiques : activité

Inhibition complète

CMI

CMI

Activité des antifongiques : AMB

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Trailing effect – méthodes en dilution liquide

� Azolés – trailing : pousse résiduelle normale avec les azolés

� Présent pour les levures� Parfois très marqué, certaines souches de C. albicans

et C. tropicalis� Absent avec les filamenteux � Ne dépends pas de la technique

Exemple : Posaconazole - EUCAST

C. albicans

A. fumigatus

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Antifongiques : activité

Activité des antifongiques : Azolés

A. fumigatus

CMI

CMI

C. albicans

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� Azolés – trailing / Etest

POSMicrocolonies

CMI 0.012 µg/ml

ITZMicrocolonies

CMI 0.19 µg/ml

FCZMicrocoloniesCMI 0.5 µg/ml

FCZMacrocolonies

CMI >256 µg/ml

� Azolés – trailing : n’existe pas pour les filamenteux

Trailing effect – méthodes en gélose

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Echinocandines : EUCAST / CLSI, Etest

Antifongiques : activité

Inhibition complète (lecture 50%)

CMI

CMI

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Filamenteux – Caspofungine � MEC / CLSI - EUCAST

Aspergillus fumigatus

MEC : concentration

minimale effective

Kurtz et al., AAC 38:1480, 1994

Techniques standardisées : les problèmes

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Echinocandines : EUCAST, Etest

Antifongiques : activité

Inhibition partielle

CMI

CMI

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Filamenteux – Caspofungine � MIC / Etest

Aspergillus fumigatus

Techniques standardisées : les problèmes

Pousse résiduelle dans la zone d’inhibition

CMI

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Cryptococcus neoformans – 5FC - Etest

Amphotericin B susceptibility testing

L’obtention d’une CMI:Des cas très particuliers

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Cryptococcus neoformans – 5FC -Etest

94 souches d’origine clinique

Techniques standardisées : les problèmes

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64

CLSIEtest

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64

RPMI – pH 7.0CMI > 32 µg/ml

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Détermination et analyse des distributions de CMI

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EUCAST definitions of wild-type MIC distribution andepidemiological cut-off Values (ECOFFs)

wild type (WT)

� A micro-organism is defined as wild type (WT) for a species by theabsence of acquired and mutational resistance mechanisms to the drugin question

� A micro-organism is categorized as wild type (WT) for a species byapplying the appropriate cutoff value in a defined phenotypic testsystem.

� Wild type micro-organisms may or may not respond clinically toantimicrobial treatment

The wild type is presented as WT<z mg/L and non-wild type as NWT >z mg/L

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EUCAST wild-type (WT) MIC distribution and epidemiologica l cut-offValues (ECOFFs)

Turnidge et al. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 418–425Turnidge et al. CMR 2007; 20: 391–408

1. Construction de la distribution des CMI� Spécifique d’espèce� Doit inclure toutes les valeurs de CMI de la distribution (pas de troncature aux extrémités)

1. Construction de la distribution des CMI� Spécifique d’espèce� Doit inclure toutes les valeurs de CMI de la distribution (pas de troncature aux extrémités)

2. Méthode de détermination des ECOFFs� Simple estimation par inspection visuelle� Analyse statistique (surtout utile si superposition entre distribution WT et souches anormales)

2. Méthode de détermination des ECOFFs� Simple estimation par inspection visuelle� Analyse statistique (surtout utile si superposition entre distribution WT et souches anormales)

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EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs)

C. albicans/ fluconazole

http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/

Epidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l

3756 observations (12 data sources)

ECOFF

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EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs)

C. glabrata/ fluconazole

http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/

Epidemiological cut-off: WT ≤ 32 mg/l

898 observations (12 data sources)

ECOFF

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CLSI wild-type MIC distribution and epidemiological cut-o ff Values (ECVs)

Adapted from Espinel-Ingroff et al., JCM 2010, 48, 325 1

ITZ PSZ

VRZ

A. fumigatus / azolesECV

ECV ECV

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Principales caractéristiques des ECOFFs

� Déterminables pour toutes les espèces

� Pas de variation dans le temps

� Utiles pour la surveillance épidémiologique

� Sensibles pour la détection de résistance

� Non WT peut répondre ou non au traitement

� Utilisables si pas de CBs disponibles

� Déterminables pour toutes les espèces

� Pas de variation dans le temps

� Utiles pour la surveillance épidémiologique

� Sensibles pour la détection de résistance

� Non WT peut répondre ou non au traitement

� Utilisables si pas de CBs disponibles

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L’interprétation d’une CMIDéfinition des seuils cliniques

(breakpoints )

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EUCAST definitions of clinical breakpoints

Clinical resistance and clinical breakpoints

Clinically Susceptible (S)

� A micro-organism is defined as susceptible by a level of antimicrobial activity associated with a high likelihood of therapeutic success

� A micro-organism is categorized as susceptible (S) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic test system

� This breakpoint may be altered with legitimate changes in circumstances

Clinical breakpoints are presented as S<x mg/L; I>x , <y mg/L; R>y mg/L

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EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs) – Determination of CBs

C. albicans/ fluconazole

Adapted from G. KahlmeterEpidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l 3756 observations (12 data sources)

WT

Résistance génotypique détectable

Résistance phénotypique détectable

Echec thérapeutique?

Echec thérapeutique?

Echec thérapeutique?

Echec thérapeutique?ECOFF

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Études des corrélations in vitro / in vivo

Stratégie de détermination des seuils: problème complexe – Intégration de nombreux paramètr es

� Données historiques� Pharmacocinétique des ATF� Distribution des CMI� Mécanismes moléculaires de résistance� Modèles expérimentaux chez l’animal� Données cliniques

http://www.escmid.org

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http://www.eucast.org/

Relevant factors in setting breakpoints for new ant imicrobials and assessment of data:

EUCAST Procedure for Harmonising andDefining Breakpoints

Dosing, formulations (oral, iv), indications and practices, target

organisms

MIC distributions

and ECOFFs

determined

Dose-effect relationships in vitro studies,

animal studies and humans (PK/PD data) evaluated

Modellingprocesses,

Monte Carlo

simulation

Clinical data relating

outcome to MIC-values

National CBs

compared and

discussed

Consensus breakpoints are sought

CBs tested against target species MIC

distributions.

CBs should not divide the WT distributions

No CBs if species a poor target for the

drug ( “-”) or insufficient evidence that the species is a good target for the

drug (IE)

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Principales caractéristiques des ClinicalBreakpoints (CBs)

� Destinés à prédire l’efficacité clinique

� Non déterminés pour toutes les espèces

� Pas de relation formelle entre CBs et ECOFFs

� Evolution possible au cours du temps

� Destinés à prédire l’efficacité clinique

� Non déterminés pour toutes les espèces

� Pas de relation formelle entre CBs et ECOFFs

� Evolution possible au cours du temps

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CLSI wild-type MIC distribution and epidemiological cut-o ff Values (ECVs)– Determination of CBs

C. albicans/ fluconazole

http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/

Epidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l

7851 observations (12 data sources)

ECV

S I R Anciens CLSI CBs

S I R Nouveaux CLSI CBs

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Garcia-Effron et al. AAC 2009;53 :3690

Candida glabrata

Antifungals: MIC - CBs

Revision of CLSI Clinical BreakpointsAntifungal Susceptible SDD/Interm Resistant

Echinocandins ≤ 2 ND ND

WT

Mutant

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Definition of CBs for Candida spp. (µg/ml)

1. CLSI M27-A3, 2008 2. Pfaller et al. JCM 2006;44 :819-263. Pfaller et al. JCM 2008;46 :2620-29

Revision of CLSI Clinical Breakpoints 1-6

Antifungals: MIC - CBs

4. Pfaller et al. ICAAC 2010, M-3695. Pfaller et al. Drug resist Updat 2011,14, 164-1766. CLSI M27-S4, 2013

Antifungal Susceptible SDD/Interm Resistant

Echinocandins ≤ 2 ND ND

Species Caspo Mica Anidula

C. albicansC. tropicalisC. krusei

S ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.25

I 0.5 0.5 0.5

R ≥ 1 ≥ 1 ≥ 1For C. glabrata: S£ 0.12, I 0,25, R ³ 0.5 for caspo and anidula and S£ 0.06, I 0,125, R ³ 0.25 for micafungin

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Antifungals : MIC - BPs

Candida spp.EUCAST Antifungal Clinical Breakpoint Table v. 8.0

valid from 2015-11-16

http://www.eucast.org

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Antifungals : MIC - BPs

http://www.eucast.org

Aspergillus spp.EUCAST Antifungal Clinical Breakpoint Table v. 8.0

valid from 2015-11-16