6
BIOCHIMIE, 1980, 62, 79-84. N-acdtylglucosaminyl-transfdrase mitochondriale en relation avec l'infection virale. O. GATEAU, R. MORELIS * et P. I.OUISOT <). (23-7-1979). Universit6 de Lyon, Facalt(" de MOdecine Lyon-Sud, Laboratoire de Biochimie Gdn~rale et M~dicale, ERA-CNRS n ° 562, Groupe de Recherches LVSERM U. 189, B.P. 12, 69600 Oallins (France). R~sum~. L'infection par Myxovirus entralne une auq- mentation de l'incorporation de N-ac6tylqluco- samine sur accepteurs polypr6niques et prot6i- niques endo~bnes, dens les mitochondries en- fibres comme dans la membrane mitochon- driale externe. L'infection virale ne provoque pas la biosynthbse de polypr6nol N-ac6tylqlu- cosaminyl6 nouveau. L'auqmentation d'incorpo- ration de N-ac6tylqlucosamine dens le cas des animaux infect6s n'est pas due b une modifica- tion du taux des accepteurs endoq~nes, mais & une auqmentation de l'activit6 N-ac6tylqlucosa. minyltransf6rasique. Mots cl~s : mitochondries - N - ae~tylglucosaminyl- transf~rase - infection virale - interm~- diaire polypr~nique. Summary. A hiqher level of N-acetylqlucosamine incor- poration by proteinic and polyprenic endoqe- nous acceptors is observed after infection by Myxovirus. This phenomenon occurs in whole mitochondria as in outer mitochondrial mem- branes, where it is particularly obvious with proteinic endoqenous acceptors. Under viral infection, no new N-acetylgluco- saminylated polyprenol is detected. In the case of infected animals as in the case of con- trol animals, compounds P1 (extracted by chlo- roform/methanol 2:1) are identified by thin layer chromaloqraphy as a N-acetylqlucosa- myl-pyrophosphoryl-dolichol and a N, N'-diace- tylchitobiosyl-pyrophosphoryl.dolichol. In the case of infected animals, biosynthesis of proteinic acceptors and dolichol is not modi- fied ; therefore the increase of N-acetylqlucosa- mine incorporation is not due to a modification of the endogenous acceptors level. By the use of exoqenous dolichol-monophos- phate we demonstrate that the increased trans- fer of [14C] N-acetylqlucosamine into polyprenic accep,~ors is the result of a hiqher activity of the mitochondrial N-acetylqlucosaminyltransferase after viral infection. Key-words : mitochondria - N - acetylglucosaminyl - transferase - viral infection - polyprenic intermediates. Introduction. Des travaux ant6rieurs [1-3] ont montr6 que l'infection virale par Myxovirus ou Arbovirus en- traine une r6action d'hyperglycosylation des pro- t6ines au niveau microsomique. Warren et al. [4], " Chargde de Recherches au C.N.R~. <> A qui lit correspondance dolt ~tre adressJe. Burridge [5], Ogata et el. [6] et Bossmann [7], ont d6crit des diff6rences significatives dans la composition et la s6quence des glycannes des gly- coprot6ines des cellules normales et transform6es, quel que soft le virus oncog~ne responsabic. Ces differences affectent, non seulement l'acide sia- lique ou le fucose, mats aussi le galactose et la N- ac6tylglucosamine, ce qui sugg6re une dysglycosy- lation au niveau des oses les plus internes de ces chaines glycanniques.

N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

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Page 1: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

BIOCHIMIE, 1980, 62, 79-84.

N-acdtylglucosaminyl-transfdrase mitochondriale en relation avec l'infection virale.

O. GATEAU, R. MORELIS * et P. I .OUISOT <).

(23-7-1979).

U n i v e r s i t 6 de L y o n , Facalt(" de MOdec ine L y o n - S u d , L a b o r a t o i r e de B i o c h i m i e Gdn~rale et M~dica le , E R A - C N R S n ° 562, G r o u p e de R e c h e r c h e s L V S E R M U. 189, B.P. 12, 69600 Oa l l i n s (France) .

R~sum~.

L' in fec t ion p a r M y x o v i r u s e n t r a l n e u n e a u q - m e n t a t i o n d e l ' i n c o r p o r a t i o n d e N - a c 6 t y l q l u c o - s a m i n e s u r a c c e p t e u r s p o l y p r 6 n i q u e s et prot6i- n i q u e s e n d o ~ b n e s , d e n s l e s m i t o c h o n d r i e s en- f ib res c o m m e d a n s l a m e m b r a n e mi tochon- d r i a l e ex t e rne . L ' in fec t ion v i r a l e n e p r o v o q u e p a s l a b i o s y n t h b s e d e p o l y p r 6 n o l N-ac6 ty lq lu - c o s a m i n y l 6 n o u v e a u . L ' a u q m e n t a t i o n d ' i n c o r p o - r a t i o n d e N - a c 6 t y l q l u c o s a m i n e d e n s le c a s d e s a n i m a u x in fec t6s n ' e s t p a s d u e b u n e m o d i f i c a - t ion d u t a u x d e s a c c e p t e u r s e n d o q ~ n e s , m a i s & u n e a u q m e n t a t i o n d e l ' ac t iv i t6 N - a c 6 t y l q l u c o s a . m i n y l t r a n s f 6 r a s i q u e .

M o t s c l ~ s : m i t o c h o n d r i e s - N - a e ~ t y l g l u c o s a m i n y l -

t r a n s f ~ r a s e - i n f e c t i o n v i r a l e - i n t e r m ~ -

d i a i r e p o l y p r ~ n i q u e .

S u m m a r y .

A h i q h e r l e v e l of N - a c e t y l q l u c o s a m i n e incor- p o r a t i o n b y p ro t e in i c a n d p o l y p r e n i c e n d o q e - n o u s a c c e p t o r s is o b s e r v e d a f t e r in fec t ion b y M y x o v i r u s . This p h e n o m e n o n o c c u r s in w h o l e

m i t o c h o n d r i a a s in ou te r m i t o c h o n d r i a l m e m - b r a n e s , w h e r e it is p a r t i c u l a r l y o b v i o u s w i t h p ro t e in i c e n d o q e n o u s a c c e p t o r s .

U n d e r v i r a l in fec t ion , no n e w N - a c e t y l g l u c o - s a m i n y l a t e d p o l y p r e n o l is d e t e c t e d . In t he c a s e of i n f e c t e d a n i m a l s a s in t he c a s e of con- t rol a n i m a l s , c o m p o u n d s P1 ( e x t r a c t e d b y chlo- r o f o r m / m e t h a n o l 2:1) a r e i de n t i f i e d b y th in l a y e r c h r o m a l o q r a p h y a s a N - a c e t y l q l u c o s a - m y l - p y r o p h o s p h o r y l - d o l i c h o l a n d a N, N ' - d i a c e - t y l c h i t o b i o s y l - p y r o p h o s p h o r y l . d o l i c h o l .

In the c a s e of i n f e c t e d a n i m a l s , b i o s y n t h e s i s of p r o t e i n i c a c c e p t o r s a n d d o l i c h o l is no t mod i - f i ed ; t h e r e f o r e the i n c r e a s e of N - a c e t y l q l u c o s a - m i n e i n c o r p o r a t i o n is not d u e to a m o d i f i c a t i o n of the e n d o g e n o u s a c c e p t o r s l eve l .

By the u s e of e x o q e n o u s d o l i c h o l - m o n o p h o s - p h a t e w e d e m o n s t r a t e tha t the i n c r e a s e d t r ans - fer of [14C] N - a c e t y l q l u c o s a m i n e in to p o l y p r e n i c accep,~ors is the r e s u l t of a h i q h e r a c t i v i t y of t he m i t o c h o n d r i a l N - a c e t y l q l u c o s a m i n y l t r a n s f e r a s e a f t e r v i r a l infec t ion .

Key-words : mitochondria - N - acetylglucosaminyl - transferase - viral infection - polyprenic intermediates.

I n t r o d u c t i o n .

Des t ravaux ant6r ieurs [1-3] ont montr6 que l ' in fec t ion v i ra le p a r M y x o v i r u s ou A r b o v i r u s en- t ra ine une r6act ion d ' h y p e r g l y c o s y l a t i o n des pro- t6ines au niveau microsomique . W a r r e n et al. [4],

" Chargde de Recherches au C.N.R~. <> A qui lit correspondance dol t ~tre adressJe.

Burr idge [5], Ogata et el. [6] et Bossmann [7], ont d6cr i t des diff6rences s ignif icat ives dans la compos i t ion et la s6quence des g lycannes des gly- copro t6 ines des cellules normales et t ransform6es , quel que soft le v i rus oncog~ne responsabic . Ces d i f ferences affectent, non seulement l ' a c ide sia- l ique ou le fucose, mats aussi le galactose et la N- ac6ty lg lucosamine , ce qui sugg6re une dysg lycosy- la t ion au niveau des oses les plus in te rnes de ces cha ines g lycanniques .

Page 2: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

80 O. Gateau et coll.

De pr6c6dents travaux ont montr6 1'existence tie glycosyl-transf6rases mi tochondr ia les autono- rues [8-11]. Plus r6cemment, on a mis en 6vidence dans les mi lochondr ies et la membrane mitochon- driale externe purifi6e, un systbme enzymatique permet tan t la fixation de X-ac6tylglucosamine sur des accepteurs polypr6niques et prot6iniques en- d o g b n e s [12] . Les produi ls glycosyl6s ont 6t6 iden- tifi6s ~ du N-ac6tylglucosaminyl-pyrophosphoryl- dolichol, du N, N'-diac6tylchi tobiosyl-pyrophos- phoryl-dol ichol et des glycoprot6ines N-ac6tylglu- cosaminyl6es.

I1 nous a paru impor tan t de rechercher Fin- fluence de l ' infect ion virale sur la glycosylation des glycoconjugu6s mi tochondr iaux. L'act ivi t6 de la N-ac6tylg lucosaminyl- transf6rase mitochon- driale, en relat ion avec l ' infec t ion virale, fait l 'objet de ce pr6sent m6moire.

Mat6riel et M6thodes.

A n imaux.

Les a n i m a u x n t i l i s 6 s s o n t des s o u r i s e x e m p t e s de g e r m e s p a t h o g 6 n e s , de s o u c h e OF 1 ( IFFA-CREDO, Les Onc ins , F r a n c e ) , d ' u n p o i d s m o y e n de 20 g, ~g6es de 2 tools . E l les s o n t t u 6 e s p a r d 6 e a p i t a t i o n , p u i s l a p a r o - t omis~es . Les fo ies s o n t r a p i d e m e n t pr~lev~s, p u i s m i s e n s u s p e n s i o n en t a m p o n s a c c h a r o s e 250 raM, Tr i s 10 raM, h p H 7,4, m a i n t e n u h 4°C.

Virus.

Le M y x o v i r u s e s t ce lui de l a g r i p p e ~quine , isol~ /~ l 'Ecole V6 t~ r ina i r e de L y o n ( souchc ~qui 2, F r a n c e ) , a d a p t 6 p a r v i n g t - d e u x p a s s a g e s s u c c e s s i f s s u r sour i s , s u i v i s de h u i t p a s s a g e s s u r les s o u r i s de s o u c h e OF 1. I1 es t i n o c u l 6 p a r v o l e i n t r a . n a s a l e /~ d i l u t i o n conve - n a b l e s o n s u n v o l u m e de 0,1 ml , a p r 6 s 16g6re a n e s t h d s i e . Les p r 6 1 6 v e m e n t s d ' o r g a n e infec t6 s o n t rf ial is~s en p l e i n e p h a s e e x p o n e n t i e l l e de v i r6mie .

Preparation et purification des mitochondries et de la membrane externe.

Les m i t o c h o n d r i e s s o n t p r~pa r6es s e l o n la m 6 t h o d e de W e i n b a e h [13] am61ior6e p a r la m 6 t h o d e de B u s t a - m e n t e [14]. Les fo ies s o n t b r o y 6 s d u n s u n h o m o g 6 - n 6 i s e u r Dounee , en t a m p o n s a c e h a r o s e 250 mM, b r a i s o n de 9 m l de t a m p o n p a r g r a m m e de foie .

Les m i t o c h o n d r i e s s o n t l av~es d e u x fo i s en t a m p o n s a c e h a r o s e 250 m M (3 m l de t a m p o n p a r g de foie) , r e m i s e s e n s u s p e n s i o n darts ee m ~ m e t a m p o n et p u r l - tikes p a r a c t i o n m ~ n a g 6 e des u l t r a - s o n s [11]-

La m e m b r a n e e x t e r n e cs t p r 6 p a r 6 e p a r ehoc o s m o - t i q u e "~ p a r t i r de ees m i t o e h o n d r i e s et pur i f i~e p a r p a s s a g e s u r g r a d i e n t d i s c o n t i n u de s aceha rose . La q u a - l i t6 des p r 6 p a r a t i o n s es t contr61~e p a r la m e s u r e des ac t iv i t6s des m a r q u e u r s e n z y m a t i q u e s sp6ci f iqnes et p a r la m i c r o s c o p i c 61ec t ron ique [11].

BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 1.

Etude des glycosyl-transfdrases milochondriales.

Le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n u t i l i s~ p o u r 6 tud ie r l ' i nco r - p o r a t i o n de [ 1 4 C ] N - a e 6 t y l g l u c o s a m i n e d u n s les accep- t e n r s e n d o g 6 n e s m i t o c h o n d r i a n x , es t ]e s u i v a n t :

• 20 ~tl de s u s p e n s i o n m i t o c h o n d r i a l e e o n t e n a n t 60 m g de p r o t 6 i n e s p a r ml , ou 30 ~tl de la s u s p e n s i o n de m e m b r a n e e x t e r n e c o n t e n a n t 10 m g de p ro t~ ine s p a r m l ; les p r o t ~ i n e s son t dosdes se lon la m~ thode de Gorna l l [15].

• 5 I~1 d ' u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e de m a n g a n 6 s e afin d ' o b t c n i r u n e c o n c e n t r a t i o n f ina le 5 raM.

• 10 Ixl d ' u n e s o l u t i o n d ' U D P - [ 1 4 C ] N - a c ~ t y l g l u c o s a - m i n e (80 pmo le s ) (NEN C h e m i c a l s , USA, ac t iv i td sp~cif ique 235 Ci/M). On a j u s t e /~ 4,5 ~M la concen- t r a t i o n en U D P - N - a c ~ t y l g l u e o s a m i n e d a n s le m i l i e u rdac t i onne l c o n t e n a n t la m e m b r a n e m i t o c h o n d r i a l c ex t c rne .

On compl6 te le m i l i e u r 6 a c t i o n n c l h 250 ~1 avec u n c s o l u t i o n de t a m p o n ( 2 - N - m o r p h o l i n o ~ t h a n e ) - a c i d e su l - f o n i q u e (MES) 20 m M d o n t le pH est a j u s t 6 /i 6,8 p o u r les i n c u b a t i o n s avec des m i t o c h o n d r i e s et 6,1 p o u r los i n c u b a t i o n s avec la m e m b r a n e ex t e rne . D a n s ces cond i - t i ons , les ac t iv i t6s p y r o p h o s p h a t a s i q u e s de d6grada - t i on de l ' U D P - N - a c t ~ t y l g l u e o s a m i n e et g l y c o s i d a s i q u e s d e v i e n n e n t n6g l igeab le s . Les i n c u h a t ! o n s son t rda l i s6es

37°C. et les r ~ a c t i o n s s o n t a r r~ t~es p a r a d d i t i o n de 10 v o l u m e s d ' u n m d l a n g ¢ c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l (2:1, en v o l u m e ) ct de 3 v o l u m e s d ' eau . Le m61ange cs t agit~ et on proc6de a u x d i f f6 ren te s e x t r a c t i o n s darts des c o n d i t i o n s p r ~ c ~ d e m m e n t dt~erites [11]. Le produit P,, e x t r a i t p a r le m ~ l a n g e c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l (2:1, en v o l u m e ) es t 6vapor6 ~k sieci td ; le produit P~, i n s o l u b l e d a n s l ' e au et les s o l v a n t s o r g a n i q u e s , e s t r6cup6r6 su r f i l t res en fibre de ve r re W h a t m a n G F / B . La r ad ioac t i - vi t6 es t ~valu~e d a n s u n c o m p t c u r /~ s c i n t i l l a t i o n l i qn ide T r i - C a r b P a c k a r d , en p r6sence de 10 ml de m ~ l a n g e s c i n t i l l a n t (5 g de PPO et 0,3 g de 1 ,4 -d im6 thy l - P O P O P d a n s u n l i t re de to lu6ne) .

Biosynth~se des protdines mitochondriales.

L '6 tnde de la b i o s y n t h 6 s e des p r o t 6 ] n e s cs t effectu~e se lon la t e c h n i q u e de Coote e t W o o r k [16], h 1 'aide d ' u n e s u s p e n s i o n m i t o e h o n d r i a l e c o n t e n a n t 0,8 m g de p r o t 6 i n e s / m l , et u n e s o l u t i o n d ' a m i n o - a c i d e s /~ 1 ~Ci / m l ( H y d r o l y s a t de Chlorella vulgaris, 560 ~tCi/mg, CEA, F rance ) .

L ' i n c u b a t i o n es t r6a l i s6e h 30°C ap r6s a d d i t i o n de 10 pd de la s o l u t i o n de [14C]amino -ac ides . La r6ae t ion es t a r r~t6e p a r p r 6 c i p i t a t i o n de s p r o t ~ i n e s p a r l ' ae ide t r i c h l o r a e 6 t i q u e h 20 p. cent . Cel les-ei s o n t r6cup6rdes s u r f i l t res en f ibre de ver re . L e u r r ad ioac t iv i t 6 es t 6va- lu~e en s c i n t i l l a t i o n l i qu ide .

Biosynth~se de dolichol.

La b i o s y n t h 6 s e in vitro de do l i cho l es t effectu6e d a n s les f r a c t i o n s m i t o e h o n d r i a l e s on d a n s la m e m b r a n e e x t e r n e pnrif i~e, h p a r t i r d ' ac ide [1-14C] i s o p e n t 6 n y l - p y r o p h o s p h o r i q u e (57 Ci/M, R a d i o c h e m i e a ! Center , A m e r s h a m ) . Le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n c o m p r e n d :

• 20 ~tl de s u s p e n s i o n m i t o e h o n d r i a l e e o n t e n a n t 60 m g de p r o t 6 i n e s p a r m], ou 30 ~t] de la s u s p e n s i o n de m e m b r a n e e x t e r n e c o n t e n a n t 10 m g de p ro td ine s p a r m l ;

• 5 I~l d ' u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e de m a n g a n b s e afin d ' o b t e n i r u n e c o n c e n t r a t i o n f inale de 5 mM ;

Page 3: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

N-acdtylghtcosaminyl-transfdrase mitochondriale el infection virale. 81

• 200 ~I de tampon MES, 20 raM, 'h pH 6,8 ; • 15 ~xl de la solution d'acide [1-14(]] isopent6nyl-

pyrophosphor ique h 2 I~(]i/ml.

Les incubations sont rdalis6es h 32°C et les rfiactions sont arr~t6es par addit ion de chloroforme/mdthanol (2:1, en volume) eomme pr~e6demment d6crit. La phase ehloroformique est 6vapor6e h siccit6 et la radioacti- vit6 est mesur6e en scinti l lat ion liquidc. Les produits synth6tist!s sont identifi6s par chromatographic sur touche mince, dans le solvant ch loroforme/m~thanol / eau (65:25:4, an volume), en pr6sence de dolichol t6moin (Sigma).

Addition de dolichol-monophosphate exoglme.

50 i~l de taurocholate de sodium 0,1 p. cent dans du eh loroforme/m6thanol (2:1, en volume) sont ajout6s b. 20 nmoles de dol ichol-monophosphate (Sigma). Le m61ange est dessdchd sous courant d'azote ; on addi- t ionne le milieu d ' incubat ion (tampon MES 20 raM, pH 6,1, MnClo 5 raM) et on homogdndisc ]e m~lange par immers ion dans un bain-marie /~ u l t ra-sons pendant 5 minutes. On ajoute ensuite la suspension de mito- chondries ou de membrane mitochondria le externe et I'UDP-[~4C] N-ac6tylglucosamine.

Comportement chromatographique du polltprdnol glgcosgld (Produit P,).

Ca prodni t est chromatographi~ sur eouehe mince de gel de silice 60 F 254 (Merck), dans le solvant chloro- fo rme/mf i thanol /eau (65:25:4, en volume).

Les plaques sour observ6es par autoradiographie (films Kodak X - O mat MA).

Nous a v o n s v6rifi6 que les ac t iv i t6s p y r o p h o s - p h a t a s i q u e s et g l y c o s i d a s i q u e s ne son t p a s m o d i - fi6es sous l ' i n f l u e n c e de r i n f e c t i o n virale : ap r6s

B

i

a_ Produit P1

5 10 Temps mn

b_Produit P 2 /

5 10 Temps, mn,

FtG. 1. - - Cin~tique d'incorporation de N-ac~t!llglu- cosamine, /l partir d'UDP-IIJ, C~ N-ac~tylglucosamine, dans les milochondries prdpard.es /t partir d 'animaux tdmoins el in[ect~s.

a) Incorporat ion de N-acdtvlglucosamine sur accep- tenrs polypr~niques (P~).

• an imaux t~moins. • animaux infect~s. b) Incorporat ion de N-acdtylglucosamine dans les

glycoprot6ines (P.~). • an imaux t6moins. • an imaux infect6s. Tampon MES 20 raM, pH 6,8, MnCI_~ 5 mM, 0,8 mg de

prot~ines mitochondriales .

R6sul ta t s .

(~INETIQUES D ' INCORPORATION DE N-ACETYLGLUCOSA-

MINE DANS LES MITOCHONDRIES DE FOIE DE SOURIS

SAINES ET INFECTEES.

I,a f igure 1 m o n t r e les c i n 6 t i q u e s d ' i n c o r p o r a - t ion de N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n e su r les a c c e p t e u r s en- dog6nes p o l y p r 6 n i q u e s (fig. l a ) et p r o t 6 i n i q u e s (fig. lb ) : d a n s le cas des a n i m a u x in fec t6s , la vi- lesse et le t aux d ' i n c o r p o r a t i o n de N-ac6 ty lg luco- s a m i n e s o n t a u g m e n t 6 s ; ce t te a u g m e n t a t i o n es t

plus i m p o r t a n t e d a n s les g l y c o p r o t d i n e s m i t o c h o n - d r i a l e s que d a n s les d6r iv6s p o l y p r 6 n i q u e s .

CINETIQUES D ' INCORPORATION DE N-ACETYLGLUCOSA-

MINE DANS LA MEMBRANE MITOCHONDRIALE EXTERNE.

De la m 6 m e m a n i ~ r e , les f igures 2a ( a c c e p t e u r s l ) o l y p r d n i q u e s ) et 2b ( a c c e p t e u r s p r o t d i n i q u e s ) m o n t r e n t que l ' i n c o r p o r a t i o n de N-acd ty lg lucosa - m i n e au n i v e a u de la m e m b r a n e m i t o c h o n d r i a l e e x t e r n e est a u g m e n t d e sous l ' i n f l u e n c e de l ' i n f ec - t ion v i r a l e ; le p h d n o m b n e est p a r t i c u l i 6 r e m e n t ne t su r les a c c e p t e u r s p r o t d i n i q u e s (2b).

BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 1.

f

i8 . . • ~ 4 g.

a_Produit P1 /

7 / 2O

10

/ b_Produit P2 /

5{] Inf

5 lO(Temps mn.) § 10(Temps mn.~

FIt;. 2. - - Cin6tique d'incorporation de N-ac~tylglu- eosamine, dt partir d'UDP-[I~C] N-acdtylglucosamine, dans la membrane milochondriale externe.

a) Incorporat ion de N-ac6tylglucosamine sur accep- teurs polypr6niques (P,).

• an imaux tdmoins. • an imaux infectds. b) Incorporat ion de N-acdtylglucosamine dans les

glycoprot6ines (P2). • an imanx t6moins. • an imaux infect6s. Tampon MES 20 raM, pH 6,1, MnC1._. 5 raM, 0,3 mg de

prot6ines.

15 m i n u t e s d ' i n c u b a t i o n , il d e i n e u r e e n c o r e 80 p. c e n t d'UrDP-[I4C] N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n e dis- p o n i b l e .

Page 4: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

82 O. Galeau el coll.

COMPORTEMENTS CHROMATOGRAPHIQUES COMPARA-

TIFS DES PRODUITS P1 EXTRAITS PAn LE MI~LANGE

CHLOROFORME/METHANOL (2 : 1), DANS LE CAS DES

ANIMAUX T~MOINS ET INFECTES.

Le p r o d u i t P1, e x l r a i t p a r le m d l a n g e c h l o r o f o r - m e / m 6 t h a n o l (2:1, en v o l u m e ) a 6t6 iden t i f i6 h u n m61ange de N - a c d t y l g l u c o s a m i n y l - p y r o p h o s p h o r y l - d o l i c h o l et de N, N ' - d i a c 6 t y l c h i t o b i o s y l - p y r o p h o s - p h o r y l - d o l i c h o l [12]. Le p r o d u i t e x t r a i t d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s s u r des p r 6 p a r a t i o n s m i t o c h o n - d r i a l e s de s o u r i s i n f e c t 6 e s se r d s o u d , 6 g a l e m e n t , e n c h r o m a t o g r a p h i c , en d e u x c o n s t i t u a n t s de B~, i d e n t i q u e ( p l a n c h e I). ] . ' i n f e c t i o n v i r a l e n e p r o - v o q u e d o n c p a s la s y n t h b s e de d d r i v d s p o l y p r d n i - q u e s N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l 6 s d i f f 6 r e n t s de c e u x o b s e r v d s c h e z les a n i m a u x t d m o i n s .

v i r u s d ' u n e p a r t en d t u d i a n t la b i o s y n t h 6 s e de ces a c c e p t e u r s e n d o g 6 n e s m i t o c h o n d r i a u x d a n s le cas des s o u r i s s a i n e s et i n f e c t 6 e s et, d ' a u t r e p a r t , en u t i l i s a n t un a c c e p t e u r ex o g 6 n e de X-ac6 ty lg luco - s a m i n e , le d o l i c h o l - m o n o p h o s p h a t e .

a) Biosynthi, se des protdines.

La f igure 3 m o n t r e qu ' i l n ' y a a u c u n e d i f f 6 r e n c e d a n s les q u a n t i t 6 s de p r o t 6 i n e s s y n t h 6 t i s 6 e s p a r les p r 6 p a r a t i o n s m i t o c h o n d r i a l e s o b t e n u e s h p a r -

TABLEAU I.

ln[luence de r in fect ion virale sur la biosynthi~se mi lochondr ia le du dolichol.

Temps en minutes Animaux t6moins Animaux inleet~s

5 8 -t- 1 12 -4- 1 8 13 +- 1 13 ___~ 2

15 36 -q- 2 38 -t- 1

Plh

i

D6p6~ Q O

1 2 PLANCHE I.

Comportement chromatoffraphique des produits P~ extraits par le mdlange chloroforme/mdlhanol (2:1 en volume).

Incorpora t ion de N-ac~tylglucosamine sur accepteurs polyprdniques endog6nes.

1. An imaux t6moins. 2. An imaux infectds (50 p. cent de mortal i td) .

Chromatograph ie sur couche mince de gel de silice 60 F 254, dans le so lvant e h l o r o f o r m e / m d t h a n o l / e a u (65:25:4, en volume), et au to rad iograph ie (film Kodak X-O Mat MA).

P rodu i t PI, : N-acdty lg lucosaminyl -pyrophosphory l - doliehol.

P rodui t P,~, : N,N'-diac~tylchi tobiosyl-pyrophospho - ryldolichol.

VARIATIONS DU TAUX D'ACCEPTEURS PROTI~INIQUES ET

POLYPRENIQUES SOUS L'INFLUENCE DE L'INFECTION

VIRALE.

Le syst6me aeel lu]aire cont ient : 0,7 mg de protdines mi toehondr ia les , MgC12 10 mM en t ampon MES 20 raM, pH 6,8. Les rdsul ta ts sont exprim6s en pmoles pa r mg de prot6ines.

t i r des s o u r i s s a i n e s et i n f e c t 6 e s ; la q u a n t i t 6 d ' a c c e p t e u r s p r o t 6 i n i q u e s d i s p o n i b l e s ~t la g lyco- s y l a t i o n es t d o n c i d e n t i q u e dar t s les d e u x cas . I1 e n rd s u l t e que , c h e z les a n i m a u x in fec t6s , 1 'aug- m e n t a t i o n d ' i n c o r p o r a t i o n d e N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n e

!

,5 10 15 lemps~ ran.)

Fro. 3. - - Influence de l'infeclion virale sur la bio- synth~se des protdines dans les mitochondries.

Incorpora t ion de [~4CJ amino-ae idcs dans un systbme acel lulai re con tenan t 0,4 mg de protdines mi tochon- driales, 10 p.l d 'une solut ion ~k 1 v, C i /ml d 'hydro lysa t de protdines de chlorel les (560 v.Ci/mg, C.E.A., France).

O an i mau x tdmoins. • a n i m a u x infectds.

N o u s a v o n s u t i l i s6 d c u x a p p r o c h e s d i i f d r e n l e s p o u r c o n t r S l e r le t a u x d ' a c c e p t e u r s p r o t 6 i n i q u e s ou p o l y p r 6 n i q u e s au c o u r s de l ' i n f e c t i o n "h Myxo-

d a n s les g l y c o p r o t d i n e s m i t o c h o n d r i a l e s n ' e s t p a s d u e h u n e 616vat ion d u t a u x d ' a c c e p t e u r p r o t d i n i - que e n d o g b n e .

BIOCHIMIE, 1980, 62, n" 1.

Page 5: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

N-acdtylghtcosaminyl-transfdrase mitochondriale et infection virale. 83

b) B i o s y n t h b s e du dol ichol .

Le t a b l e a u I m o n t r e q u ' i l n ' y a p a s dc d i f f 6 r e n c e s i g n i f i c a t i v e d a n s les q u a n t i t 6 s de d o l i c h o l s y n t h 6 - t i s6es au n i v e a u m i t o c h o n d r i a l e n t r e les a n i m a u x

"7

1.8

i A.4

-~ 1.0

,~ 0.6

,,~ 0.2

5 1'3 Temps(mn

Fro. 4. - - St imulation de la biosynthbse du produit P~ par le doliehol-monophosphate exogbne.

50 ~xl de taurochola te de sodium 0,1 p. eent dans du ch lo ro fo rme /m6thano l (2:1, en volume) sont a jout6s h des quant i t6s croissantes de do l i eho l -monophospha te (Sigma). Le m41ange est 6vapor4 ~ siceit6 sons eourant d 'azote , on a joute le mi l ieu d ' i ncuba t ion ( tampon MES 20 raM, pH 6,8, MnCl~ 5 mM) et on homog6n4ise le m6- lange pa r immers ion darts un b a i n - m a r i e h u l t ra - sons pendan t 5 minutes . On a jou te ensui te la suspension de mi tochrondr ies et l ' i neuba t ion est r6alis6e h 37°C apr6s addi t ion d'UDP-[14C] N-acdtylglueosamine (80 pmotes).

• sans addi t ion de do l ieho l -monophospha te ; addi- t ion de • 14 nmoles, • 20 nmoles, • 30 nmoles de doli- chol -monophosphate , respeet ivement .

a .

.~1.5

• ; 0,5

5 10 Temps(mnl

F16. 5. - - Cin~tique d'incorporation de N-acJtylgtu- cosamine dans le produit P~, en presence de dolichol- monophosphate exog~ne (20 nmoles), dans les milo- chondries entibres pr6par~es d partir des animaux t~;moins et infectds.

Animaux t6moins : • sans do l icho l -monophospha te ; © 20 nmoles de dol ichol -monophosphate .

Animaux infect6s : • sans do l icho i -monophospha te ; 20 nmoles de dol ichol -monophosphatc .

t 6n to ins ou i n f ec t6 s au b o u t de 8 m i n u t e s d ' i n c u - ba r ton , b i e n (lue d a n s les c i n q p r e m i 6 r c s m i n u t e s , la b i o s y n t h 6 s e so i t s i g n i f i c a t i v e m e n t s t i m u l 6 e chez les a n i m a u x in fec t6s . Nous a v o n s vg*rifi6 d a n s lcs deux cas, que le p r o d u i t s y n t h 6 i i s ( ~ in vi tro, h p a r -

t i r d ' a c i d e - i s o p e n t ~ n y l - p y r o p h o s p h o r i q u e a v a i t le m 6 m e c o m p o r t e m e n t c h r o u m t o g r a p h i q u e que le d o l i c h o l de r ~ f ~ r e n c e .

s) A d d i t i o n de d o l i c h o I - m o n o p h o s p h a t e exog~ne a u x sys tbmes acel lulaires de g l ycosy la t i on m i t o c h o n d r i a u x .

La b i o s y n t h ~ s e de s p o l y p r ~ n o l s g l y c o s y l 6 s est s t i m u l ~ e p a r a d d i t i o n de q u a n t i t ~ s c r o i s s a n t e s de d o l i c h o l - m o n o p h o s p h a t e , ce qu i i n d i q u e q u e le t a u x d ' a c c e p t e u r p o l y p r 6 n i q u e e n d o g ~ n e est l i m i - t a n t d a n s les p r 6 p a r a t i o n s m i t o c h o n d r i a l e s (fig. 4). Des r 6 s u t t a t s c o r n p a r a b l e s de s t i m u l a t i o n p a r le d o l i c h o l - m o n o p h o s p h a t e s o n t o b t e n u s a v e c la m e m b r a n e m i t o c h o n d r i a l e e x t e r n e .

La f igure 5 m o n t r e que l ' a u g m e n t a t i o n d ' i n c o r - p o t a t i o n de . V - a c ~ t y l g l u c o s a m i n e d a n s les p o l y p r ~ - no ls es t p l u s i m p o r t a n t e d a n s le cas des a n i m a u x i n f e c t 6 s b i e n que l ' o n so i t e n p r e s e n c e d ' u n e q u a n - t i t6 s a t u r a n t e d ' a c c e p t e u r s exog~nes .

Discussion.

L ' i n f e c t i o n p a r M y x o v i r u s e n t r a i n e u n e m o d i f i - c a t i o n de l ' i n c o r p o r a t i o n de N - a c O y l g l u c o s a m i n e su r les a c c e p t e u r s p o l y p r 6 n i q u e s (P1) e t p r o t 6 i n i - ques (P2) e n d o g ~ n e s . Ce p h 6 n o m b n e es t o b s e r v 6 d a n s les m i t o c h o n d r i e s e n t i b r e s (fig. 1) c o m m e d a n s la m e m b r a n e m i t o c h o n d r i a l e e x t e r n e (fig. 2); la v i t e s s e et le t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n de N-ac6 ty l - g l u c o s a m i n e son t a u g m e n t 6 s sous l ' i n f l u e n c e de l ' i n f e c t i o n v i r a l e ; c e t t e d i f f 6 r e n c e est p l u s i m p o r - t a n t e d a n s le cas de la g l y c o s y l a t i o n des p r o t 6 i n e s (P2). On n ' o b s e r v e a u c u n e m o d i f i c a t i o n des e n z y m e s de d 6 g r a d a t i o n des s u b s t r a t s des g lyco- s y l - t r a n s f 6 r a s e s . Le c o m p o r t e m e n t du s y s t b m e se d i s t i n g u e d o n c s e n s i b l e m e n t de ce qu i a 6t6 d 6 c r i t d a n s le cas des v i r u s o n c o g b n e s . E n effet , Boss- m a n n et al. E7, 171 et d ' a u t r e s a u t e u r s El8] o n t o b s e r v 6 de s c h a n g e m e n t s s i g n i f i c a t i f s d a n s le t a u x des g l y c o s y l n u c l 6 o t i d e s p y r o p h o s p h a t a s e s , s a n s a p p o r t e r d ' i n t e r p r 6 t a t i o n h ce p h 6 n o m ~ n e .

Le p r o d u i t P1 se r 6 s o u d p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n u n m61ange de N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l - p y r o p h o s - p h o r y l - d o l i c h o l ct de N , N ' - d i a c 6 t y l c h i t o b i o s y l - p y r o p h o s p h o r y l - d o l i c h o l d a n s lc cas des a n i m a u x t 6 m o i n s c o m m e d a n s le cas des a n i m a u x i n f e c t 6 s : l ' i n f e c t i o n v i r a l e n ' e n t r a i n e d o n c pa s la s y n i h b s e de p o l y p r ~ n o l N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l 6 n o u v e a u ( P l a n c h e I).

BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 1.

Page 6: N-acétylglucosaminyl-transférase mitochondriale en relation avec l'infection virale

84 O. Gateau el coll.

Cette a u g m e n t a t i o n d ' i n c o r p o r a l i o n de N-ac~ty l - g l u c o s a m i n e d a n s le c a s des s o u r i s i n f e e t ~ e s p o u r - r a i l s ' e x p l i q u e r p a r l ' e x i s t e n c e d ' u n e q u a n t i t ~ p lu s i m p o r t a n l e d ' a c e e p t e u r s . E n effet , d a n s un t ou t a u t r e d o m a i n e , la d i f f ~ r e n c i a t i o n des i i s sus d ' o v i d u c t e de Pou le , L u c a s et al. [19~ on t o b s e r v ~ u n e a u g m e n t a t i o n du t a u x de d o l i c h o l - m o n o p h o s - p h a t e e n d o g ~ n e . Or, n o s r ~ s u l l a t s d O n o n l r e n t l ' a b s e n c e de m o d i f i c a t i o n en ce qu i c o n c e r n e la b i o s y n t h ~ s e des a c c e p t e u r s p r o t ~ i n i q u e s et po ly - p r ~ n i q u e s (fig. 3 et t a b l e a u I), a lo r s que l ' on sa i l la p o s s i b i l i t 6 d ' u n e b i o s y n t h ~ s e i m p o r t a n t e de d o l i e h o l au n i v e a u m i t o c h o n d r i a l [20] : l ' i n f e c t i o n v i r a l e es t s a n s effet s u r elle.

S ' i l en O a i t a u t r e m e n t , l ' a d d i t i o n de d o l i c h o l - m o n o p h o s p h a t e au s y s t ~m e m i t o e h o n d r i a l d e v r a i t c o n d u i r e h la b i o s y n t h ~ s e d ' u n e m ~ m e q u a n t i t 4 de p o l y p r ~ n o l N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l d (P1) d a n s les d e u x cas. Or, p o u r u n e q u a n l i t ~ s a t u r a n t e de doli- c h o l - m o n o p h o s p h a t e (20 n m o l e s ) le r a p p o r t e n t r e l ' i n c o r p o r a t i o n de N - a c ~ t y l g l u c o s a m i n e d a n s le p r o d u i t P1 c h e z les a n i m a u x i n f e c t ~ s et c h e z les a n i m a u x t ~ m o i n s , p o u r 5 m i n u t e s d ' i n c u b a t i o n , es t de 2,1, ce q u i s i gne u n e a u g m e n t a t i o n de la seu le ac t i v i t~ de g l y c o s y l a t i o n an c o u r s de l ' i n - f e c t i o n v i r a l e . D ' a i l l e u r s , H a r f o r d et al. [213 en ~ t u d i a n t la s y n t h ~ s e de m a n n o s y l - p h o p s h o r y l - d o l i - c h o l d a n s la m a t i ~ r e b l a n c h e du c e r v e a u , e n t r e des a n i m a u x a d u l t e s et des a n i m a u x j e u n e s en p l e i n e p h a s e de m y 6 1 i n i s a t i o n , on t o b s e r v e , eux auss i , u n e d i f f 6 r e n c e d ' a c t i v i t ~ e n z y m a t i q u e de g l y c o s y l a t i o n , s a n s a u c u n e m o d i f i c a t i o n des q u a n - t i t~s d ' a c c e p t e u r s .

L ' i n f e c t i o n p a r M y x o v i r u s e n t r a l n e d o n c , a u n i v e a u m i t o c h o n d r i a l , u n e a u g m e n t a t i o n n e t t e de l ' a c t i v i t ~ N - a c O y l g l u c o s a m i n y t - t r a n s f 6 r a s i q u e , tou- c h a n t h la fo is la g l y c o s y l a t i o n des p r o t ~ i n e s et des p o l y p r ~ n o l s .

Remerciements.

Ce travail a bdn~ficid de l'aide du Centre National de la Recherche Scientifique (ERA-CNRS 562), de l'Ins- t i tut National de la Santd et de la Recherche Mddicale (FRA 28 et U. 189 ; CRL 77.1.085.3), de la Direction des Recherches, Etudes et Techniques (ConDention 78.152), de la Fondation pour la Recherche Mddicale Franfaise, de l'Association Franfaise de Lutte contre la Muco- viscidose, et de l'Universitd de Lyon (Facult~ de Mdde- cine Lyon-Sud).

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