Voies de signalisation et Mécanismes de toxicitéComment detecte-t-on le signal toxique?

Comment ce signal est il transmis?

Octobre 2011 Master 2 de Toxicologie

UE 2 Mécanismes d’action des toxiques

Robert BaroukiINSERM UMR-S 747

Université Paris Descartes Paris France

Notion de Stress

Exemples

La notion de stress

Origine du mot�Physique: réponse d’un métal à la déformation�Physiologique: ensemble de réponses à une situation extrême (Selye: adrénaline)

�Cellulaire: réponse de la cellule à une agression�Psycho-sociologique: manifestations comportementales ou clinique chez un individu ou une population

Le stress est une réponse adaptative à une situationextrêmeCette réponse a un coût

Différents types de stress cellulaires

�Stress conformationnel: thermique, réticulumendoplasmique

�Stress osmotique�Stress oxydant�Stress chimique ou stress d’exposition auxxénobiotiques

�Stress hypoxique�Stress nutritionnel (jeûne)�Stress mécanique: étirement (muscle) cisaillement (shear stress, vaisseaux)

Stress d’Exposition aux Xénobiotiques

Xénobiotique

Enzymes et transporteurs:Métabolisme et sortie

O-Conj

Récepteur:Détection et induction

élimination

Bénéfice: élimination de molécules potentiellement toxiquesCoût: intermédiaires toxiques; stress oxydant

Stress par cisaillement (shear stress)

- Stress impliqué dans les maladies cardio-vasculaire s- Flux affectant les cellules endothéliales- les effets cellulaires et pathologiques dépendent de la nature du flux:

- flux régulier: favorise la différenciation des cellules endothéliales; induit les gènes protecteur s anti-oxydants, SOD, GPx, HO1 (mécanisme?)

- flux irrégulier: stress oxydant

- Comment ce stress provoque-t-il un stress oxydant?- oxydases- induction de CYP

• Intervient dans de nombreuses situations physiologiqu es et pathologiques:développement, angiogenèse, maladies cardio-vasculai res, neurologiques,cancer

• Activation de 1) la glycolyse anaérobie, 2) la vasod ilatation, 3) l’angiogenèse, 4) l’hématopoïèse

• Induction de gènes cibles: 1) glycolyse, Glut, 2) NO -Synthase, 3) VEGF, 4) EPO (érythropoïétine)

• Médiateur: Facteur de transcription : HIF-1 αααα et HIF-1ß

• Protéine HIF-1 αααα stabilisée par l’hypoxie

• Active la transcription de plus de 70 gènes

Stress hypoxique Découverte de HIF-1 �

19921992--1995 1995 Gène EPO activé par l’hypoxieAnalyse du promoteur et identification du facteur l iant le HRE

Forme avec HIF-1ß un hétérodimère, facteur de transc ription90% d’homologie entre souris, rat et homme

Formation de l’hétérodimèreLiaison à l’ADN

Transactivation

Dégradation de HIF-1 � en normoxie

Normoxie : Demi-vie < 5 min * Hydroxylation des Prolines 402 et 564 par

les PHD (Prolyl Hydroxylase-Domain protein)* Acétylation de la Lysine 532 par

ARD1 (Acetyltransferase)* Hydroxylation de l’Asparagine 803 par

FIH-1 (Factor Inhibiting HIF-1)

von Hippel-Lindau

VHL (von Hippel-Lindau)

Maladie rare, la maladie de Von Hippel-Lindau est caractérisée par la présence d’hémangioblastome du cervelet, de la moelle épinière ou d’angiome de la rétine. En raison de la fréquence des manifestations cancéreuses dans cette pathologie, on peut parler de cancer héréditaire dans cette pathologie.

Mutation du gène VHL se situant sur le locus p25 p26 du chromosome 3. Il existe plus de 200 mutations connues du gène pouvant entraîner une maladie de Von Hippel-Lindau. La protéine codée par ce gène a un rôle important dans la formation des vaisseaux.

Protéine de reconnaissance d’une E3 ubiquitin ligas eTumeurs fortement vascularisés

Stabilisation de HIF-1 � par l’hypoxie

Hypoxie : Demi-vie de plusieurs heures* Diminution des hydroxylations (O 2 substrat de PHD et FIH-1)* Pas de dégradation* Activité transcriptionnelle

von Hippel-Lindau

Maladies et stress conformationnels

De nombreuses pathologies sont associées à une mauva ise conformation protéique:

-maladies neurodégénératives-maladies à prion-amyloses-certaines maladies génétiques (stress ER, muco, a1 anti-trypsine)-causes toxiques: stress oxydant., adduits aux prot éines..-cancer: p53

Intracellular conditions that damage cell proteins

-Temperature of 37 °°°°C or higher (denaturing conditions).

-Many reactive small molecules — these cause oxidatio n, deamidation, glycation or nitrosylation.

-Many enzymes that modify proteins, for example prote ases or kinases.

-High salt concentrations (which favour dissociation of multimers)

-Many fatty acids, which act like detergents.

-Other unfolded proteins — nascent polypeptides, damage d or mutant polypeptides and insoluble inclusions are sticky.

Conclusion: to maintain a protein's function, avoid the intracellular milieu.

Maladies et stress conformationnels

-Rôle des petits aggrégats par rapport aux grands

-Rôle de la localisation des aggrégats: extra-cellula ire,cytosolique, nucléaire, dans le réticulum

-Conséquence: surcharge du protéasome; des dépôts cytosoliquesou nucléaires peuvent indirectement entraîner un stres s du RE

-Rôle thérapeutique des HSP (ex: surexpression de la synucléine chez la drosophile; la surexpression de hsp70guérit la mouche parkinsonnienne mais ne dissout pas les Aggrégats)

- Thérapeutique conformationnelle

Prot mal conformée

HSFHSP70

Hdj1

Prot native

Régulation de la HSP70 par les protéines mal confor mées

Un exemple de signalisation

stress oxydant

Régulation redox de cJUN (complexe AP1)

SH

transactivation liaison ADNCys 272

SOH2, SO2H, S-SX

oxydant

SH

Ref1, TRX

LIAISON à l’ADN

+

-

+

Réparation des protéines oxydées:Rôles de Ref-1 et de la Thiorédoxine

FTSOx

FTSH

FTSH

FTSOx

Ref-1 SH Ref-1 SOx

Trx SHSH

Trx SHSH

Trx SS

NADP+

NADPH

Trx réductase

ERO

Trx SS

Comment s’adapter?

Régulation de cJUN par les kinaseset les phosphatases

Ser Ser Ser SerThr

GSK3, CKIIJNK

phosphatase

Liaison ADNtransactivation

EROTPA

TPA

Régulation de JNK par le stress oxydant

Complexe JNK-cJun-GSTπ

PP

JNK

cJun

GSTπ

SS

SS

stressoxydant P

P

Adler et al, 1999, EMBO J, 18: 1321

cJun actif

PP

Toxicologie

Bases biologiques de la détection et de la réponse

Disciplines scientifiques

� Epidémiologie: étude des populationslien entre un contaminant et une pathologie

� Toxicologie: mécanismes biologiquesmarqueurs, modèles, prédiction

� Écologie et expologie: sources et exposition

� Sciences humaines et sociales: perception et implications

� Analyse et gestion des risques

Environnement: les familles de suspects

-Agents Physiques: Rayonnements ionisants; Radon; uv; rayonnements électromagnétiques, température

-Agents biologiques: virus, bactéries, parasites, prion

-Agents classés par familles chimiques:- Hydrocarbures aromatiques polycycliques (Benzopyrène)- Benzène- Organochlorés et organobromés (pesticides, dioxine, PCB, polybromés)- Amines aromatiques- Organophosphorés (sarin, chlorpyrifos)- Fibres: amiante- Métaux lourds- Toxines (aflatoxines)- Mélanges: tabac, particules fines, goudrons

Stress d’exposition aux xénobiotiques

L’exposition à un xénobiotique (polluant, contaminan t, médicament, souvent hydrophobes) entraîne un stress cellulaire: phénomène a daptatif à une situation extrêmeCe stress vise à rendre le xénobiotique plus hydrophile et à l’éliminer par les urines

Xénobiotique

Enzymes et transporteurs:métabolisme et sortie

O-Conj

Récepteur:Détection et induction

élimination

Le paradoxe du stress des xénobiotiques:Intoxication due à la détoxication

Xénobiotique

OH

Phase I

CYP

Phase II Phase III

O-ConjO-ConjGST UGTMDR MRP

Récepteur

Réactivité nécessaire à la transformation et à l’élimination

Cette même réactivitéest à l’origine des effetstoxiques

Toxicité à long terme liée à la succession de phénomènes adaptatifs à court terme

time

exposure direct toxicity

adaptation

Side effects

��residual direct toxicitythreshold?

��side effectsthreshold?

Adaptation à un monde chimique diversifiéPropriétés des EMX

Complexité et diversité de l’univers chimiqueEconomie de l’adaptation

Apport de la biologie structurale et de la modélisation

100 000molécules chimiques

20 CYP 3 récepteurs

Deux substratsdu CYP3A4

Le système de détoxication et toxiques récents

� système ancien bien adapté aux toxines naturelles

� adapté aux toxiques hydrophobes et réactifs

� semble moins efficace pour les toxiques polyaromatiqueshalogénés (HAH).

� production industrielle des HAH: pesticides, isolants, ignifugesdérivés de combustion…

� le système de détoxication est sans doute moins bien adapté à certains toxiques « modernes »

CYP et grandes voies d’induction par les NR

AhR

CYP1

PXR - CAR

CYP2 - CYP3

PPAR

CYP4

Xénobiotiques

Métabolisme des xénobiotiquesmolécules endogènes.

Perturbateurs endocriniens =

ER

Influence des mélanges de xénobiotiques ?

l Récepteurs nucléaires liant des xénobiotiques� PXR: pregnane X receptor� CAR: constitutive androstane receptor� PPAR: peroxisome proliferator activated receptor

� RXR: retinoid X receptor� ER: récepteur aux estrogènes

Récepteurs des xénobiotiques de la famille des récepteurs Nucléaires

Généralités

37%A/B D F63%

77%A/B D F96%

LBD (E)A/B D FDBD (C)h PXR

45%A/B D F66%h CAR

h VDR

m PXR

Transactivationindépendantedu ligand (AF1)variable, peu conservé

liaisonADNdimérisationdoubleZn finger

CharnièreflexibilitéNLS

liaison du ligand, dimérisationliaison coactivateur/corépresseurtransactivation dépendante du ligand (AF2)

Necela, B. M. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:39279-39288

Zinc finger Interaction du DNA Binding Domain avec l’ADN

Etat de repos des récepteurs nucléaires

En absence de ligand, le récepteur peut être nucléaireou cytoplasmique

Le récepteur peut être lié parfois à des protéines chaperones(Hsp90)

Le récepteur peut exister sous des états de phosphorylation différents selon qu’il est lié ou non au ligand

Le récepteur peut être lié à des co-répresseurs en absence deligand

S Khorasanizadeh et al, 2001, TIBS, 26, 384-390

Elément de réponse DNA des récepteurs nucléaires

HRE: hormone responsive element

PXR

PXR à l’état basalnucléaireconstitué de deux domainesprincipalement exprimé dans le foie et dans l’intestin grêleLigands du PXRendogènes : acide biliaire (acide lithocholique) � moyen de défense contre les acides biliairesexogènes : nombreux xénobiotiques (rifampicine, hyperforin)Gènes ciblesenzymes du métabolisme des xénobiotiques : CYP 3A4, CYP 2B6,UDP-glucuronosyltransférasetransporteurs membranaires de métabolites : MDR-1, MRP-2…

Structure schématique du PXR

PXR

DBD

LBD

NLS

1 107 140 428 43410 Hélices α et 1 feuillet β

Caractéristiques de la poche de liaison du ligand du PXR

Ligand: hyperforin

*Poche très large > 1100 Ǻ 1600 Ǻpar ouverture d’une constriction dans la 2ème cavité liée à une boucle flexible (aa309-321)*Poche très hydrophobe (20/28 aa)*Boucle hydrophobe à l’extérieur de lacavité qui fait le premier contact avec le ligand

=> Large gamme de ligands

R E Watkins et al, 2003, Biochemistry, 42, 1430-1438

Flexibilité de la poche du PXR

SR13812hypocholestérolémiant

Hyperforinantidépresseur

Région mobile en pseudo-hélice

1280 Å

1544 Å

Sans ligand1294 Å

R E Watkins et al, 2003, Biochemistry, 42, 1430-1438

RXR

CYP3A4

P-gpautres gènes

RXR

rifampicine

PXRPXR

PXR

XREM

Voie de transduction de PXR

XREM: xenobiotic responsive element modulator:DR3: AGGTCAnnnAGGTCAER6: AGGTCA nnnnnnTGACCT

Toxicologiesystémique

Les OMIQUES

Génomique structuralegénome

transcriptome

protéome

métabolome

physiome

Proté omique

Métabol omique

Transcript omique

ADN

Protéine

Métabolite

ARN

Apports fondamentaux des OMIQUES

� Epigénétique et régulation des gènes � Epissage des ARNm� Dégradation des ARNm

� Stabilité des protéines � Régulation post traductionnelle� Interactions protéine-protéine

� Réseaux de voies métaboliques

� Biologie de systèmes

Génomique fonctionnelle

Protéomique

Métabolomique

La Biologie de Systèmes

But: construire un modèle complet intégrant la génomiqueprotéomique, métabolomique

Etre aussi quantitatif que possible

Prédire les conséquences de perturbations dans le système

Peut être plus focalisée: réseau de régulation des gènesréseau d’interactions protéiquesvoies métaboliques….

La pensée systémique

La cellule, le tissu et l’organisme sont considérés comme des systèmes définis par leur organisation, donc par les relations ou interactions dynamiques entre les éléments

Énumérer et décrire les éléments d ’ un système/machine ne permet pas d ’ en comprendre le fonctionnement

C ’ est en s ’ intéressant à l ’ ensemble des interrelations des éléments que l’on comprendra comment fonctionne ce système/machine

-Regrouper les gènes selon leurs modes de régulation: ceux qui sont régulés de manière similaire ont des fonctions probablement proches

-Compilation de 553 expériences de transcriptome (17000 gènes environ)

-Corrélation Pearson: distance des gènes en 2d calculée selon leur co-régulation

-La 3ème d reflète le nombre de gènes par surface

Exemple 1: compilation de 553 expériences detranscriptomique dans C elegans

Exemple 2: pourquoi étudier l’interactomeprotéine-protéine

génomeprotéome

interactome

650 000 interactions (Stumpf 2008)

25 000 gènes 250 000 protéines

complexité

La complexité biologique des organismes n’est pas reflétée par le nombre de gènes mais par le nombre de protéines et d’interactions physiologiques.

Interactome, suite

Nœud « node »

Arc « edge »

Les données d’interactomique peuvent être représentées sous la forme de graphe. L ’ analyse (mathématique et informatique) de ces graphes peut constituer un outil de choix pour la compréhension de l ’organisation des réseaux d’interaction et du fonctionnement cellulaire.

Interactome, suite Interactome, suite

Il existe des modules au sein des réseaux d’interaction

Certains modules sont plus importants que d’autres

Interactome, différents types de hubs

Party hubs: interactions nombreuses simultanées

Date hubs: interactions multiples transitoires

Biologie systémique en toxicologie: une approche gl obale