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264 BIOCH'IMICA ET BIOPHYSICA ACTA BBA 25 r2 3 O-MI~THYLATION DU GUANIDOt~THYL PHOSPHATE EN OPHELINE (GUAN I DOI;.2TH YLMt~]TH Y L PHOSPHATE) CHEZ OPHELIA NEGLECTA S. N.y. THOAI, Y. ROBIN E'r C. AUDIT l.aboratoire de Biochimie gdn~rale et comparde, Coll~ge de France, Paris, et Laboraloire de t3iologie marine, Concarneau (France) (]lequ le 1O Mars, z964) SUMMAt~Y O-methylation of guanidoethyl phosphate into opheli~e (guanidoethylmethyl /)hosphate) in Ophelia ne.glecta Schneider The origin of the methyl group of opheline (guanidoethylmethyl phosphate), new biological monosubstituted guanidine isolated from a marine Polychaeta, Ophelia neglecta, was investigated from various methyl donors through isotopic studies in vivo and in vitro. 6 and z4 h after intra-coelomic injection to the worms of L-[Me-X~CJmethionine, radioactive ophelinc was isolated from the tissues, the whole of this radioactivity being localized in the muscle fraction. In similar conditions, no incorporation was observed from [14C~formate, i2-14C acetate, D-E~4Ce2glucose or [Me-l~Cjcholine. In another series of experiments, acellular extracts of muscle and tractus were incubated with labeled methionine and guanidoethyl phosphate or aminoethyl phos- phate, with or without ATP. Formation of radioactive opheline was observed only in presence of muscle extract, and when methionine, guanidoethyl phosphate and ATP were together present in the incubation mixtures. From the above data, we can conclude that the biosynthesis of opheline occurs in 0. neglecta muscle through transfer of the methyl group of methionine on the phos- phoric group of guanidoethyl phosphate. The ATP-dependence of the reaction, as shown by the essays in vitro, suggests the intermediary formation of S-adenosvl- methionine. INTROI)UCTION L'oph~line (acide guanido6thylm6thyl phosphorique), nouvelle guanidine monosub- stitu~e biologique isol~e d'une Ann~lide Polychbte marine, Ophelia neglecta Schneider ~, est 6galement un d6riv6 m6thyl6 d'un type nouveau: son groupement m6thyle est en Abr6viations: GEP, acide guanido6thyl phosphoriquc; A EP, acide amino~thyl phosphorique; GEMP, acide guanido6thylm6thyl phosphorique (oph61ine); AEMP, acide amino6thylm6thyl phosphoriquc. Biochim. Biophys...tcla, 93 (I904) "t'4-27t

O-méthylation du guanidoéthyl phosphate en ophéline (guanidoéthylméthyl phosphate) chez Ophelia neglecta S

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264 BIOCH'IMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 25 r2 3

O - M I ~ T H Y L A T I O N DU G U A N I D O t ~ T H Y L P H O S P H A T E E N O P H E L I N E

(GUAN I DOI;.2TH YLMt~]TH Y L P H O S P H A T E )

C H E Z OPHELIA NEGLECTA S.

N.y. THOAI, Y. ROBIN E'r C. AUDIT

l.aboratoire de Biochimie gdn~rale et comparde, Coll~ge de France, Paris, et Laboraloire de t3iologie marine, Concarneau (France)

(]lequ le 1O Mars, z964)

SUMMAt~Y

O-methylation of guanidoethyl phosphate into opheli~e (guanidoethylmethyl /)hosphate) in Ophelia ne.glecta Schneider

The origin of the methyl group of opheline (guanidoethylmethyl phosphate), new biological monosubsti tuted guanidine isolated from a marine Polychaeta, Ophelia neglecta, was investigated from various methyl donors through isotopic studies in vivo and in vitro.

6 and z4 h after intra-coelomic injection to the worms of L-[Me-X~CJmethionine, radioactive ophelinc was isolated from the tissues, the whole of this radioactivity being localized in the muscle fraction. In similar conditions, no incorporation was observed from [14C~formate, i2-14C acetate, D-E~4Ce2glucose or [Me-l~Cjcholine.

In another series of experiments, acellular extracts of muscle and tractus were incubated with labeled methionine and guanidoethyl phosphate or aminoethyl phos- phate, with or without ATP. Formation of radioactive opheline was observed only in presence of muscle extract, and when methionine, guanidoethyl phosphate and ATP were together present in the incubation mixtures.

From the above data, we can conclude that the biosynthesis of opheline occurs in 0. neglecta muscle through transfer of the methyl group of methionine on the phos- phoric group of guanidoethyl phosphate. The ATP-dependence of the reaction, as shown by the essays in vitro, suggests the intermediary formation of S-adenosvl- methionine.

INTROI)UCTION

L'oph~line (acide guanido6thylm6thyl phosphorique), nouvelle guanidine monosub- stitu~e biologique isol~e d'une Ann~lide Polychbte marine, Ophelia neglecta Schneider ~, est 6galement un d6riv6 m6thyl6 d'un type nouveau: son groupement m6thyle est en

Abr6viations: GEP, acide guanido6thyl phosphoriquc; A EP, acide amino~thyl phosphorique; GEMP, acide guanido6thylm6thyl phosphorique (oph61ine); AEMP, acide amino6thylm6thyl phosphoriquc.

Biochim. Biophys...tcla, 93 (I904) "t'4-27t

0 - M E T H Y L A T I O N DU GUANIDOI~,THYL P H O S P H A T E 265

effet fix~ non comme on l 'observe le plus souvent dans les tissus animaux star une fonction soufrde ou azot6e mais sur un oxhydrile d'un radical phosphorique.

H N = C ( N H 2 O O p h 6 1 i n e II

\ N H - C H z - C H 2 - O - P - O - C H 3 t

O H

Ce dernier caract~re diffdrencie l'oph~line des autres d6rivds 0-m6thyl~s biolo- giques animaux (d~riv~s 0-mfthyl6s de l'6pin6phrine et autres cat6chols, de la sdroto- nine, de l'acide xanthur6nique, etc.) ou vdg6taux (divers alcaloides, lignine, flava- noides), dont le groupe m6thyle est toulours fix6 sur un oxhydrile pMnolique d'un noyau aromatique ou d'un h~t6rocycle, et dont le mode de formation ne pouvait donc nous renseigner que tr~s imparfai tement sur celui de l'ophdline.

II nous a paru int6ressant de rechercher l'origine du groupement m6thyle de l'oph~line ~ partir de divers agents mdthylants et d'dtudier le mdcanisme de la r~action chez 0. neglecta au moyen d'essais isotopiques in vivo et in vitro.

MATI~RIEL ET MI~THOI)ES

Les vers marins 0. neglecta S. employ6s dans ce travail ont fit6 r6coltds dans la bale de Terenez (Nord-Finist+re) et dans celle de Concarneau (Sud-Finistfre). Les animaux peuvent ~tre conserves pendant quelques jours dans de l'eau de mer dans une chambre froide b. =- 4 °.

l.a L-[Me-l*C!mdthionine, le [l*C]formiate de sodium, le [2-14C]ac6tate de sodium, et le l)-r~14C6]glucose ont 6t~ fournis par le C.E.A. (Saclay, France). La [Me-14C!choline a ~td obtenue du Radiochemical Centre (Amersham, Grande-Bretagne).

Les acides amino~thyl phosphorique, guanido6thyl phosphorique et guanido- 6thylm~thyl phosphorique (oph61ine) ont 6td svnth6tis~s comme il a dt6 indiqu~ prdc6demment 1. L'acide amino6thylm6thyl phosphorique a fit6 obtenu par action de l'iodure de m~thyle sur le sel monoargentique de l'acide amino~thyl phosphorique.

La DL-m6thionine et I 'ATP ~taient d'origine commerciale.

Traitement des animaux et preparation des extraits

Essais in vivo: Les substrats radioactifs ont dt~ mis en solution dans l'eau de mer et administr6s aux animaux par injection intraeoelomique, l'aiguille ~tant intro- duite par l'orifice anal. Pendant la durde de l'exp~rience, les animaux ont ~t6 places dans de l'eau de mer, dans une chambre froide "~ -! 8 ~. Le protocole des essais est sch6matis6 dans le Tableau I.

T A B L E A U I

SCHI~MA DE L'ADMINISTRATION DES SUBSTRATS MARQUI~S AU IIC AUX O. neglecta

Radioactit.itd Radioactivztc Lot Nombre Poids du lot SulJstrat admimstrd sp/ci f i q m " administrde Temps d','xp. P. 'o. d'ammaux {g) ( mC /m,'¢l : par lot { I~C)

1 8 I l ~ t4C~Formia t e - ,0.83 3 ° 6 2 8 I i D- [I'ICsT.G I u c o s e 45 .0 3 ° 6 3 8 12 [Me-VtC~Chol ine 37 .6 3 ° t~ 4 8 x I L- [.Me-14C j M 6 t h i o n i n e 6. 3 3 ° 6 5 I o i 8 L- [Me-t4( '~ M6t h i o n i n e 0 .3 4 ° 24 6 x o 18 ,~2-1~C" A c d t a t e i o .o 4 ° 24

Biochim.. Biophys..4cta, 93 ( t 9 6 4 ) 2 0 4 - 2 7 1

266 N . V . THOAI, Y. ROBIN, C. AUDIT

,'a la fin des essais, les animaux ont dt6 sacrifi6s et les tissus ont dt6 extraits en vue d'isoler l'oph~line et d 'dtudier sa radioactivitd. Pour les lots I "5. 4, les tissus (muscle et tractus) ont 6td extraits ensemble; pour les lots 5 et 6, les muscles et les t ractus ont dt~ sdpar6s et trait6s isoldment. Les tissus 6taient pesds, broy6s an mortier avec sable et extraits par 3 vol. d 'acide ac6tique "a 2 % ; les homogdnats dtaient chauff6s 5 rain au bain-marie bouillant et centrifug6s, les r~sidus dtaient r~extraits 2 fois/1 chaud avec, "a chaque fois, I vol. d'acide, acdtique 1%, et les liquides surna- geant dtaients r~unis.

Essais in vitro: Les prdparations enzymat iques utilis6es 6taient soit des homo- g~nats de l 'ensemble des tissus (muscle et tractus), soit des extraits acelhfiaires de muscle on de t ractus s~pards. Les homogdnats ont 6t~ obtenus en broyant les tissus (muscle -:- tractus) au mortier avec 3 vol. de tampon phosphate de potassium o.oo5 M de pH 7.2 et en passant l 'homogdnat /t t ravers une 6paisseur de, gaze pour ~liminer les gros d6bris cellulaires. Les extraits acellulaires ont ~t~ obtenus en broyant les muscles aw~.c 7.5 vol. et les t ractus avec 3 vol. de tampon phosphate de potassium o.oo5 M de pH 7.2 et en centrifugeant les prfiparations apr~s 5 min &agitat ion ~ o ~.

I. 'activit~ m~thyltransfdrasique des pr@arat ions enzymat iques vis-/l-vis de la L-[Me-~4C!mfthionine comme donateur de m6thyle et du GEP ou de I ' A E P comme accepteurs a dt~ essay6e dans diverses conditions expdrimentales d~crites dans le Tableau I I I .

La dfiprot~inisation des extraits a dt6 effectu(3e en fin d ' incubat ion par addition "a chaque essai (vol. 4 ml) de o.4 ml d 'acide ac6tique 2 M et chauffage 5 min it IOO: ; apr~s centrifugation, les rdsidus dtaient lavfis 2 fois "a chaud avec 2 ml d 'acidc acdtique o.2 M et les liquides surnageants 6taient rdunis.

lsolement du GEMP (ophdline) et de l'A E M P et mesure de la radioactivitd des produits isolds

Le GEMP et I 'AEMP ont dt6 isol6s des extraits gr/tce ~ l 'emploi de colonnes de Dowex 5o-X(2 H+); cette r~sine ne fixe p a s c e s d~riv~s, qui sortent dans l'effluent aqueux, mais elle freine leur passage de telle sorte que, si l 'on recueille l'effluent par fractions correspondant an volume de r6sine employ6e, I 'AEMP sort dans la seconde et la moitic! de la troisi~me fraction et le GEMP, moins acide done plus for tement retenu, dans les 4~me, 5¢?me et 6~me fractions. Le GEMP (ophdline) a dtfi dtudi6 clans tous le s essais in vivo et in vitro; I 'AEMP n 'a ~t~ dtudid que dans le dernier essai in vitro (Tableau I I I, pr6paration 3).

].es extraits provenant des essais in vivo des lots I /t 4 ont dt~ passes sur des colonnes de 5 ° ml (37-5 , 1.3 cm) de Dowex 5o-X (2 H ¢ IOO-2oo mesh); ils avaient dt6 concentr~s sous vide it un volume de 25 ml avant d'~3tre filtr6s sur la rdsine. Les extraits provenant des essais in vivo des lots 5 et 6 et des essais in vitro ont 6t6 passds sur des colonnes de 3 ° ml (3 ° > 1.23 cm) de 1~, m~me r6sine; ils ont 6td filtrds sur la rdsine sans concentrat ion prdalable. Les colonnes dtaient ddvelopp6es /t l 'eau et les effluents dtaient recueillis sur un collecteur de fractions par fractions de 15 ml.

I.a sortie de l 'ophdline ct dc I 'AEMP dtait contr61de par chromatograplfie sur papier, conatmrativement avec les produits de rdfdrence, dans les mdlanges : pyridine 3-mdthyl-I-butanol--acid~' ac(}tiqm, - eau (8:4 :I :4, v/v) et pyridine -dthanol--ammo- n i aque -eau (3 :3 :3 :1 , v/\') ; les chromatogrammes dtaient rdvdlds par la rdaction a la ninhvdrine et par la rdaction it l ' -a-naphtol-hyt)obromite alcalin ~. Les fractious con-

lti:~chim. Htophys..'1eta, 93 (19('4) 264 -271

O-METHYLATION DU GUANIDOI~THYL PHOSPHATE 267

t enan t les produits recherchds 6taient r6unies et concentrdes sous vide et rechromato- graphides dans les solvants ci-dessus; les chromatogrammes 6taient comptds cm par cm en scint i l lat ion liquide 3, puis rdv616s par les r6actifs approprifs afin de contr61er la position des pies d'oph61ine ou d 'AEMP. Aucune radioactivit6 n ' a y a n t 6t6 observ6e au niveau de I 'AEMP r6v616 par la r6action /t la n inhydr ine , la purification de cette fraction a 6t6 abandonnde. Par contre, dans tous les cas oh un pic de radioactivit6 a 6tfi d6cel6 au niveau du pic d 'ophdline r6vdlde par la rdaction de Sakaguchi, la fraction de l 'ophdline a dtd repurifi6e par passage sur une seconde colonne de Dowex 5o-X (2 H + ioo-2oo mesh) selon le m6me protocole. Avan t d'effectuer la d6terminat ion de la radioactivitd sp6cifique de l 'ophdline ainsi isol6e, nous nous sommes assur6s par chromatographie sur papier dans divers solvants que le pro&fit ne donnai t q u ' n n e seule tache rdvdlable par le r6actif de Sakaguchi et non par le r6actif h la n inhydr ine , que cette tache renfermait toute la radioactivitd de la fraction et qu'elle se t rouvai t au niveau de l'oph61ine t6moin (Figs. I et 2).

Oph Oph

0 I0 20 30 /+O c m 0 I0 20 30 ~.0 c m

Fig. 1. Comptage d'un chromatogramme d'oph61ine marqu6e isol6e du muscle d'O. neglecta 24 h apr~s injection de [MeJ4C]m6thionine. Oph, oph61ine; Solvant I, pyridine-3-m6thyl-I-butanol- acide acdtique-eau (8 : 4 : I : 4, v/v) ; Solvant I l, pyridine-dthanol -ammoniaque-eau (3 : 3 : 3 : I, v/v). Abscisses: longueur du chromatogramme (cm); ordonndes: radioactivit6 mesurde (coups/rain).

BO Oph I

II I /

0 10 ?0 30 38 c m

Fig 2. Comptage d'un chromatogramme d'oph61ine marqu6e isol6e d'une pr6paration acellulaire de muscle d'O. neglecta incub~e en pr6sence de L-~Me-ViC~m6thionine, d'ATP et de GEP (Ta- bleau Ill , essai 4). Oph, oph61ine. Solvant: pyridine-3-m6thyl-I-butanol-acide ac6tique-eau (8 : 4 : i : 4, v/v). Abscisses : longueur du chromatogramme (cm) ; ordonn6es : radioactivit6 mesur6e

(coups/rain).

Ddtermination de la radioactivitd spdcifique de l'ophOline

La radioactivitd a 6t6 d6termin6e par scinti l lat ion liquide au spectrom~tre Tri- Carb Packard (94o V) ct le dosage a 6t6 effectu~ spect rophotomdtr iqucment par la

m6thode au diac6tyle-e-naphtol 4.

Biochim. Bioph.vs. Acta, 93 (r964) 204-27 t

208 N.V. THOAI, Y. ROBIN, C. AUDIT

RI~SU I.TATS

Essais in vivo

De tous les p r o d u i t s m a r q u d s au I*C essayds au t o u r s de ce t r av a i l : L-rMe-taC i- m d t h i o n i n e , [ t4CJformiate de s o d i u m , !2A4C]acdtate de s o d i u m , D-p4C~!glucose,

[Md4C !cho l i ne , seule la m d t b i o n i n e es t s u s c e p t i b l e d ' a g i r c o m m e d o n n e u r de m d t h y l e

lors de la b i o s y n t h 6 s e de l ' ophd l ine chez O. neglecta (Tableau II) .

TA BI.I£..\ U II

BIOSYNTHI~,SE DE L 'OPH~LINE iJl ViVO

A PARTIR DE DIVERS AGENTS M~THYLANTS CHEZ (). n e g l e c t a

Suhstmt admtnistrd

! t~C i Formiate D- q4C~](;lucosc

ii3Ie-14C~Choline 72A4C]Acdtate

L- i~.V/eJaC~ Mdthionine

Radioactiviti spdcifique de "l'issu dtudtd l 'ophilinc isolde des tissus

I coups/min par #rtmlel

Animal entier ()

Animal entier o Animal entier o

Muscle o Tractus o

Muscle 260o Tractus o

Apr6s a d m i n i s t r a t i o n de m d t h i o n i n e m a r q u d e , nous n ' a v o n s obse rv6 a u c u n c rad io-

ac t iv i t6 d a n s l ' ophd l ine isol6e du t r a c t u s , celle-ci 6 t a n t c o n c e n t r 6 e d a n s l 'oph61ine du

musc le , d o n t la r a d i o a c t i v i t 6 spdcif ique a dtd t r o u v d e dgale /t 2600 c o u p s / m i n par

/ ,mole .

Essais in vitro

Los r6su l t a t s des essais in vitro s o n t rassemblf i s d a n s le T a b l e a u I I I .

En p r6sence d ' h o m o g 6 n a t s de t i ssus d 'O. neglecta, de L--Me-l~Cmdtlfionine et

d ' A r l ), h,s cssais de m d t h v l a t i o n de s u b s t r a t s p rdcu r seu r s poss ib les de l ' ophd l ine tcls

T.\I3LEAU 11I

BIOSYN'FH|,~.SE DE L'OPHI~'LINE i*l v i l r o X PARTIR DE LA I.-[.~//B-14C'MI~:TItlONINI': EN PRESENCE I)E DIVERSES PR]~PARATIONS ENZYMATIQIYES D'(_). n e g l e c t a

M, muscle; Tr, tractus. Milieu r6actionncl de base: tampon phosphate tic potassium (pH 7.o), too pmolcs: L-I'?,le-X4C]m6thionine (activit6 sp6cifique 0. 3 mC/mmolc) i 2 tt(': DL-m6thioninc, 7/tmoles; pr6paration enzymatique (voir texte), J.6 ml. Suivant les essais: ATP, 2o/tmolcs; ac6tate de magn6sium, 2o ttmolcs; ATP ou GEP, 2o umoles. Vol. totM, 4 ml. l)urde des incubations: I h h 3 o,:. R6action stoppde par addition de o 4 ml d'acide ac6tique e 31 et chauttagc 5 mira au

bain-marie bouillant.

Essais Radioactirit~: sp~cz)ique - - des produits/ormds

Preparation en~ymahquc Nubstrags ajoutds au mili~'u de base (coups/ram par t~molc) - - - . \ ' o .

No. Nature Tissu A T P 3Ig t• A E t ) G E P A E M P G E M P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

l ltomog6nat M + Tr l + -b o 3I + Tr 2 -t- + [ 700

, Extrait acellulairc M 3 + o 31 4 + ~- I 2oo Tr 5 + o Tr 0 + "- o

.3 Extrait accllulaire M 7 + ~. + o o M S + .t- .!. o 4000

t?iochim. Biophys. Acla, 93 (r064) 204 -27 t

O-METHYLATION DU GUANIDOI~THYL PHOSPHATE 269

que I 'AEP ou le GEP ont conduit ~ la formation d'oph61ine marqu4e au 14C (radio- activit6 sp6cifique 177o coups/min par t~mole) dans l'essai off le substrat ajout6 6tait le GEP (essai 2).

Les essais effectu6s en pr6sence d 'extrai ts acellulaires de muscle et de tractus d'O. neglecta ont confirm6 les r6sultats obtenus au cours des pr6c6dents essais in vivo et in vitro et permis de pr6ciser le m6canisme de la r6action. Les rdsultats suivants ont 6t6 obtenus :

La formation d'oph61ine radioactive (radioactivitd sp6cifique 12oo coups/min par p.mole) a fit6 observ6e en pr6sence d 'extrai t acellulaire de muscle d'Ophelia, de c-[Me-14C)m6thionine, d 'ATP et de GEP (essai 4).

Ancun transfert n 'a 6t6 obtenu en l'at)sence d 'ATP (essai 3). L 'extrai t acellulaire de tractus d'O. neglecta est ddpourvu de transmdthylase

conduisant ~ la formation de l'oph61ine en pr6sence de m6thionine., d 'ATP et de GEP (essai 6). L 'AEP n'est pas m6thyl6 en AEMP par la m6thyltransf6rase du muscle d'O. neglecta (essai 7), dans les conditions exp6rimentales off nous avons observd une forte m6thvlation du GEP en oph61ine (essai 8 : radioact iv i t6 de l'oph61ine isol6e, 46oo coups/min par p.mole).

La pr6sence d'ions Mg 2+ semble renforcer l 'activit6 de la transmdthvlase du muscle d'O. neglecta: la radioactivit6 sp6cifique de l'oph~.line isol6e d'un essai incub6 sans addition d'ions Mg 2~- 6tait de 12oo (essai 4), alors qu'elle atteignait 46oo dans un essai de mfime composition, mais suppl6ment6 en Mg ~+ (essai 8).

DISCUSSION

L'origine du groupe m6thyle de l'ophfiline pouvait ~tre recherch6e soit dans une. for- mation de novo ~ partir d'fiMments /t chalne carbonde plus ou moins complexe (for- miate, ac6tate, glucose), soit dans un transfert k partir d 'agents transm6thylants N-m6thvl6s (type choline) ou S-mdthylfs (type mdthionine). Les r6sultats obtenus au cours de ce travail montrent que, des divers substrats essay6s (E14C]formiate de sodium, [2-14C.]ac6tate de sodium, D-[14C~glucose, [Me-14C;choline, L-[Me-I*C!m6- thionine), seule la m6thionine est active in vivo et in vitro pour la biosynth6se de l'oph61ine chez O. neglecta. Le fait que I 'ATP soit indispensable ~t la r6action dans les essais in vitro sugg6re que la r6action comporte la formation interm6diaire de S-addno- sylm6thionine, selon le m6canisme 6tabli pour d 'autres m6thyltransfdrases et, en partieulier, pour les O-m6thyltransf6rases (EC classe 2.I.I.) actuellement connues, aussi bien d'origine v6g6tale: O-m6thyltransf6rase des tissus en croissance 5, norbella- dine-O-m6thyltransf6rase n,v, que d'origine animale.: catdchol-O-mdthyltransf6rase s,° et hydroxyindole-O-m6thyltransf6rase 1°.

L'addition d'ions Mg 2+ au milieu r6actionnel semble augmenter l 'activitd de l 'enzyme; la synth6se assez forte observ6e dans un essai non supplfment6 en Mg 2+ (Tableau I I I , essai 4) peut 6tre due an fair que nous travaillons aw~c un enzyme brut susceptible de renfermer des traces de mftaux, mais, dans un essai analogue additionn6 d'ac6tate de magn6sium 5 mM (Tableau I I I , essai 8), l ' incorporation de radioactivit6 dans l'oph61ine 6tait environ quatre fois plus 61ev6e. Nous nous proposons de v6rifier le r61e des cations divalents sur la GEP-O-m6thyltransf6rase purifi6e, afin de voir s'ils sont ndcessaires ~ l 'activit6 de l 'enzyme, comme cela a 6t6 ddmontr6 par :\xv:LItoD

Biochim. Biophys...Icta, 93 (19()4) 264-27x

270 N.v. THOAI, Y. ROBIN, C. AUDIT

EI TOMCHICK 9 pour la cat~chol-O-m6thyltransfdrase, ou non, comme dans le cas de la tyramine-mdthyltransf6raseL

Comme les O-mdthyltransf6rases animales ~tudi~es jusqu'ici, la GEP-O-mdthyl- transffrase d'O. neglecta est un enzyme soluble, mais elle se diff6rencie des premi6res par sa localisation exclusive dans le tissu musculaire. Alors que l'hydroxyindole-O- m~thyltransf6rase des Mammif~res est 6troitement localisde darts la glande pindale t° et que la cat~chol-O-m~thvltransf~rase de ces animaux, bien que tr6s largement rd- pattie, est pratiquement absente du muscle 9, nous avons, en effet, constatd que les extraits de tractus d'O. neglecta ne poss6daient aucune activit6 transm6thylante et que la tntalit~ de l 'enzyme 6tait rassemblde dans la fraction du muscle (Tableau III , essais 4 et 6).

Une autre diffdrence entre ces enzymes r6side dans leur sp6cificitC Celle de la GEP-O-m~thyltransf6rase d'O. neglecta semble tr6s ~troite; dans le pr6sent travail, l'actixdtd de l 'enzyme a dt6 essay6e in vitro sur deux substrats voisins, I 'AEP et le GEP: malgr~ l'analogie de structure des deux compos6s, aucun transfert n'a 6t6 observd ~ partir de la [MeA4Cim(~thionine sur le d~riv6 amind (Tableau III , essai 7), alors que l'homologue guanidique dtait fortement m~thyl6 dans les m~mes conditions expdrimentales (Tableau III, essai 8). La sI~cificit6 de la cat6choI-O-mdthyltrans- ffrase est au contraire trbs large: AXELROD ET TOMCHICK 9 ont montr6 que l'enzyme ~tait actif non seulement sur l'6pin6phrine et la nor~pindphrine, mais aussi sur la dopa, la dopamine et, d'nne manibre g6n6rale, sur tousles catdchols m6tasubstitu6s, quelle que soit la nature des substituants sur le noyau aromatique; l'enzvme est dgalement actif sur certains triphfinols n.

Ces diffdrenees entre l'enzyme transm6thylant d'O. neglecta et les atttres trans- mdthylases sont probahlement li6es "A la diff~rence de structure des substrats mdta- bolisfs: dans le cas ~tudi6 ici, le transfert de m6thyle s'effectue sur un oxhydrile phosphorique d'un d~rivd aliphatique, tandis que, dans tous les cas dtudi6s prdeddem- ment, le transfert se produisait stir un oxhydrile d'un compos~ aromatique8, 9,n-~3 ou d'un hdt6rocvcle ~°,lt. Nous pouvons cependant t}tablir un rapprochement entre le fait que la pr6sence de deux groupements ph6noliques voisins est n6cessaire "i l'activit~ de la cat6chol-O-mdthyltransf6rase, et celui que le GEP poss~bde deux hv- droxyles phosphoriques libres; bien que les essais n'aient pas dt~ ddvelopt)6s dans ce sens au tours de ce travail, il semble que la m6thvlation s'arr~2'te chez O. neglecta, comme chez les Mammif~res ",n, ~ la formation d'un d6riv6 monom~thyld.

Etant donnde l'apparente inaptitude de I 'AEP it fixer le groupement n~6thvle labile de la m~thionine en pr6sence d'une prdparation enzymatique de muscle d'O. ne- glecta alors que son analogue guanidique se montre un tr~.~ bon accepteur (Tableau I I I), il sembh~ que la mdthvlation du GEP dans le muscle constitue la derni6re 6tape de la biosvnth~se de l'oph~line chez O. neglecta.

m.~stJ.~1 #.

La O-m~thylation du guanidofithyl phosphate en ophdline (guanidofithylm~thyl phos- phate) a fit~ ~tudi~e chez une Anndlide Polych6te Sddentaire, Ophelia neglecta Schneider,

partir de divers agents mdthylants (formiate, ac6tate, glucose, choline, mdthionine) inarquds au 14C.

Les essais in vivo ont montr~ que, des divers substrats essay6s, seule la L-[Me-~4C )

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0-MF.THYLATION DU GUANIDOI~THYL PHOSPHATE 271

m6thionine donnait lieu fl la formation d'oph61ine marqu6e, et ceci uniquement dans le muscle.

Des essais in vitro, il ressort que l'enzvme responsable du transfert du groupe m6thyle labile de la m6thionine sur le guanido6thyl phosphate est extractible et localis6 dans le muscle, et qu'il semble inactif vis-fl-vis de l'amino6thyl phosphate. L'ATP est indispensable 5. la r6action, ce qui laisse supposer la formation interm6- diaire de S-ad6nosyl m6thionine.

Ces rfisultats sugg~rent que la 0-mdthylation du guanido6thyl phosphate par la m6thionine dans le muscle constitue la dernibre dtape de la biosynth~se de l'ophdline chez 0. neglecta.

B I B L I O G R A P H I E

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