OFFICE DE LA RECHERCHR

SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE

OUTRE-i"ER

Laboratoire de Microbiologie

B.P. 1386 - DAKAR

ANNEXE AU RAPPORr SCIENTIFIQUE

PRODUCTION

ENRICHIS EN

A PARTIR

rD'ALINENTS GLUCIDIQUES ,i

PROTEINES PAR FERJ'"'1ENTATION f

DE SUBSTRATS Alo:1YLACES !

M. RAD1BAULT - J. C• GERMON - D. ALAZARD

(avec la collaboration technique de P. DUPONT)

RAPPORT INTERIEUR : avril 1976

D.G.R.S.T. - Comité P.O.U

Contrat nO 74.7.1234

INTRODUCTION-=-=-=-=-

L'étude que nous présentons se situe dans le cadre de la

recherche de nouvelles sources de protéines alimentaires, destinées

à remédier à la pénurie actuelle dont les effets sont particuliè-

rement marqués dans les pays en voie de développement.

La croissance démographique implique une augmentation de

plus en plus importante de la consommation de viande et, par voie

de conséquence, une intensification de l'élevage et des besoins

accrus en protéines alimentaires. On s'accorde à penser que l'ac-

croissement des productions de protéines d'origine végétale ne

suffira pas à couvrir ces besoins et qu'il est nécessaire d'envi-

sager l'utilisation des possibilités offertes par les protéines des

microorganismes tels que les bacteries, les levures et les champi-

gnons.

Les végétaux élaborent leurs protéines à partir de l'éner-

gie solaire et du CO2

de l'air qui sont gratuits. Par contre,

l'azote doit leur être fourni en grande partie sous forme dDengrais

dont le prix est élevé et le rendement de transformation en protéi-

nes médiocre dans les conditions habituelles de culture. Leur vites-

se de croissance est faible, mais il sont capables de synthétiser

et d'accumuler de grandes quantités de composés riches en énergie

sous forme de cellulose ou d'amidon.

Les microorganismes présentent plusieurs avantages par

rapport aux végétaux supérieurs : en conditions favorables, ils

possèdent des taux de multiplication cellulaire élev~s et transfor-

ment l'azote minéral en azote protéique avec des rendements excel-

lents. Leurs protéines ont des gualités nutritionnelles comparables,

voire même supérieures, à celles des protéines végétales pour l'ali~

mentation animale ou humaine (l, 2, 3).

Pour permettre la croissance des microorganismes, on uti-

lise des substances capables de fournir à la fois le carbone et

l'énergie nécessaires à la biosynthèse des matériels cellulaires.

2

Ces substances carbonées doivent être disponibles en très grandes

quantités pour pouvoir fonder des perspectives d'avenir; leur prix

doit être Modéré pour obtenir des produits protéinés d'un prix de

revient comparable à celui des produits existants. On distingue

actuellement deux catégories de substances susceptibles d'offrir

des perspectives intéressantes : les glucides et les hydrocarbures.

- Les hydrocarbures paraffiniques contenus dans le pétrole

ont déjà fait l'objet d'études approfondies et de réalisations

pilotes et industrielles (4). Cependant le pétrole étant une subs-

tance organique fossile, les réserves disponibles, quoique très

importantes sont li~itées. La consorrmation rapide de ce produit

pouvant poser des problèmes 3 long terme, il ne faut pas que les

perspectives offertes par les paraffines fassent négliger la pos-

sibilité d'utiliser dVautres substrats pour la production de pro-

téines d'organismes unicellulaires.

- Les possibilités offertes par le méthane sont également

intéressantes car on dispose de très importantes réserves de cet

hydrocarbure gazeux dont le prix est relativement faible. Il peut

être produit biologiquement par la èécomposition de la matière

organique en anérobiose. Les recherches récentes qui se sont déve-

loppées portent sur l'utilisation directe du méthane par des bac-

téries ou sur 1 vutilisation du !né thanol, obtenu par transformationchimique du méthane, comme substrat soluble pour des cultures de

levures ou de bactéries.

- Les substrats glucidiques agricoles présentent l'avan-

tage dVêtre ~ la fois abondants et théoriquement inépuisables

puisqu'ils sont régénérés en permanence grâce à la photosynthèse.

L'utilisation des résidus agricoles disponibles en quantités

importantes et parfois gènants, pourrait conduire à leur valorisa-

tion tout en supprimant des sources de pollution.

Les substrats gluciniques se répartissent en deux catégo-

ries: les sucres simples et les polysaccharides. L'utilisation

des mélasses, des liqueurs sulfitiques et du pEtit-lait pour la

production de levure est pratiquée depuis déjà de nombreuses années.

3

La cellulose et l'amidon sont les substrats glucidiques

les plus'abondants, et ils offrent des perspectives d'avenir inté-

ressantes. La cellulose dont les disponibilités potentielles sont

élevées présente l'inconvénient de nécessiter l'hydrolyse des

liaisons glucidiques S-1-4 qui est un processus lent et difficile

à réaliser aussi bien chimiquement que biologiquement. L'amidon,

est, par contre, facilement et rapidement hydrolysé par de nombreux

microorganismes. Il semble donc préférable, dans un premier temps,

de choisir les matières amylacées pour la production de protéines

d'organismes unicellulaires.

Les différents travaux concernant l'utilisation de l'ami-

dont pour la production de protéines ont porté essentiellement sur

la culture en milieu liquide dilué de différentes souches de micro-

organismes. La récolte et le condi"tionnement du matériel cellulaire

synthétisé permet d'obtenir un produit sec à haute teneur en pro-

téines. Les différentes possibilités qui ont été étudiées ont con-

duit à l'élaboration de divers procédés dont nous rappelons ici

les plus satisfaisants.

Procédé SYHBA (S) - Il s'agit de la culture mixte en "batch li de

deux levures, l'une ét~nt arnylolytique (Endomycopsis fibuliger)

et l'autre pas (Candida utilis). Son but principal est la récu-

pération de l'amidon contenu dans les effluents d'usines alimen-

taires. Il peut être amélioré dans la mesure oü une fabrication

contenue pourrait lui être appliquée.

Procédé IRCHA (6) - Il est basé sur une fabrication en continu

comportant deux stades successifs l'hydrolyse enzymatique en

réacteur tubulaire à 50°C par une amyloglucosidase du commerce,

puis la culture d'une levure alimentaire type Candida utilis sur

l'hydrolysat glucosé. L'originalité de ce procédé réside surtout

dans la continuité de production d'une levure à partir d'un subs-

trat glucidique agricole; la productivité des matériels utilisés

est de ce fait bien supérieure (4,5 9 de protéines/ l / h) à celle

des procédés en "batch".

Procédé Canadien (7) - Il utilise la transformation directe de

l'amidon en protéines par une moisissure amylolytique thûrmophile

4

(Aspergillus fumigatus). L1intérêt de ce procédé vient du fait

qu1il ne nécessite pas de conditions stériles ni de refroidissement

important et que le mycelium produit est facile à récolter. Par

contre, corr~e il ne fonctionne pas en continu, la productivité du

fermenteur utilisé est assez faible (0,45 g de protéines/ 1 / h).

La réalisation de ces différents procédés de transforma-

tion quantitative de 19~nidon en corps microbiens fait appel à une

technologie relativement complexe nécessitant des investissements

élevés. L'optimisation de ces productions conduirait à la mise en

place d'installations de taille importante. Etant donné le prix

assez élevé de la matière première agricole et de son transport,

et les difficultés d'approvisionnement dûes à la nature fluctuante

des récoltes, la rentabilité de telles installations reste problé-

matique et les protéines fabriquées risquent d1avoir un prix de

revient trop élevé.

Une autre possibilité de fournir de nouvelles sources de

protéines alimentaires à partir d1amidon a été proposée par le

Professeur J-C SENEZ. Elle consiste à produire non pas des cellules

microbiennes, mais des aliments glucidiques enrichis en protéines

par fermentation et destinés à être utilisés tels quels pour l'a-

limentation animale. Il s'agit dans ce cas de développer une

technologie simple permettant à des installations de fermentation

situées à proximité des cultures et de llélevage, d'être économi-

quement rentables tout en conservant une taille modeste.

Le programme de recherche que nous présentons a donc été

élaboré pour déterminer s'il est possible, par une technique simple

de transformer un produit amylacé pauvre en protéines en un produit

enrichi contenant suffisamment de protéines pour servir de base à

une alimentation animale. La simplicité requise oriente naturel-

lement les recherches vers la culture de germes amylolytiques sur

des substrats amylacés solides. Peu de recherches ont été faites

dans ce domaine. BROOK et col. (R) ont étudié l'enrichissement de

la farine de manioc par des souches de Rhizopus et de Mucor. Leur

technique, essentiellement inspirée de la fabrication du "tempeh"

5

(produit dDune fermentation tranitionnelle de graine de soja en

Extrême-Orient), fournissait un produit de type fromage dont la

teneur en protéines ne dépassait pas 3 %. Ce faible enrichissement

est dû vraisemblablement à une mauvaise aération du produit et à

l'utilisation d'amidon cru.

Nous avons choisi le manioc comme matériel d'étude en

raison de sa haute teneur en amidon, de sa pauvreté en protéines et

de ses rendements potentiels élevés (60 tonnes / ha) dans des zones

géographiques où les carences protéiniques sont graves. Signalons

cependant que d'autres substrats amylacés peuvent être envisagés'

tels que la pomme de terre, les écarts dG triage de bananes ou les

résidus de féculeries.

Etant donné la nature solide du substrat à enrichir, nous

nous sornrnsintéressés surtout aux moisissures amylolytiques qui

ont des capacités hydrolytiques importantes et qui peuvent tolérer

des acidités permettant dVéviter les contaminations bactériennes.

Au cours de cette étude, nous avons donc isolé des moisis-

sures amylolytiques que nous avons testées et classées suivant

leurs capacités à croître en milieu liquide sur amidon de manioc.

Toujours en milieu liquide, nous avons étudié les paramètres de

croissance des souches les plus actives. Nous avons ensuite recher-

ché la méthode la plus adaptée au développement du myceliurn sur le

produit solide. Après avoir choisi la technique qui fournissait les

meilleurs résultats, nous avons corr~encé l'étude des différents

paramètres de cette fermentation en milieu solide en utilisant une

souche dVAspergillus niger que nous avions sélectionnée.

-=~=-=-=-=-=-

6

l'1l\TEHIEL ET ~JfETHODES~=-=-=-=~=~~=-=~=-

1 0 - PREPARATION DE LA FARINE DE HANIOC

Les farines de manioc qui ont servi de matiêre premiêre

dans presque toutes nos expériences ont été préparées de la façon

suivante ~

- à partir de manioc cru ~ les tubercules de manioc lavés ont été

séchés au soleil aprês leur arrachage, puis transformés en farine

à liaide dOun broyeur à marteaux. Cette farine a servi essentiel-

lement à la préparation des m.ilieux de culture liquides et gélosés.

à partir de manioc cuit : les tubercules frais lavés ont été cuits

à la vapeur dans un autoclave, refroidis et stockés dans un congé-

lateur. Suivant les besoins, le manioc cuit a été décongelé, séché

dans un courant diair chaud, et broyé. La farine obtenue a servi

à la préparation des milieux solides.

Les deux farines avaient une teneur en eau voisine de 10 %.

2 0 - COHPOSITION DES !'lILIEUX DE CULTURE

Nous avons considéré dans un premier temps que la quantité

de sels minéraux contenue dans la farine de manioc et dans l'eau

du robinet était suffisante pour permettre la constitution de

milieux simples.

Les isolements ont été faits sur boîtes de Pétri, les

souches repiquées et conservées en tubes gélosés, et testées en

milieux liquides. Ces différents milieux avaient la composition

suivante.

7

Milieu Boites Tubesliquide de Pétri gélosés

Farine de manioc cru 20 9 20 9 20 9

(NH4 ) 2S04 3 9 3 9 3 g

KH2

P04 l 9 l 9 l 9

Bacto-agar 25 9 25 g

Chloramphénicol 100 mg

Streptomycine 100 mg

Eau du robinet q.s.p. l 1. g.s.p. l 1. g.s.p. l 1.

Le pH des milieux stérilisés 30 mn à 110°C est de 5,5.

Les antibiotiques ont été ajoutés après refroidissement à 45°C. Les

cultures en fermenteurs ont été faites sur les milieux liquides

dont le pH était ajusté à 4,5 avec lDacide phosphorique.

Pour la préparation des milieux gélosés, nous avons uti-

lisé un empois dDamidon préparé à partir de la farine de manioc

cru, afin de pouvoir travailler sur un milieu homogène et limpide.

Une suspension de 20 g de farine de manioc dans un peu dVeau est

versée dans 500 ml dUeau bouillante. Après refroidissement, la

solution est centrifugée à 3000 g nendant 10 rnn. Dans le surnageant,

on ajoute les sels nécessaires et on ajuste à l litre.

3° - MATERIELS DE FERMENTATION

LUétude cinétique des paramètres de fermentation en milieu

liquide a été réalisée dans un réacteur QUICKFIT de 2 litres équipé

du contrôle de la température et du pH. La nispersion de lUair était

réalisée grâce à un vibro-mixer vertical CHEM~PEK. Une agitation

magnétique et une circulation continue du milieu par lVintermédiaire

dUune pompe WAB ont servi à lVhomogénéisation du milieu de culture.

LVétude des rendements de production et de transformation

de lVamidon de manioc en protéines a été faite sur un fermenteur

BIOLAFITTE de 20 litres muni dVune unité de régulation permettant

de contrôler la températurG, lVaération, l'agitation et le pH.

Le matériel utilisé pour les fermentations en milieu solide

sera décrit dans le chapitre traitant de cet aspect.

4 0 -. PREPARATIon DES ECHANTILLONS

Avant d'être analysés, les échantillons ont subi un trai-

tement préparatoire qui dépend des conditions de culture et du

microorganisme étudié.

- champiqnon sur milieu liquide - Pour la séparation du mycelium

de la phase liquide, nous avons utilisé un dispositif de filtration

"stérifil" HILLIPORE dans lequel le filtre est remplacé par une

fine grille dOacier ayant des mailles de 100 ~m. Le mycelium

récolté à partir de 5 ml de milieu de culture a servi à la déter-

mination de lOazote total par la méthode de KJELDAHL. Par ailleurs,

20 ml de milieu ont été filtrés; le mycelium lavé deux fois avec

5 ml d'eau a servi à la détermination du poids sec~ le filtrat

obtenu, convenablement dilué, a servi pour les dosages de llacti~

vité amylasique, des sucres totaux et des sucres réducteurs.

- levures sur milieu liquid~ ~ Après homogénéisation du prélèvement

de culture, la densité optique est mesurée à 600 nID. Par ailleurs,

20 ml de cet échantillon sont centrifu9és pendant 10 mn à 10000 gi

le culot est remis en suspension dans lOeau et centrifugé une nou-

velle fois. Le culot obtenu a servi à la détermination du poids sec

synthétisé et de l'azote total, dans les surnageants l'activité

amylasique a été mesurée et les sucres totaux et les sucres rési-

duels ont été dosés.

- champignons sur milieu solide - Pour l'étude cinétique des para-'

mètres de fermentation, nous avons utilisé les élèments dOincuba-

tion qui sont décrits plus loin. Au moment du prélèvement, 4 élè~

ments servant de répétitions sont pesés afin de déterminer le poids

humide total. Sur une partie (environ 5 g) de chaque échantillon

correctement homogénéisé, on détermine l'humidité. Par ailleurs,

5 g de produit humide sont pesés, auxquels on ajoute 30 ml dOeau

distillée; la suspension est homogénéisée par un broyage de quelques

secondes à l'ULTRA-TURR~X, et le volume ajusté à 50 ml. Après avoir

9

déterminé' le pH, cette suspension est placée dans un bain-marie

bouillant pendant 10 mn pour transformer llamidon résiduel en empois

et favoriser la solubilisation du produit. Cette suspension conve-

nablement diluée a servi à la détermination des protéines par la

méthode de LOWRY, et au dosage des sucres résiduels après hydrolyse

enzymatique.

5° - METHODES DE DOSAGE

dosage des protéines vraies -

Nous avons utilisé la méthode de LOWRY (9) basée sur la

formation d Çun complexe coloré entre le réactif de FOLIN-CIOCALTEU

.et certains aminoacides.

Réactifs Soude N

Solution A Na2C03 anhydre à 2 % dans la soude O,lN

Solution B CUS04 à l %

Solution C tartrate double de Na et K à 2 %

Réactif de FOLIN-CIOCALTEU 2N

Protocole ~ A l ml de solution convenablement diluée (entre 50 et

150 mg/l de protéines) on ajoute l ml de soude normale dans un tube

à essais qui est placé au bain-marie bouillant pendant 5 ron afin

de libérer les protéines intracellulaires. Après un refroidissement

rapide, on ajoute 5 ml du mélange préparé à partir des solutions

A, B et C dans les proportions de 50/1/1. Après 30 mn à l'obscurité,

on ajoute l ml de réactif de FOLIN CIOCALTEU dilué de moitié. On

laisse à nouveau 30 mn \ l'obscurité pour pernettre à la coloration

de se développer. L'intensité de cette coloration est alors mesurée

au colorimètre à 750 nm et comparée à celle d1une gamme étalon de

"sérum albumin bovine" dont la concentration en protéines slétale

entre 30 et 300 mg/le

- dosage de lUazote total par la méthode de KJELDAHL -

Pour accélérer la minéralisation de la matière organique

nous avons utilisé la modification faisant intervenir lleau oxygénée

(10) •

10

Pour 100 mg de matière sèche à analyser, on ajoute 5 ml diacide

sulfurique concentré, et on place le matras sur la rampe de chauf-

fage jusquià disparition des fumées blanches et ébullition à reflux.

Le matras est alors retiré de la rampe, et après l'avoir laissé

refroidir pendant 2 mn on ajoute environ 15 gouttes d'eau oxygénée

à 110 volumes tout en agitant. Le chauffage est alors repris jus-

qu'à ébullition pendant 2 mn. Si la décoloration est incomplète on

renouvelle l'apport d'eau oxygénée. Après refroidissement complet,

le contenu du matras est amené à 50 ml, l'a~moniac est dosé sur

une aliquote de 10 ml par distillation dans un appareil de PARNAS

et WAGNER.

- Dosage des sucres totaux -

Les glucides totaux sont dosés colorimétriquement par la

méthode à l'anthrone qui réagit avec tous les sucres simples, mais

également avec les polysaccharides comme la cellulose et l'amidon

(11) .

Réactif solution d'anthrone à 2 %0 dans l'acide sulfurique con-

centré.

Dans les tubes à essais placés dans un bain d'eau glacée,

on ajoute 2,5 ml de la solution à doser, diluée de façon à avoir

moins de 50 ~g de sucre/ml, puis 5 ml de réactif à l'anthrone préa-

lablement réfrigéré. Après homogénéisation, les tubes sont placés

dans un bain-marie bouillant pendant exactement 10 ron. La réaction

est alors stoppée en plaçant les tubes dans lOeau glacée pendant

5 mn. L'intensité de la coloration est mesurée au colorimètre à

625 nm et comparé à une gamme étalon de glucose.

- Dosage des sucres réducteurs -

Les sucres réducteurs ont été déterminés par la méthode

de SOMOGYI~NELSON, basée sur la formation d'un complexe coloré

entre l'acide arsénomolybdique et les ions cuivreux formés par la

réduction avec les sucres (12).

Réactifs Solution A

Solution B

Na2C03anhydre

tartrate double de Na et K

NaHc03

Nël.2 SO4

eau permutée

Cus04 , 5H 20

eau permutée

H2so

4concentré

Il

25 g

25 g

20 g

200 g

q.s.p. 1 litre

15 g

q.s.p.lOO ml

2 gouttes

Solution C eau permutée

molybdate d'ammonium

H2S04 concentré

arséniate disodique anhydre

dans

450 ml

25 g

21 g

1,8 g

25 ml d'eau

Ce réactif est incubé 24 heures à 37°C

avant la première utilisation.

A 1 ml de solution à doser convenablement diluée, on ajoute l ml

du mélange des solutions A et B (25/1). Le tube est placé dans un

bain-marie bouillant pendant 20 mn; après refroidissement, on ajoute

1 ml de solution C et le volume est ajusté à 25 ml. La coloration

est mesurée à 720 nm et comparée à une gamme étalon de glucose al-

lant de 0 à 75 ~g/ml.

- Dosage des sucres résiduels -

Dans ce dosage, on détermine les sucres provenant de l'a-

midon et qui n'ont pas été assimilés par les microorganismes. On

effectue une hyàrolyse enzymatique avec une amyloglucosidase du

commerce pour sOassurer que tout l'amidon est transformé en sucre

réducteur. Les sucres réducteurs obtenus sont alors dosés par la

méthode précédente.

Réactifs : Amigase 200 AGN (Société Rapidase, 59 - SECLIN france)

Tampon pH 4,5 : acide citrique monohydrate 5,71 g

Na 2HP04, 12H

20 16,31 g

eau permutée q.s.p. 1 litre

12

L'hydrolyse est réalisée 1 partir d'un échantillon de la ml, con~

tenant l'mnidon sous forme d'empois, auquel on ajoute 15 ml de

tampon pH = 4,5 et environ 30 mg d'amigase, le tout placé dans unerlen de 150 ml. On incube pendant 1 heure dans un bain-marie agité

à GOoC. La réaction est arrêtée par chauffage au bain-marie bouil-

lant pendant la mn. Les sucres réducteurs sont alors dosés sur cet

hydrolysat convenablement dilué.

- Dosage de l'activité amylasique -

LGactivité amylasique a été mesurée en faisant agir la

solution à doser sur une solution tamponnée d'amidon qui est dosée

avant et après la réaction.

Réactifs tampons phosphate pH - 0,3 à 0,5 M et 0,05 M.

solution dl amidon à 1,5 et 3 %

acide sulfurique à 5 %

solution iodo-iodurée N/500 0 KI 20 g0

solution d'iode O,lN . 20 ml0eau permutée q.s.p. 1 litre

Les solutions à doser peuvent contenir aussi de l'amidon; il faut

donc faire un témoin pour chaque échantillon avant la réaction

d'hydrolyse. Pour les essais, on apporte dans un tube

· 1 ml de la solution d'amidon à 1,5 %

• 1 ml de tampon phosphate 0,05 M

• 1 ml de solution à doser.

Les tubes sont placés au bain-marie à 37°C pendant 15 mn exactement,

puis on arrête la réaction en ajoutant 1,5 ml d'acide sulfurique à

5 %. Une gamme étalon contenant uniquement l'amidon (de 0 à 30 g/l)

et le tampon sont incubés dans les mêmes conditions.

Pour les tubes témoins, on apporte dans l'ordre

· 1 ml de solution dlamiàon à 1,5 %

· 1 ml de tampon phosphate 0,05 M

· 1,5 ml d'acide sulfurique à 5 %

puis . 1 ml de la solution à doser.

Ces tubes n'ont pas ét~ incubés à 37°C.

13

Pour la mesure de llantidon résiduel; on prélève 0,5 ml des mélanges

précédents que l'on ajoute à 15,5 ml de réactif à IViode dilué

30 fois. Après homogénéisation, la coloration est lue à 580 nm.

Les résultats sont exprimés en mg d'amidon hydrolysé pendant 15 mn

à 37°C par ml de solution.

-=-=~=~=~=-=~=-=-=~

14

RESULTA'IS ET DISCUSSION~=~=-=-=~=-=~=-=~=-

l - SELECTION DES GBR!'1ES MWLOLYTIQUES

1. - Isolements

Ils ort été faits sur des boîtes de Pétri contenant un milieu

gélosé à l'amidon de manioc auquel on a ajouté de la streptomycine

et du chloramphénicol pour supprimer les colonies bactériennes. Les

étalements ont été faits à partir de différents échantillons de

sols et de manioc frais ou fermenté. Les boîtes ont été incubées

2 à 3 jours à 30 ou 45°C puis exposées quelques instants aux vapeurs

d'iode pour colorer l'amidon en bleu et visualiser ainsi les zones

d' hydrolyse. Les germes pr6sc:it.ê..r.'.:. ";lne activité arnylolytique sont

alors purifiés par plusieurs repiquages et sont conservés en tubes

de gélose inclinée.

Une première série d'isolements nous a permis d'obtenir 45

souches de moisissures et également quelques levures amylolytiques.

Par la suite nous avons refait une série d'isolements qui nous a

fourni 30 nouvelles souches dont certaines ont été isolées à 45°C.

2. - Classification et sélection des souches

Les champignons ont été cultivés sur milieu liquide en erlens

de 250 ml, contenant 50 ml de milieu de base, et ensemencés à partir

de spores obtenues en tubes gélosés. Il ont été incubés 48 heures

à 30°C sur une table d'agit~tion. Les levures ont été cultivées dans

les mêmes conditions.

Le poids sec de myceliurn synthétisé a été déterminé à partir

de 25 ml de milieu de culture filtre sur une grille de 100 ~m d'ou=

verture. La teneur en protéines du mycelium lavé a été estimée par

la méthode àe Kjeldahl. L'activité arnylolytique et les sucres totaux

à l'anthrone ont été déterminés sur le filtrat de culture. Le tableau

l rassemble les résultats obtenus à partîr du premier lot d'isolats.

Nycelium Teneur en Proteines Sucres ActivitéN° Produit Protéines formées résiduels amylasique

g/l % g/l g/l- --"'-'-""'._~'·-I 1-- - -,--_._- ,--

_____ "'_"'• ..,....JO ___

..,....,...-""",..",.. __ 0''''''_-...."' __ c=o ...,.,. ___ ~.".. _ ___ IS>l>K&> •______

10 9,69 25,6 2,48 0 ++++7 Il,27 20,0 2,25 0 +++

12 9,83 21,0 2,07 0 ++++24 8,44 24,0 2,02 0 '-.'"Il 7,89 23,1 1,D2 2,4 +++

8 7,92 22,4 1,77 2,5 +++45 5,07 34,7 1,76 6,7 -

9 8,04 20,8 1,67 3,0 ++14 7,74 21,3 1,65 3,8 +51 6,39 25,8 1,65 7,6 -52 7,02 22,5 l,58 6,6 -34 7,21 20,8 l,50 5,2 ++17 5,25 22,1 1,16 9,6 -53 4,31 25,6 1,10 13,3 -46 4,62 23,4 1,08 10,7 -49 4,70 21,1 0,99 10,8 -

6 6,37 15,

15

Il faut rerrarquer tout d'abord que les valeurs obtenues n'ont

qu'une valeur comparative, les conditions optimales n'ayant pas

été réalisées dans la plupart des cas. Ce test nous a cependant

permis de classer les souches et diapprécier leur capacité à croî-

tre sur amidon de manioc.

Si on compare nos résultats avec ceux de BROOK et col. (12)

nous constatons que la moitié des souches que nous avons isolées sont

favorablement comparables aux souches amylolytiques de collection

que ces auteurs ont cultivées dans des conditions assez voisines.

On s'aperçoit également que pour certaines souches ayant

transformé liamidon de façon efficace, l'activité amylasique est

très faible, alors que pour diautres elle est très élevée. Ceci

semblerait indiquer que chez certaines moisissures, lienzyme est

restée liée au mycelium. Cette remarque est également valable pour

les quelques levures que nous avons testées : les souches 35 et

Endomycopsis fibuliger fournissent des surnageants de culture for-

tement amylolyti0ues, mais pour toutes les autres l'activité mesu-

rée est très faible. Cette observation rejoint les études de GALZY

(13) selon lesquelle3 l'activité amylasiquG de certaines levures

semble située dans la paroio

Les nouvelles souches que nous uvons isolées récemment seront

également testées en milieu liquide, cependant, puisque le but de

ces recherches n'est pas de cultiver ces moisissures en milieu

liquide, un nouveau screening devra être fait sur toutes les souches

isolées en utilisant la méthode de culture sur milieu solide que nous

avons mise au point et dont nous reparlerons plus loin.

La détermination des différentes souches que nous avons isolées

n'a pas été faite de façon systématique. Cependant parmi les plus ef-

ficaces, on rencontre surtout des germes appartenant au groupe Asper-

gillus et présentant des fructifications noires (nO 7, la, 12),grises (n° Il, 24) ou verdâtres (nO 24, 51, 45).

16

Les souches les plus actives ont été cultivées en fermen-

teur pour l'étude des parronètres de croissance et des rendements

de production. La souche nO 10 (Aspergillus niqer) présentant des

caractéristiques intéressantes nous a été particulièrement utile

dans la suite des travaux.

~=-=~=~=-=~=-=~=-

17

II - ETUDE DES P~RA~ffiTRES DE FERMENTATION EN MILIEU LIQUIDE

1. ~ Cinétiques de croissance

Afin de connaître de façon plus précise les paramètres de

culture des germes amylolytiques, nous avons étudi.é la cinétique

de croissance de quelques souches en milieu liquide. Nous avons

pour cela utilis& un réacteur QUICKFIT de 2 litres muni de disposi-

tifs permettant l'homogénéisation du milieu ct le contrôle de la

température et du pH. Les cultures ont été faites à 30°C, le pH

régulé à 3,5 par apport d'ammoniaque et le débit d'air fixé à 60

litres/heure. Le fermenteur contenant 1,5 litre de milieu à 20 g/l

de farine de manioc cru, a été stérilisé pendant 30 mn à 110°C.

Après refroidissement, il a été inoculé avec 50 ml d'une préculture

agitée de 48 heures.

Nous avons suivi la. consom.'llation (~e sucres totaux, l' accu-

mulation de sucres réducteurs, la formation de protéines r le poids

sec de matériel synthétisé, ainsi que l'activité amylasique du

milieu de culture. Les résultats concernant la souche d'Aspergillus

niger n° 10 et la souche de levure nO 35 sont rapportés sur les

figures 1 et 1 bis.

En règle générale, nous observons une phase de démarrage

assez longue (5 à 10 heures) pendant laquelle l'activité amylasique

est faible et la quantité de sucres réducteurs présents dans le

milieu de culture pratiquement nulle. Elle est suivie d'une ph~p,e

de croissance pendant laquelle l'activité amylolytique devient très

élevée et provoque un pic d'accUMulation des sucres réducteurs, ce

qui montre que l'hydrolyse de l'amidon n1est plus un facteur limi-

tant de la croissance. Après 20 ~ 24 heures, l'amidon est entière-

ment hydrolysé, et les sucres réducteurs consommés; la fermentation

est alors terminée. Ces cinétiques sont tout à fait comparables à

celles décrites par READE et GREGORY (7) qui ont cultivé une souche

d'Aspergillus fumigatus à 45°C sur amidon de manioc.

Pour connaître le temps de doublement de la biomasse des

souches que nous avons cultivées, nous avons rapporté, en coordonnées

semi-logarithmiques, la quantité de protéines synthétisées

o li)Cl,) (l,)111 C111 .Q)

"'0 '0o ...O. Cl.

6 2

4 1

2

"Il'

... 5

Fig.1 Paramètres de croissance de la souche 10 . .-...... Proro;nes ......-.. Poids sec --....... Sucres totaux.

• .. Sucres -réducteurs 1~'Amylases

/

5

E.....•(1)

15 15 ~0

"-li) a...Q,I"C

Cl lI)~li) ct! CQI >.0... E:Q0:J

18

en fonction du temps dOincubation (figure 2). Nous constatons

qu'en se basant sur ce paramètre, la phase de croissance est expo~

nentielle et fournit une droite après la phase de démarrage. Pour

les souches 10 et :2 le temps de doublement est pratiquement iden-

tique (4 h 15) 0 La souche nO 7 qui est un peu plus rapide, (3 h

45) présente une phase de latence sensiblement plus longue.

La souche de levure n035 présente des caractéristiques

intéressantes. Elle pousse très bien sous forme unicellulaire, son

temps de doublement est sensiblement plus court que celui des

champignons (3 h 15). Elle pousse à pH acide (3,5) et accumule dans

le milieu de culture des quantités élevées daamylase (plus élevées

qu'une souche dlEndomycopsis fibuliger que nous avons testée). Il

serait intéressant de connaître les paramètres d'une telle souche

en culture continue, et en se plaçant à un taux de dilution tel

que lion obtienne le maximum de sucres réducteurs en sortie du

fermenteur. En ajoutant alors une levure telle que Candida utilis,

on doit pouvoir obtenir une culture mixte stable. Ceci pourrait

éventuellement conduire à un procédé type 8yrnba, mais en fermenta-

tion continue et avec deux levures unicellulaires, ce qui augmen-

tLrait très sensiblement la productivité des installations.

Dans le tableau II, nous avons rassemblé les différents

paramètres de croissance et les rendements de transformation obtenus

pour les différentes souches étudiées. Nous voyons que les résultats

sont assez voisins pour les levures ou les moisissures amylolytiques.

Les rendements de transformation des sucres consommés en protéines

sont relativement faibles si on les compare aux 25 % obtenus couram-

ment à partir d'une levure cultivée sur un substrat directement

assimilable. On peut expliquer cette différence en remarquant tout

daabord que les rendements maximum n'ont peut-être pas été obtenus

dans le type de réacteur que nous avons utilisé. En particulier le

coefficient de transfert de l'oxygène était sans doute insuffisant.

Par ailleurs, il faut également noter que les souches amylolytiques

doivent dans un premier temps réaliser l'hydrolyse de laamidon et

donc synthétiser une enzyme spécifique en quantité importante.

L'énergie dépensée pour cette synthèse et fournie par le substrat

carboné, conduit nécessairement à un rendement moins élevé que si

og/I

IJ)

QIl:. --

.C)-eQ.

0,5

1

1

1

.,A

• •

5. 10. 15 20. 25 heures 30- ......Fig.2 Détermination du temps de doublement des souches

n 7.. ..10 l't--e .12* 1'~. 35 a--II .

Numéro dG l'isolat 10 12 7 35

--------~-..--~---,-·

19

le germe était cultivé sur un substrat directement assimilable.

Il reste cependant que les rendements dé croissance observés (de

l'ordre de 40 %) et la teneur en protéines (35 à 40 %) sont satis-

faisants pour cette catégorie de microorganismes.

2. - Rendements de transformation

Afin de vérifier les résultats précédents et connaitre de

façon plus précise les r'endements de transformation de l'amidon

de manioc en biomasse et en protéines, nous avons cultivé une

dizaine de moisissures et une levure amylolytique dans un fermen-

teur BIOLAFITTE de 20 litres. Le fermenteur contenant 12 litres

de milieu de culture à 20 g/l de farine de manioc cru a été stéri-

lisé à l'autoclave et inoculé avec 1,5 litre d'une préculture de

24 heures régulée dans les mêmes conditions opératoires ~ tempéra-

ture ~ 30°C, pH : 3,5. Le débit d'air a été fixé à 4 litres/rnn et

l'agitation à 400 tours/rnn.

Pour savoir à quel moment il fallait stopper la fermentation,

nous avons suivi, après 15 heures d'incubation, le poids sec synthé-

tisé, la quantité de protéines formées et les sucres résiduels dans

le milieu de culture. A la fin de la fermentation, la biomasse est

récoltée par centrifugation et séchée. Dans le surnageant de cul-

ture nous avons dosé les sucres et les protéines résiduels. A partir

du matériel cellulaire récolté, nous avons calculé le poids sec

synthétisé et la teneur en protéines par la méthode de Kjeldahl

(Nx 6,25) et la méthode de LOlvRY. La quantité de sucres métaboli-

sables apportée à été calculée et correspond à 236 9 de glucose

dans tous les cas.

Les résultats concernant les dosages effectués en fin de

fermentation sont rapportés dans le tableau III. A partir de ces

données, nous avons calculé les teneurs en protéines et les dif-

férents rendements concernant d'une part la production de biomasse

et de protéines, et d'autre part la transformation des sucres en

matériel cellulaire et en protéines (tableau IV).

N° Durée fer~ Sucres Sucres Poids sec Protéines récoltées Protéinessouche rnentation résiduels consommés récolté ------------------- résiduelles

N x 6,25 LONRYh g g g g g g

__ ...""..,.."..,.,._"CJ...,.". ... _ ---------- --~--=------ C'Of._ ________ _..,... ...... __ ~____ 1nD _.·..

rrENEUR EN PROTEINES RENDEr1ENTS DE PRODUCTION RENDEMENTS DE TRANSFOID1ATION% % %

N° ---------- -----_.'_.- ...-"_._------ -------------_ ..~----~- --------~._------~-~------~-----SOUCHE brutes vraies Hatière Protéines Protéines Hatière Protéines Protéines

N x 6,25 (LOWRY sèche brutes vraies sèche brutes vraies-------~"-------------- -_.._=-----~ .,.-------_.-,..---------- --_ ..__ 0::.. ..-_..- __________

20

La différence entre les protéines brutes (Nx 6,25) et les

protéines vraies (méthode de LOWRY) est moins importante pour les

levures que pour les moisissures. Pour connaître l'influence d'une

association avec une levure alimentaire type Candida utilis, nous

avons fait des cultures mixtes de cette levure avec une autre levure

amylolytique (nO 35) et avec une moisissure (nO 10). La présence de

C. utilis qui se développe bien dans ces conditions semble toujours

bénéfique, et a pour conséquence une consommation beaucoup plus

rapide des sucres, ce qui est particulièrement net dans le cas de

la levure 35.

Nous constatons par ailleurs que la quantité de protéines

résiduelles dans les surnageants nUest pas négligeable, et repré-

sente en moyenne 10 a 15 % des protéines synthétisées. Elles repré-sentent dOune part les cellules restées en suspension, mais égale-

ment les protéines exocellulaires et celles provenant de lVautolyse

des cellules. Dans le cas des cultures en milieu liquide, elles ne

sont pas récupér3bles, cependant nous en avons tenu compte pour

pouvoir comparer par la suite les résultats obtenus en milieu liqui-

de et en milieu solide. Les rendements de production correspondent

donc à la biomasse et aux protéines récoltées par rapport aux sucres

disponibles; les rendements de transformation correspondent à la

biomasse récoltée et aux protéines totales formées par rapport aux

sucres réellement consommés.

La teneur en protéines des biomasses récoltées est en général

satisfaisante. Elle varie de 38 n 54 % en ce qui concerne les pro-téines brutes (N x 6,25). Quand on considère les protéines vraies,

on obtient des chiffres significativement plus faibles, de 22 à 35 %.

La différence est due essentiellement aux acides nucléiques, aux

sucres aminés et à l'ammoniacrésiduel qui sont considérés comme

protéines avec la méthode de Kjeldahl (N x 6,25).

Les rendements de production de biomasse sont également

satisfaisants pour la plupart des souches étudiées et varient de 40

à 45 %. Dans le cas des moisissures appartenant au genre Rhi20PUS

(isolat nO 13 et souche R.O. de collection), les rendements de

21

production de matière sèche sont très faibles, malgré une bonne

teneur de leur myceliurn en protéines. Vraisemblablement ces moisis~

sures doivent posséder un catabolisme très élevé et accumuler des

quantités importantes de métabolites dans le milieu de culturel du

moins dans les conditions où elles ont été cultivées.

Les rendements que nous avons obtenus sont en général plus.

élevés que ceux que nous avons obtenus en réacteur QUICKFIT de 2

litres. Ceci est sans doute lié à la meilleure oxygénation du milieu

de cultur(~ en fermenteur BIOLAFITTE, et à la plus grande précision

des résultats obtenus à partir de 12 litres de culture. Les résul-

tats que nous obtenons concordent assez bien avec ceux des auteurs

canadiens (7) qui ont travaillê sur une souche d'A3pergillus fumi-

gatus. Ils sont sensiblement supérieurs à ceux de BROOK et col. (8)

qui étaient contraints d'ajouter jusqu'à 2 % d'extrait de blé germé

dans leur milieu de culture pour obtenir une teneur en protéines

brutes de 42 %, alors qu'elle ne dépassait pas 22 % sans cet additif

pour leurs souches de Mucor et de Rhizopus.

3. - Composition alimentaire

Pour avoir des renseignements plus complets concernant ces

biomasses récoltées, nous avons fait effectuer les analyses de com-

position alimentaire par le laboratoire de l'ORANA à Dakar. (tableau

V). Les résultats concernant les teneurs en protéines coïncident

assez bien avec ceux que nous avions obtenus. La teneur en lipides

est très variable suivant la souche considérée et se situe entre

0,8 et 9,2 % du poids sec. L'indigestible glucidique représente 10

à 15 % de la matière sèche et est constitué essentiellement par des

composés cellulosiques. Les teneurs en fer, calcium et phosphore

présentent une forte variabilité suivant les souches.

Sur la base des différents résultats obtenus à ce stade des

recherches, nous avons sélectionné, dans un premier temps, la souche

d'Aspergillus niger nO 10 pour la suite de nos travaux sur milieux

solides. En effet, cette souche possède une croissance relativement

rapide, elle produit de grand~quantités d'amyloglucosidase, la

N° de Protéines Indiges- Jla N x 6,25 Lipides Cellulose tible glu Cendres Fer Phosphore Calcium

souche cidiqueg % g % g % g % g % mg % mg % mg %

---..,.--~----....,.I--~~--~._~." .-..--"- ..... - ..- .... - 1-------_._--- .~-_.~----- ----------- ._-------- ----,.,..--"'---- ----------

7 3'~ .1 2,11 11,77 14,59 5,03 6,84 1 047 912b, •

10 41,2 l,Il 10,85 13,19 5,53 9,25 1 377 172

Il}f

39,0 0,85 7,66 9,36 5,23 7,88 1 384 87

12 40,6 2,36 12,42 13,05 5,84 8,79 1 428 172

13}f

46,8 9,17 13,34 15,00 5,52 7,02 948 137

24 40,9 7,86 7 , ,15 16,39 4,98 3,32 311 86

1

35 37,8 2,24 _. - 3,50 4,44 609 4651 37,8 B,ge 7,56 8,36 7,01 7,68 1 953 105

1

R. o. 52,3 6,32 .- - 4,77 5,17 785 8910 + C.u. 43,6 2,24 8,48 Il,56 7,14 7,37 1 798 135

135 + C.u. 37,6 2,02 - ,~. 5,02 5,98 991 91

TABLEAU V o. COf1POSITION ALIMENTAIRE DES SOUCHES CULTIVEES EN FEID-1ENTEUR

C. u.

xCandida utilis

contaminée par une levure

Alanine 7,67 100 de protéinesx

g pour g

Arginine 5,08 9li iD

Ac. Aspartique 7,51 9 " "1/2 Cystine 0,48 9 " "Ac. Glutarniq1.ll:l 10,71 9 n

Il

Glycocolle 4,62 9Ui "

Histidine 2,79 9QU li

Isoleucine 3,70 9 " "Leucine 6,52 9

li "Lysine 7,28 9 " "Méthionine 1,44 g li "Phénylalanine 3,47 9 n "Proline 2,46 9 " n

Sérine 4,36 9 " "Théonine 4,'17 9 " "'1' ryptophane

Tyrosine 3,40 9 Il "Valine 4,72 9 " "

x protéines N 6,25x

TABLEAU VI - CŒ'!POSI'l'ION EN ACIDES AMINES

DES PROTEINES DE LA SOUCHE N° 10

22

teneur de son mycelium en protéines est satisfaisante, et la quan-

tité de lipides intracellulaires est faible. La composition en

acides aminés de cette moisissure a été déterminée dans le labora-

toire ne M. DESCHAMPS à liIRCHA (tableau VI). Sa teneur en aminoa-

cides essentiels est bonne et favorablement comparable à celle

dUautres microorganismes utilisés pour lUalimentation.

23

III - RECHERCHE ET MISE AU POINT D'UNE METHODE D'ENRICHISSEMENT

EN MILIEU SOLIDE

Le but de nos recherches n'étant pas de produire une biomas-

se en milieu liquide, mais d'effectuer un enrichissement direct du

manioc en protéines par fermentation, nous avons été amenés à recher-

cher la technique la plus adaptée à la culture de microorganismes

sur des milieux concentrés en amidon. Nous avons utilisé essentiel-

lement une souche de moisissure amylolytique (A. niger nO 10) étant

donné l'aptitude de cet organisme à pousser sur de tels substrats.

Le premier problème qui se pose alors est celui de l'aéra-

tion. Le transfert d'oxygène dans un produit concentré et épais

semble au premier abord difficile à résoudre, et les risques de

fermentation anaérobie sont importants. Pour éviter cela, le subs-

trat ~ enrichir devra donc se présenter sous une forme telle qu'il

permette aux microorganismes en croissance de s'approvisionner

correctement en oxygène, tout en adoptant une technique d'aération

simple pour ne pas entrainer des dépenses d'énergie trop importantes.

Pour répondre à ces impératifs, nous avons essayé la culture de la

moisissure sur un milieu pâteux en couche de faible épaisseur, sur

un milieu pâteux agité dans un malaxeur et sur des milieux plus

concentrés en amidon, mais structurés et poreux (substrats "solides").

Le développement du myceliurn de la moisissure dépendre éga~

lement de l'homogénéité de la répartition de l'inoculurn et des sels

minér~ux ajoutés dans la masse du substrat; il dépendra également

du degré de digestibilité de l'amidon par le germe ou son amylase.

Ces paramètres dépendent des traitements physiques et du mode de

conditionnement du produit avant la phase d'enrichissement: cuis-

son, séchage, malaxage, extrudation.

Un autre point capital à considérer est celui des risques

de contaminations par des bacteries ou des levures, ou par d'autres

souches de moisissures. On doit pouvoir les éviter en se plaçant

dans des conditions de culture favorables au développement du myce-

liurn et défavorables à celui d'autres microorganismes: faible teneur

24

en eau du produit, pH acide, température assez élevée. Quant à la

contamination par diautres moisissures, c1est essentiellement un

problème de taille de l~inoculum et de sélection de souches compé-

titives.

Il faudra enfin résoudre le difficile problème du contrôle

du développement du myceliurn et celui de la sporulation. En effet,

puisque le produit enrichi est destiné à lialimentation, ses quali-

tés organoleptiques devront être satisfaisantes. Or un produit for-

tement sporulé serait vraisemblablement inutilisable. Diautre part

tant que le mycelium se trouve dans une phase de croissance végéta-

tive, sa composition diffère peu de celle diune levure ou d'une

bacterie, et il accumule peu de métabolites exocellulaires. Par

contre, quand il entre dans une phase de dégénérescence et de fruc-

tification, les métabolites sont beaucoup plus nombreux et les

risques de production de substances toxiques augmentent rapidement.

A partir des considérations que nous venons d1indiquer, nous

avons effectué une première série diexpériences ayant pour but le

choix de la technique d'enrichissement la plus appropriée. Pour

cela nous avons testé plusieurs possibilités : milieu pâteux en

couche de faible épaisseur, milieu pâteux malaxé en permanence,

manioc cru coupé en petits morceaux et aéré et substrats solides

aérés.

1. - Choix de la technique dienrichissement

Rappelons d1abord les différents modes de conditionnement

et les conditions d'incubation que nous avons utilisés:

Milieu pâteux - A 1 kg de tubercule de manioc cuit à la

vapeur (à 70 % dieau environ) nous avons ajouté 45 g de sulfate

d'ammonium, 15 g de phosphate monopotassique et 1 litre d1eau du

robinet. Le produit a été broyé dans un mixer. On a alors ajouté

50 ml d'une préculture diA. niger nO 10 et de llacide phosphorique

dilué au 1/10e pour amener le pH de la pâte à 3,5. Lihumidité du

produit était alors de no % environ.

25

Pour les cultures en couche de faible épaisseur, la pâte

a été versée dans des boîtes de Pétri de 4 mm et 8 mm de profondeur

qui n'ont pas été recouvertes. Elles ont été incubées en atmosphère

saturée d'humidité à 30°C pendant 48 heures.

Pour les cultures en milieu pâteux agité, la pâte a été

versée dans un malaxeur thermostaté à 30°C. LOagitation était ef-

fectuée au moyen d'une pale permettant d'homogénéiser et d'aérer

le produit, sur une profondeur de 10 à 15 cm environ. L'incubation

a duré également 48 heures.

_. Manioc cru - Le manioc frais a été coupé en fines lamel-

les de 1 à 2 cm de long. A 500 g du produit obtenu, nous avons

ajouté par aspersion 100 ~l d'une solution à pH : 3,5 contenant

22,5 g de sulfate d'ammonium, 7,5 g de phosphate monopotassique et

l'inoculum d'A. niger sous forme de spores.

La moitié du produit obtenu a été placée sur un plateau en

couche de 1 cm et . incubé à 30°C pendant 72 heures en atmosphère

saturé d'eau.

L'autre moitié du produit a été placée dans un flacon laveur

dont le fond était muni d'une plaque de ve~re fritté. Le produit

formait ainsi une colonne de 5 cm de diamètre et 15 cm de hauteur

environ. Le flacon a été placé dans un bain-marie thermostaté à

30°C, et aéré par un courant d'air ascendant préalablement

humidifié. L'incubation a duré également 72 heures.

- Produits "solides~ - Pour la fabrication de ces produits

nous avons utilisé de la farine de manioc séché, cru ou cuit. L'uti-

lisation d'une farine permet une répartition homogène de l'inoculum

et des sels dans la masse du produit. Pour 100 9 de farine, nouS

avons ajouté de façon homogène une solution à pH ~ 3,5 contenant

l'inoculum de spores d'A. niger nO 10, 15 9 de sulfate d'ammonium

et 5 9 de phosphate monopotassique. Dans le cas de la farine de

manioc cuit, le volume de cette solution est de 150 ml, ce qui

fournit un produit à 55 % d'eau environ. Dans le cas de la farine

de manioc cru, cette quantité d'eau est trop importante et ne

26

permet pas d'obtenir une structuration par la suite, étant donné que

la capacité d'absorption de l'eau par cette farine est plus faible.

Nous avons donc ajouté seulement 100 ml d'eau dans ce cas, ce qui

fournit un produit à 45 % d'eau environ.

La pâte solide obtenue est pétrie vigoureusement et passée

à travers un tamis ayant des mailles de 4 ~~. On obtient alors un

produit finement granuleux qui est versé dans des flacons laveurs

dans les mêmes conditions que précédemment. L'incubation à 30°C a

duré 48 heures.

A la fin des incubations, les protéines ont été dosées par

la méthode de LOWRY et les sucres résiduels suivant le protocole

décrit dans le chapitre des méthodes. Des observations microscopiques

ont été faites sur les produits obtenus pour avoir une estimation

du taux de contaminations. Les résultats obtenus sont rapportés

dans le tableau VII.

Les teneurs en protéines obtenues à partir du milieu pâteux

en couches minces ont été satisfaisantes, mais la sporulation se

produit facilement et on observe une très forte proportion de con-

taminants bactériens. Il semble donc raisonnable d'écarter ce type

d'enrichissement.

Le produit obtenu en malxeur est essentiellement le résultat

d'une fermentation par un mélange de levures qui supplantent spon-

tanément la moisissure, montrant ainsi que les conditions de cul-

ture sont favorables aux levures et défavorables au dfveloppement

du mycelium. Ce type d'enrichissement doit donc être également écarté.

L'enrichissement direct sur manioc cru est assez faible,

malgré une durée d'incubation importante. De plus la sporulation

est alors très rapide. Le principal obstacle dans ce cas, vient du

fait que le mycelium a de la difficulté à pénétrer dans ce substrat

très solide et au fait que l~amidon cru est peu accessible aux amy-

lases.

--------~---------I------_._-- -----.----PROTEINES

_._~--_._-~--------------I-....._----~--

g pour g pour100 9 de % du 100 g demanioc poids sec maniocsec au sec audépart départ.---------I----------I----------I--_._-_.-----~-------_.---------

OBSERVATIONSSUCRES RESIDUELS

% du'poids

secfinal

CONDITIONNEMENT

· l1ILIEU PATEUX.- en couche de 4 mm 10,9- en couche de 8 mm 8,5- en malaxeur 6,5

9,4

7,5

6,2

61,8

77,4

nd

53, ~-:;

67,7

nd

- sporulation en surface,très fortes contamina-tions bactériennes.

- faible développementmycelium supplanté parun mélange de levures

· MAN'IOC CRU- sur plateau 7,4 nd 65,1 nd - très forte sporulation.- en fiole aérée 5,1 nd 74,0 nd - sporulation

· PRODUIT IIS0LIDE"AERE~-

- farine crue 6,1 5,9 44,5 42,7 - sporulation~ farine qu~te 10,2 10,1 46,7 46,3 - faible tendance à la

sporulation tardive,bon développement myce-lium.

TABLEAU VII - RESULTATS CONCERNANT LES DIFFERENTS TYPES DE CONDITIONNEMENT

27

Les meilleurs résultats ont été obtenus à partir des produi.ts

"solides" conditionnés à partir de farines séchées. La consommation

des sucres a été en effet très nettement supérieure ici à ce qu'elle

est dans les autres types de fermentation. La teneur en protéines

obtenue à partir de farine de manioc cuit (10 %) est encourageante.

Celle plus faible obtenue à partir de farine de manioc cru, était

peut être dûe à la faible teneur en eau du produit (43 %). On remar-

que de plus que dans ce type d'enrichissement, la tendance à la spo-

rulation est beaucoup plus faible, et que le taux de contaminations

bactériennes est très réduit.

Nous avons donc poursuivi les expériences dans cette direc-

tion et nous avons mis au point une méthode d'enrichissement en uti-

lisant la technique de conditionnement de farine de manioc cuit.

2. - Mise au point d'une méthode d'enrichissement

Les différents essais que nous avons faits nous ont conduits

à l'élaboration d'une méthode d'enrichissement dont nous rappelons

ici les principales caractéristiques.

Cette méthode est bas8e sur le conditionnement du substrat

amylacé en petits agrégats de diamètre inférieur à 4 mm, possédant

une teneur en eau déterminée et uniformément inoculés dans leur masse

par des spores de champignons.

Cette structure granuleuse permet à un flux d'air humidifié

de traverser aisément la masse du produit pendant toute la durée de

l'incubation, ce qui a pour conséquence d'apporter l'oxygène néces~

saire à la croissance du myceliurn tout en évitant une dessiccation

rapide du produit. Grâce à l'échauffement de l'eau contenue dans l'&ir,

une partie des calories dégag2€s lors de la fermentation peut être

transportée à l'extérieur.

Etant donné la structure fineQent granuleuse du produit, la

surface de contact avec le flux d'air est très importante, ce qui

permet un bon transfert de l'oxygène. Par ailleurs, un tassement

28

régulier du produit dans l'incubateur permet d'éviter la sporulation,

même avec des moisissures comme A. niqer qui ont une très forte

tendance à sporuler sur un milieu solide.

Au cours de l'incubation, le produit amylacé est peu à peu

envahi par le mycelium. Celui-ci se développe aussi bien à l'inté-

rieur qu'à la surface des grains qui se trouvent ainsi. reliés entre

eux. Ceci provoque une prise en masse du produit enrichi qui acquiert

une consistance solide spongieuse et aérée.

Pour obtenir le conditionnement granuleux du produit nous

opérons de la façon suivante. Les tubercules de manioc sont cuits

à la vapeur 15 mn à 110°C, puis séchés dans un courant d'air chaud

et réduits en poudre. Dans le volume d'eau nécessaire pour amener

le produit à l'humidité désirée, on dissout les sels minéraux indis-

pensables à la croissance du myceliurD (phosphate de potassium, sul-

fate d'ammonium, urée) et on ajoute l'inoculum de spores. Le pH est

ajusté convenablement et le liquide obtenu est ajouté progressivement

à la farine qui est malaxée de façon à obtenir une pât8 très consis-

tante bien homogène. Celle-ci est passée à travers un ta~is dont

l'ouverture des mailles est de 1 mm. On obtient alors un produit

granuleux que l'on transfère dans liincubateur.

Au cours des expériences préliminaires, nous avons utilisé

co~me incubateurs, des flacons laveurs de 500 ml munis d'une plaque

de verre fritté. Cependant leur utilisation présentait un certain

nombre d'inconvénients. Le remplissage de ces flacons nécessitait

la préparation de quantités importantes de produit. Pour suivre les

cinétiques de croissance, il était nécessaire de vider entièrement

le flacon, d'homogénéiser son contenu, de faire les prélèvements

et de le remettre dans le flacon. Ceci entrainait des perturbations

importantes de la croissance du myceliurn. Bnfin, ce dispositif ne

permettait pas une bonne régulation de la température.

C'est pourquoi, nous avons mis au point, pour les besoins

des analyses de laboratoire un dis~ositif d'incubation simple dont

nous donnons une représentation schématique sur la figure 3.

1 rn f'I""\

" t t c

a 22 l'

C lJn d itiO!1f'é

1 ~, C !l f' (J f~

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or--

') 1 0::: P 0 si t d i "1 ~_. li bai 0 n po u (' a n 3 Il, s f' S de lilbc atoire

29

Ces tubes peuvent contenir chacun 20 g de produit granuleux,

ce qui est largement suffisant pour les analyses que nous avons à

effectuer. Leur faible diamètre permet un bon échange thermique

avec l'eau du bain-marie dans lequel ils sont immergés. La tempé-

rature du produit est alors remarquablement stable tout au long de

la fermentation et est égale à celle du bain-marie.

L'aération de chaque tube est réglée par une vanne à un

débit constant, ce qui rend les éléments indépendants et permet

d'en prélever certains sans perturber les autres.

LUair est préhumidifié par passage dans un flacon laveur à

température ambiante, puis saturé à la température du bain-marie

par barbotage dans le réservoir d'eau placé à la base de chaque

tube.

Nous disposons actuellement d'une série de 24 éléments

d'incubation. Cela permet en particulier d'effectuer des études

cinétiques de la croissance, en faisant des analyses sur quatre

répétitions à six temps d'incubation. Ou bien en fixant une durée

d'incubation identique pour tous les tubes, il est possible d'ef-

fectuer des expériences permettant d'apprécier l'influence de cer-

tains paramètres.

La réalisation de systèmes d'incubation de taille plus

importante posera sans doute un certain nombre de problèmes et fera

l'objet d'une étude séparée. La température, en particulier devra

être contrôlée. En effet, une étude préliminaire sur un dispositif

contenant 2 kg de produit a montré que la température au sein du

produit pouvait s'élever jusqu'à 48°C. Une possibilité de régula-

tion pourrait être fournie par l'adjonction contrôlée, au sein du

produit, de petites quantités d'air froid.

Il reste c~pendant qu'un tel type d'incubateur fait appel

à une technologie très simple, puisqu'il ne nécessite pas, comme

c'est le cas pour la plupart des fermenteurs liquides, de conditions

stériles et d'agitation mécanique importante.

30

IV - ETUDES DES PARANETRES DE FEroqENTATION EN MILIEU SOLIDE

Nous n 8 avons. que peu de données concernant les paralnètres

de croissance des moisissures en général, et pratiquement aucune

dans les conditions où nous opérons. Nous avons donc été amenés à

étudier l'influence des paramètres que nous pouvons facilement

contrôler, afin de pouvoir définir les conditions permettant de

synthétiser le maximum de protéines pour la consommation minimum de

sucres. Par ailleurs, au cours de cette étude nous nous somm~ef

forcés de déterminer les conditions permettant dUobtenir un produit

enrichi présentant des garanties suffisantes pour une utilisation

en alimentation animale. En particulier nous avons veillé à sup-

primer ou à réduire au maximum la sporulation et les risques de

contaminations bactériennes.

Nous avons donc effectué des études cintiques de la crois-

sance du mycelium et de l'enrichissement en protéines, en faisant

varier chacun des paramètres pris isolément. Cette méthode est

critiquable dans la mesure où elle ne tient pas compte des interac-

tions éventuelles entre ces différents paramètres. Cependant ellenous a permis de progresser rapidement.

Nous nous sommes efforcés dans la mesure du possible, de

standardiser au maximum les conditions expérimentales, afin de ne

pas introduire des causes de variations indépendantes du paramètre

étudié. En particulier, nous avons veillé à utiliser des inoculums

de spores préparés toujours dans les mêmes conditions.

LVinoculum a été préparé à partir dVun erlenmeyer de 250 ml

contenant 10 g de milieu pâteux ~ 70 % dVeau,stérilisé , et qui a

été ensemencé une semaine à IV avance. On ajoute 200 ml d 8 eau du

robinet et une goutte de détergent. Les spores sont mises en suspen-

sion par agitation magnétique pendant 10 Ininutes. Le contenu de 11

lUerlenmeyer est alors passé à travers un fin tamis de 0,5 mm pour

éliminer le mycelium et est à ajusté à l litre. Cette quantité de

spores peut servir à inoculer 2 kg de farine.

31

En fonction de la quantité de farine utilisée, on prélève

donc le volume de suspension de spores nécessaire auquel on ajoute

la quantité d'eau permettant d'obtenir l'humidité requise du pro-

duit. On dissout alors les sels minéraux et on ajuste le pH à la

valeur désirée avec de l'acide phosphorique ou sulfurique dilué

au liSe.

Le liquide obtenu est alors ajouté progressivement à la

farine. Cet instant est compté comme temps zéro. Après homogénéi-

sation énergique, on laisse la pâte reposer pendant 10 mn, puis

on la passe à travers le tamis de 4 mm. Le produit obtenu est

placé dans les tubes en quantité déterminée (en général 20 g) et

en effectuant un tassement très modéré. Les tubes sont alors placés

dans le bain thermostaté jusqu'à leur prélèvement pour analyse. Le

débit d'air est réglé grâce à l'emploi d'un débit-mètre.

Au moment de leur prélèvement les tubes sent vidés de

leur contenu qui est pesé, puis après une homogénéisation correcte,

des échantillons sont prélevés pour la détermination de l'humidité,

de la teneur en protéines vraies, de la quantité de sucres résiduels,

du pH, etc •.•

Pour les études suivantes, nous avons toujours utilisé

la souche d'Aspergillus niger nO 10 que nous avons sélectionnée

précédemment.

1° _0 Influence de la teneur en eau initiale du produit

L'humidité du produit joue un rôle capital dans ce type

de fermentation. En effet, elle influence fortement la vitesse

de croissance du mycelium, mais également la germination et la

sporulation (14). Il ne faut cependant pas confondre l'humidité

relative et la teneur en eau du substrat. En effet, pour une tem-

pérature donnée, à chaque teneur en eau du substrat correspond une

certaine humidité relative représentant l'état de liberté de l'eau

dans le substrat. C'est ce dégré de liberté de l'eau, variant donc

avec la température qui aura une influence déterminante sur la

croissance du mycelium.

32

Par ailleurs, lihumidité du produit est en relation avec

la pression osmotique qui joue un rôle sélectif sur la croissance

des microorganismes. En effet, contrairement aux levures et aux

bactéries, les moisissures tolèrent et même préfèrent en général,

des milieux à pression osmotique élevée (très riches en glucides

par exemple). Ce facteur, lié à liutilisation diun pH acide, permet

dieffectuer des enrichissements dans des conditions non stériles,

sans avoir de contaminations importantes.

Enfin, la teneur en eau aura également une influence sur

la porosité du produit, une humidité excessive pouvant être un obs-

tacle à la diffusion des gaz au sein des agrégats.

Pour ces différentes raisons, nous avons été amenés à

déterminer le seuil d'humidité qui permet le meilleur enrichissement

en protéines.

Dans un premier temps nous avons étudié les cinétiques

d'enrichissement obtenues à partir de teneurs en eau allant de 35

à 60 %. Après avoir déterminé une durée d'incubation optimale

(30 heures) nous avons alors réalisé une expérience de contrôle avec

six humidités étalées de 42 à 60 % (figures 4 et 5) •

Les sels minéraux ont été ajoutés dans les proportions

suivantes : pour 100 g de farine de manioc, on a apporté 5 g de

phosphate monopotassique; Il,25 g de sulfate d'ammonium et 1,7 g

d'urée; ceci correspond à une dose de 25 % d'azote apportée sous

forme d'urée. La solution obtenue et contenant lUinoculum de spores

a été ajustée à pH : 3,0. Les incubations ont été réalisées à 30°C

avec une aération de 4 litres d'air par heure et par tube.

Les résultats obtenus montrent qu'il existe un optimum

d'humidité se situant entre 50 et 55 % dieau. Avec un produit trop

sec la phase de germination est très longùe et la croissance du my-

celium est ralentie. Avec nes teneurs en eau initiales supérieures

à 55 %, lienrichissement en protéines n'augmente pas sensiblement,

par contre les risques de contaminations bactériennes sont plus

Protéines (grammes pour100 g de farine demanioc)

Sucres résiduels (grammes

pour 100 g de farinede manioc)

Rendement

71,(

1

!54111 23 ,5%

1 3,0

1

,

III 7,

'------..........,1

60,1 % !--------1

1jj

1

1

1

1

13,0

71,1

23,9%

13,8

50,9

3,1

23,2%

70,4

1 13,6j

1

1j

50,31

1

1!

53,51

1 25,7%

1 3,211

4,1

28,6%

63,6

,1

125,7%1

581, 1

i

11

11 76,71

111lt

secinitial)

1

1! pH11L

111

î

1 Poids sec (% du poids

1

111

TABLEAU VIII - INFLUENCE DE LA TENEUR EN EAU INITIALE DU PRODUIT AMYLACE 1APRES 30 HEURES D'INCUBATIONo

Les résultats concernent l'expérience de contrôle représentée sur lafigure 5. Le rendement correspond à la quanti té de Yirotéines néoforméessur la quantité de sucres consommés.

g 100 9 de farine

au départ .

5

/'

10. 20• 30. 40heures+ ....Fig.4 Cinétiques de production de protéines avec différentes

humldi tés in iLales.

l

l------f------t------~-----1

-

15t1

lJlL100li)!lJl.Ë! ~.G)" U.... 1:"

~~I

33

élevées, surtout pendant les quelques premières heures d'incubation

représentant la phase de germination des spores. L'expérience de

contrôle que nous avons réalisée confirme ces résultats. On notera

(Tableau VIII) que nous avons obtenu des rendements de transfor-

mation des sucres consommés en protéines particulièrement élevés

dans cette expérience.

Nous noterons également qu'au cours de l'incubation il se

produit une humidification progressive du produit. En partant d'une

teneur initiale de 50 % d'eau, on obtient un produit enrichi conte-'

nant environ 63 % d'eau. Cette humidification n'est pas liée à la

seule perte de poids sec, car la quantité d'eau totale dans l'échan-

tillon augmente en fonction de l'enrichissement en proteines et de

la croissance du myceliurn. Elle est dûe vraisemblablement à l'eau

métabolique produite lors de la dégradation du glucose.

Malgré cette augmentation de la teneur en eau totale, on

peut se demander si la quantité d'eau dans le produit amylacé rési-

duel est suffisante en fin d'incubation. En effet, le myceliurn de

la moisissure cultivée en milieu liquide, possède une teneur en

eau voisine de 80 %. Cet-te eau de ~onstitution cellulaires n'étant

pas de l'eau libre, la teneur en eau dans le produit amylacé rési-

duel peut être inférieure à 40 %, ce qui pourrait être une des

causes de l'arrêt de la croissance. Des expériences complémentaires

devraient être réalisées pour vérifier cette hypothèse.

2. - Influence de la température

La température joue un rôle prépondérant sur la croissance,

la germination et la sporulation des moisissures, mais aussi leur

métabolisme. En fait l'influence de la température sur les moisis-

sures est complexe. En particulier, les températures extrêmes de

croissance, de germination et de sporulation peuvent être très

différentes (14). La thermotolérance est très variable suivant les

espèces; A. niger tolère une température de croissance de 50o e,mais pousse encore à 20°C. Sans avoir étudié tous les aspects de

ce problème, nous avons voulu déterminer pour la souche diA. niger

9/1009 de farine

fi)

QIc::-.C)....o..0.

au départ.

1

~1O1

5

. ....30 heures20,10.Fig.6 Cinétiques de production de protéines à différentes

températures d'incubation.

34

que nous utilisons, les meilleures conditions d'incubation et savoir

en particulier quelle était la température qui fournissait le meil-

leur enrichissement pour une durée minimum.

Pour cela nous avons réalisé des études cinétiques de la

croissance à 30, 35, 40 et 45°C dans les conditions standard décrites

plus haut, en utilisant un produit initial à 50 % d'eau. Les résul-

tats qui sont rapportés sur la figure 6 montrent que les meilleurs

enrichissements sont obtenus pour une température située entre 35

et 40°C. A partir de 45°C, nous avons observé une augmentation im-

portante de la phase de germination; cependant, une fois commencée,

la croissance du mycelium semble aussi rapide qu'à une température

plus basse. Ceci indique que la souche que nous avons utilisée peut

supporter des variations de température importantes sans que la

croissance de son mycelium 8n soit très sensiblement modifiée. Par

contre, la germination des spores est ralentie lorsque la tempéra-

ture dépasse 40°C. La température optimale apparemment élevée pour

la germination peut s'expliquer par le fait que l'élévation de la

température nUa pas qu'un effet thermique, mais qu'elle agit égale-

ment sur le degré de liberté de l'eau dans le produit, facteur très

important pour la germination.

La thermotolérance d'une telle souche permet donc d'envi-

sager un enrichissement ne nécessitant qu'un contrôle grossier de

la température, avec un démarrage vers 35°C et un refroidissement

partiel empêchant celle-ci de s'élever au dessus de 45°C.

35

3. - Contrôle "autogène" du pH

Le pH du milieu est un facteur essentiel dans ce type de

fermentation. Il doit être suffisamment acide dès le début pour

éliminer les risques de contaminations. Cependant lors de la crois-

sance, il se produit une acidification très importante qui amène

rapidement le pH en dessous de 3, quand on part d'un mélange de

phosphate monopotassique et de sulfate d'ammonium. Cette forte aci-

dification tend à ralentir et même à stopper la croissance du myce-

lium et l'enrichissement en protéines. C'est pour cette raison que

nous avons cherché un moyen simple de contrôler le pH, en apportant

l'azote sous forme d'un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée.

READE et GREGORY (7) ont observé qu'en partant d'un milieu

liquide à pH: 3,5 et en apportant tout l'azote sous forme d'urée,

le pH était pratiquement stable tout au long de la phase de crois-

sance d'A. fumigatus, ce qui leur permet de supprimer les appareils

de contrôle et de régulation de ce. paramètre.

L'urée présente l'avantage de ne pas libérer d'acide minéral

fort dans le milieu lors de son assimilation, comme c'est le cas

avec le sulfate d'ammonium. En léger excès, son hydrolyse conduit à

l'accumulation d'ammoniac qui peut compenser une éventuelle acidi-

fication par des métabolites acides. Cependant si l'excès est trop

important, il peut entrainer une alcalinisation trop forte, favora-

ble aux cont~ninations.

Il apparaît donc qu'un mélange de sulfate d'ammonium et

d'urée peut avoir un effet tampon sur le pH du milieu et donc favo-

riser la croissance du myceliQm. Nous avons fait des expériences

dans cette voie pour déterminer les conditions optimales d'utilisa-

tion de l'urée.

Une série d'expériences préliminaires a été effectuée en

utilisant les dispositifs d'incuhation en flacons laveurs. Des études

cinétiques de croissance ont été faites sur des produits ayant reçu

des doses croissantes d'urée, la quantité d'azote total étant cons-

tante.

• Protéines"'Ji(9 1009 de farine au départ)

12

9

6

3

11Sucres1résiduels1(9 .·100g del.! farîneaudépart)11

i\.50

1

11

24 40 48 62

Fig 7 Cinétiques avec différentes doses d 'azote sous forme d ·urée.

36

Pour 100 g de farine de manioc on a ajouté 5 g de phos-

phate monopotassique et l'azote suivant le tableau ci-dessous:

% d'azote sousforme d'urée

, Sulfate d'ammoniumg/100 g de farine

Uréeg/100 g de farine

0 15,0 0

10 13,5 0,68

20 12,0 1,35

40 9,0 2,70

60 6,0 4,05

Le produit initial contenait 50 % d'eau. L'inoculurn était

constitué par du mycelium d'A. niger provenant d'une culture liquide

de 48 heures, ce qui explique la teneur initiale en protéines rela-

tivement élevéeo Le liquide contenant les sels minéraux et l'inocu-

lurn a été ajusté à pH : 3,50 Chaque flacon contenant 140 g de pro-

duit a été incubé à 30°C et aéré à raison de 10 litres/heure/flacon.

Comme nous ne disposions que d'un dispositif par dose d'urée, à

chaque prélèvement le contenu est homogénéisé, les échantillons

prélevés et le reste replacé dans le flacon.

Malgré les perturbations ainsi apportées, nous avons obser-

vé (figure 7) une influence très nette de la dose. d'urée sur l'évo-

lution du pH du produit et sur sa tGneur en protéines, montrant ainsi

l'effet bénéfique de l'apport d'urée jusquQà une certaine dose. La

dose optimale d'urée dans ce cas est assez basse car le pH initial

du produit était relativement élevé.

Nous avons par la suite fait une seconde série d'expérience,

dans les conditions standard en utilisant les 24 dispositifs d'in-

cubation dont nous disposons, et en abaissant plus fortement le pH

initial du produito

37

Après une série d'études cinétiaues portant sur des produits

ayant reçu des doses croissantes d'urée, qui ont confirmé les

résultats que nous avions observés dans les expériences préliminaires,

nous avons effectué une exnérience de contrôle portant sur 6 doses

d'urée allant de 0 3 100 %. Tous les prélèvements ont été faits

après 30 heures d'une incubation ~ 35°C et comportant une aération

de 4 litres/heure/tube. Cette durée d'incubation correspond au pic

de production de protéines, qui a été déterminé grâce aux études

cinétiques. Pour obtenir un pH initial du produit contenant 50 %

d'eau de 3,5, la solution contenant les sels minéraux et l'inoculum

de spores a été ajusté à pH ~ 2,25 avec de l'acide sulfurique.

Les résultats qui sont rapportés sur la figure (8) montrent

que dans ces conditions, la quantité d'urée à apporter pour obtenir

le meilleur enrichissement en protéines correspond à 50 - 60 % de

l'azote total. Au delà de cette dose, la quantité de protéines

synthétisées n'augmente pas, et on assiste à une nette augmentation

du pH.

On remarque que le fait d'apporter le mélange d'urée et

d'ammoniaque dans les proportions optimales a pour conséquence de

doubler la quantité de protéines synthétisées par rapport à celle

obtenue lorsqu'on n'utilise que du sulfate d'ammonium, tout en

évitant les contamin2tions.

Il faut toutefois remarquer que l'apport d'urée favorise

également la consommation des sucres, et que pour des doses élevées,

si la quantité de protéines n'augmente pas, la consommation des

sucres est pratiquement totale. Ceci a pour conséquance d'abaisser

le rendement global de transfornation en protéines. On peut alors

se demander si on a intérêt R augmenter au maximum la quantité de

protéines formées, ou si on peut se contenter d'en produire un peu

moins, mais avec un bon rendement de transformation et obtenir un

produit enrichi contenùnt encore une quantité plus importante de

sucres résiduels.

l/lq)

l/l :J~ ~c: l/l

,q) ,q).... .. c.0 l/l.. q)c. ..

(Jjl/l

10 100

B

5~50

6

--..--..... --

% uréeo'-----::-------="=:------~~-----~------~'~-----1':":0~·0~............o 20 40 60 80

Fig.B Protéines. sucres rés iduels (g 100 9 de fa rine au départ)

et pH en fin dïncubation avec différentes doses d'urée.

••--e. Protéi nes .....-_..... Sucres résiduels

38

Des expériences complémentaires devront être faites, mais

nous avons montré qu'il est possible de contrôler et d'orienter

l'enrichissement en jouant à la fois sur le pH du produit et sur

la dose d'urée.

4° - Influence de l'aération

La quantité d'oxygène mise à la disposition des moisissures

pour leur respiration est un facteur important de leur développement.

La plupart des moisissures sont a8robies, mais les besoins en

oxygène varient suivant les espèces, certaines étant même capables

de se développer en atmosphère d'azote.

Par ailleurs de faibles quantités de CO2

sont nécessaires

à la germination des souches d'A. niger, alors que des concentra-

tions trop importantes inhibent leur développement (14).

On voit que l'aération du produit amylacé est un facteur

très important puisqu'elle agit au niveau de la germination des

spores, et lors de la croissance du mycelium en apportant l'oxy-

gène nécessaire, et en transportant une partie des calories dégagées.

Nous n'avons pas étudié en détail tous les aspects de cette

question qui sera reprise de façon plus approfondie dans une étude

séparée, sur un dispositif d'incubation de taille plus importante,

le matériel dont nous dis?osons actuellement ne nous permettant

pas d'effectuer des réglages de déhits avec une assez grande pré~

cision.

Nous avons seulement voulu vérifier que le débit d'air que

nous avions fixé arbitrairement était suffisant pour apporter

l'oxygène nécessaire à la croissance du mycelium dans les disposi-

tifs d'incubation que nous utilisons.

Pour cela nous avons effectué une expérience sur de la

farine de manioc prGparée dans les conditions standard décrites

19/ 1 oog de ,farine ...1au depart. 1III T Tcp •

c: 1 1.«> 1

-ft- 1 i0 10...1Q. l1

5

o 0.5 2 4 6 Il h 8

10

9 11009 de farineIII«> au départ.c:

-QI15tt

Fige9 Production de protéines avec différentes aérations après

22heures ........ et 30 heures .. •• d'incubation.

10 20 30 heures. .......

Fig.10 Product ion de protéines avec différentes concentrations de

lïnoculum.

39

précédemment: 50 % dOeau, 25 % d'urée, 30°C. Nous avons utilisé

5 débits d'air allant de 0 à 8 litres par heure par tube. Nous

avons fait les analyses après 22 heures et 30 heures d'incubation,

en prélevGnt 3 tubes, servant de répétitions, pour chaque débit.

Les résultats sont rêpportés sur la figure 9.

Les produits qui n'ont pas été aérés présentent une teneur

en protéines nettement plus faible que les autres montrant ainsi

la nécessité d'une oxygénation continue du·produit pendant l'in-

cubation.

Les produits aérés avec 0,5, 2 et 4 litres/heure donnent

des résultats identiques. Le produit qui a reçu un débit d'air de

8 litres/heure, semble par contre acquérir une teneur en protéines

plus élevée. Il est possible que la prolifération du mycelium gène

la diffusion de l'oxygène et qu'un débit d'air élevé, en fin d'in-

cubation soit favorable au développement du mycelium.

Nous n'avancerons pas plus dans nos conclusions, cette

expérience devant être reprise ultérieuremont de façon plus com-

plète, et en particulier en relation avec la régulation thermique

du produit par le transport des calories dégagées.

5° - Densité de l'inoculum de spores

L'inoculum doit être suffisant pour assurer un ensemen-

cement homogène du produit et un démarrage rapide de la croissance.

Il ne doit cependùnt pas être trop important, d'abord pour des

raisons pratiques et économiques, ensuite parce qu'une densité

trop élevée de spores peut entraîner des phGnomènes d'inhibition

et gèner 1~ germination d'un certain nombre d'entre elles. Il ne

serait pas judicieux d'introduire une quantité de spores qui ne

germeraient pas et que l'on retrouverait intactes et gènantes dans

le produit enrichi. Par ailleurs, avec un souche d'A. niger un

inoculum trop dense fournit au produit une couleur grise peu at-

trayante qui persiste en fin de fermentation.

40

Pour déterminer la quantité adéquate de spores à apporter,

nous avons fait des études cinétiques d'enrichissement de produits

ayant reçu 3 doses de sporeso

L'inoculum de base est constitué ?ar une fiole contenant

10 g de produit pâteux, ensemencée à l'anse avec des spores et

incubée une semaine à 30°C. Le produit obtenu est alors fortement

sporulé. Des comptages microscopiques effectués sur les suspensions

de spores pr&parées suivant le protocole que nous avons décrit au

début de ce chapitre, montrent qu'une telle fiole renferme approxi~

mativement 401010 spores. Les inoculuns ont été préparés à partir

d'une telle fiole de façon ~ obtenir 4 x 108 ,4 x 107 ou 4 x 106

spores par gra~~e de farine. Nous avons par ailleurs adopté les

conditions standarŒ de prépnration et d'incubation du produit (50 %

d'eau., 25 % d'urée, 30°C et débit de 4 litres par heure par tube) 0

Les résultats sont rasse~blés sur la fiqure (10) 0

Le produit ayant reçu l'inoculum le plus concentré démarre

plus rapidement, cependant la croissance s'arrête plus tôt et

brusquement. Par ailleurs un examen rnicroscopique du produit final

révêle qu'une proportion importante de spores n'ont pas gerrn&. Les

cinétiques correspondant aux deux autres inoculations sont voisines,

le produit ayant reçu la dose movenne de spores fournissant un

enrichissement légèrement supérieur. L'examen microscopique montre

que très peu de spores n'ont pas germé dans le produit inoculé â

4.107 spores/g, et aucune spore n'a pu être observée dans le pro-

duit final ayant reçu 4.106 spores/gramme. Par ailleurs dans les

deux cas, le produit obtenu Gtait bien blanc et présentait un aspect

très favorable, alors que dans le premier cas le produit obtenu

était gris.

J:·Jous pouvons donc conclure que la dose d' inoculum habi~

tuellement utilis8e lors des expériences précédentes, qui corres-

pondait à un ensemencenent de 2 kg de farine pour une fiole d'ino-

culurn soit environ 2 x 107 spores par gramme de farine était large-

ment suffisante, pour obtenir un enrichissement correct, mais

qu'elle n'était cepenàant pas excessive.

41

6. - Conclusion

La méthode d'enrichissement que nous avons mise au point

nous parait très satisfais~nte et le dispositif d'incubation que

nous avons utilisé pour les analyses de laboratoire d'un emploi

simple et pratique. Il nous a nermis d'effectuer un grand nombre

d'expériences d'enrichissement, montran