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OO domíniodomínio BacteriaBacteria compreendecompreende asas eubactériaseubactérias (bactérias(bactérias verdadeiras)verdadeiras) ee asascianobactériascianobactérias.. OO domíniodomínio ArchaeaArchaea compreendecompreende bactériasbactérias (arqueobactérias)(arqueobactérias)frequentementefrequentemente encontradasencontradas emem ambientesambientes extremos,extremos, comocomo pântano,pântano, fontesfontes termais,termais,fundofundo dede oceanos,oceanos, salinas,salinas, vulcõesvulcões ee fontesfontes ácidasácidas..

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LUCA = Last Universal Common AncestorOs procariotos são considerados uma das mais bem sucedidas formas de vida,tendo-se adaptado às condições mais extremas encontradas na face da Terra.

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Replicon: qualquer molécula de DNA que tenha a capacidade de se replicarautonomamente.A razão pela qual esses organismos são tão ubíquos deve-se à simplicidade eplasticidades de seus genomas.

Plasticidade genômica é a propriedade dinâmica do genoma que pode envolverganho, perda ou rearranjo do DNA. A compreensão da heterogeneidadebacteriana e dos métodos que levam a bactéria a essa plasticidade é de grandeinteresse para estudos evolutivos, epidemiológicos e filogenéticos.

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Mb = megabase = 1.000.000 pb (pares de bases)

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Alguns gêneros, como Agrobacterium, Borrelia, Rhizobium e também a espécie Bacillusthurigiensis têm 2 a 3 cromossomos, sendo que os genes de manutenção podem serencontrados em todos eles.

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Boa parte do conhecimento acerca da estrutura do genoma procariótico veio dosintensos estudos genéticos realizados com a bactéria Escherichia coli. Quandolinearizado, o cromossomo de E. coli exibe comprimento superior a 1 mm, cerca de 400vezes maior do que a própria célula. Como é possível empacotar tanto DNA em umespaço tão pequeno? A solução consiste em um superenovelamento, no qual a duplafita de DNA é adicionalmente torcida. O superenovelamento submete a molécula deDNA a um estado de torção muito similar à tensão imposta a um elástico quando étorcido.O que significa superenovelamento do DNA? Vamos usar o fio do telefone comoexemplo para facilitar a compreensão. Podemos dizer que o fio do telefone é espiralado,pois possui a forma de uma espiral. Você já deve ter observado que, às vezes, o fio seenrola sobre ele mesmo, ficando mais curto. Pode ser bem trabalhoso colocá-lonovamente na forma original. Esse enrolamento é uma superenrolamento, pois ofio do telefone já é uma espira, e sobre ela foi formada outra. Assim, osuperespiralamento significa o espiralamento de uma espiral.

O superenovelamento negativo ocorre quando o DNA é torcido ao longo do seu eixo nadireção oposta à da dupla hélice dextrógera.

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Algumas destas proteínas são semelhantes às histonas (procariotos não possuemhistonas), mas uma estrutura como o nucleossomo eucariótico ainda não foiidentificada. Em E. coli, acredita-se que existem mais de 100 domínios superenovelados,cada qual estabilizado pela ligação de proteínas específicas.

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Os superenovelamentos podem ser introduzidos ou removidos por enzimas conhecidascomo topoisomerases. Existem duas classes principais de topoisomerases e cada umaatua por um mecanismo distinto. As topoisomerases de classe I (tipos I e III) realizamuma clivagem em uma das fitas do DNA, permitindo a rotação de uma das fitas sobre aoutra. Cada uma dessas rotações adiciona ou remove um único superenovelamento.Após esse processo o corte é selado. As topoisomerases de classe II (tipos II e IV)realizam quebras nas duas fitas, passam a dupla hélice intacta através da quebra efinalmente selam o corte. Cada uma dessas operações adiciona ou remove doissuperenovelamentos. A inserção de superenovelamentos no DNA requer ATP para ofornecimento de energia, enquanto a liberação de superenovelamento não o requer. Nodomínio Bacteria e na maioria das Archaea há uma topoisomerase de classe IIdenominada DNA girase (topoisomerase do tipo II), a qual introduz superenovelamentosnegativos no DNA, auxiliando no processo de compactação do material genéticobacteriano.

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1 Kb = 1.000 pb

Os genomas lineares apresentam estruturas terminais abertas, com proteínas ligadasà extremidade 5’. Mais raramente, as terminações estão em forma de “grampo”,na qual uma das fitas do DNA faz uma alça (loop) e forma uma fitacomplementar do DNA duplex.

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Plasmídeos: elementos genéticos, geralmente circulares, que se replicamautonomamente. Normalmente são considerados dispensáveis, não codificandofunções essenciais para a fisiologia normal da célula. As células, portanto, podemcrescer sem os plasmídeos, a não ser que alguma vantagem seletiva sejaoferecida por eles, senão tendem a ser perdidos durante a divisão celular ou seintegram no cromossomo. Os plasmídeos encontrados em isolados naturaisgeralmente estão em baixo número de cópias, mas este número tende aaumentar com a diminuição dos seus tamanhos. Os plasmídeos mais bemcaracterizados contêm informações genéticas para algumas funções específicas.Por exemplo, os plasmídeos F codificam proteínas envolvidas na conjugação; osplasmídeos R conferem resistência a antibióticos; outros plasmídeos podemcodificar enzimas responsáveis pelo metabolismo de certos compostos. Algunsplasmídeos podem se integrar no cromossomo e depois serem excisados por ummecanismo bem especializado. Esses plasmídeos são também conhecidos comoepissomos.Pequenos cromossomos: alguns pequenos DNAs circulares adicionais (replicons)com genes adicionais que são essenciais para a vida das arqueobactérias.

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Plasmídeos: elementos genéticos, geralmente circulares, que se replicamautonomamente. Normalmente são considerados dispensáveis, não codificandofunções essenciais para a fisiologia normal da célula. As células, portanto, podemcrescer sem os plasmídeos, a não ser que alguma vantagem seletiva sejaoferecida por eles, senão tendem a ser perdidos durante a divisão celular ou seintegram no cromossomo. Os plasmídeos encontrados em isolados naturaisgeralmente estão em baixo número de cópias, mas este número tende aaumentar com a diminuição dos seus tamanhos. Os plasmídeos mais bemcaracterizados contêm informações genéticas para algumas funções específicas.Por exemplo, os plasmídeos F codificam proteínas envolvidas na conjugação; osplasmídeos R conferem resistência a antibióticos; outros plasmídeos podemcodificar enzimas responsáveis pelo metabolismo de certos compostos.Pequenos cromossomos: alguns pequenos DNAs circulares adicionais (replicons)com genes adicionais que são essenciais para a vida das arqueobactérias.

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Alguns plasmídeos têm a capacidade de existir tanto em estado autônomo como tambémintegrados ao cromossomo, recebendo o nome particular de epissomos. Portanto, todos osepissomos são plasmídeos, e mesmo um plasmídeo cuja integração ao cromossomo não foidemonstrada pode, no futuro, ser considerado um epissomo assim que sua integração forcomprovada.

As propriedades dos plasmídeos podem ser resumidas nos seguintes itens:(a) Os plasmídeos não são essenciais. Isso equivale a dizer que eles podem estarpresentes ou ausentes em uma determinada célula e sua ausência não implica ainviabilidade dela, pelo menos em certas condições. Essa propriedade contrasta,em parte, com a do material genético cromossômico, pois, embora possamexistir células com perda de pequenos cromossomos ou de fragmentoscromossômicos, a perda de genes essenciais é letal.(b) Os plasmídeos são constituídos por DNA circular e superespiralizado(supercoiled DNA); muitos são cerca de uma centena de vezes menores que ocromossomo bacteriano, embora possam existir plasmídeos de tamanhos bemvariados (0,2% a 4% do cromossomo). Nesse particular, eles podem ser grandes(100 a 200 genes), como o R, F, colV e coll, ou pequenos (15 genes), comomuitos plasmídeos bacteriocinogênicos (produzem bacteriocinas, que matam outrasbactérias).Plasmídeo ColV: possui genes de virulência (TraT e iss), determinantes pararesistência sérica aos efeitos bactericidas do sistema complemento dohospedeiro e à fagocitose, comumente relacionados a cepas septicêmicas.

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As propriedades dos plasmídeos podem ser resumidas nos seguintes itens(continuação):(c) Os plasmídeos podem existir no estado autônomo, ou seja, eles podemocorrer independentemente do cromossomo bacteriano, apesar de algunspoderem existir em estado integrado, ou seja, ligados ao cromossomo.

Os plasmídeos, quando no estado autônomo, podem se duplicarindependentemente do cromossomo bacteriano, o que significa que uma divisãodo cromossomo pode corresponder a várias divisões do plasmídeo. Se ele existirno estado integrado, a duplicação depende do cromossomo bacteriano. Osestados autônomo e integrado são reversíveis, isto é, o epissomo ligado aocromossomo bacteriano pode se desligar dele e vice-versa. Na volta do estadointegrado ao autônomo, o epissomo pode levar alguns genes bacterianosconsigo. É o que acontece, por exemplo, na conjugação com linhagens Hfr e nofenômeno da transdução com o fago (lambda).d) Uma vez ausentes, os plasmídeos só podem ser recuperados por infecção, oque vale dizer que tais elementos não podem ser formados "de novo". Portanto,um plasmídeo tem de provir de outro já existente.(e) Certas drogas podem interferir nos plasmídeos, como é o caso das acridinas,que eliminam plasmídeos de células. Essa propriedade já foi verificada em umasérie de plasmídeos, embora não seja de âmbito geral, e recebe a denominaçãogeral de cura (curing).

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Cístron: segmento do DNA que codifica a sequência de aminoácidos de umpolipeptídeo ou proteína.Em procariotos, além da típica organização gênica monocistrônica (uma unidadetranscricional para cada gene), os estudos iniciais de mapeamento genético mostraramfortes evidências de que grupos de genes envolvidos nas mesmas vias metabólicasestavam fisicamente bem próximos no genoma. Além do mais, a expressão destes genesera regulada de forma muito parecida. Esta forma de organização gênica policistrônica échamada de operon, sendo bem comum entre procariotos. O operon permite que aexpressão de um grupo de genes seja controlada simultaneamente e isto permite umaresposta fisiológica de um estímulo externo.

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Figura: Esquema representativo da estrutura e da expressão de um geneprocariótico que codifica uma proteína. O gene é constituído basicamente poruma região codificadora e por regiões reguladoras da sua expressão). Porconvenção, o gene é representado de 5' para 3', considerando sua fitacodificadora (em preto). A fita complementar (em vermelho), de orientaçãooposta (de 3' para 5'), é utilizada como molde para a síntese de um mRNA demesma orientação e sequência de bases. A região codificadora é flanqueadapelas regiões reguladoras. A região reguladora à montante da região codificadorainclui o promotor, e pode incluir um ou mais sítios de ligação de proteínasativadoras ou repressoras da transcrição. À jusante da região codificadora, háuma sequência reguladora que determina o final do processo de transcrição dogene. Quando o gene é expresso, a RNA-polimerase o transcreve em um mRNA,cuja síntese inicia alguns pares de bases antes da região codificadora e terminaalguns pares de bases depois do final dessa região. As regiões não codificadorasdo RNA são chamadas de regiões 5' ou 3' não-traduzidas ou UTR (deuntranslated region). Na região 5’-UTR do mRNA transcrito, há sequênciasimportantes para o início da sua tradução. Nos ribossomos, a região codificadorado RNA é interpretada de 5' para 3' e traduzida em uma cadeia polipeptídica,cuja sequência de aminoácidos é sintetizada da sua extremidade aminoterminalpara a sua extremidade carboxiterminal. Em genes que codificam apenas RNAs,como os de rRNA e tRNA, a etapa de tradução não ocorre.

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Figura: Representação esquemática da estrutura típica de um operon. O operonilustrado contém três sequências codificadoras de proteínas (A, B e O),separadas por regiões intercistrônicas curtas, cujas extensões variam entre umae poucas dezenas de pares de bases em operons típicos. As três regiõescodificadoras têm sua transcrição controlada por regiões reguladoras comuns, asquais determinam a produção de um mRNA único, que é por isso chamado depolicistrônico. As três proteínas codificadas (A, B e C) pelo mRNA policistrônicosão depois sintetizadas de forma independente nos ribossomos.

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Os genes procarióticos encontram-se bem empacotados, o que implica que genomasmaiores têm mais genes que genomas menores, umas vez que os procariotos possuemessencialmente sequências de cópia única. Os genomas procarióticos menores refletemum modo de vida mais especializado, como o parasitismo, e os maiores refletem aexistência de processos mais sofisticados e complexos, como a esporulação.Não existe uma ordenação conservada dos genes procarióticos ao longo dos genomasaté hoje sequenciados. A exceção, são os genes ligados a operons e agrupamentos oublocos (clusters) de genes envolvidos em um mesmo processo fisiológico, como os genesenvolvidos na replicação do DNA.

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Dependendo da orientação da cópia duplicada, eventos de crossing-over podemacarretar na deleção de uma das cópias ou do segmento entre elas. Os genes do DNAribossomal podem se duplicar quando a célula necessita de mais proteínas ribossomais,mas, eventualmente, eventos de recombinação podem reduzir o número de cópias. Noentanto, quando um gene está amplificado pelo fato de estar presente em umplasmídeo de múltiplas cópias, ele não tenderá a sofrer rearranjos que impliquem emsua deleção.

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A variabilidade genética é muito grande entre procariotos e vários são os mecanismos que apromovem, entre eles, os três mecanismos de transferência de material genético entremicroorganismos: conjugação, transdução e transformação. Foi observado que, mesmo emorganismos do mesmo gênero, como no caso de Mycoplasma pneumoniae e Mycoplasmagenitalium, ocorreram diferenças macrogenômicas significativas desde que esses organismos sedivergiram, com inserções e deleções. Por outro lado, E. coli e Salmonella typhimurium, bactériasenteropatogênicas de gêneros distintos, guardam entre si uma ordem gênica bem conservada.Um dos mecanismos mais comuns que causam a variabilidade dentro da mesma espécie é orearranjo causado por recombinação homóloga. Um mecanismo importante que provocadeleções e inserções é causado pela integração de elementos acessórios como transposons,integrons, ilhas de patogenicidade, profagos e epissomos, dentre outros. Esses elementosacessórios podem se encontrar numa forma integrada ou replicativa, que pode ser funcional ounão. Os elementos acessórios podem conter genes que conferem alguma vantagem seletiva paraa bactéria, como os genes de virulência (ilhas de patogenicidade) ou resistência a drogas. Emoutros casos, não há nenhuma vantagem aparente (sequências de inserção). Os elementosintegrados podem estar numa reta final de evolução, como os profagos defectivos, pois apósterem sofrido várias mutações perderam a mobilidade genética. As ilhas de patogenicidade sãoclusters (blocos) de genes presentes em linhagens patogênicas e são formadas por genesenvolvidos com a virulência (toxinas). Estas ilhas podem se propagar através de elementos deinserção. O número dessas ilhas é bem variável, mesmo dentro da mesma espécie, e podemestar associadas com outras capacitações metabólicas favoráveis às células.Os plasmídeos que podem ser mantidos ou replicados de maneira autônoma dos cromossomossão chamados epissomos (podem existir tanto em estado autônomo como também integradosao cromossomo).

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Nesse processo, a passagem de DNA tem lugar através de pontes ou comunicaçõescitoplasmáticas temporárias (chamadas pontes de conjugação) entre duas célulasbacterianas, onde uma das cepas transfere informação genética para a outra. A cepadoadora contém no citoplasma um filamento circular de DNA, o fator F, que é umplasmídeo (plasmídeo F). Esse plasmídeo contém genes que codificam a fímbria sexual,que mantém juntas as duas bactérias, possibilitando a formação da ponte deconjugação.Na conjugação, apenas um dos filamentos do plasmídeo é transferido da célula doadorapara a célula receptora. O filamento que fica na bactéria doadora se mantém circular,porém o filamento que é transferido para a receptora se rompe e migra pela ponte deconjugação, sob a forma de um filamento alongado.Figura de cima: Conjugação. Um plasmídeo F está sendo transferido de uma bactériadoadora F+ para uma receptora F . A transferência ocorre no local de contato criadopelo pilus sexual. O novo plasmídeo da bactéria receptora é composto por uma fitaparental (linha contínua) e uma fita recém-sintetizada (linha pontilhada). O plasmídeopreviamente existente na bactéria doadora agora consiste em uma fita parental (linhacontínua) e uma fita recém-sintetizada (linha pontilhada). Ambos os plasmídeos sãoilustrados exibindo somente uma curta porção do DNA recém-sintetizado (linhaspontilhadas), mas no fim da síntese de DNA tanto o doador quanto o receptor contêmuma cópia completa do DNA plasmidial.

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Figura: Recombinação de alta frequência. Parte superior: Um plasmídeo de fertilidade(F) foi integrado ao cromossomos bacteriano. Parte inferior: O plasmídeo F medeia atransferência de genes cromossômicos da bactéria doadora para a bactéria receptora.

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Bactérias que morrem em seu ambiente natural se desintegram e seu DNA pode serpartido em pedaços e captado pelas células adjacentes. O DNA que penetra na bactériapode ser reconhecido como estranho e destruído pelas enzimas de restrição, cujafunção é defender a bactéria contra invasores (bacteriófagos), destruindo seu DNA.Quando o processo de transferência de genes é bem sucedido, ocorre umarecombinação, que consiste na integração, no cromossomo bacteriano, do DNA quepenetrou na bactéria.

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Transdução é o processo pelo qual uma bactéria transmite informação genética a outra,usando como vetor um vírus bacteriano (bacteriófago). Durante o processo de formaçãodos bacteriófagos, pode ocorrer a produção de alguns bacteriófagos defeituosos,contendo DNA de bactéria em vez de somente DNA viral. Esses bacteriófagosdefeituosos contendo DNA bacteriano, irão injetar genes de uma bactéria dentro daoutra, assim transferindo a informação genética.Figura: Transdução. A: Um bacteriófago infecta uma bactéria e o DNA fágico penetra nacélula. B: O DNA do fago replica-se e o DNA bacteriano é fragmentado. C: A progêniefágica é formada e liberada; a maioria contém DNA fágico, enquanto poucos contêmDNA bacteriano. D: Outra bactéria é infectada por um fago contendo DNA bacteriano. E:O DNA bacteriano transduzido integra-se ao DNA hospedeiro, e o hospedeiro adquireuma nova característica. Essa bactéria sobrevive, uma vez que nenhum DNA viral étransduzido; dessa forma, não ocorre replicação viral.

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Em qualquer situação, o principal resultado da recombinação geral ou homóloga ésempre o mesmo: duas moléculas de DNA homólogas sobrepõem-se e trocam partes,isto é, suas hélices duplas quebram-se e as duas extremidades quebradas unem-se comsuas parceiras opostas para formar novamente duas hélices intactas, cada umacomposta por partes das duas moléculas de DNA iniciais. O sítio de troca pode ocorrerem qualquer lugar da sequência de nucleotídeos homóloga das duas moléculas de DNAenvolvidas (embora alguns tipos de sequências possam ser favorecidas em relação aoutros); e lá, uma fita de uma das moléculas de DNA faz um pareamento de bases comuma das fitas da outra molécula, criando uma junção alternativa chamada de junçãoheterodupléx entre as duas diferentes hélices. Não há alteração nas sequências denucleotídeos no sítio de troca; a quebra e os eventos de religação ocorrem de umaforma precisa de forma que não há perda, ganho ou alteração de um único nucleotídeo.Para maiores informações sobre recombinação homóloga, ver aula sobre “Mecanismosde recombinação genética”.Para maiores informações sobre reparo, ver aula sobre “Mutações e mecanismos dereparo”.

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Os rearranjos programados consistem no movimento de um gene de um local silenciosode armazenamento, onde o gene não é expresso, para um local ativo, onde a transcriçãoe a tradução ocorrem. Há muitos genes silenciosos que codificam variantes dosantígenos, e a inserção de um novo gene no local ativo de maneira sequencial, repetidae programada, consiste na fonte da variação antigênica consistente. Essasmovimentações não são induzidas por uma resposta imune, mas têm como efeitopermitir que os organismos dela evadam. Esse processo têm importância médicaporque as bactérias podem adquirir novas proteínas (antígenos) em sua superfície,evadindo do sistema imune. Dois importantes organismos onde isto ocorre são Neisseriagonorrhoeae, bactéria agente causador da gonorreia, e Borrelia recurrentis, bactériacausadora da febre recorrente. Também ocorre em Trypanosoma brucei (eucariotounicelular), um protozoário que causa a doença africana do sono.

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Os rearranjos programados consistem na movimentação de genes a partir de sítiosinativos (de armazenamento) para sítios ativos, onde são expressos como novasproteínas.

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O epissomo ligado ao cromossomo bacteriano pode se desligar dele e vice-versa.Na volta do estado integrado ao autônomo, o epissomo pode levar alguns genesbacterianos consigo. É o que acontece, por exemplo, na conjugação comlinhagens Hfr e no fenômeno da transdução com o fago (lambda).

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Para maiores informações, ver aula sobre “Mecanismos de recombinação genética”.

Os elementos genéticos móveis (EGM) facilitam a transmissão da resistência aantibióticos. Descobriu-se que esses elementos podem carregar genes deresistência a antibióticos e transferir-se do cromossomo para um plasmídeotransmissível presente na mesma célula, que não tinha genes de resistênciaantes. Isso já estava estabelecido nos anos 80, mas novas descobertasmostraram que existe uma variedade maior de modos de manter e transmitir osgenes de resistência: foram descritos os integrons, EGM que produzem umaenzima responsável por recombinação em locais específicos do DNA. Além disto,eles têm um sítio onde são integrados os chamados cassetes gênicos, estruturasformadas por um gene de resistência a antibiótico e uma pequena região pararecombinação. Cerca de 60 cassetes gênicos já foram descritos com genes deresistência a diversas categorias de antibióticos, possibilitando a transferênciahorizontal de genes de resistência entre linhagens distintas e entre espécies degrupos filogenéticos bastante afastados. Existe também a proposição de trocasde genes entre bactérias e eucariotos mediadas por esses EGM, dando umadimensão da importância dos mecanismos de recombinação envolvidos e desuas possíveis consequências evolutivas. (Texto adaptado de: Ciência Hoje 170,abril 2001)

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Patogenicidade é definida como a capacidade de um microorganismo de causar doença.Os microrganismos patogênicos se distinguem de outros da mesma espécie pelo fato depossuírem e expressarem genes que codificam fatores de virulência, isto é, fatores quepropiciam a colonização e ocorrência de diversos eventos que subvertem a fisiologiahospedeira, ocasionando o aparecimento de sinais e sintomas anormais, que irão,finalmente, definir o estado de doença. Entre os fatores de virulência mais importantesencontram-se as adesinas, que possibilitam aos microorganismos a colonização dostecidos; as toxinas, as invasinas, os sistemas de captação de ferro, e os fatores queabolem as defesas do hospedeiro. Além disso, a aquisição de genes que permitem aresistência a drogas antimicrobianas tornou-se um elemento adicional no arsenal devirulência das bactérias.Ilhas de patogenicidade (IP) constituem segmentos de DNA inseridos no cromossomobacteriano, que atribuem uma variedade de características de virulência aosmicroorganismos que a possuem. São ilhas genômicas constituídas por amplas regiõescromossômicas (10.000 a 200.000 pares de bases) de alta instabilidade e comcaracterísticas distintas do restante do genoma bacteriano. Codificam um ou mais genesde virulência e parte ou todo arsenal molecular para que esses genes possam alcançarsua célula alvo. São ricas em C+G e estão comumente associadas a genes que codificamRNA transportador. Possuem em suas extremidades elementos que estão envolvidos namobilidade genética. Dentre as propriedades conferidas pelas IP destacam-se acapacidade de aderir e invadir o epitélio da célula hospedeira, produzir toxinas, captarferro do meio ambiente e sintetizar o sistema de secreção tipo III, dispositivo molecularque permitem a translocação de moléculas efetoras para o interior da célulahospedeira. A capacidade de adquirir propriedades patogênicas em um único eventogenético permite a evolução, bem como o surgimento de microorganismos patogênicos.Apresentam conteúdo de G+C diferente do restante do cromossomo e geralmente estãolocalizadas em regiões específicas no genoma bacteriano, associadas a genes quecodificam RNA transportador (RNAt), como pheU, pheV, selC e leuX 5, entre outros.

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Figura: Estrutura geral de uma Ilha de patogenicidade (IP). (A) IP estãonormalmente inseridas no core genômico da amostra hospedeira (barra cinzaescuro) em sítios específicos que são com frequência genes RNAt or RNAt-like(barra cinza com listas).Genes de mobilidade, como as integrases (int), quasesempre se encontram no inicio da ilha perto RNAt. As IP apresentam um ou maisgenes ligados à virulência (V1 to V4) e estão comumente intercaladas por outroselementos de mobilidade como sequências ou elementos de inserção IS (ISc eISd). Os sítios de ligação (DR, representados pelos triângulos), são usados nosprocessos de inserção ou deleção. (B) Uma das características das IP é umconteúdo G+C diferente do genoma. Essa característica é comumente usada naidentificação de uma nova IP.

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Caso a excisão dos profagos ocorra de maneira defeituosa, poderá haver atransferência de um pequeno fragmento de DNA bacteriano para o DNA viral(figura). Esses vírus defeituosos (defectivos) podem transferir o DNA bacterianopara outras células.

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Um elemento essencial na regulação gênica em procariotos é a rapidez com que os genes seligam ou desligam, em resposta a mudanças ambientais repentinas (fatores como temperatura,pH e outros organismos no ambiente podem mudar com rapidez). O microorganismo deve estarpronto a se adaptar imediatamente a tais alterações. Esse tipo de regulação de curto prazo éexemplificado pelo sistema operon lac, em bactérias.

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Os referidos pesquisadores cunharam o termo operon para a unidade de ação gênica que consiste em umgene operador e os genes estruturais que lhe são adjacentes e cuja ação o gene operador controla. Esteúltimo, por sua vez, é controlado por um gene regulador, que não está necessariamente próximo. Todosos genes de um operon são transcritos como uma única unidade, originando um único mRNA(policistrônico). O operador localiza-se à jusante do promotor, onde a síntese do mRNA é iniciada.O controle da transcrição pode ser negativo ou positivo. No caso do controle negativo, o gene reguladorsintetiza uma proteína regulatória denominada repressor ou proteína repressora que, quando ativada,inibe a síntese de mRNA. Como nesse tipo de operon o elemento regulador é a proteína repressora (e osrepressores apresentam papel inibitório), a regulação envolvendo repressores é denominada controlenegativo. Já no controle positivo da transcrição, uma proteína reguladora ativa a ligação da RNApolimerase ao DNA.

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Como nesse tipo de operon o elemento regulador é a proteína repressora (e osrepressores apresentam papel inibitório), a regulação envolvendo repressores édenominada “controle negativo”.

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A substância que induz a síntese de uma enzima é denominada indutor, enquanto aquela quereprime sua síntese, é denominada correpressor. Essas substâncias, que geralmentecorrespondem a pequenas moléculas, são coletivamente denominadas efetores.Todos os sistemas regulatórios que empregam repressores possuem o mesmo tipo demecanismo básico: a inibição da síntese de mRNA pela atividade de proteínas repressorasespecíficas, as quais são, por sua vez, controladas por pequenas moléculas efetoras específicas(indutor ou correpressor).Na indução enzimática, uma enzima é sintetizada somente quando seu substrato encontra-sepresente. A repressão enzimática consiste em processo oposto, sendo amplamente distribuídaem bactérias como mecanismo de controle da síntese de enzimas necessárias à biossíntese deaminoácidos, purinas e pirimidinas. No geral, a indução enzimática afeta as enzimas degradativas(catabólicas), enquanto a repressão enzimática afeta normalmente enzimas biossintéticas(anabólicas).A regulação, seja indutiva ou repressiva, pode estar sob controle negativo ou positivo. Uma vezque os repressores apresentam papel inibitório, a regulação envolvendo repressores édenominada controle negativo.

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Quando o operon lac é induzido, são sintetizadas três enzimas: permease, -galactosidase etransacetilase, que metabolizam a lactose, facilitam sua entrada na bactéria e degradam os produtostóxicos da digestão da lactose. Os genes estruturais para as três enzimas estão reciprocamente próximos,no cromossomo da E. coli, na seguinte ordem: lac Z ( -galactosidase), lac Y (permease) e lac A(transacetilase). Junto a esse grupo de genes estruturais, encontram-se o gene operador (O), o promotor(P) e, a alguma distância, o gene regulador ou repressor (I). O gene regulador ou repressor transcreve ummRNA que é traduzido em uma proteína regulatória denominada repressor ou proteína repressora queinibe a síntese de mRNA. No estado repressor ou não-induzido, essa proteína liga-se a um sítio específicodo gene operador (O), impedindo a ligação da RNA-polimerase ao promotor e, consequentemente, atranscrição dos genes estruturais do operon lac. Assim, quando o gene regulador está funcionando, asproteínas não são sintetizadas pelos respectivos genes estruturais, que somente funcionam quando oregulador é "desligado" pela inativação do repressor por um metabólito específico denominado indutor(neste caso, a lactose).Atualmente, entre outros aspectos, sabe-se que o repressor codificado pelo gene I é um monômerocomposto de 360 aminoácidos, em cuja região central se encontra o sitio de ligação ao indutor; mas orepressor funcional é, realmente, um homotetrâmero, isto é, contém quatro cópias do monômeroreferido. A ligação desse repressor em dois sítios do operador distorce a conformação do DNA, fazendocom que este se dobre e afaste do repressor, além de impedir o acesso da RNA polimerase durante oestado de repressão.

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No estado indutor, a lactose, funcionando como indutor, liga-se à proteína repressora,impedindo-a de unir-se ao gene O. Na ausência dessa ligação, a RNA-polimerase junta-se aopromotor (P) e ocorre a transcrição dos genes estruturais lac Z, lac Y e lac A, com a subsequentetradução do mRNA nas três enzimas.

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Figura: Processo de repressão enzimática, empregando o operon arginina (arg)como exemplo. (a) O operon é transcrito porque o repressor não é capaz de seligar ao operador. (b) Após a ligação de um correpressor (uma pequenamolécula) ao repressor, o repressor liga-se ao operador e bloqueia a transcrição;o mRNA e as proteínas codificadas pelo operon não são sintetizados. No caso dooperon argCBH, o aminoácido arginina é o correpressor que se liga ao repressorda arginina.

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No caso do controle positivo da transcrição, uma proteína ativadora favorece a ligaçãoda RNA polimerase ao DNA, aumentando a síntese de mRNA.

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Figura: Controle positivo da indução enzimática, empregando o operonmaltose como exemplo. (a) Na ausência de um indutor, nem a proteínaativadora, nem a RNA polimerase, são capazes de se ligar ao DNA. (b) Umamolécula indutora (que no caso do operon malEFG, é o açúcar maltose) liga-se àproteína ativadora (MalT) que, por sua vez liga-se ao sítio de ligação do ativador.Isto permite à RNA polimerase ligar-se ao promotor e iniciar a transcrição.

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Os procariotos têm que lidar com vírus em seu ambiente e pode-se pensar na infecçãoviral como uma bomba relógio: a célula dispõe de apenas alguns minutos para desativara bomba antes que seja destruída por ela. Por isto, muitas eubactérias e Archaepossuem um sistema imunológico adaptativo chamado CRISPR/Cas.

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Repetições palindrômicas são idênticas quando lidas da esquerda para a direita ou dadireita para a esquerda.CRISPER representa uma família de DNA repetitivo encontrada em Archaea eeubactérias. Procariotos podem ter mais do que um loco CRISPR. Muitos genomas,principalmente de eubactérias, contêm apenas um ou poucos arranjos (locos) deCRISPR, mas nos genomas de Archaea vários locos CRISPR podem estar presentes (até18 locos já foram identificados em Methanocaldococcus jannaschii, totalizando mais doque 1% do genoma). O tamanho das unidades de repetição das CRISPR varia de 24 a 74pb e, nos arranjos (locos), elas estão presentes em um número que pode variar de 2 a249.

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Os locos CRISPR estão normalmente localizados no cromossomo, embora alguns tenhamsido identificados em plasmídeos. Consistem de várias repetições diretas não contíguasseparadas por trechos de sequências repetitivas hipervariáveis chamados espaçadores.O tamanho das sequências espaçadoras entre as repetições dentro de um mesmoarranjo (loco) de CRISPR varia de 26 a 72 pb conforme a espécie. Os locos CRISPR estãonormalmente dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estruturaem “grampo” ou “hairpin”.

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Embora a descoberta inicial de uma estrutura CRISPR tenha ocorrido em 1987, emEscherichia coli, a sigla foi cunhada em 2002, depois que estruturas semelhantes foramobservada nos genomas de várias eubactérias e Archaea.

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Em 2005, três independente estudos relataram homologia entre sequênciasespaçadoras e elementos extracromossômicos, tais como vírus e do plasmídeos. Istolevou à hipótese de que CRISPR pode fornecer imunidade adaptativa contra elementosgenéticos estranhos.

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Em 2007, foi mostrado em Streptococcus thermophilus que durante a geração naturalde variantes resistentes aos fagos, bactérias alteraram seus locos CRISPR pelaincorporação de unidades repetitivas de espaçadores CRISPR. As sequências integradasforam idênticas às dos fagos utilizados, o que sugeria que se originam a partir do ácidonucleico viral. Para determinar os impactos de CRISPR na resistência aos fagos, oconteúdo espaçador foi alterado através de engenharia genética, que mostrou que oespaçador pode proporcionar novas adições de resistência aos fagos, enquanto suaeliminação pode resultar na perda de resistência aos fagos. Estes resultados foramconfirmados em Streptococcus mutans, onde os mutantes resistentes aos fagosadquiriram novos CRISPR com as sequências correspondentes do genoma do fago, invitro e in vivo.

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Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma espéciede bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do mecanismo, oque levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são capazes de clivar DNAalvo in vitro quando guiadas por crRNAs. Isto resultou na utilização do sistema CRISPRcomo uma ferramenta de engenharia genética, tornando possível editar com sucesso ogenoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos.Atualmente encontra-se disponível um RNA-guia (gRNA) que consiste na construção deuma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade demimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover odirecionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que estapromova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuaçãoda maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interessepresente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR(CRISPR/Cas) uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custoquando comparada a técnicas anteriores.

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O sistema CRISPR/Cas consiste de pequenas sequências não contíguas repetidas deDNA, separadas por espaçadores únicos de tamanho similar e flanqueadas por umconjunto de genes que codificam uma proteína CRISPR-associada (Cas).

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A transcrição de locos CRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidadede desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como umguia de modo a orientar a nuclease Cas9, que irá promover a clivagem e consequenteeliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria,atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores.

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Os CRISPR são transcritos e transformados em pequenos RNAs CRISPR que especificamimunidade adquirida contra a infecção bacteriófago por um mecanismo dependente daidentidade estrita entre crRNAs e DNAs-alvos. Este sistema requer a co-expressão deuma proteína CRISPR-associada denominada Cas9 e de um RNA guia. O complexo liga-sea elementos de DNA complementares à sequência crRNA, o que resulta na repressão daexpressão do gene alvo.

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Existem diferentes tipos de sistemas de CRISPR: tipo I (dividido em 6 subtiposcategorizados de A a F), tipo II (comumente encontrado em Archaea e dividido em 3subtipos: A a C) e tipo III (compreendem dois subtipos, III-A e III-B). Entretanto, demaneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de aquisição,expressão e interferência, conforme descrito a seguir:a) Aquisição de novos espaçadores: Geralmente realizada através do reconhecimento eclivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração aocromossomo bacteriano nos locos CRISPR.b) Transcrição dos locos CRISPR: Processamento e amadurecimento do transcrito empequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo.c) Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz de guiarnucleases (Cas) de maneira especifica ao DNA alvo (bacteriófagos e plasmídeos).

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O sistema CRISPR tipo II, no qual se baseiam os sistemas atualmente disponíveis pararealização da edição gênica, requer a presença de um RNA transativador (tracrRNA), euma molécula pequena de RNA complementar à sequência repetida capaz de associar-se ao transcrito inicial do loco CRISPR, denominada RNA CRISPR (crRNA; sequências queconsistem em um protoespaçador ligado a uma sequência repetida com estrutura degrampo). Esta associação origina o complexo tracrRNA-crRNA, uma molécula de RNAdupla fita que após ser processada pela RNase III é convertida em uma molécula híbridamadura com função importante no que diz respeito à associação e direcionamento deuma nuclease para eliminação do DNA invasor. Nesse sistema especificamente, anuclease envolvida na clivagem refere-se à proteína CRISPR-associada 9 (Cas9).Figura: No sistema CRISPR de Streptococcus pyogenes uma proteína CRISPR-associada(Cas9) e um complexo de RNA contendo um RNA CRISPR (crRNA) e um RNA comatuação em trans ou transativador (tracrRNA) são os fatores responsáveis pelosilenciamento DNAs estranhos. O sistema possui uma molécula de RNA-guia em amarelo(crRNA) que servirá para encontrar, pareando base por base, a sequência do DNA-alvo,e uma outra molécula de RNA chamada de tracrRNA, em vermelho, que servirá pararecrutar a proteína cas9.

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Os sinais moleculares envolvidos neste processo de distinção ainda não estãocompletamente elucidados. Contudo, o mapeamento das sequências espaçadoraspresentes nos genomas virais revelaram uma sequência de poucos nucleotídeos decomprimento próxima ao espaçador, denominada Motivo Adjacente ao Protoespaçador(Protospacer Adjacent Motif - PAM). Motivos (“motif”) são sequências nucleotídicascurtas, em geral de dois até dezenas de pares de base de extensão, que podem serrelativamente comum nos genomas procarióticos. Essas sequências podem estardispersas ou agrupadas no genoma e, em muitos casos, são unidades formadoras derepetições. Cada domínio PAM pode ter a sequência variável de acordo com o tipo desistema CRISPR, sugerindo que proteínas Cas presentes nos distintos tipos de CRISPRestejam envolvidas no reconhecimento do domínio PAM.Figura: Visão geral do mecanismo de ação CRISPR/Cas. (A) Processo de imunização: Apósa introdução de DNA exógeno de vírus ou plasmídeos, um complexo Cas reconhece oDNA estranho e integra uma nova unidade espaçadoras repetitivas na extremidade líderdo CRISPR. (B) Processo de Imunidade: A matriz de repetição CRISPR-espaçador étranscrita para uma pré-crRNA que é processado em crRNA maduros, os quais sãosubsequentemente usados como guia pelo complexo de CAS para interferir com ocorrespondente ácido nucleico invasor. Legenda: repetições não contíguas sãorepresentadas como losangos, espaçadores como retângulos, e o líder CRISPR(sequência regulatória localizada antes do promotor, não traduzível) é representadopela letra L. A organização do loco CRISPR tem sido sugerida como ferramenta degrande valia para a distinção entre um DNA invasor do genoma hospedeiro pelamaquinaria de reparo celular. Há relatos de que a sequência líder possua elementoscapazes de promover o recrutamento deste mecanismo de reparo celular de modo afavorecer a integração do espaçador no DNA bacteriano.

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