Partie 1 : Analyse microbiologique 1. Laboratoire de

Analyses Microbiologiques et Biochimiques

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Partie 1 : Analyse microbiologique

1. Laboratoire de Microbiologie

1.1. Boite de pétri

Une boîte de pétri est une boîte cylindrique transparente peu profonde, en verre ou en

plastique, munie d'un couvercle.

• Elle est utilisée en microbiologie pour la mise en culture de microorganismes, de

bactéries ou de cellules d’organismes supérieurs.

• Elle est partiellement remplie d’un liquide nutritionnel permettant le développement

du microorganisme étudié.

1.2. Anse de platine

Matériel spécifique de microbiologie constitué d’un manche, d’une tige et d’un fil rigide en

platine iridié ou en une autre matière telle que le plastique se terminant par une boucle fermée

de 2 mm ou plus de diamètre intérieur.

• Elle est utilisée pour l’isolement des microorganismes. Cet instrument est stérilisé

avant et après chaque utilisation.

1.3. Bec Bunsen

Un bec Bunsen est un appareil de laboratoire qui produit une flamme. Il se présente sous la

forme d’une cheminée, reliée à une arrivée latérale de gaz combustible. Une virole permet de

varier l’arrivée d’air par des orifices latéraux afin de régler l’intensité et la chaleur de la

flamme. Ainsi, on distingue quatre sortes de flammes :

- une flamme éclairante, jaune, due à une combustion incomplète ;

- une flamme douce, bleue ;

- une flamme moyenne que l’on ne distingue presque pas ;

- et une flamme forte, due à une combustion complète, qu’on ne voit pas mais que l’on

entend.

- En biologie, le bec Bunsen est destiné à assurer les conditions indispensables

d’asepsie (destruction locale et immédiate par la chaleur des microorganismes se

trouvant sur les objets manipulés et dans l’air ambiant) dans un rayon de 20

centimètres autour de la flamme.

http://lyc-chevreuse-gif.ac-versailles.fr/biotech/techlab/res/bec%20bunsen.jpg


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1.4. Autoclave

Un autoclave est un récipient à parois épaisses et à fermeture hermétique conçu pour réaliser

sous pression -qui dépasse la pression atmosphérique et donc de porter de l’eau liquide au-

delà de 100°C soit une réaction industrielle, soit une stérilisation à la vapeur. Pour qu’un

matériel soit considéré comme stérile, la probabilité théorique d’isoler un germe doit être

inférieure à 1 pour 1 million.

L’agent stérilisant est la vapeur d’eau saturée sous pression ou l’eau surchauffée. La chaleur

associée à l’humidité provoque la destruction des germes en réalisant une dénaturation

protéique. La stérilisation par la vapeur est le mode de stérilisation le plus utilisé.

Les quatre phases du cycle de stérilisation

1. Montées simultanées en pression et en température par vapeur ou eau surchauffée.

2. Palier ou stérilisation. La température de palier est maintenue pendant un temps donné

par le barème de stérilisation.

3. Refroidissement. Diminution du couple température / pression.

4. Retour à la pression atmosphérique.

1.5. Etuve

Une étuve de laboratoire est un appareil de chauffage fonctionnant le plus souvent à la

pression atmosphérique (parfois sous vide ou sous gaz neutre) et permettant d’effectuer divers

traitements thermiques à température régulée. La température maximale est de l’ordre de

500°C, au-delà on parlera plutôt de four.

Les étuves sont généralement équipées de chauffage électrique. Elles sont pourvues d’un

système de ventilation afin de rendre la température la plus homogène possible.

1.6. pH mètre

Un pH-mètre est un appareil, souvent électronique, permettant la mesure du pH d’une

solution. Le pH-mètre est généralement constitué d’un boîtier électronique permettant

l’affichage de la valeur numérique du pH et d’une sonde de pH constituée d’une électrode de

verre permettant la mesure et d’une électrode de référence.

Après chaque mesure, la sonde de pH est rincée un court instant à l’eau purifiée (eau

déminéralisée, distillée, etc.), puis rapidement immergée dans le liquide de conservation

indiqué par le constructeur.

1.7. Le microscope

Le microscope optique ou microscope photonique est un instrument d’optique muni d’un

objectif et d’un oculaire qui permet de grossir l’image d’un objet de petites dimensions (ce qui

caractérise son grossissement) et de séparer les détails de cette image (et son pouvoir de

résolution) afin qu’il soit observable par l’œil humain.

1.8. Autre matériel

Agitateur, balance, vortex, réfrigérateur, bain-marie, bain-marie à agitation, hôte

microbiologique, évaporateur rotatif, micropipette, etc.

https://fr.wikipedia.org/wiki/Pression_atmosph%C3%A9rique

https://fr.wikipedia.org/wiki/St%C3%A9rilisation_%C3%A0_la_vapeur

https://fr.wikipedia.org/wiki/Agent_infectieux

https://fr.wikipedia.org/wiki/Liste_des_instruments_et_%C3%A9quipements_scientifiques

https://fr.wikipedia.org/wiki/Chauffage

https://fr.wikipedia.org/wiki/Gaz_neutre

https://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9gulateur_PID

https://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89lectronique

https://fr.wikipedia.org/wiki/Potentiel_hydrog%C3%A8ne


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La verrerie est composée principalement de : ampoule à décanter, ballon, bécher, burette,

creuset, cristallisoir, dessiccateur, entonnoir, éprouvette graduée, erlenmeyer, fiole jaugée,

mortier et pilon, pipette, pissette, tube à essai, verre de montre, etc.

1.9. Classes des différents laboratoires suivant leur destination

Dangers et risques biologiques

Les risques biologiques résultent de la manipulation d’organismes biologiques ou de

microorganismes naturellement pathogènes (bactéries, virus, champignons, parasites, ou

animaux infectés) ainsi que de la manipulation de (micro)-organisme génétiquement modifiés

(pathogènes ou non). Les microorganismes ont des effets pathogènes et des virulences très

différentes et sont susceptibles d’entraîner des désagréments, voire des maladies graves et/ou

létales pour l’être humain, les animaux et les végétaux. Les modifications génétiques peuvent

engendrer des effets indésirables susceptibles de modifier irréversiblement notre

environnement.

Contamination, infection, confinement et précaution

Les microorganismes mis en culture intentionnellement à des fins de diagnostic, de recherche,

de production industrielle ou naturellement présent dans notre environnement (poignée de

porte, de fenêtre, de frigo, de tiroirs, téléphone, documents divers, robinets, outils, etc.)

utilisent différentes portes d’entrée pour infecter un organisme ou se développer en surface

sur la peau et les muqueuses et différentes portes de sorties pour se répandre dans

l’environnement.

D’une façon générale une transmission/contamination microbiologique peut avoir lieu :

a. par voie digestive (ingestion), d’où l’interdiction de boire, manger, fumer, pipeter à la

bouche ;

b. par voie cutanée ou oculaire, (p. ex. par absorption de la peau ou projection dans les yeux) ;

c. par voie respiratoire (p. ex. par inhalation des aérosols créés au cours des manipulations ou

de poussières) ;

d. par voie transcutanée (par morsure, coupure et piqûre).

Parallèlement les voies de dissémination dans l’environnement sont :

a. l’air: ventilation, fenêtres ou portes ouvertes ;

b. l’eau: lavabo ;

c. les déchets ;

d. les personnes contaminées: mains, habits, etc.

e. durant les transports.

La transmission ou la dissémination de microorganismes pathogène et/ou génétiquement

pathogènes pouvant avoir des répercussions négatives sur la santé des personnes qui les

manipulent, sur la population ou sur l’environnement, il y a lieu de prendre un certain nombre

de précautions lors de leur utilisation.


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Afin de protéger le personnel ou toute autre tierce personne d’éventuelles infections, et afin de

protéger l’environnement et la population, il convient de confiner toute activité avec des

agents biologiques pathogènes et/ou génétiquement modifiés ainsi que leur entreposage.

L’utilisation d’organismes génétiquement modifiés ou pathogènes doit s’effectuer en milieu

confiné sauf si de tels organismes peuvent être utilisés dans l’environnement en vertu de

l’ordonnance du 25 août 1999 qui a pour but de protéger l’homme et l’environnement des

atteintes nuisibles ou incommodantes résultant de l’utilisation de ce genre d’organismes.

Ces organismes peuvent constituer une menace pour l’environnement ou indirectement pour

l’homme en raison de leurs propriétés, de leur mode d’utilisation ou de la quantité utilisée.

Il est nécessaire de prescrire, en particulier :

a. dans quel groupe ces organismes doivent être classés ;

b. les mesures de sécurité et autres exigences relatives à l’utilisation de ces organismes.

Niveaux de dangers biologiques

Le Centre de prévention et de contrôle des maladies des États-Unis a classé les maladies à

différents niveaux de risque, le niveau 1 représente le risque minimum et le niveau 4

représente les risques extrêmes.

Niveau 1 :

Concerne les agents ne causant généralement pas de maladie chez l’adulte en bonne santé. À

ce niveau, les précautions sur le matériel sont minimales, en général gants et protections

faciales. Habituellement, le matériel contaminé est laissé dans une poubelle ouverte. La

procédure de décontamination est similaire à toutes les protections contre les virus et bactéries

fréquents (par exemple : se laver les mains avec un savon antibactérien, désinfecter toutes les

surfaces exposées du laboratoire).

Exemples d’agents de niveau 1 : plusieurs types de bactéries dont le Bacillus subtilis,

hépatite canine, Escherichia coli non pathogène, varicelle, tout comme quelques cultures

cellulaires et d’autres bactéries non-infectieuses.

Niveau 2 :

Concerne les agents associés à des maladies humaines dont la transmission se fait par blessure

percutanée, ingestion, ou exposition à une muqueuse.

Exemples d’agents de niveau 2 : hépatite B, hépatite C, grippe, salmonelles, VIH.

Niveau 3 :

Concerne les agents indigènes dont la contagion peut se faire par l’air et qui peuvent avoir des

conséquences sérieuses voire mortelles.

Exemples d’agents de niveau 3 : anthrax, virus du Nil occidental, tuberculose, typhus, fièvre

jaune.


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Niveau 4 :

Concerne les agents dangereux ou exotiques avec un fort risque de décès et une transmission

par l’air, ou les agents similaires dont le risque de transmission est inconnu de plusieurs portes

simultanément.

Exemples d’agents de niveau 4 : fièvre hémorragique bolivienne, virus Ebola, fièvre de

Lassa, et autres maladies hémorragiques.

Mesures de sécurité

Les activités impliquant des organismes en milieu confiné sont réparties dans quatre classes

en fonction du risque qu’elles présentent pour l’homme et l’environnement. Les classes sont

définies comme suit :

a. classe 1: activité à risque nul ou négligeable ;

b. classe 2: activité à risque faible ;

c. classe 3: activité à risque modéré ;

d. classe 4: activité à risque élevé.

Mesures de classe 1 = Niveau de sécurité biologique 1 = P1

1. Les principes de bonnes pratiques dans les laboratoires microbiologiques doivent être

appliqués.

2. Pipeter avec la bouche est formellement interdit. Utiliser les pipettes mécaniques.

3. La présence d’aliments, de boissons et de tabac est interdite dans le laboratoire.

4. Les mains sont lavées avant et après toute manipulation.

5. On porte des vêtements (blouse de travail) uniquement pour le laboratoire.

6. Le laboratoire est tenu propre, en ordre et sans la présence de matériel n’étant pas en

relation avec le travail.

7. L’identité des souches utilisées est régulièrement contrôlée pour vérifier leur potentiel

pathogène.


1. La zone de travail en classe 2 doit être indiquée avec le sigle « Biohazard».

2. L’accès au laboratoire est restreint aux personnes désignées par le responsable de projet.

3. Les portes et les fenêtres doivent être maintenues fermées pendant les manipulations.

4. Les mesures suivantes sont prises lorsque le travail peut produire des aérosols : - il faut

travailler sous une hotte ventilée avec un flux d’air protégeant l’utilisateur - les appareils ne

doivent pas libérer des aérosols à l’extérieur. Les éventuels gaz libérés doivent passer à

travers un filtre.

5. Des récipients incassables doivent être utilisés pour les prélèvements et les transports.

6. Les appareils en contact avec des agents infectieux seront désinfectés avant de les nettoyer.

7. En cas de renversement de microorganismes pathogènes, la zone contaminée sera fermée et

décontaminée.

8. Les liquides contaminés et les déchets solides seront traités de façon à inactiver le matériel

biologique (stérilisation 20 minutes à 121°C (1,2 bar) et une température de 134°C (1,5 bar)

pour les spores).


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1. Le laboratoire est séparé du reste du bâtiment par une zone d’accès contrôlé avec un double

sas.

2. Les surfaces des murs, des planchers et des plafonds seront lisses et faciles à nettoyer.

3. Les personnes travaillant dans cette zone doivent être visibles à travers des fenêtres placées

dans les séparations entre les zones.

4. L’air sortant du laboratoire passera sur un filtre à haute efficacité arrêtant 99,999% des

particules inertes ou vivantes ayant un diamètre supérieur à 0,3µm.

5. La manipulation d’échantillons pathogènes doit s’effectuer sous hottes s’il y a production

d’aérosol entraînant un risque d’infection aérogène.

6. Un programme de lutte contre les insectes et les rongeurs sera effectué.

7. Tout matériel contaminé doit être décontaminé avant de sortir du P3 par voie chimique ou

par autoclave. Le P3 devra d’ailleurs être équipé d’un autoclave à double entrée.

8. On ne portera que des vêtements destinés au P3 : Blouses à manches longues boutonnées à

l’arrière, gants collés sur la blouse, surbottes, éventuellement masque et lunettes. Ces

vêtements de protection ne quitteront le P3 que s’ils sont stérilisés.

9. Les documents, cahiers de laboratoire seront désinfectés avant leur sortie. Au mieux, ils

resteront dans le laboratoire.

10. Un téléphone ainsi qu’un bouton d’alarme seront présents dans le laboratoire.

11. Les matériaux biologiques qui sortiront du P3 à l’état viable seront placés dans un

récipient incassable et scellé qui sera lui-même placé dans un 2ème récipient incassable et

scellé.


1. Réglementation de l’accès. Le laboratoire de confinement de haute sécurité – sécurité

biologique niveau 4 doit être situé dans un bâtiment séparé ou tout au moins dans une zone

clairement délimitée d’un bâtiment sécurisé.

2. Régulation de la ventilation. L’air doit être filtré au moyen de filtres spécifiques tant à

l’admission qu’à l’évacuation.

3. Décontamination des effluents. Tous les effluents qui sortent du laboratoire doivent être

décontaminés avant d’être définitivement éliminés.

Certification d’un laboratoire

La certification est un processus par lequel une tierce partie (un organisme compétent) donne

une assurance écrite de conformité aux exigences spécifiées dans une norme donnée.

Accréditation

Attestation délivrée par une tierce partie, ayant rapport à un organisme d’évaluation de la

conformité, constituant une reconnaissance formelle de la compétence de ce dernier à réaliser

des activités spécifiques d’évaluation de la conformité

L’accréditation a pour objet après évaluation d’attester que des organismes sont capables

techniquement : - De réaliser des analyses, des étalonnages ou des essais ; - De procéder à des

actions d’inspection ; - Ou à des actions de certification (de produits, services, systèmes

qualité ou de personnes).


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2. Milieux de culture

2.1. Définition d’un milieu de culture

C’est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier. Il doit

donc satisfaire les exigences nutritives du microorganisme étudié ce qui implique :

- couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la source de

carbone et d’énergie, etc. ;

- présenter un pH voisin du pH optimal.

2.2. Préparation des milieux de cultures

Les milieux de culture peuvent être :

• commercialisés : « prêts à l’emploi », « prêts à couler » ou en poudre (mélange

complet des constituants de base) ;

• préparés en mélangeant les différents composants le constituant (cas des milieux

synthétiques).

La préparation nécessite une stérilisation (non exclusive) :

• par autoclavage (15 à 20 minutes à 120°C).

• par filtration si certains composants sont thermolabiles.

2.3. Conditionnement

Les milieux peuvent être conditionnés en :

• Tubes de faible diamètre ;

• Tubes normaux (18 ml maximum) ;

• Tubes de grands diamètres ;

• Flacons ;

• Boites de Pétri (conservation limité au réfrigérateur ou en chambre froide, boites

retournées pour éviter la condensation sur le couvercle).

Dans certains cas, le volume de milieu doit être respecté scrupuleusement : gélose

antibiogramme, tubes de diluants pour dilutions en série, etc.

2.4. Techniques

Les techniques de culture sont nombreuses ; elles varient en fonction :

• de la nature du prélèvement : surfaces, sécrétions, organes, broyages, etc.

• des buts de l’étude : identification, dénombrement, antibiogramme, etc.

• des moyens à disposition du chercheur : matériel, temps, etc.

2.5. Différents types de milieux de culture

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences

nutritives des microorganismes.


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• Milieu solide

Milieu liquide auquel on ajoute un agent de solidification tel que l’agar-agar. L’agar-agar est

un polysaccharide extrait d’une algue marine. C’est un gel qui est à l’état solide à une

Température de moins de 60°C et qui se liquéfie à 100°C.

• Milieu liquide

C’est un milieu qui contient les mêmes composants que le milieu solide sauf l’agar.

Et selon la composition, on a :

• Milieu sélectif

C’est un milieu qui permet de sélectionner le type de microorganismes qui pourront pousser

sur celui-ci, alors que tous les autres microorganismes présents sont inhibés. Pour cela on

ajoute des éléments qui inhibent la croissance des microorganismes indésirables comme le

chlorure de sodium à forte concentration.

Les éléments ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du microorganisme

recherché. Ces milieux sont utilisés pour l’analyse d’un prélèvement polymicrobien.

• Milieu synthétique

Ce sont des milieux dont on connaît exactement la composition chimique, tant d’un point de

vue qualitatif que quantitatif. Ils sont utilisés dans la recherche d’une réaction enzymatique

précise. Ce sont les milieux les plus couramment utilisés. Exemple : on utilisera le milieu

tryptophane pour révéler la présence de tryptophanase.

• Milieu semi-synthétique

On ne connaît leur composition exacte que pour certains composants (d’un point de vue

quantitatif, pour les produits ayant un intérêt, comme les facteurs de croissance.). Les autres

composants étant présents de manière empirique.

• Milieu de culture enrichi

Ils contiennent, outre les composants de base, des composants indispensables aux bactéries,

que celles-ci ne peuvent pas synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour l’obtention des

bactéries dites exigeantes.

Par exemple : les milieux au sang frais (le sang est riche en nutriments divers).

• Milieu différentiel

Le milieu de culture dit différentiel ou indicateur permet de distinguer deux types de

microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu met en évidence

certaines caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l’aptitude à

dégrader un substrat) en présence d’indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs


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colorés de pH ou d’oxydo-réduction (tel que le rouge neutre, le rouge de phénol, l’éosine ou

le bleu de méthylène).

• Milieux complexes

Aussi appelés milieux empiriques. Contiennent des ingrédients dont la composition chimique

est indéterminée.

2.6. Méthodes de conservation des cultures microbiennes

2.6.1. Définition de la conservation des souches microbiennes

C’est une méthode utilisée dans les laboratoires pour conserver les cultures des différentes

espèces microbiennes isolées. Ces cultures servent des souches de référence c’est-à-dire gardé

constant l’ensemble de ces propriétés morphologique, métabolique, génétique et

physiologique.

2.6.2. Méthode de conservation des souches

- Réfrigération

C’est une méthode qui permet de ralentir le métabolisme sans tuer les microorganismes. Elle

permet de conserver des cultures microbiennes pendant un court intervalle de temps à une

température entre 4 et 7ºC (frigo).

- Congélation

Elle est utilisée pour conserver dans des meilleures conditions les structures cellulaires. Il

convient de congeler à la température la plus basse (souvent de -25°c à -80°c) qui arrête la

croissance des microorganismes. Ainsi on congèle en présence d’additifs cryoprotecteurs

comme le glycérol à des concentrations de l’ordre de 50%.

Après cette opération, il n y a aucune activité métabolique ; développement totalement bloqué

mais la plupart des cellules restent vivantes. Cette méthode permet de décongeler la culture et

de la faire croître, même après plusieurs années.

- Lyophilisation

C’est un procédé de conservation des produits biologiques par dessiccation sous vide à basse

température. Les bactéries sont toujours vivantes mais dépourvues d’activité métabolique.

Les bactéries peuvent être ranimées en tout temps par hydratation avec un milieu nutritif.

La poudre peut être conservée pendant des années.

2.7. Techniques de stérilisation

2.7.1. Définition de la stérilisation

La stérilisation est une opération permettant d’éliminer ou de tuer les microorganismes portés

par des milieux contaminés, le résultat de cette opération ayant pour objectif le degré 0 en fin

d’opération (= le produit est stérile) et permettant de conserver cet état pour une période de

temps précisée.


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2.7.2. Méthodes de stérilisation

Stérilisation par les méthodes physiques

Stérilisation par la chaleur

1. Flambage

Il est basé sur l’emploi du bec Bunsen. Cette méthode est utilisée pour la stérilisation

immédiate du matériel de manipulation : extrémité de l’anse, extérieur des pipettes Pasteur et

pipettes graduées, col des tubes à essai, tubes et flacons contenant des milieux de culture,

erlenmeyers et flacons divers, etc.

2. Le four pasteur

C’est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide

(tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients

divers).

La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement bouchée avec du

coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à l’intérieur du four et subit un

chauffage de : 30 minutes à 1 heure à 170°C - 180°C ou 2 heures à 160°C ce qui a pour but

d’éviter le brunissement du coton.

3. L’autoclave

Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une température de 100°C à 130°C,

pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des

récipients.

4. Autres méthodes

Certains milieux de culture fragiles ne supportant pas les températures élevées, on procède à

une ébullition à 100°C.

- Pasteurisation

La pasteurisation est un traitement thermique à des températures comprises entre 60 et 80°C

ayant pour but de détruire la totalité des microorganismes pathogènes non sporulés et de

réduire significativement la flore végétative présente dans un produit.

C’est un procédé de conservation limité pour lequel le produit doit être conditionné

hermétiquement et réfrigéré (le produit pasteurisé peut être en effet conservé à 4°C de

quelques jours à quelques semaines). Elle est toujours suivie d’un refroidissement rapide.

- Tyndallisation

C’est une méthode de stérilisation qui consiste en chauffages discontinus à une température

relativement basse (60 et 70°C), suivis de refroidissements. On admet qu’au cours de ces

périodes de chauffage discontinu, les bactéries perdent leur aptitude à sporuler.

Actuellement, la tyndallisation consiste en une série de 3 pasteurisations de 1h. A 70 - 80°C,

séparées par un intervalle de 24 heures à température ambiante, ce qui permet la germination


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et la destruction des spores, sans l’emploi d’une température excessive. Cette méthode est

utilisée pour les milieux fragiles contenant sérum, œuf ou toute substance thermosensible de

forte viscosité qui ne peut être stérilisée par filtration.

Stérilisation par filtration

Cette méthode est utilisée pour les milieux sensibles à la chaleur, mais n’est possible que

lorsque la viscosité de ces milieux est faible. On utilise alors, suivant le cas, des filtres de

verre poreux ou les membranes filtrantes à usage unique.

Stérilisation par les radiations

Elles assurent un bombardement (rayonnements électromagnétiques) détruisant ainsi les

structures internes du noyau. Les traitements s’effectuent à froid en continu ou discontinu.

La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l’air et des

paillasses situées sous la hotte de protection : le rayonnement n’agit que de façon directe. Des

instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri peuvent être stérilisées de la sorte.

Stérilisation par des agents chimiques

Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles et plans de travail et pour la

destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être

systématiquement pratiqué, dans nos laboratoires, pour les lames et pour la verrerie qui ne

passe pas en autoclave par :

1. Les antiseptiques liquides

- L’alcool éthylique à 60% pour la désinfection des paillasses et des instruments.

- L’hypochlorite de sodium (eau de Javel).

- Les savons et détergents agissent surtout par leur pouvoir mouillant, ce qui facilite

l’élimination des germes.

2. Les antiseptiques gazeux

Les vapeurs d’une solution chauffée de formol sont utilisées pour désinfecter les pièces et les

étuves.


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1. Les nouvelles technologies de destruction des microorganismes applicables en

industrie agro-alimentaire

1. Les traitements thermiques améliorés

Les nouvelles technologies sont axées sur la rapidité de montée en température (au niveau de

la surface ou de la masse du produit) et sur l’absence ou la minimisation du gradient

thermique entre l’élément chauffant et le produit. Ces techniques vont dans le sens d’une

minimisation des modifications des propriétés organoleptiques des produits.

1.1. Transferts par rayonnement

1.1.1. Infrarouges

Ce sont des radiations électromagnétiques de longueur d’onde comprise entre 0,8 et 10 µm.

Elles provoquent par leur absorption dans le produit un échauffement sur une profondeur

limitée fonction de leur longueur d’onde. Utilisée surtout pour un traitement dans l’emballage.

Principaux inconvénients:

- traitement de surface ;

- coloration pas toujours souhaitée ;

- investissement et entretien important.

1.1.2. Les micro-ondes

Ondes électromagnétiques ayant une fréquence allant de 3 kHz à 300 GHz. L’onde

électromagnétique est généralement engendrée par un magnétron (composé d’une anode

cylindrique et d’une cathode constituée d’un filament chauffé ; des aimants permanents

produisent un champ magnétique continu et perpendiculaire au champ électrique). L’onde se

propage jusqu’au produit à traiter dans un guide d’ondes, elles sont ensuite transmises au

produit par un applicateur adapté.


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Principaux freins au développement des micro-ondes en industrie :

- coûts d’achat et de maintenance élevés ;

- problème d’hétérogénéité de traitement pour les produits conditionnés.

1.2. Les transferts par conduction améliorée et par chauffage ohmique

1.2.1. Les tubes à passage direct de courant

Dans ces appareils, la chaleur est générée par effet Joule dans la masse même d’un tube qui

sert de résistance électrique et dans lequel circule le fluide à chauffer. Ces appareils sont des

échangeurs d’électricité fluide, puisque l’énergie est transmise à travers une surface

d’échange : la paroi interne du tube.

Il est possible de contrôler très finement la température de la paroi interne du tube par

l'intermédiaire de la puissance électrique.

Limites actuelles :

- Technologie limitée aux liquides pas trop visqueux et sans gros morceaux ;

- Coût important.

1.2.2. Le chauffage ohmique

Il résulte du passage d’un courant électrique alternatif à travers un produit liquide. C’est donc

ici directement le produit alimentaire qui va être le siège d’une résistance au passage du

courant électrique et chauffer par effet Joule.

La plupart du temps le gradient de température dans le produit est extrêmement faible, le cœur

des particules (jusqu’à 25mm) et le liquide sont chauffés presque simultanément.

Outre le coût actuel très élevé du matériel, le principal frein à l’industrialisation est le

problème de l’usure des électrodes et donc de la contamination des produits par les molécules

qui les composent.


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2. Méthodes non thermiques

2.1. Champ électrique pulsé

L’exposition d’une cellule animale ou végétale à un champ électrique extérieur induit une

différence de potentiel électrique de part et d’autre de sa membrane.

Lorsque ce champ électrique est très intense (supérieur à 10 kV/cm), il induit un potentiel

transmembranaire de valeur plus élevée que le potentiel naturel de la cellule et si ça atteint

une valeur critique, les phénomènes de répulsion entre les molécules chargées de la

membrane entraînent la formation de pores dans la membrane cellulaire augmentant sa

perméabilité entraînant ainsi la migration vers l’extérieur du contenu cellulaire et ainsi la mort

de la cellule.

L’intensité du champ électrique appliqué est généralement comprise entre 2 et 87 kV/cm,

mais les taux d’inactivation efficaces sont généralement obtenus avec des champs d’intensité

comprise entre 20 et 50 kV/cm.

Les traitements par champs électriques pulsés permettent d’obtenir des hauts degrés de

dégradation des microorganismes tout en étant rapides et à faible température.

Les applications potentielles de cette technologie incluent la majeure partie des boissons et jus

de fruits, le lait, les sirops, sauces ou purées et les soupes.

Limitations des CEP

- réservé aux fluides pompables et pas trop visqueux ;

- problèmes avec les produits hétérogènes ;

- produits à haute conductivité non traitables ;

- Industrialisation difficile.


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2.2. Les champs magnétiques pulsés

Soumettre un aliment à un champ oscillant dont la période d’atténuation est supérieure à

environ 5 kHz et dont l’intensité est supérieure à environ 5 Tesla réduit considérablement le

nombre de microorganismes,

Mode d’action (théories) :

- perméabilité membranaire au Ca2+ et K+ modifiée ;

- interaction ion molécule modifiée ;

- cassure des liaisons covalentes de l’ADN - Recombinaison radicalaire.

2.3. Hautes pressions hydrostatiques

Le procédé des hautes pressions consiste à soumettre un produit alimentaire liquide ou solide,

avec ou sans emballage, à des pressions comprises entre 100 et 800 MPa, à température

ambiante ou inférieure à 50 °C. La durée de traitement est généralement comprise entre 5 et

30 min. Contrairement aux traitements utilisant la température, la pression est transmise

instantanément et uniformément à travers le produit, indépendamment de sa taille, forme et

composition (la montée en pression est généralement de 200 MPa/min).

Applications

en alimentaire, pasteurisation à basse température : jus de fruits, purée d’avocats,

viandes, compotes, gelées, sauces, etc.

dans le domaine de la santé : stérilisation de composés thermosensibles en industries

pharmaceutiques, stérilisation d’instruments chirurgicaux et inactivation des déchets

hospitaliers.


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2.4. La lumière pulsée

Le système de lumière pulsé utilise des flashs de lumière intense émise par une lampe à

xénon. Le spectre d’émission de la lampe couvre le domaine en longueurs d’ondes s’étendant

entre 200 et 1300 nm. Ces flashs de lumière ont des durées de 10-6 à 10-1 seconde

Effets de la lumière pulsée :

- photochimiques (UV agit sur certaines liaisons comme celles de l’ADN) ;

- photothermiques (ce serait le spectre IR du flash qui serait efficace ; il provoquerait

une augmentation brutale, importante mais très brève de la température à la surface de

l’échantillon qui entrainerait l’éclatement des cellules).

Efficacité et applications :

- Efficace sur tous les microorganismes ;

- Traitement rapide - Peu ou pas de résidus chimiques ou toxiques ;

- Application pour les décontaminations de surface, des liquides clairs ou peu colorés et

la stérilisation des emballages.

Limites d’utilisation

- Applicable à des produits où la lumière peut avoir accès à toute la surface et à tout le

volume ;

- Difficulté de traitement au travers des emballages absorbant les UV ;

- Les surfaces rugueuses ou poreuses posent problème (zone d’ombre).

2.5. Les ultrasons

Les ultrasons ont une action de destruction des microorganismes essentiellement par effet

mécanique. Le principe d’action mis en avant est le phénomène de cavitation qui créerait des

cisaillements très importants et répétitifs au niveau des cellules.

La cavitation entraine une dislocation des parois cellulaires qui sont altérées par les

microbulles gazeuses crées au sein du liquide.

Les effets thermiques accompagnant cette émission peuvent éventuellement renforcer son

effet létal.

L’utilisation des ultrasons en tant qu’agent de destruction des microorganismes se fait

systématiquement en combinaison avec une autre méthode: - en combinaison avec les

désinfectants - en combinaison avec la chaleur - en combinaison avec la chaleur et la pression.


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2.6. Les plasmas froids

Le plasma froid est un gaz partiellement ionisé à l’intérieur duquel l’énergie électronique ne

se disperse pas thermiquement mais par collisions.

Ces collisions mettent en jeu les électrons et les espèces du gaz, aboutissant à un changement

de nature de ces espèces.

Le plasma froid est ainsi un générateur de radicaux et d’espèces excitées très actives

chimiquement.

La première application des plasmas froids est le développement d’un stérilisateur pour

endoscopes, instruments médicaux fragiles et thermosensibles, potentiellement vecteurs

d’infections hospitalières.

Les limites prévisibles pour une application en agro-alimentaire sont liées à la nature des gaz

générés et à leur effet sur la matière organique en particulier au niveau des résidus

d'oxydation cancérigènes.

Documents

Partie 1 : Analyse microbiologique 1. Laboratoire de