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PARTIE BIOCHIMIE INTRODUCTION
Chez les mammifères, la dégradation oxydative des acides gras à chaîne longue joue un rôle
majeur dans le métabolisme énergétique. Le principal d’entre eux est l’acide palmitique :
CH3-(CH2)14-COOH. Cette dégradation oxydative ayant lieu dans la mitochondrie, un
système de transfert est nécessaire pour faire passer la forme activée (liée au coenzyme A et
donc appelée acyl-CoA) des acides gras à chaîne longue du cytosol vers la mitochondrie. Ce
système de transfert implique le couplage de l’acide gras à une molécule appelée carnitine et
comprend deux enzymes membranaires appelées carnitine-palmityl transférases ou CPT :
l’activité CPT1 est située sur la face cytosolique de la membrane externe de la mitochondrie
et l’activité CPT2 sur la face interne de la membrane interne de la mitochondrie selon le
schéma suivant :
Il existe trois isoformes de CPT1 (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux
différents selon les tissus.
STRUCTURES L’analyse de la séquence de la protéine CPT1A (un peu plus de 770 résidus) par le
programme TopPred (Topology prediction of membrane proteins) permet de déterminer le
diagramme d’hydrophobicité présenté dans la figure B1A.
Figure B1A : En abscisse est indiquée la position des acides aminés et en ordonnée est
indiqué le degré d’hydrophobicité.
Question 32 : Indiquez le nombre de segments transmembranaires que peut comporter
la protéine membranaire CPT1A, prédit par le diagramme d’hydrophobicité :
a. Un
FAUX : voir b
b. Deux
VRAI : Dans la question, la notion « que peut comporter » est importante car si on est
rigoureux, avec ce type d’expérience on ne peut que formuler une hypothèse sur la nature
des segments que l’on étudie. En effet ici on cherche le nombre de segments
transmembranaires, or qui dit transmembranaire dit hydrophobe car la bicouche lipidique
est elle même fortement hydrophobe. De plus ces segments doivent être assez longs pour
pouvoir traverser la membrane, généralement on dit qu’à partir de 20 résidus le segment
est assez long pour cela. Sachant cela, on remarque que deux segments sur le diagramme
d’hydrophobicité correspondent à ces critères (entre les résidus 0 et 100 à peu près).
Encore une fois ici ce sont des sortes de « segments candidats » pour être
transmembranaire, car ils ont les caractéristiques pour, mais en l’absence d’autres
expériences on ne peut pas totalement en être sûr.
c. Sept
FAUX : voir b
d. Onze
FAUX : voir b
e. Douze
FAUX : voir b
NB (Q32) : Sur ce genre de question il faut surtout faire attention à où est le 0 en
ordonnée pour le degré d’hydrophobicité car avec le stress et la rapidité à avoir on a vite fait
de compter des segments en trop .
La structure tridimensionnelle de la partie cytoplasmique de la protéine CPT1A a été résolue
par diffraction des rayons X. Si la détermination de son appartenance à une classe est difficile
à établir, il est par contre possible d’observer certaines caractéristiques structurales présentées
dans la figure B1B.
Figure B1B
Question 33 : Identifiez la ou les caractéristique(s) correspondant aux structures
proposées :
a. La protéine comporte un seul domaine
FAUX : voir b
b. La protéine comporte deux domaines
VRAI : Le Domaine est l’unité fondamentale de la structure tertiaire. Or sur la structure
tertiaire de la CPT1A on voit deux grands ensembles se profiler, ce sont des domaines.
Sachant que chacun des domaines correspond à un ensemble de structures secondaires
(hélice α, feuillet β) et superstructures secondaires (par exemple motif α-α, hélice-boucle-
hélice ou encore β en épingle à cheveux ..).
c. La protéine comporte trois domaines
FAUX : voir b
d. Le coude est un coude bêta classique
FAUX : un coude bêta classique est constitué de 4AA avec une liaison hydrogène entre les
résidus i et i+3, or ici la liaison hydrogène se fait entre les résidus i (ARG) et i+4 (ASP)
e. Le coude est un coude de structure atypique
VRAI : C’est une question de « par cœur »pure, bête et méchante. Ca vous montre surtout
que le professeur Hainque adore les coudes et que même si il n’insiste pas toujours dessus
en cour il faut absolument connaître les exemples donnés.
Petit rappel : il existe globalement deux grands types de coudes :
- coude γ (ou « γ-turn ») : d’une longueur de 3 résidus, avec une liaison hydrogène
entre le C=O du résidu i et le groupe N-H du résidu i+2
- coude β (ou « β-turn ») : long de 4AA quelque soit le type de coude β.
--> puis on distingue plusieurs types de coudes β classés selon les angles Ψ et Φ et des
résidus i+1 et i+2.
Exemple : - Type I et II : i+1 est souvent une proline et i+3 est souvent une glycine (peu
d’encombrement stérique) pour pouvoir tourner court
- Type VI : i+2 est souvent une Proline en configuration « cis » et i+1 est
souvent une glycine. (on dit que la séquence « Gly-cis-Pro » est représentative d’un coude
β de ce type)
Donc dans cette exo, il suffit de voir que le coude présente 5 résidus pour pouvoir tout de
suite l’exclure de la classification vue en cour.
Les prédictions de structures secondaires pour la protéine CPT1A indiquent l’existence d’une
hélice alpha entre les acides aminés 103 et 122. La projection des chaînes latérales des résidus
d’acides aminés selon l’axe de l’hélice présentée dans la figure B2 répond aux caractéristiques
de celle-ci et permet d’en reconstituer la structure primaire. Pour ne pas surcharger la
représentation du modèle de la roue hélicoïdale, les acides aminés 121 et 122 ne figurent pas
sur le schéma. Le code des acides aminés est fourni dans le tableau ci-dessous.
Remarque : Ce n’est pas nécessaire de voir cela pour la question suivante, mais si on fait
attention au texte : « Les prédictions de structures secondaires pour la protéine CPT1A
indiquent l’existence d’une hélice alpha entre les acides aminés 103 et 122 », et que l’on relie
ça avec le diagramme d’hydrophobicité de la première question, on remarque qu’entre les
résidus 103 et 122 (à peu près) on avait le deuxième « segment candidat » hydrophobe. Ceci
va dans le sens d’un segment transmembranaire puisque seule les hélice α (à de rares
exceptions près) peuvent être transmembranaires. Trouver un feuillet β aurait été assez bizarre
alors que là on est conforter dans l’idée d’avoir un segment transmembranaire à cet endroit là.
Question 34 : Déterminez la séquence de la région en hélice alpha : 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122
a. N L G L G V W V I T V V L V G S A F T M
b. N F A S G V L V V T I V W V G L G L T M
c. N W L L V V G I G L T S G V A V V F T M
d. N V I L A V W L G T G T L V G S V V T M
e. N V V S G V L F G T G L W V A L I V T M
Réponse vrai : E : Pour ce genre de question assez classique il y a deux chose à savoir :
- Si on réfléchie et qu’on a le temps : grâce au cour on sait qu’une hélice α droite classique
comporte environ 3,6 résidus par tour de spire. Comme la représentation ici est une projection
de la position de 18 résidus consécutifs, chaque résidu en partant du premier de l’hélice peut
être représenté tous les 100° (360°/3,6). Ainsi on part du résidu 103 et on tourne tout les 100°
sur le résidu consécutif de la structure primaire !
- Une fois qu’on sait ça et qu’on veut aller vite, sur ce type de représentation il suffit de partir
du premier acide aminé de l’hélice (le 103) que l’on appellera i, et de retrouver la séquence
primaire en laissant entre chaque résidu consécutifs 4 autres résidus, c’est à dire : i, i+5, i+10,
i+15 etc .. soit ici N V V S etc .. Donc réponse E !
Question 35 : Indiquez la caractéristique de la région en hélice alpha :
a. Transmembranaire et hydrophile
FAUX : il n’y a pas assez de résidu hydrophile pour que l’on puisse affirmer cela
b. Transmembranaire et hydrophobe
VRAI : sur 18 AA, 12 présentent une hydrophobicité importante (les L, V, W, I, A et F),
l’hélice et donc majoritairement hydrophobe
c. Transmembranaire et amphiphile
FAUX : une espèce chimique est dite amphiphile (ou amphipatique) si elle possède à la
fois un groupe hydrophile et un groupe hydrophobe, or ici on a un gros bloc hydrophobe et
à côté seulement 2 résidus hydrophiles (T et S) qui ne suffisent pas réellement à former un
« groupe » hydrophile.
d. Exposée au milieu aqueux (cytoplasmique ou intermembranaire mitochondriale) et
amphiphile
FAUX : pour deux raisons qui se complètent : l’hélice alpha n’est pas amphiphile mais
hydrophobe, et étant hydrophobe elle ne peut pas être exposé « naturellement » (c’est à dire
en absence de tout problème au niveau de la protéine comme par exemple une mauvaise
conformation pathologique) à un milieu aqueux
e. Hétéropolaire (hydrophile sur 1,5 tour et hydrophobe sur 4,0 tours)
FAUX : une partie de la proposition peut paraître cohérente car ce type de conformation
permet bien à peu près de visualiser 5,5 tours (en effet 18résidus/3,6résidus par tour = 5) mais
l’hélice n’est pas hétéropolaire mais hydrophobe.
Deux oligopeptides de 15 acides aminés appartenant à la séquence de la protéine CPT1A
(partie C terminale) ont été choisis en vue de produire des anticorps polyclonaux de lapins
afin de pouvoir réaliser des western blots.
On rappelle qu’il existe trois isoformes (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des
niveaux différents selon les tissus. La séquence d’une partie de la région C terminale de
l’isoforme CPT1A (référence P50416) est alignée avec la séquence homologue de l’isoforme
CPT1B (référence Q92523) et celle de l’isoforme CPT1C (référence Q8TCG5).
L’oligopeptide 1 est à l’origine de la production de l’anticorps 1 et l’oligopeptide 2 est à
l’origine de la production de l’anticorps 2.
A partir de broyats de tissus, on prépare des extraits totaux et des fractions purifiées
mitochondriales. Pour chaque tissu (foie, muscle, cerveau), ces deux types d’échantillons sont
dénaturés par la chaleur en présence de SDS et de bêta-mercaptoéthanol et soumis à une
électrophorèse de type SDS-PAGE (une même quantité de protéine est déposée dans chaque
puits). On procède ensuite à un électrotransfert sur une membrane qui est finalement soumise
à une immunodétection avec les anticorps 1 ou 2 (à une même concentration en
immunoglobulines), marqués à l’aide d’un isotope radioactif. La révélation est faite par
autoradiographie et les résultats sont portés en figure B3.
Figure B3. Foie : pistes 1 et 2 ; Muscle : pistes 3 et 4 ; Cerveau : pistes 5 et 6.
Question 36 : Interprétation qualitative du western blot. Analysez les documents et
choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) :
a. L’anticorps 1 et l’anticorps 2 sont spécifiques de CPT1A
FAUX : on remarque sur la figure B3 que l’anticorps 1 (marqué radioactivement) ne peut
pas être spécifique de l’isoforme CPT1A puisque l’expression des trois isoforme de CPT1
est sensée être tissu dépendent, c’est à dire que même si à première vu on ne sait pas si
CPT1A est plutôt exprimé dans le foie, les muscles ou dans le Cerveau, on peut penser que
globalement elle sera majoritaire dans un de ces tissu et moins dans les autres. Or
l’autoradiographie révèle globalement avec l’anticorps 1 un tâche sur le gel pour chacun
des tissus, et donc à priori que toutes les isoformes sont détectées par cet anticorps d’où sa
non spécificité.
De plus on peut conforter cette conclusion en regardant le tableau de séquence des Cter des
3 isoformes où on voit bien que la séquence de l’oligopeptide 1 (qui a servit a faire
l’anticorps 1) est présente dans l’isoforme CPT1A, et que les isoforme CPT1B et CPT1C
possèdent des séquences très proches de l’oligopeptide 1 (à quelques résidus près) qui
seront donc aussi surement reconnaissables par l’anticorps 1. Cet anticorps reconnaît donc
les 3 isoformes et n’est donc pas spécifique de CPT1A.
En ce qui concerne l’anticorps 2, en regardant le Western Blot on remarque que cet
anticorps semble être spécifique d’une seule des isoformes de CPT1, en l’occurrence
l’isoforme qui s’exprime principalement dans le Foie. Puis grâce au tableau de séquence on
remarque que l’oligopeptide qui a servit à fabriquer l’anticorps 2 a sa séquence présente
uniquement dans l’isoforme CPT1A. On peut donc conclure deux chose, d’une part qu’il
semblerait que l’isoforme présente dans le foie soit la CPT1A (mais bon on s’en fou un peu
pour le moment, mais c’est important de comprendre ça pour les questions suivantes),
d’autre part on voit que l’isoforme pour laquelle l’anticorps est spécifique est la CPT1A !
b. L’anticorps 1 est spécifique de CPT1A et l’anticorps 2 n’est pas spécifique de CPT1A
FAUX : voir a
c. L’anticorps 1 n’est pas spécifique de CPT1A et l’anticorps 2 est spécifique de
CPT1A
VRAI : voir a
d. Vis-à-vis des 3 isoformes, la différence de spécificité des anticorps 1 et 2, n’est pas
surprenante
VRAI : Pour répondre à cette question on s’appui surtout sur le tableau de séquence. On
remarque alors qu’en effet la différence de spécificité entre les anticorps 1 et 2 n’est pas
surprenante car l’anticorps 1 va pouvoir reconnaître dans les trois forme la séquence soit
exacte soit proche de l’oligopeptide 1 dont il est issu, alors que l’anticorps 2 ne pourra
reconnaître que l’isoforme CPT1A car c’est la seul qui possède dans sa séquence la
séquence de l’oligopeptide 2 dont est issue l’anticorps 2
e. Vis-à-vis des 3 isoformes, les résultats obtenus à l’aide de l’anticorps 1 en termes de
spécificité, ne sont pas surprenants
VRAI : là on essayait éventuellement de vous piéger sur le fait que les isoformes CPT1B et
CPT1C n’avaient pas exactement au résidu près la séquence de l’oligopeptide 1 qui a
permit de fabriquer l’anticorps 1. Or ce n’est pas par ce que la séquence n’est pas
exactement la même que l’anticorps ne la reconnaîtra pas, il la reconnaîtra peut être un
peu moins bien (même si ça ne semble pas être le cas ici) mais il la reconnaîtra quand
même. D’autant plus que les anticorps fabriqués ici sont des anticorps polyclonaux qui
ne sont pas aussi spécifiques que des monoclonaux car pouvant reconnaître plusieurs
épitopes d’un même antigène donc il n’est pas surprenant de voir que notre anticorps 1
reconnaisse des séquences qui ne sont pas strictement identiques.
Question 37: Interprétation quantitative du western blot. Analysez les documents et
choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) :
a. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 68 kDa
FAUX : voir b
b. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 88 kDa
VRAI : on sait grâce à la question précédente que l’anticorps 2 est spécifique de CPT1A,
on regarde à peu près où se situe la tâche sur le gel laissé par la révélation de l’anticorps
2 et on lit un poids un peu en dessous de 97kDa donc entre les 68kDa et 88kDa
proposés on choisit 88kDa.
NB : on se rend compte dans la suite de l’exo qu’il s’agit plutôt ici de la masse moléculaire
d’une sous unité de CPT1A, mais cette question était plus une question de lecture de
blot qu’autre chose.
c. Pour l’anticorps 2, la piste 1 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la piste 2
à l’extrait total
FAUX : voir d
d. Pour l’anticorps 2, la piste 2 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la
piste 1 à l’extrait total
VRAI : on sait que « une même quantité de protéine est déposée dans chaque puits » et que
l’immunodétetion sur ce western blot s’est fait « à une même concentration en
immunoglobulines ». De plus on voit que sur la piste 2 la tâche est significativement
plus grosse que sur la piste 1, cela signifie que l’anticorps 2 s’est lié à plus de CPT1A.
On en conclue que la piste 2 correspond à la fraction purifiée mitochondriale puisque si
plus de CPT1A est présente alors que l’on a mit dans chaque puits une même quantité
de protéine totale, c’est que la CPT1A a une concentration plus grande dans
l’échantillon mis sur le deuxième puits, or cette plus grande concentration s’explique
par une étape de purification qui permet d’isolé la protéine qui nous intéresse.
e. L’anticorps 1 a plus d’affinité pour CPT1A que l’anticorps 2
FAUX : si on suppose que pour les deux Blot les étape préalable de prélèvement et de
purification se sont fait de manière strictement identique, cela signifie qu’il y aura
autant de protéines CPT1A dans les piste 1 respectives et 2 respectives de chaque Blot.
Ainsi la seul chose pouvant expliquer une différence de grosseur de tâche entre les deux
pistes 1 ou les deux pistes 2 c’est une différence d’affinité de l’anticorps pour la
CPT1A. Or en comparant respectivement les piste, on voit que globalement les tâches
révélées par l’anticorps 2 sont plus grosses que celles laissées par l’anticorps 1, d’où le
fait que ce soit l’anticorps 2 qui ai plus d’affinité que le 1 pour CPT1A
Pour mieux comprendre la structure 3D de la protéine CPT1A, des mitochondries isolées sont,
dans un premier type d’expérience, traitées par du DSS (disuccinimidyl suberate), un agent de
pontage hydrophobe. Ce genre de réactif chimique est capable de créer des liaisons covalentes
entre les sous-unités d’un complexe (dans l’expérience on voit qu’il est utilisé à différentes
concentrations). Après action, les réactifs sont éliminés et les mitochondries sont récupérées
par centrifugation. Celles-ci sont alors remises en suspension puis on procède à une extraction
des protéines pour finir par leur analyse par western blot (figure B4). La masse moléculaire du
complexe déterminée par SDS-PAGE et correspondant à CPT1A est d’environ 270 kDa.
Dans un deuxième type d’expérience, les mitochondries isolées sont traitées par un tampon
contenant une faible concentration d’un détergent non ionique (triton X-100, digitonine), de
façon à extraire et solubiliser sans les dénaturer les protéines de la membrane externe
mitochondriale. Après centrifugation, les surnageants sont soumis à une chromatographie par
filtration sur gel (superose 6) et sur chaque fraction recueillie (éluats de 200 microlitres), il est
procédé à un western blot afin de mettre en évidence de façon semi-quantitative la protéine
CPT1A (exprimée en unités arbitraires, a.u., figure B5). Le chromatogramme représente pour
chaque point : en abscisse le volume d’élution et en ordonnée la quantité de CPT1A éluée. La
masse moléculaire du complexe déterminée par filtration sur gel et correspondant à CPT1A
est d’environ 270 kDa.
Figure B4
Figure B5
Question 38 : Interprétation des expériences de pontage et de filtration sur gel. Analysez
les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) :
a. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration sur gel
est une coïncidence
FAUX : voir b
b. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration
sur gel reflète l’organisation en sous-unités
VRAI : ici on essaye de vous piéger sur le fait que la première expérience de SDS PAGE
se fait en condition dénaturante alors que la deuxième non et que vu de loin on ne
s’attend pas forcément à avoir le même résultat. Mais il faut voir qu’on utilise dans la
première expérience du DDS qui est « capable de créer des liaisons covalentes entre les
sous-unités d’un complexe » (on rappel que mis à part les ponts disulfure, les différentes
sous unités sont associées les unes aux autres par des liaisons faibles sensible au SDS),
et donc que dans les deux expériences on voit au final la protéine CPT1A sous sa forme
oligomérique. De plus le témoin de la première expérience sans DDS montre une seule
tâche de plus petit poids moléculaire qui correspond au poids d’une sous unité de la
protéine. Ces deux expériences démontrent donc bien l’organisation en sous unités.
c. Les résultats expérimentaux sont incompatibles avec une organisation oligomérique de
la protéine CPT1A
FAUX : au contraire le gradient croissant de DDS dans la première expérience montre une
organisation oligomérique puisqu’il permet de re-associer les différentes sous unités de
CPT1A entre elles malgré des conditions dénaturante dans un premier temps.
d. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation homodimérique de
la protéine CPT1A
FAUX : voir e
e. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation
homotrimérique de la protéine CPT1A
VRAI : on sait que la protéine native a un poids moléculaire de 270 kDa. Ensuite, soit sur
la figure B4, soit sur la figure B3 (où en effet on était aussi en condition dénaturante
avec SDS et bêta-mercaptoéthanol histoire d’être sûr que même d’éventuels pont
disulfures ne viennent pas fausser les résultats) que chacune des sous unité de CPT1A a
en gros un poids moléculaire de 90kDa, or 90 x 3 = 270 kDa d’où une organisation
homotrimérique !
Après hydrolyse trypsique de la protéine CPT1A, on isole par chromatographie sur phase
inversée 2 tétrapeptides parmi les différents peptides produits. On analyse ces peptides par
spectrométrie de masse. Les spectres obtenus après électronébulisation (ESI, pas de
fragmentation) fournissent un ion moléculaire (M+H)+ de rapport m/z déterminé pour chaque
peptide. La fragmentation (ESI-MS-MS) de chaque ion fournit les fragments de type « y » de
rapport m/z suivants :
Il convient de noter que le prétraitement de la protéine CPT1A par une phosphatase suivi de
l’hydrolyse trypsique ne permet d’isoler qu’un seul tétrapeptide (tétrapeptide 1).
Rappel : La fragmentation des chaînes peptidiques se fait principalement au niveau des
liaisons peptidiques selon le schéma suivant :
La charge positive retenue côté COOH fournit les fragments de type « y ». L’acide aminé C
terminal verra sa masse augmenter de 19 (à cause du OH du groupement carboxylique et de la
fonction amine). En vous aidant du tableau ci-dessous, déterminez la séquence de chaque
tétrapeptide :
Question 39 : Déterminez la séquence des peptides trypsiques (PTyr correspond à de la
phospho tyrosine) :
a. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - Tyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - PTyr – Cys
b. Tétrapeptide 1 : Cys - Tyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - PTyr - Asp – Arg
VRAI
c. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - PTyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - Tyr – Cys
d. Tétrapeptide 1 : Cys - PTyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - Tyr - Asp – Arg
e. Tétrapeptide 1 : aucune séquence proposée Tétrapeptide 2 : aucune séquence
proposée
Raisonnement : Tout d’abord on élimine facilement les proposition a et c en déterminant
le dernier acide aminé des deux tétrapeptides. En effet on prend le dernier fragment
d’un PM de 175,1190 auquel on retire 19, ce qui donne à peu près 156, ce qui
correspond dans le tableau à l’Arginine.
Puis on « remonte » : . 290,1458 – 175,1190 = 115 --> Asp
. pour le tétrapeptide 1 : 453,2092 – 290,1458 = 163 --> Tyr
556,2184 – 453,2092 = 103 --> Cys
. pour le tétrapeptide 2 : 533,1756 – 290,1458 = 243 --> ?
636,1847 – 533,1756 = 103 --> Cys
On a donc tetrapeptide 1 = Cys – Tyr – Asp - Arg et Tetrapeptide 2 = Cys - ? – Asp – Arg
Ensuite il faut voir que lorsque l’on fait subir une déphosphorylation de la protéine CPT1A
à l’aide d’une phosphatase, on n’obtient ensuite que le tétrapeptide 1. Or le fragment
obtenu avec le tétrapeptide 2 de PM 243 semble indiquer une augmentation de PM d’à peu
près 80 témoignant ainsi d’un résidu ayant subit une modification post-traductionnelle
(c’est pour cela que l’on ne retrouve nulle part 243 dans le tableau). Vu l’expérience avec
la phosphatase, on en déduit que cette modification post-traductionnelle est certainement
une phosphorylation.
Or il faut savoir qu’une phosphorylation est l’ajout d’un groupement –H2PO3 à la place
d’un –H, ce qui ajoute un PM approximatif de 3x16 (pour l’oxygène) + 30 (pour le
phosphate) + 2 = 80. (Vous devez connaître approximativement le poids des modifications
post-traductionnelles données en cours histoire de ne pas avoir à refaire le calcul à chaque
fois.
Pour finir il faut remarquer que 243 – 80 = 163 --> Tyr, c’est donc bien sur une tyrosine
qu’a eu lieu la phosphorylation !
Donc le tétrapeptide 2 est bien : Cys – PTyr – Asp – Arg !
ENZYMOLOGIE
On s’intéressera ici principalement à la CPT1, qui catalyse la réaction :
palmityl-CoA + carnitine ⇄ palmityl-carnitine + CoA
La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de foie de rat, afin de comparer son activité
sur des acyl-CoA de différentes longueurs, pour une concentration constante et saturante de
carnitine (2 mM). Les résultats sont les suivants :
Question 40 : Pour une enzyme dont la cinétique est michaelienne, et qui satisfait aux
conditions du quasi-équilibre, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A . La Km est approximativement égale à la constante de dissociation du complexe
enzyme-substrat (ES), c’est-à-dire de l’équilibre E + S ⇄ ES
VRAI : En conditions de quasi-équilibre, k2 << k1, donc Km≈k-1/k1 soit Km≈ Kd
B. La Km est approximativement égale à l’inverse de la constante d’affinité du
substrat pour l’enzyme (Kaff)
VRAI : Nous sommes dans l’hypothèse du quasi-équilibre, et Kd= 1/Kaff, donc Km≈1/Kaff
C. La Vmax est proportionnelle à la Km
FAUX :Vmax est proportionnelle à k2 et non à Km, Vmax= k2.[E]t
D. La Km est la concentration de substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à
Vmax/2
VRAI :Du pur cours…
E. La Km est proportionnelle à la concentration totale de l’enzyme ([E]t)
FAUX : Vmax est proportionnelle à la concentration totale de l’enzyme [E]t…
Question 41 : On admet que la cinétique de la CPT1 correspond aux conditions de
quasi-équilibre. Au vu des résultats présentés dans le tableau ci-dessus, quelle est la ou
quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A. Le substrat qui a la plus grande affinité pour la CPT1 est le composé de longueur C2
FAUX : ce composé a la plus faible affinité pour CPT1 (son Km étant le plus grand, il
a l’affinité la plus faible (Km= 1/Kaff))
B. Le substrat pour lequel la Vmax est la plus élevée est le composé de longueur C16
VRAI : 100% de Vmax… pourquoi chercher compliqué
C. Les différences de Km et de Vmax prouvent que l’enzyme purifiée est en réalité le
mélange de différentes iso-enzymes
FAUX : ici, ce sont bien les substrats qui changent (longueur des chaines) et non l’enzyme,
rien ne permet de conclure cela…
D. Les données présentées ne permettent pas de calculer le rapport kcat/Km
VRAI : on ne dispose pas de la concentration totale d’enzyme, on ne peut pas calculer
kcat.[E]t=Vmax, et donc kcat/Km non plus…
E. Les données présentées ne sont pas interprétables car, dans les conditions du quasi-
équilibre, on ne peut pas déterminer la Vmax
FAUX : la Vmax dépend de la concentration totale d’enzymes, elle dépend des
conditions expérimentales et peut donc être déterminée, même en condition de quasi-
équilibre
La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de rat, préparées soit à partir de muscle
(CPT1B), soit à partir de foie (CPT1A). Dans les deux cas, on a utilisé soit des animaux
nourris, soit des animaux laissés à jeun pendant 24 heures. Sur les CPT1B et CPT1A purifiées
à partir d‘animaux nourris ou à jeun, on a étudié l’effet du malonyl-CoA, qui est un composé
intermédiaire de la synthèse des acides gras. Les résultats sont présentés dans la figure B6.
Figure B6 : Effet du malonyl-CoA sur l’activité CPT1, mesurée avec comme substrats le
palmityl-CoA et la carnitine.
Question 42 : Au vu des résultats présentés dans la figure B6, quelle est la ou quelles
sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. Ces résultats démontrent que le malonyl-CoA est un inhibiteur compétitif vis-à-vis du
palmityl-CoA
FAUX : ces résultats démontrent qu’il est inhibiteur, mais pas nécessairement compétitif
b. Seule la forme hépatique de la CPT1 (CPT1A) est significativement inhibée par le
malonyl-CoA
VRAI: que les rats soient à jeun ou nourris, l’inhibition de CPT1B est quasiment
négligeable, surtout à côté de l’effet du malonyl-CoA sur CPT1A
c. Le jeûne induit la protéolyse de la CPT1A
FAUX : Rien ne permet de le dire… (ne faites JAMAIS de conclusion hâtive en bioch’ !)
d. Le malonyl-CoA est un substrat de la CPT1A, mais pas de la CPT1B
FAUX : Cette expérience ne permet pas de le dire.
e. Le jeûne entraîne une augmentation de la sensibilité de la forme hépatique (CPT1A) à
l’effet inhibiteur du malonyl-CoA
FAUX: On voit bien que l’état nourri renforce l’inhibition du malonyl-CoA sur CPT1A et
non l’inverse.
Sachant que le jeûne induit la libération de glucagon, une hormone qui agit par l’intermédiaire
de protéines-kinases, certains chercheurs ont supposé que l’effet du jeûne sur la forme
hépatique de la CPT1 (CPT1A) était dû à une phosphorylation de la protéine.
Ils ont purifié la CPT1A à partir de foies de rats laissés à jeun, et ont étudié l’effet du
traitement de l’enzyme purifiée par un mélange de protéines-phosphatases. L’activité de
l’enzyme non traitée, était de 115 nmol.min-1.mg-1 de protéines, contre 65 nmol.min-1.mg-1 de
protéines pour l’enzyme traitée. Ils ont aussi comparé l’effet inhibiteur du malonyl-CoA sur
l’enzyme traitée ou non par les protéines-phosphatases. Les résultats sont présentés dans la
figure B7.
Figure B7 : Effet du malonyl-CoA sur la CPT1A purifiée à partir du foie de rats à jeun, non
traitée (- PPases) ou traitée (+ PPases) par des protéines-phosphatases. Les substrats utilisés
sont le palmityl-CoA et la carnitine.
Question 43 : Compte-tenu des données de l’énoncé, et des résultats présentés dans la
figure B7, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de son activité
enzymatique
FAUX : On passe de 115 à 65 après déphosphorylation , l’activité diminue et n’augmente
donc pas
b. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de la sensibilité de
l’enzyme à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA
VRAI : après déphosphorylation, on obtient la courbe de la figure B6 pour les rats à l’état
nourri, la sensibilité de CPT1A à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA a augmenté
c. Les données expérimentales sont incompatibles avec une régulation de la CPT1A par
modification covalente de l’enzyme
FAUX : la déphosphorylation et la phosphorylation sont des liaisons covalentes, et il y a
bien régulation de l’activité de l’enzyme en fonction de son état de phosphorylation
d. La déphosphorylation de la CPT1A fait disparaître le site de fixation du malonyl-CoA
FAUX : la déphosphorylation rend la CPT1A sensible à l’effet inhibiteur du malonyl-
CoA..
e. La protéolyse partielle de la CPT1A par les protéines-phosphatases entraîne une baisse
de l’activité enzymatique
FAUX : ce n’est pas la déphosphorylation elle-même qui entraine la baisse de l’activité
Question 44 : Concernant la régulation d’une activité enzymatique par modification
covalente de la protéine (phosphorylation/déphosphorylation), quelle est la ou quelles
sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. La déphosphorylation entraîne toujours une diminution de l’activité catalytique
FAUX : Non non non ! Ne tombez pas dans ce piège, la déphosphorylation peut aussi
augmenter l’activité catalytique.
b. La phosphorylation entraîne toujours une augmentation de l’affinité de l’enzyme pour
le substrat
FAUX : Comme pour la proposition a, ce n’est pas toujours le cas (questions simples pour
le c*******, faites gaffe)
c. Le pourcentage d’enzyme sous la forme phosphorylée dépend uniquement de la
concentration intracellulaire de l’ion phosphate
FAUX : le « uniquement » rend la proposition fausse
d. La phosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines-kinases et la
déphosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines phosphatases
VRAI : A chaque action, son enzyme .
e. La régulation par modification covalente ne concerne jamais des enzymes allostériques
FAUX : elle peut concerner ce type d’enzyme
Afin de déterminer la localisation du site actif et du site de liaison du malonyl-CoA, la
CPT1A, purifiée à partir de foies de rats nourris, a été soumise à des protéolyses ménagées.
Ces expériences et des expériences complémentaires de mutagénèse dirigée in vitro, ont
montré que le site de fixation du malonyl-CoA était situé sur l’extrémité N-terminale de
l’enzyme, et que le site actif était situé sur l’extrémité C-terminale. Pour préciser le mode
d’action du malonyl-CoA, des chercheurs ont fait exprimer différentes protéines
recombinantes dans la levure S. cerevisiae (qui possède des mitochondries, mais n’a pas
d’activité CPT) : la CPT1A en totalité, la CPT2 (voir schéma de l’Introduction) en totalité, et
un hybride CPT1A/CPT2, formé de la fusion de l’extrémité N-terminale de CPT1A avec la
totalité de CPT2. Les sites actifs de la CPT1A et de la CPT2 sont strictement identiques. Les
propriétés de chacune de ces enzymes ont été étudiées. Les constructions et les résultats sont
présentés ci-dessous :
Question 45 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) compatible(s) avec les
données de l’énoncé et avec les résultats présentés ci-dessus ?
a. La CPT2 est insensible à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA
VRAI : le % d’inhibition est de 0 pour la CPT2
b. La présence du site actif de l’enzyme suffit pour que le malonyl-CoA puisse exercer son
effet inhibiteur
FAUX : La protéine recombinante est insensible à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA et
possède pourtant le site actif de l’enzyme CPT2
c. L’effet inhibiteur du malonyl-CoA nécessite la présence simultanée de l’extrémité
N-terminale et de la partie C-terminale de la CPT1A
VRAI : la protéine recombinante possède le site de fixation du malonyl-CoA sur CPT1A
mais que le site actif de CPT2, et il n’y a pas d’inhibition. Il faut donc la partie C-TER de
CPT1A pour avoir une inhibition
d. L’extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l’activité de la CPT2
FAUX : l’activité reste sensiblement la même quand on compare la CPT2 et la protéine
recombinante CPT1A/CPT2
e. L’extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l’affinité du site actif de la
CPT2 pour le palmityl-CoA
FAUX : la baisse est très faible, et en plus, c’est la Km qui baisse, donc l’affinité
augmente ;)
Des travaux ont montré que le jeûne provoque une augmentation de la fluidité de la
membrane externe de la mitochondrie, et qu’il existe une relation inverse entre cette fluidité et
le degré d’inhibition de la CPT1A par le malonyl-CoA. L’insertion de la CPT1A dans la
membrane externe de la mitochondrie est telle que l’extrémité N-terminale et l’extrémité
Cterminale se trouvent toutes deux dans le cytosol.
Pour préciser la relation entre la fluidité de la membrane externe mitochondriale et l’inhibition
de la CPT1A par le malonyl-CoA, des chercheurs ont utilisé : d’une part, l’alcool benzylique,
qui augmente la fluidité membranaire ; d’autre part, un réactif qui a la propriété de stabiliser
un éventuel contact entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale de la CPT1A, en
créant une liaison covalente. Les résultats de cette étude sont présentés dans la figure B8 et
dans le tableau B1 ci-dessous.
Tableau B1 : Des mitochondries de foies de rats nourris ont été traitées à l’alcool benzylique
aux concentrations indiquées, puis avec l’agent permettant le couplage stable de l’extrémité
N-terminale et de l’extrémité C-terminale de la CPT1A (« Couplage N/C »), ce qui permet
d’évaluer la probabilité de contact entre ces deux extrémités. Les résultats sont exprimés en de
la CPT1A sous forme couplée.
Question 46 : Compte tenu des données de l’énoncé, et des résultats présentés dans la
figure B8 et le tableau B1, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. En fluidifiant la membrane externe de la mitochondrie, l’alcool benzylique
diminue la probabilité de contact entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-
terminale de la CPT1A
VRAI : le tableau B1 montre qu’en augmentant la concentration d’alcool benzylique (et
donc en augmentant la fluidité membranaire), la probabilité de couplage diminue.
b. L’alcool benzylique mime l’effet du jeûne sur la sensibilité de la CPT1A à l’effet
inhibiteur du malonyl-CoA
VRAI : quand on met de l’alcool benzylique dans le milieu, la courbe de la figure B8 se
superpose à celle des rats à jeun. L’alcool mime donc l’effet du jeûne (ils augmentent tous
deux la fluidité membranaire).
c. L’alcool benzylique augmente la sensibilité de la CPT1A à l’effet inhibiteur du
malonyl-CoA
FAUX : l’alcool benzylique diminue la sensibilité de la CPT1A à l’inhibition puisqu’il
mime le jeûne
d. L’alcool benzylique diminue l’activité catalytique de la CPT1A
FAUX : Il ne la diminue pas, il permet de contrer l’effet inhibiteur du malonyl-CoA
et ainsi, « augmente » l’activité catalytique de la CPT1A
e. L’alcool benzylique, qui est hydrophobe, entre en compétition avec la palmityl-CoA
pour le site actif de la CPT1A
FAUX : l’alcool benzylique à surtout une action indirecte selon l’expérience (celle
d’augmenter la fluidité de la membrane), rien ne dit qu’il se fixe sur la CPT1A
Question 47 : Au total, concernant la régulation de la CPT1A, quelle est la ou quelles
sont les proposition(s) compatible(s) avec l’ensemble des données des énoncés et des
résultats présentés dans la partie « enzymologie » de ce problème ?
a. L’inhibition de la CPT1A par le malonyl-CoA nécessite un contact entre
l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale de l’enzyme
VRAI : l’alcool benzylique augmente la fluidité membranaire, ce qui permet une
diminution de la probabilité de couplage entre les extrémités N-TER et C-TER, et cette
fluidité empêche l’inhibition du malonyl-CoA. On peut donc dire que le couplage N-
TER/C-TER intervient dans l’inhibition de l’enzyme.
b. Le jeûne, en provoquant une augmentation de la fluidité de la membrane externe
de la mitochondrie, diminue la probabilité de contact entre l’extrémité N-
terminale et l’extrémité C-terminale de la CPT1A
VRAI : l’alcool mime le jeûne et le tableau montre qu’il permet de diminuer la probabilité
de contact (et donc, le jeûne aussi)
c. Le jeûne, en provoquant une diminution de la sensibilité de la CPT1A à l’effet
inhibiteur du malonyl-CoA, entraîne une diminution du transfert de l’acide palmitique
vers la matrice mitochondriale
FAUX : le jeûne entraîne une activation de l’enzyme CPT1A, il faut alors retourner au
chapitre du début pour voir sa fonction (les textes sont longs, donc pensez à noter les infos
importantes sur une feuille à part) : faire passer l’acide palmitique du cytosol vers la
matrice mitochondriale. Si elle est active, elle augmente le transfert de l’acide gras.
d. La diminution de la concentration de malonyl-CoA observée au cours du jeûne
peut contribuer à l’augmentation du transfert de l’acide palmitique vers la
matrice mitochondriale
VRAI : Si la concentration de l’inhibiteur diminue, l’activité de CPT1A augmente, et elle
peut ainsi faire passer plus d’acide palmitique du cytosol vers la matrice pour qu’il y soit
dégradé.
e. Une augmentation du transfert de l’acide palmitique vers la matrice
mitochondriale permet d’augmenter sa dégradation oxydative
VRAI : Evidemment, puisque la dégradation oxydative se déroule dans la mitochondrie.
L’inhibition de la CPT1A pourrait être un moyen de traiter certaines maladies métaboliques.
Plusieurs groupes ont donc cherché à synthétiser des inhibiteurs de cette enzyme. Une
première série de composés, appelés C73-CoA, C76-CoA et C75-CoA ont été testés sur une
CPT1A recombinante produite dans la levure S. cerevisiae. Les résultats sont présentés dans
la figure B9
Figure B9 : L’activité CPT1A a été mesurée en l’absence d’inhibiteurs, ou en présence de
l’un d’entre eux. Chaque inhibiteur a été utilisé à la même concentration (5 μM).
Question 48 : Concernant les composés étudiés dans l’expérience de la figure B10, quelle
est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs allostériques de la CPT1A
FAUX : voir proposition b
b. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs compétitifs de la CPT1A
VRAI : les droites coupent l’axe des ordonnées en un même point qui est 1/Vmax, et
elles coupent l’axe des abscisses en des points différents qui sont plusieurs -1/Km. La
Vmax est donc inchangée, contrairement à la Km. On a donc affaire à des inhibiteurs
compétitifs
c. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs non compétitifs de la CPT1A
FAUX : voir la proposition b
d. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C75-CoA
VRAI : c’est celui qui donne le -1/Km le plus proche de l’origine, ce qui correspond au
plus grand Km, et donc à la plus faible affinité ( plus grand pouvoir inhibiteur)
e. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C73-CoA
FAUX : même raisonnement qu’en d, il donne le -1/Km le plus éloigné de l’origine, donc
le plus petit Km, et la plus grande affinité (plus faible pouvoir inhibiteur des 3)
BIOENERGETIQUE
Des souris mutantes présentant un excès d’activité CPT avec un métabolisme lipidique
anormal font l’objet d’analyses biochimiques musculaires qui donnent les résultats suivants,
exprimés en % par rapport aux valeurs mesurées dans des muscles de souris contrôles :
148 sur la vitesse de production mitochondriale d’ATP
151 sur la vitesse de production mitochondriale d’acétyl-CoA
62 pour la teneur en lipides totaux
144 sur la vitesse de production mitochondriale de FADH2
Question 49 : Sur la base des résultats ci-dessus, quelle est la ou quelles sont les
proposition(s) exacte(s)?
a. Les souris mutantes ont une glycolyse hépatique anormalement élevée
FAUX : dans cette expérience on regarde des analyse musculaire et non hépatique, de plus
comme c’est le métabolisme lipidique qui est anormal, on ne parlerai plutôt d’une bêta-
oxydation anormal (voie de dégradation des acides Gras) que d’une glycolyse qui est la
voie de dégradation du Glucose.
b. L’accroissement de la production d’ATP peut résulter d’un accroissement de la
fourniture de molécules de coenzymes réduits à la chaîne respiratoire
VRAI : les coenzymes réduits NADH et FADH2 vont agir au niveau des complexes CoI et
CoII en « relâchant » leurs électrons dans la chaîne respiratoire, permettant ainsi en
passant de complexe en complexe le bon fonctionnement de l’ ATP synthase en
permettant le maintient du gradient de proton nécessaire à cette dernière. Ainsi les 148%
sur la vitesse de production mitochondriale d’ATP peuvent être dut à un grand apport de
molécules de coenzymes réduits.
c. Ces souris mutantes ont une capacité anormalement élevée d’oxydation musculaire
des acides gras
VRAI : on voit en effet que la teneur en lipide totaux est inférieur à la normale (62%), cela
témoigne d’une surconsommation de ces lipides, or cette surconsommation se fait via la
bêta-oxydation, d’où une oxydation musculaire anormalement élevée.
d. Un défaut du Cycle de Krebs est responsable de la totalité des observations effectuées
chez les souris mutantes
FAUX : un défaut au niveau du cycle de Krebs n’expliquerai pas la teneur lipidique
anormalement faible.
e. Aucune des interprétations ci dessus n’est exacte
FAUX
Dans des conditions où les acides gras peuvent entrer dans les mitochondries, les capacités
fibroblastiques de production mitochondriale de NAD+, NADH + H+, FAD, FADH2 et ATP
sont mesurées, en réponse à l’addition d’acides gras libres, chez un malade présentant un
déficit sévère de la ß-oxydation des acides gras.
Question 50 : Par comparaison avec des fibroblastes d’un individu sain, identifiez la ou
les bonne(s) réponse(s) :
a. La production d’ATP est accrue
FAUX : le malade présente un déficit sévère de la bêta-oxydation, la dégradation des
acides gras en acétyl-CoA est donc diminuée, du coup le cycle de Krebs est moins
alimenté en Acétyl Coa et ne fonctionne donc pas de manière optimal, d’où au final une
production d’ATP qui diminue.
b. Le rapport NAD+ / NADH+H+ est diminué
FAUX : la chaine respiratoire n’est pas affectée en soit, donc elle continuera à consommer
tous les NADH,H+ qu’elle trouvera, alors que dans le même temps, comme le cycle de
Krebs est ralentie par la baisse de fourniture d’Acétyl-CoA, la formation de NADH,H+
se trouve ralentie. On a donc de plus en plus de NAD+ alors que le NADH,H+ est
moins renouvelé, le rapport NAD+/NADH,H+ diminue donc !
c. Les productions de NADH + H+, FADH2 et ATP sont diminuées
VRAI : comme il y a un déficit de la bêta-oxydation, moins d’Acétyl-CoA est fournit au
cycle de Krebs qui est donc moins efficace et qui ne produit plus autant de coenzymes
réduits. De plus comme il y a moins de coenzymes réduits, la production d’ATP au
niveau de la chaine respiratoire diminue également.
d. Les productions de NADH + H+ et FADH2 sont diminuées
VRAI : voir c
e. Le rapport FAD / FADH2 est diminué
Des mitochondries de souris normales sont isolées et placées dans un milieu permettant leur
respiration en présence de substrats. La capacité de ces mitochondries à respirer, synthétiser
de l’ATP et être le siège d’un transport de protons est mesurée.
Question 51 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. La face inter-membranaire de la membrane mitochondriale interne se charge
positivement par rapport à la face matricielle au cours de la respiration
VRAI :
b. La membrane mitochondriale externe contrôle l’établissement du gradient de protons
présent de part et d’autre de la membrane interne lorsque les mitochondries respirent
FAUX : c’est au niveau de la membrane mitochondriale interne que s’effectue ce contrôle
c. La synthèse mitochondriale d’ATP est accompagnée par un transport de protons
depuis l’espace inter-membranaire vers la face matricielle de la membrane interne
VRAI : c’est grâce à ce mouvement des ions H+ qui passent selon leurs gradient que l’ATP
synthase peut faire sont boulot et reformer de l’ATP
d. Au sein de la chaîne respiratoire, interviennent des systèmes transporteurs de
protons et d’électrons
VRAI : les Co I et CoIII ou IV en sont de bon exemple puisqu’ils permettent de transporter
des électrons de complexe en complexe et de faire remonter des H+ pour maintenir un
gradient entrant.
e. Le transport des électrons, le transport des protons et les phénomènes de
phosphorylation correspondent à des processus étroitement couplés
VRAI : tous ceci permet au final la resynthèse d’ATP.
BIOLOGIE MOLECULAIRE
Pour étudier la structure du ou des gènes codant la CPT1 ainsi que le profil d’expression
tissulaire, des chercheurs disposent d’une banque d’expression réalisée à partir d’un mélange
de tissus (foie, muscle, muscle cardiaque) ainsi que, pour le criblage, d’un anticorps anti
CPTA1 de lapin préparés à partir de l’oligopeptide 1 comme indiqué plus haut (figure B3).
Cette banque d’expression utilise un système bactérien comme cellules hôtes.
Question 52 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
a. On réalise une banque d’expression après extraction des acides nucléiques suivie d’une
transcription in-vitro puis synthèse des ADNc et clonage
FAUX : on réalise la banque après extraction des ARN suivie de l’action de la
transcriptase inverse pour obtenir les ADNc. Les ADNc étant ensuite insérés dans des
vecteurs.
b. On réalise une banque d’expression après insertion de l’ensemble des ADNc obtenus à
partir du mélange dans un phage comportant un gène codant la bêta galactosidase sous
le contrôle du promoteur d’un « gène domestique » humain
FAUX : le promoteur n’est pas celui d’un gêne domestique humain mais de plusieurs
gènes différents dont celui codant la bêta galactosidase
c. On réalise une banque d’expression après insertion des ADNc obtenus à partir du
mélange, chacun dans un vecteur comportant un gène codant la bêta galactosidase
sous le contrôle d’un promoteur de l’opéron lactose
VRAI : Pour faire une belle banque d’expression, il nous faut une cellule hôte (la
bactérie), le fragment d’intérêt (ADNc) et notre vecteur portant un marqueur de sssélection
(aaah !). L’intérêt est que notre fragment d’intérêt s’insère dans le gène de la bêta
galactosidase et l’invalide, tout en se servant du promoteur de l’opéron lactose pour
pouvoir être transcrit. Invalider la bêta galactosidase permet de détecter quelles bactéries
contiennent les vecteurs recombinés, car la bêta galactosidase, en présence de son substrat,
rend le milieu bleu. Si le milieu ne devient pas bleu, la bactérie a recombiné le bon vecteur.
d. La protéine produite est en général une protéine de fusion
VRAI : les vecteurs d’expression contiennent notre ADNc, placé au sein d’un gène codant
une protéine du vecteur normalement. La transcription de cette séquence recombinée suivie
d’une traduction aboutit donc à une protéine de fusion.
e. Tous les ADNc insérés correspondant à CPTA1, exprimeront la protéine CPTA1
FAUX : les ADNc insérés ne sont pas forcément mis dans le bon sens de lecture et ne
Seront donc tous transcrits.
Le criblage à l’aide de l’anticorps 1 a permis d’identifier deux clones recombinants (X et Y).
Chacun de ces clones est amplifié après culture en milieu bactérien et les inserts sont extraits
et isolés du vecteur. Chacun des inserts (ADNc) des clones X et Y est marqué de manière
radioactive et utilisé comme sonde pour réaliser un northern blot à partir d’extraits de
différents tissus. Après hybridation avec l’ADNc du clone X et lavages, l’autoradiographie
montre les résultats indiqués dans la figure B10 :
Figure B10 : Northern blot obtenu après hybridation avec l’ADNc du clone X.
GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.
Question 53 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
Les résultats observés sont compatibles avec :
a. Une transcription spécifique de tissu
VRAI : la taille des transcrits diffèrent en fonction des tissus, et ceux retrouvés dans les
globules blancs (2,4Kb) ne sont pas ailleurs, de même pour les transcrits de 0,8Kb du
placenta
b. Une réplication spécifique de tissu
FAUX : piège classique^^, on est dans un northern blot, on ne voit donc que les ARN
c. Une utilisation de promoteurs alternatifs
VRAI : on obtient des transcrits de tailles différentes
d. Une maturation spécifique de tissu des ARNm
VRAI : l’épissage alternatif n’est pas le même en fonction du tissu
e. L’absence du signal au niveau du muscle ne peut s’expliquer que par des artéfacts liés à
la qualité de l’anticorps 1 utilisé pour le criblage de la banque d’expression
FAUX : ce n’est pas la seule explication possible, il peut aussi s’agir d’une question de
sensibilité de la technique utilisée ou autre.
La membrane du northern-blot est débarrassée (déshybridée) de la sonde ADNc du clone X
puis ré-hybridée avec l’ADNc du clone Y. Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure
B11 :
Figure B11 : Northern blot obtenu après hybridation à l’aide de l’ADNc du clone Y.
GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.
Question 54 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
Les résultats des deux northern blots (B10 et B11) sont compatibles avec:
a. L’utilisation de sites d’initiation de la traduction différents selon les tissus
FAUX : Northen blot, donc parler de traduction n’a pas sa place ici
b. L’utilisation de promoteurs alternatifs selon les tissus
VRAI : en fonction des positions des promoteurs, les transcrits obtenus n’ont pas
forcément la même taille
c. L’utilisation de sites d’épissage différents selon les tissus
VRAI : ça expliquerait les différences de taille des transcrits en fonction des tissus
d. L’utilisation de sites de polyadénylation différents selon les tissus
VRAI : même histoire, c’est compatible vu que notre seule information est l’existence de
transcrits de tailles différentes…
e. L’ensemble de tous ces mécanisme
FAUX : la proposition a est fausse
Question 55 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
L’ensemble des résultats permettent à ce stade d’affirmer que les ADNc des clones X et
Y :
a. Sont les produits de deux gènes différents
b. Sont issus d’un seul et même gène
c. Correspondent à des expressions différentes au cours du développement
d. Sont les produits d’une même famille de gènes
e. Aucune de ces propositions n’est exacte
VRAI : je ne commente pas les propositions précédentes (toutes FAUSSES d’ailleurs) vu
que nous ne disposons que d’une seule information (taille des transcrits), on ne peut rien
AFFIRMER à ce stade
Les extrémités des ADNc issus des clones X et Y ont été séquencées. Les résultats de
séquence du premier et dernier exon obtenus pour le brin sens, sont indiqués respectivement
en figure B12A pour le clone X et en figure B12B pour le clone Y :
Figure B12A : Une partie du brin sens (premier et dernier exon) du clone X.
B12B : Une partie du brin sens (premier et dernier exon) du clone Y
On souhaite réaliser une RT-PCR à l’aide d’amorces spécifiques de la séquence de l’ADNc
du clone X. Pour cela, on décide de réaliser un choix d’amorces.
Question 56 : Parmi les combinaisons proposées ci-dessous, laquelle ou lesquelles permet
ou permettent de réaliser une amplification correcte ?
a. 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’ + 5’ GGATGACTTAGGGGTTTCCG 3’
b. 5’ GGAAGACTCTGGGGGGTCCG 3’ + 5’ GGATGACTTAGGGGTTTCCG 3’
c. 5’ GGAAGACTCTGGGGGGTCCG 3’ + 5’ CCTACTGAATCCCCAAAGGC 3’
d. 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’ + 5’ GCCTTTGGGGATTCAGTAGG 3’
e. 5’ GCCTTTGGGGATTCAGTAGG 3’ + 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’
VRAI : les propositions d et e sont les mêmes (oui oui, je sais, c’est vicieux un peu^^).
Sinon, c’est la base : vous prenez votre brin sens en 3’ (puisque que vous formez un
brin 5’vers 3’), et vous le lisez à l’envers (en mettant les nucléotides correspondants)
Grâce au couple d’amorces adéquates, les produits de RT-PCR sont analysés et montrent,
après électrophorèse, les résultats portés dans la figure B13.
Figure B13 : Electrophorèse des produits de RT-PCR obtenus grâce au couple d’amorces
correspondant à la séquence du clone X. Les pointillés indiquent des produits de RT-PCR de
faible intensité. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.
La même expérience de RT-PCR est réalisée à l’aide d’amorces spécifiques de la séquence
d’ARNm du clone Y. Les résultats sont portés dans la figure B14.
Figure B14 : Electrophorèse des produits de RT-PCR obtenus grâce au couple d’amorces
correspondant à la séquence du clone Y. Les pointillés indiquent des produits de RT-PCR de
faible intensité. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.
Question 57 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
L’ensemble des résultats obtenus par RT-PCR :
a. Confirme l’existence de deux gènes différents correspondant aux clones X et Y
FAUX : rien ne prouve l’existence de deux gènes différents
b. Montre que cette technique est plus sensible que le northern blot
VRAI : les transcrits présents sont plus nombreux que dans le northern blot (ceux
« apparus » étaient en trop faible quantité pour être détectés par le NB)
c. Démontre l’existence de deux ARNm d’un même gène de stabilité différente selon les
tissus
FAUX : cette expérience ne démontre rien de tel
d. Montre que l’ADNc du clone Y correspond à un ARNm majoritairement exprimé
dans les tissus de type musculaire
VRAI : les 3 transcrits de tailles différentes sont tous présents au niveau du muscle, les
autres tissus n’en présentent pas autant
e. Aucune de ces propositions n’est exacte
FAUX
Des médecins ont adressé à des chercheurs spécialistes de CPT, pour une étude génétique, une
famille dont un enfant présentait une maladie sévère affectant le métabolisme d’oxydation du
palmitate. Ces chercheurs réalisent à partir de fibroblastes un western blot chez l’enfant
malade ainsi que chez ses parents, qui ne présentent aucun symptôme. Des résultats
significatifs ne sont obtenus qu’avec l’anticorps reconnaissant CPT1A. Les résultats sont
portés sur la figure B15.
Figure B15 : En 1 le père, 2 la mère, 3 l’enfant malade, 4 Individu sain contrôle. Les bandes
de faible intensité correspondent à des hybridations non spécifiques.
Question 58 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A ce stade, les résultats obtenus chez le malade, sont compatibles avec :
a. La synthèse d’une protéine instable totalement dégradée
VRAI : nous étudions un Western Blot (donc les protéines), l’enfant ne présente aucune
barre à 90kDa, donc aucune protéine CPT1A. Elle peut donc être instable et dégradée par
la suite. Cette hypothèse peut être approfondie en faisant un NB, si l’ARNm est présent, on
peut penser que le problème vient bien de la stabilité de la protéine.
b. La synthèse d’ARNm codant CPT1A totalement dégradé
VRAI : Pas d’ARNm, pas de protéine, donc rien sur le WB . Il faudrait faire un Northern
blot pour réfuter ou affirmer cette hypothèse
c. L’absence de transcription du gène codant CPT1A par hyperméthylation des
promoteurs
VRAI : pareil, n’ayant que le WB, cette hypothèse est valable
d. La présence de mutations d’épissage
VRAI : elles peuvent aboutir à un ARNm instable, dégradé par la suite.
e. Une délétion totale du gène CPT1A
VRAI : donc pas de protéine visible sur le WB
Des RT-PCR chevauchantes sont réalisées sur les ARNm du malade à l’aide d’amorces
spécifiques de CPT1A. Un produit de RT-PCR F1 inclut, chez le sujet témoin, les exons 13,
14 et 15, l’autre fragment F2 comprend les exons 15, 16 et 17. Les résultats observés sont
portés sur les figures B16A et B16B.
Chez le malade, on retrouve deux fragments surnuméraires à l’état hétérozygote : F1 M-602
bp et F2 M-350 bp.
Figure B16 : Etude par RT-PCR du malade (M) et d’un sujet témoin (C)
Le fragment F1 M-602 bp a été identifié chez le père à l’état hétérozygote
Le fragment F2 M-350 bp a été identifié chez la mère à l’état hétérozygote
Pour mieux comprendre ces anomalies, on détermine la séquence des fragments
surnuméraires chez le sujet malade c’est à dire, F1.M-602 bp purifié et F2.M-350 bp purifié.
Les résultats sont portés sur la figure B17. La séquence du fragment F1.M-602 bp montre la
présence de l’exon 13 et un fragment compris dans l’intron 13 (figure B17A1). La séquence
du fragment F2.M-350 bp montre la présence des exons 15 et 17 (figure B17B1).
Figure B17 : A1 et B1 sont les séquences obtenues chez le sujet malade
A2 et B2 sont les séquences obtenues chez le sujet témoin
A : A1 partie de séquence du fragment de 602 bp recouvrant les exons 13 à 15
A2 partie de séquence du fragment de 489 bp recouvrant les exons 13 à 15
B : B1 partie de séquence du fragment de 350 bp recouvrant les exons 15 à 17
B2 partie de séquence du fragment de 503 bp recouvrant les exons 15 à 17
Question 59 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A ce stade, les anomalies observées comparées au sujet témoin, permettent d’affirmer
chez le malade la présence :
a. D’une anomalie d’épissage possible avec rétention d’un fragment de l’intron 13
pour F1 M-602 bp
VRAI : l’anomalie d’épissage entraine l’utilisation préférentielle d’un autre site donneur
situé dans l’intron 13 (démasqué, activé ou autre..), expliquant la rétention d’un fragment
de celui-ci
b. D’une duplication de l’intron 13 dans le gène CPT1A pour F1 M-602 bp
FAUX : il s’agit d’un bout de l’intron 13 qui est retenu, et la duplication n’explique pas la
rétention possible de l’intron (pas de création ou activation de sites cryptiques)
c. D’une anomalie d’épissage possible avec saut de l’exon 16 pour le fragment F2 M-
350 bp
VRAI : l’anomalie d’épissage entraine l’utilisation préférentielle d’un autre site accepteur
(créé ou démasqué, on ne sait pas encore) que celui d’origine (avant l’exon 16), situé en
aval de l’exon 16, expliquant son saut.
d. D’une délétion du gène CPT1A qui emporte l’exon 16 et toute la partie 3’du gène
CPT1A
FAUX : le malade possède toujours l’exon 17, situé en 3’ de l’exon 16.
e. Aucune de ces propositions n’est exacte
FAUX
Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires au niveau génomique, les chercheurs
ont entrepris le séquençage de l’intégralité du gène CPT1A chez le malade et ont identifié
deux variations de séquence chez le malade, non retrouvées chez le sujet témoin. La première
est une délétion de TT dans une séquence répétée en T (figure B18), délétion située en 3’ dans
l’intron 13 à l’état hétérozygote. Cette délétion a également été retrouvée chez le père.
Aucune autre anomalie n’est retrouvée au voisinage immédiat de la région de 113 bp insérée
dans F1 M-602 bp.
La seconde est une variation de séquence G>A qui a été retrouvée chez le malade dans le site
accepteur d’épissage de l’intron 15 à l’état hétérozygote et qui est transmise par la mère.
Question 60 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A ce stade, les anomalies observées transmises par la mère correspondent :
a. A une mutation du site accepteur d’épissage de l’intron 15 qui induit un saut de
l’exon 16
VRAI : l’anomalie transmise est la variation de séquence au niveau du site accepteur en
amont de l’exon 16, comme il est muté, il n’est pas reconnu lors de l’épissage et le saut
inclut l’exon 16 jusqu’au prochain site accepteur (situé en amont de l’exon 17)
b. A une mutation qui crée un site cryptique accepteur d’épissage, préférentiellement
utilisé durant l’épissage
FAUX : la mutation affecte le site accepteur d’épissage, elle n’en crée donc pas.
L’épissage aura lieu au prochain site accepteur d’épissage (déjà présent à l’origine)
c. A une mutation synonyme qui affecte l’épissage
FAUX : il n’y a pas création de site cryptique mais abolition d’un site…
d. A une mutation qui active un site cryptique dans l’exon 17
FAUX : le site cryptique dans l’exon 17 est celui utilisé à l’origine pour faire un saut de
l’intron entre les exons 16 et 17. Il y a juste abolition (encore la même justification^^) de
site cryptique.
e. Aucune de ces propositions n’est exacte
FAUX : proposition a vraie
Devant l’incompréhension du cas paternel et après relecture de la séquence génomique
normale de l’intron 13 deux motifs particuliers de part et d’autre du fragment de 113 bp
attirent l’attention des chercheurs (figure B18).
Figure B18
Question 61 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?
A ce stade, les anomalies observées transmises par le père sont compatibles avec :
a. Une activation de sites cryptiques démasqués par la délétion du dinucléotide TT à
la fin de l’intron 13
VRAI : en fait, la délétion peut induire un changement de conformation et démasquer ainsi
un site cryptique qui devient alors accessible lors de l’épissage.
b. Une variation de séquence qui crée un site accepteur d’épissage AG cryptique en 5’ du
fragment de 113 bp
FAUX : n’oubliez pas que les chercheurs ont précisé qu’il n’y avait aucune autre anomalie
au voisinage du fragment de 113bp
c. Une variation de séquence qui crée un site donneur d’épissage GT cryptique en 3’ du
fragment de 113 bp
FAUX : même justification qu’à la proposition b
d. Deux variations de séquence de part et d’autre du fragment de 113 bp créant un exon
dans l’intron 13
FAUX : même justification qu’à la proposition b
e. Une absence d’épissage du fragment de 113 bp qui ne peut avoir lieu car les sites
donneurs et accepteurs d’épissage sont en position inverse
FAUX : la proposition n’a aucun sens, ce fragment est épissé à l’origine car il se situe dans
l’intron qui est épissé en entier normalement. Ces sites démasqués sont à l’origine de la
rétention du fragment, provoquée par la délétion.
