Pauline Blin - INRA · 7 CmaB, HP, pyoverdine sidechain (siderophores) 2209 8 glucoside transporteur, HP, fructokinase 2109 9 Copper -sensing response regulator (CusR), cation efflux

Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016

Pauline Blin

Directeur de thèse : Denis Faure Equipe « interaction plantes-bactéries »

I2BC - CNRS

Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016 2

© J.Cigna

© J.Cigna

► Introduction et contexte

►Problématique

►Résultats

• Diversité des populations

• Phytoprotection



► Originaire d’Amérique du Sud et cultivée depuis 8000 ans

► 4ème culture vivrière la plus importante à l’échelle mondiale après le maïs, le blé et le riz

► Cultivée dans 150 pays et les surfaces de cultures sont en constantes augmentation

► Plusieurs milliers de variétés dans le monde entier, dont 200 sont inscrites au Catalogue officiel des espèces

et variétés végétales (et donc autorisées à la culture en France)


3 filières interdépendantes :

► Consommation

► Transformation (industrie fécule)

► Plants ou semences

6% 16%

78%

Production 2010 de pommes de terre par filière

(Semence ; 350 000 tonnes/an,

Exportation : 150 000 t)


• Comité Nord Plants de Pomme de Terre

• Bretagne Plants

• Comité Centre et Sud

Organismes certificateurs :

Les missions du Comité Nord Plants de Pomme de Terre

► Contrôle et certification des plants

► Production et multiplication des plants

► Recherche et Développement : méthodes de détéction et de lutte contre les pathogènes et création

variétale


-Perte de 2% de la production totale des plants en France (environ 10 000 t/an)

~160 maladies

Bactéries

Virus Autres, non déterminées

Champignons Motifs de refus à la certification en France

(année 2013/2014)

Maladies de la jambe noire et

de la pourriture molle

3%

37%

60%

Autres maladies (bactéries,

champignons…)

Maladies à virus


Causée par: - Dickeya dianthicola - Dickeya solani - Pectobacterium atrosepticum - Pectobacterium carotovorum

Jambe noire

sur tige

Pourriture molle

sur tubercule

Flétrissement

sur feuille


► Bactéries pectinolytiques (production d’enzymes de dégradation de la paroi végétale)

► Plantes hôtes : 16 familles de dicotylédones et 10 de monocotylédones pour Dickeya

Distribution géographique des Dickeya et Pectobacterium. Toth et al., 2011

P. atrosepticum

P. carotovorum

D. dianthicola

D. solani


P. carotovorum

P. atrosepticum

P. wasabiae

Dickeya spp., Dickeya dianthicola

Pectobacterium spp.,

P. brasiliensis

Dickeya solani

2000

Pectobacterium spp., (endémique)

1970

Dickeya dianthicola (E. chrysanthemi)

Emergence de Dickeya solani Complexe

bactérien

Epidémiologie (données champs de pomme de terre)


Comprendre la structure génétique des pathogènes et l’associer à des traits fonctionnels Adapter les moyens de lutte à ces populations pathogènes

1

2



39,5

52,6

7,8

Parcelle 1 - <1% JN

41,8

57,2

0,9

Parcelle 3 – 7% JN

21,2

13,3 65,2


2,3

97,4


20,5

78,8

Parcelle 6 – 6,5% JN

► Détection par PCR et par séquençage de “métagénomes”

► Structure des populations très hétérogène

P. atrosepticum

P. carotovorum

P. wasabiae

D. dianthicola

D. solani


Mappings successifs entre toutes les D.

dianthicola

Récupération des séquences alignées

Mappings successifs sur d’autres espèces

Récupération des séquences non

alignées

BLAST sur toutes les souches

Validation des clusters si présents

dans toutes les souches de

D.dianthicola uniquement

gènes length (bp)

1 organic hydroperoxide resistance, transcriptionnal regulator, muconolactone isomerase, HP 3755

2 rhamnulokinase, L-rhamnose operon regulatory, alcohol dehydrogenase 2857

3 Quinone oxidoreductase, RND efflux membrane fusion protein, Cobalt zinc cadmium efflux RND 3666

4 RND efflux transporteur 2104

5 metal dependant phosphohydrolase, putative membrane protein, pyruvate kinase 4288

6 fructokinase, sucrose-6-phosphate hydrolase 2211

7 CmaB, HP, pyoverdine sidechain (siderophores) 2209

8 glucoside transporteur, HP, fructokinase 2109

9 Copper -sensing response regulator (CusR), cation efflux system protein CusC precursor 2004

► Traits spécifiques de l’espèce D. dianthicola (11 génomes séquencés)

► 7 régions spécifiques : essentiellement des gènes de métabolisme, de transport et de réponse au

stress


Mappings successifs entre toutes les D.

solani

Récupération des séquences alignées

Mappings successifs sur d’autres espèces

Récupération des séquences non

alignées

BLAST sur toutes les souches

Validation des clusters si présents

dans toutes les souches de D.solani

uniquement

► Identification de 40 régions spécifiques, dont 9 codants pour des protéines hypothétiques et 2 étant

localisées dans des régions non codantes

► Traits spécifiques de l’espèce D. solani (20 génomes séquençés)


a

b

c,d d

Test de Kruskal Wallis et de Tukey 3 classes d’agressivité croissantes

20 souches de D. solani 11 souches de D. dianthicola

d

Test de Kruskal Wallis et de Tukey 1 classe d’agressivité, pas de différence

significative entre les souches

d’hôtes, de pays et d’années d’isolement différents

a

b


EU 3296

fliN

fliC rpoS

Flagelline

Régulateur de réponse aux stress

Conseil Scientifique SIPRE 20-21 Janvier 2015

Mobilité ?

• Mobilité affectée chez la souche EU 3296

swimming swarming

EU3296

3337


►Complexification des populations (émergence de Dickeya)

►Structure des populations très hétérogènes au sein des parcelles

Observation de la structure et de la dynamique à l’année n+1

Etablir un lien entre la structure des population et les pratiques culturales

Réaliser une veille épidémiologique (nouveaux pathogènes ?)

►Identification de traits spécifiques d’espèce (7 pour dianthicola et 40 pour solani)

Caractériser ces traits spécifiques – traits d’émergence ? (création de mutants ou génétique additive)

►Agressivité variable au sein des espèce - Perte de la mobilité associée à une très faible agressivité de la

souche D. solani EU3296

Tests d’agressivité sur plante entière – corrélation ?



Symptômes

Jambe noire

Pourriture molle

Enzymes

De macération Infection Croissance

Pectobacterium et

Dickeya

107-108 cell/g

Quorum

Sensing

N-acyl homoserine lactones (AHL)

O

O

N H R2

O R1

2. Anti-quorum sensing = Quorum quenching

1. Antibiose Y. RAOUL DES ESSARTS

Quorum Sensing : - Signaux moléculaires (AHL)

- Concentration d’ AHL - valeur seuil


Symptômes

Jambe noire

Pourriture molle

Enzymes de

macération Infection croissanc

e

Pectobacterium et

Dickeya

107-108 cell/g

Quorum

Sensing

O

O N H R2

O R1

AHL

Y. RAOUL DES ESSARTS

Antagonistes

bactérien

(Pseudomonas)


► Criblage et identification de 6 agents de biocontrôle contre Dickeya et Pectobacterium

► Souches isolées depuis l’environnement de la pomme de terre (rhizosphère, peau du tubercule…)

Identification de la souche Pathogène inhibé

Pseudomonas fluorescens

PA3G8

Pectobacterium et Dickeya

Pseudomonas fluorescens

PA4C2


Pseudomonas putida

PA14H7


Pseudomonas brassicacearum

PP1-210F

Pectobacterium

Pseudomonas brassicacearum

PA1G7

Pectobacterium

Bacillus simplex BA2H3 Pectobacterium


0 3 2 Semaines

Trempage des

tubercules

puis plantation

Antagonistes (seuls ou

en mélange)

Arrosage du

substrat par

suspension

d’antagonistes

(seuls ou en mélange)

Infection

par arrosage

du substrat

avec Ddi

Observation des

symptômes 2 fois

par semaine

4 jours

Arrosage du

substrat par

suspension

d’antagonistes

(seuls ou en mélange)

► 3 apports d’antagonistes durant l’expérience

► Un seul apport en pathogène


0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Dd04.9

Dd04.9 + PA3G8

Dd04.9 + PA14H7

Dd04.9 + PA4C2

Dd04.9 + combinaison

jours

% d

e sy

mp

tôm

es

► Dans l’ensemble, les plantes ayant reçu la combinaison des 3 antagonistes présentent moins de symptômes

que les plantes non traitées ou que les plantes traitées à l’aide d’un seul antagoniste

► Effet cumulatif de l’efficacité des agents


Symptômes

Jambe noire

Pourriture molle

Enzymes de

macération Croissance

Pectobacterium et

Dickeya

107-108 cell/g

Quorum

Sensing

Traitement:

Rhodococcus erythropolis

R 138

O

O N H R2

O R1

AHL

= Enzyme de dégradation des NAHL (QsdA)

R138

Quorum

Quenching


Uroz et al., (2005) Microbiology

QS-signal

Uroz et al., (2008) AEM

Pa6276 + R138

Tissus sains Pa6276 seul

Tissus macérés

Après 96h

Lactonase

Ouverture du

noyau lactone

Oxydo-reductase

Reduction de C=0

en C3 en C-OH

Acylase/amidohydrolase

Clivage de la liaison N-C

► Isolé depuis la rhizosphère de pomme de terre

► Capable d’inactiver le signal quorum sensing

► R138 est capable de limiter les symptômes dus à Pectobacterium


Campagne 1 Campagne 2

► Diminution des symptômes avec R138 qui est

renforcée lorsque R138 est biostimulé

► Aucune diminution de symptôme, même avec

traitement R138

► Effets contrastés selon les années – Problématique multifactorielle (environnement complexe)


►Les agents Pseudomonas et R138 montrent des effets significatifs de phytoprotection, mais doivent encore

être optimisés – effets contrastés selon les années

Mise en place d’essais en champs combinant la stratégie d’antibiose et la stratégie quorum quenching

(Pseudomonas +R138)

Mise en place d’essais en serre afin d’évaluer l’effet phytoprotecteur de R138 en s’affranchissant des

contraintes environnementales (atmosphère contrôlée) - Mise en place d’une formulation pour R138


INTÉRACTIONS PLANTES-BACTÉRIES

Denis FAURE

Peter MERGAERT

Yves DESSAUX

Benoît ALUNNI

Eva KONDOROSI

Catherine GRANDCLEMENT

Aurélie RAFFOUX

Jérémy CIGNA

Tania TIMTCHENKO

Julien LANG

Fabienne PIERRE

Yannick RAOUL DES ESSARTS

Pauline BLIN

Slimane KHAYI

Florian LAMOUCHE

Quentin BARRIERE

COLLABORATEURS

Frédérique VAN GIJSEGEM

Jacques Pédron

Teik-Min CHONG

Kok-Gan CHANG

Valérie HELIAS

Mohieddine MOUMNI

Amélie BEURY

Euphrasie MUNIER

Documents

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