Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine

Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe

d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé

Pierre AbadieUMR 1202 BIOGECOEquipe de Génétique

INRA Bordeaux – AquitaineSite de Recherche de Pierroton

33612 CESTAS

Présentation des travaux de thèse Vendredi 10 Avril 2009LRBB

Co-directeurs:Pauline Garnier-GéréAntoine Kremer

Septembre 2007 – Août 2010

Plan de l’exposéI. Présentation du sujet – Problématique

Spéciation sympatrique et flux de gènesLe complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé

Des divergences phénotypiquesUne faible divergence moléculaire

II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

Objectif et principeLe dispositif

Réalisation des croisementsMesures cytologiques

RésultatsPerspectives

III. A la recherche des gènes de spéciation

ObjectifChoix des GC

RésultatsLe cas du locus S

Perspectives

Plan de l’exposé

I. Présentation du sujet – Problématique

Spéciation sympatrique et flux de gènesConcept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur

Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants

Mise en place de barrières reproductives

Importance de la géographie dans les processus de spéciation:

Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique


(en rouge: barrières reproductives)

Spéciation sympatrique et flux de gènesConcept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur

Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants

Mise en place de barrières reproductives

Importance de la géographie dans les processus de spéciation:

Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique


(en rouge: barrières reproductives)

Interaction entre flux de gènes et divergence

Spéciation sympatrique et flux de gènes

Différents types de barrières à l’hybridation:


From Lepais 2008 (PhD)

Spéciation sympatrique et flux de gènesComment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique?

Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu :


spéc

iatio

n

Espèce 1

Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées

Alternant avec zones « perméables » aux flux de

gènes

Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence

totale des génomes

Spéciation sympatrique et flux de gènesComment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique?

Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu :


spéc

iatio

n

Espèce 1

Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées

Alternant avec zones « perméables » aux flux de

gènes

Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence

totale des génomes

Vision génique de la spéciation:Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des

espècesCes gènes contrôlent les barrières reproductives



Vision génique de la spéciation:Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des

espècesCes gènes contrôlent les barrières reproductives

Quelques résultats en accord avec ce modèle:

Nosil & al., 2009Savolainen & al., 2009



- Etude de l’interaction entre les flux de gènes et la sélection divergente

- Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ?

Modèle d’étude: le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé

Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé


Chêne sessile (Quercus petraea) et chêne pédonculé (Quercus robur)

Aire de répartition sympatrique:

Potentiel « hotspot » d’hybridation

Atlas Florae Europaeae 1999

Hybridation asymétrique: sessile (pollen) pédonculéBacilieri & al., 1996: Analyses de parentéKleinschmit & al., 2000: Croisements contrôlésExpérience de Guy Roussel à l’INRA

A la base d’un modèle de migration:

Un modèle de migration d’espèces

: Q. robur = espèce pionnière: Q. petreae = espèce en introgression

of sessile

From Lepais 2008 (PhD)Petit & al 2004

Des divergences interspécifiques

Divergences morphologiques

Divergences écologiques

Types de solsSessilePédonculé

Wet

Dry

pH

Kremer et al. 2002

From Lepais (PhD)


Rameau & al. 1994

Une différenciation moléculaire très faible…

•Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs)

•Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3%

•Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique »


Une différenciation moléculaire très faible…

Toutefois, forte différenciation pour quelques marqueurs

Scotti-Saintagne et al., 2004

Ces marqueurs ont été cartographiés

•Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs)

•Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3%

•Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique »


…mais des « hotspots » de différenciation

Scotti-Saintagne et al., 2004

Cartographie des marqueurs:

Existence de régions génomiques (~15cM) plus différenciées entre les deux espèces

En accord avec la vision génique de la spéciation proposant un modèle de génome en mosaïque structuré en régions différenciées et perméables aux flux de gènes, dans le cadre d’un processus de spéciation sympatrique


…mais des « hotspots » de différenciation


Limites des données actuelles:

• Etudes anciennes avec marqueurs peu informatifs

• Peu de données sur les fonctions des gènes dans les clusters différenciés

• Au final, peu de données biologiques précises sur la compatibilité de l’hybridation

• A quel niveau se situe ce complexe d’espèces dans le modèle de Wu ?

Stratégie de recherche

Objectif général:Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente

Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique


Stratégie de recherche


Objectif général:Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente

Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique

2 approches parallèles:

- Croisements contrôlés inter-spécifiquesEtude de la compatibilité d’hybridation entre différents génotypes

- Recherche des gènes de « spéciation » impliqués dans la divergenceApproche gènes candidats

Etude de la diversité moléculaire et de la différenciation


Objectif et principe des croisements


Objectif : Etudier la compatibilité d’hybridation entre les deux espèces

Principe : Caractérisation de croisements hybrides en fonction de différents génotypes

Croisements dans le sens le plus favorable: sessile vers pédonculé

Le dispositif


Parcelle expérimentale de l’INRA à Bourran (Lot-et-Garonne)

2196 individus pédonculés âgés de 7 à 10 ans

Arbres « plein-frères »: Descendants F1 du croisement intra-pédonculé 3P x A4

352 génotypes, présents de 7 à 10 copies (clones)

Nombreuses données disponibles sur ces arbres (taille, croissance, débourrement, etc)

Les arbres du croisement


♀

30 arbres mères pédonculés

10 génotypes représentatifs de la variabilité du pédigrée

3 clones par génotypes

♂

Mélange pollinique sessile

4 individus sessiles en proportion 25% de grains

viables(Qs27, Qs30, Qs31, Qs32)

Les arbres du croisement


Localisation des arbres sur la parcelle

Les étapes des croisements


Protocole mis au point à l’INRA par Guy Roussel



L’empochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant



L’empochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant



Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique



Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique



Dépochage, mesures, prélèvements De Mai à Septembre

Mesures cytologiques


Objectif : Observation des tubes polliniques en croissance dans les styles

Protocole fourni par Adrienne RessayreBasé sur une coloration au bleu d’aniline (callose)Microscopie à fluorescence (UV)

Prélèvements et conservation dans le FAA

Croisements contrôlés : Variables mesurées


Identification

Morphologie

Phénologie

Succès des croisements

Cytologie

Croisements contrôlés : Analyses de variance


4 modèles d’analyse de variance utilisés:

•« Effet génotype seul »

Yij = µ + Gi + Eij Valeur moyenne effet génotype erreur

•« Effet génotype + bloc »

Yij = µ + Gi + Bj + Eijk Valeur moyenne effet génotype effet bloc erreur

•« Analyse de covariance »

Yik = µ + Gi + β COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur

•« Analyse de covariance hiérarchisée »

Yik = µ + Gi + βi COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur

: Effet génotype: Effet environnement



Effet génotype significatif



Nécessité de déclarer des covariables représentant les hétérogénéités de l’environnement pour mettre en évidence

les effets génotypes Augmentation de la puissance des tests



Contribution des effets sur la somme des carrés d’écarts totaux sur la moyenne finale

Croisements contrôlés : Résultats

Comparaison avec les témoins naturels


• Plus d’inflorescences pour les arbres empochés Influence de la poche qui favoriserait la floraison?

• Plus de grains de pollen sur les fleurs pour les témoins naturelsPlus longue exposition au pollen chez les témoins?

Comparaison avec les témoins naturels


•Pour la même date de prélèvement, les tubes polliniques sont plus développés chez les témoins naturels

•Ralentissement de la croissance des tubes

Existence de barrière pré-zygotique ?

Corrélations entre variables


•Relations positives, artificiellement créées ?

•Manque de points intermédiaires

•A confirmer en 2009 Augmentation des mesures

•Pas de conclusions possibles à ce stade

(116)

(116)

(140)

Et côté paternel ?


•Génotypage des glands obtenus pour déterminer le père de chaque gland

•336 glands génotypés avec 12 microsatellites

•Pas de résultats à présenter aujourd’hui (il manque un parent)

•Type de résultats attendus:

•Objectif : Données sur de possibles différences de compatibilité selon le génotype de chêne sessile

Croisements contrôlés : Conclusions


•Différences significatives entre les génotypes d’arbres mères pour les variables mesurées

Différences entre les génotypes pour la compatibilité d’hybridation

•Moins bonne croissance des tubes polliniques lors des croisements hybrides

Détection de barrières pré-zygotiques

•A confirmer: corrélations entre variables cytologiques et « macrovariables »

Détection de barrières pré-zygotiques ?

Croisements contrôlés : en 2009


•Génotypage des glands•Suivi des glands Données sur barrières post-zygotiques?

•Les croisements et les mesures cytologiques réalisés en 2008 ont bien fonctionné et nous ont apporté des infos

Nouveaux croisements 2009 à plus grande échelle:

Augmentation du nombre de croisements hybrides

19 génotypes * 3 clones2 génotypes « ponts »

Croisements intra-pédonculés Témoins empochés

10 génotypes * 1 clone

Croisements intra-pédonculésSuivi de témoins naturels

19 génotypes * 3 clones

Pollen sessile Pollen pédonculé Pollen naturel

Croisements contrôlés : en 2009


Suivi de 124 arbres, dont 66 empochés la semaine dernière :

Merci à Guy, Benjamin, et à l’Unité Expérimentale de Bourran

Plan de l’exposé

II. A la recherche des gènes de spéciation

Analyse de séquences nucléotidiques de gènes candidats

A la recherche des gènes de spéciation

Objectif :

Détection de gènes candidats potentiellement impliqués dans la divergence entre les deux espèces

Principe :

•Analyse de séquences nucléotidiques : diversité et différenciation inter-spécifique

•Focalisation sur les gènes potentiellement impliqués dans les barrières à l’hybridation

•Détection de gènes « outliers » par rapport à une référence expérimentale « neutre » basée sur l’étude d’un grand nombre de fragments (projet de reséquençage)


Choix des gènes candidats


MECHANISME GENERAL FONCTION STRATEGIE

NOMBRE D’EST

SELECTIONNE

OK / TESTED

Interspecific incompatibility

-pollen/pistil interaction-pollen germination-pollen tube growth-pollen tube guidance

-Keywords search in Arabidopsis, Populus and Prunus databases

-Blast against own oak EST database

38 3 / 5

Flowering -phase transition-flowering 9 0 / 0

Strong Gst-pollen cytosqueletton-pollen glycoproteins-pollen-specific proteins

-Oak genome scanning for strong Gst ESTs-Selection by function annotation

11 2 / 5

Auto-incompatibility -S locus proteins

-Direct design of degenerated primers according to Prunus sequences alignements

2 0 / 2

Fragments séquencés


•Gene Pop2: •Précurseur d’une sous-unité de la gamma-aminobutyrate transaminase•Contrôle du guidage du tube pollinique•Longueur du gène chez At = 5,3kb, 13 introns•1 fragment obtenu sur 13 testés

•Gene Tub8: •Sous unité alpha de la tubuline 8•Longueur du gène chez At = 1,8kb•2 fragments obtenus sur 4 testés

•Gene H8: •Récepteur glycoprotéique•Screené avec un fort Gst dans la banque•2 fragments obtenus sur 2 testés

Fragments séquencés


•Gene Feronia: •Récepteur à activité kinase exprimé dans les synergides•Contrôle de l’interaction pollen-pistil chez At•3 paralogues détectés chez le chêne, 1 séquencé•1 fragment obtenu sur 4 testés

•Gene ROS: •Récepteur exprimé dans le pollen•Screené avec fort Gst dans la banque•1 fragment obtenu sur 1 testé

Résultats: Diversité & Différenciation




Calcul des statistiquesFst / Nst par une AMOVA sur des matrices de distance entre les haplotypes

D de TajimaFs de Fu

Reconstitution des phases avec ArlequinAlgorithme ELB (Excoffier & al., 2003)

POP2 : p>0,8 pour 10 individus sur 19 TUB8 : p>0,8 pour 9 individus sur 22 H8 : p>0,8 pour 8 individus sur 16Feronia : p>0,8 pour 9 individus sur 14

ROS : p>0,8 pour 11 individus sur 14





Nst (2)

13,5%

10,1%

14%

-0.04%

12%

Nst (2): Autre méthode dans Arlequin pour estimer le Nst« Locus by locus Amova »

Se base sur le calcul du Fst à chaque SNPAvantage: ne dépend pas de la phase, et moins dépendant des données manquantes



*** ******

Ecarts entre Fst et Nst



*** ******

Forte différenciation des locus POP2 et H8



*** ******

Forte diversité des locus POP2 et ROS



*** ******

D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia

Interprétation des tests


D de Tajima < 0 pour Tub8 et FeroniaFs de Fu < 0 pour les 5 gènes

Θs : estimateur de diversité basé sur le nombre de sites polymorphesΘπ : estimateur de diversité basé sur le nombre moyen de différences entre séquences

•Sous hypothèse de neutralité sélective et d’équilibre démographique, tous les estimateurs de diversité sont égaux à 4 Ne µ•Ici, un D < 0 correspond à un excès de mutations rares (θs y est + sensible que θπ)

•S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique

(ERREUR DANS LE RAPPORT)

avec K = nbre d’haplotypes attendukobs = haplotypes observés

•Si kobs > K = excès d’allèles en faible fréquence S’ est faible Fs < 0

•S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique

Analyse le long des fragments


A faire : estimer les taux de recombinaisons et les DL


Gène Tub8

Gène entier 1,8kb

Intron de 100pbconnu comme

très différencié(Porth & al,

soumis)


Intron de 100pbconnu comme

très différencié(Ilga Porth,

comm. perso.)

Gène entier 1,8kb

Baisse de la diversité et de la différenciation de 5’ vers 3’

Gène Tub8

• zone en 5’ différenciée

• zone fonctionnelle soumise à sélection purificatrice?



•L’étude de ces gènes candidats révèle des patterns de diversité et de différenciation intéressants:•Diversité importante pour les gènes POP2 et ROS•Forte différenciation des gènes POP2, H8 et TUB8 (10 à 16%)•D de Tajima < 0 pour TUB8 et FERONIA

• Ce sont des gènes homologues de gènes impliqués dans les barrières aux croisements

Bons candidats de gènes de « spéciation »

Est-ce que ce sont des « outliers » ?

Recherche d’« outliers »•40000 simulations réalisées avec le logiciel FDIST2 (M. Beaumont)•Détermination des quantiles 5% et 95% correspondant aux enveloppes inférieures et supérieures de la distribution des points

Quantile 95%Median

Quantile 5%Hétérozygotie

Paramètres des simulations:

•2 populations•2 dèmes•Fst = 3%•40000 simulations

Fst


Recherche d’« outliers »Fst

Fst des 5 gènes

H des 5 gènes

Pas de gène outlier détecté avec ces simulations

Recherche de SNP outliers Réalisation des simulations avec d’autres logiciels (SIMCOAL) (méthodes ABC)

Recherche d’outliers avec le Nst et non le Fst

Hétérozygotie


Le locus S d’auto-incompatibilité


• Système gamétophytique à deux composantes (♀ S-RNase et ♂ SFB)

• Individus 100% hétérozygotes

• Association d’allèles des 2 gènes S-RNase et SFB

• Qu’est-ce qui se passe au niveau inter-espèces pour la différenciation génétique ?

• Mécanisme favorisant les croisements entre individus différents

Favorise l’hybridation ?

• Acquisition de données en 2009, nécessiter de passer par des étapes de clonage

Perspectives


•Obtention de données sur un plus grand nombre de gènes candidats

•Résultats du projet de reséquençage allélique (2009) Obtention de statistiques sur 300 ESTs aléatoires A utiliser comme référence neutre pour la recherche d’outliers

•Augmentation du nombre d’individus séquencés pour les gènes qui seront les plus intéressants

Perspectives

•Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ?Fst et Nst = indices de fixationCreuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs /

partagés) ?

Aparté sur les types de polymorphismesGène Haplotypes

exclusifsHaplotypes partagés

Pop2 32 1Tub8 37 1H8 16 3

Feronia 23 0ROS 25 0

(basés sur les reconstitutions de phase d’Arlequin)

Calcul d’autres paramètres pour estimer la différenciation ?

Dst = absolute differentiation (Nei 1973) Gst = relative differentiation (Nei 1973) Hst = between-subpopulation heterozygosity (Aczel & Daroczy 1975; Tsallis & Brigatti 2004) Δst = between-subpopulation component of diversity, or the effective number of distinct subpopulations (Jost 2008) D = actual differentiation (Jost 2008) This is NOT the same thing as Dest. Hs/Ht = proportion intra-population heterozygosity vs total heterozygosity (Jost 2008) Δs/Δt = proportion of total diversity that is contained in the average subpopulation (Jost 2008)

Jost 2008

Perspectives

•Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ?Fst et Nst = indices de fixationCreuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs /

partagés) ?

•Développer une recherche d’outliers basée sur le Nst ou autre ?Test de type Beaumont & NicholsRéalisation d’une routine permettant de simuler des enveloppes

neutres et de placer des gènes / SNPs par rapport à ces enveloppes, à partir d’entrées fasta par exemple. Utilisation de R ou de SIMCOAL

•Tester le sens des flux de gènes dans ce complexe d’espèces ?Méthode développée par M. Navascues (ENS Ulm), basée sur les types

de polymorphismes

•Où se situe ce complexe d’espèces dans le processus de spéciation ?Un équilibre entre flux de gènes et sélection divergente est-il

possible ?Modélisation des données dans un modèle de spéciation sympatriqueGavrilets & al., 2007

Merci de votre attention

Documents

Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine