Place de la bactériologie dans l’évaluation du statut sanitaire

Animaleries rongeurs

Christine Médaille, Dr vétérinaire,diplômée du collège européen

de biologie cliniqueLaboratoire Vébiotel

Plan

• Mise en perspective

• Définitions et terminologie

• Qui chercher, comment et où ?

• Limites et robustesse des méthodes

Mise en perspective : pourquoi la pourquoi la recherche de bactéries ?recherche de bactéries ?

Médecine vétérinaire individuelleMédecine vétérinaire individuelle : mise en évidence d’un agent infectieux, évaluation de sa pathogénicité, détermination des anti-infectieux utilisables, contrôle de son éradication.

Médecine de groupe : Médecine de groupe : dépistage d’un agent infectieux latent dépistage d’un agent infectieux latent ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la maladie ou d’un contrôle de son extension dans le groupemaladie ou d’un contrôle de son extension dans le groupe

Cas particulier d’une animalerie de recherche : Cas particulier d’une animalerie de recherche : notion notion d’interférence avec les résultats d’un essai de façon directe d’interférence avec les résultats d’un essai de façon directe ou indirecte.(Baker: Naturel ou indirecte.(Baker: Naturel pathogenspathogens of of laboratorylaboratory animalsanimals))

Interférence avec la recherche

même en l’absence de signes cliniques ou pathologiquesinfluence directe ou indirecte

1.1. impact sur les études en immunologie, impact sur les études en immunologie, reproduction,oncologiereproduction,oncologie

2.2. inhiber l’induction du modèle animalinhiber l’induction du modèle animal2.2. inhiber l’induction du modèle animalinhiber l’induction du modèle animal3.3. entraîner des difficultés d’interprétation des résultats entraîner des difficultés d’interprétation des résultats

finauxfinaux4.4. générer des modifications dosesgénérer des modifications doses--dépendantesdépendantes5.5. induire des variations dans un groupeinduire des variations dans un groupe

Et ce malgré la présence d’un groupe témoin ou contrôle

Buts de l’examen bactériologique en animalerie de recherche Buts de l’examen bactériologique en animalerie de recherche

Prévenir l’impact de la présence d’un agent infectieux Prévenir l’impact de la présence d’un agent infectieux (bactérie ou virus ou parasite)(bactérie ou virus ou parasite)

Etablir un diagnostic sur un maladeEtablir un diagnostic sur un malade

Mais le statut microbiologique de la colonie est plus Mais le statut microbiologique de la colonie est plus important que le statut d’un animal particulier:sentinelleimportant que le statut d’un animal particulier:sentinelle

Etablir un diagnostic sur un maladeEtablir un diagnostic sur un malade

Définitions et terminologie

Infection versus maladieInfection versus maladie

•• Présence d’un microorganisme dans un animal Présence d’un microorganisme dans un animal •• Présence d’un microorganisme dans un animal Présence d’un microorganisme dans un animal ou une colonieou une colonie

•• Apparition de signes cliniques liés à la présence Apparition de signes cliniques liés à la présence de cet agent microbiende cet agent microbien

•• Commensal : présent sans impact négatif sur l’hôteCommensal : présent sans impact négatif sur l’hôte

•• Saprophyte : incapable de déclencher une maladieSaprophyte : incapable de déclencher une maladie

•• Symbiote : impact positif sur l’hôteSymbiote : impact positif sur l’hôte

Différentes pathogénicités

•• Symbiote : impact positif sur l’hôteSymbiote : impact positif sur l’hôte

•• Opportuniste : pathogène facultatif/ besoin d’un Opportuniste : pathogène facultatif/ besoin d’un

déclencheurdéclencheur

•• Pat. obligatoire : responsable d’une maladie si présentPat. obligatoire : responsable d’une maladie si présent

FloreFlore

1.1. Il existe une flore naturelle des muqueuses et de la Il existe une flore naturelle des muqueuses et de la

peau chez les mammifères : elle est constituée de peau chez les mammifères : elle est constituée de

bactéries commensales et de bactéries éventuellement bactéries commensales et de bactéries éventuellement

opportunistes : opportunistes : définir «définir « vos opportunistesvos opportunistes »?»?

2.2. Ces bactéries sont responsables d’une «Ces bactéries sont responsables d’une « infection infection 2.2. Ces bactéries sont responsables d’une «Ces bactéries sont responsables d’une « infection infection

maladiemaladie » en cas de rupture des défenses naturelles de » en cas de rupture des défenses naturelles de

l’hôte : l’hôte : définir «définir « vos animaux fragilesvos animaux fragiles »?»?

3.3. Des infections infraDes infections infra--cliniques chez les rongeurs cliniques chez les rongeurs

sauvages mais doivent être absentes en recherche : sauvages mais doivent être absentes en recherche :

continuer à rechercher des continuer à rechercher des «« pathogènespathogènes vrais»vrais»

Une bactérie peut être solitaire Une bactérie peut être solitaire

L’impact de la présence d’une bactérie sur l’expérimentation L’impact de la présence d’une bactérie sur l’expérimentation est difficile à connaître ou à évaluer :est difficile à connaître ou à évaluer :

«« méchancetéméchanceté » d’une bactérie» d’une bactérie

•• Facteurs intrinsèques = pathogénicitéFacteurs intrinsèques = pathogénicité

•• Facteurs environnementauxFacteurs environnementaux

•• Facteurs individuelsFacteurs individuels

•• Facteurs inhérents à l’expérienceFacteurs inhérents à l’expérience

F. intrinsèque : la pathogénicité

•Notion de pression bactérienne : Bordetella bronchiseptica (x10 3)

•Virulence différente des souches de Clostridium piliforme

•Co-infection : M. pulmonis et CAR bacillus , P.pneumotropica

Facteurs environnementaux

VentilationVentilation

NH3NH3ratsrats

infections respiratoires à infections respiratoires à Mycoplasma pulmonisMycoplasma pulmonis

Déficit en vit A ou EDéficit en vit A ou E ratsrats Mycoplasma pulmonisMycoplasma pulmonis

Acidification eau de Acidification eau de boissonboisson

toustousdiminue prévalence de diminue prévalence de

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Ventilation insuffisanteVentilation insuffisanteAnx immunoAnx immuno--

déprimésdéprimés

Maladies respiratoires à Maladies respiratoires à Staphylococcus xylosus ou Staphylococcus xylosus ou Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Déficit vitamine CDéficit vitamine C cobayescobayesInfections cliniques à Infections cliniques à

Streptococcus et Klebsiella spStreptococcus et Klebsiella sp

Déficit en FerDéficit en Fer ratsrats Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae

Glucose et arachide :Glucose et arachide :

Effet protecteurEffet protecteursourissouris

Développement Développement

Maladie de TyzzerMaladie de Tyzzer

Caséine :Caséine :

Effet délétèreEffet délétèresourissouris

Développement Développement

Maladie de TyzzerMaladie de Tyzzer

Facteurs individuels et expérimentaux

1. Statut génétique : abcès des souris nude

(Staphylococcus aureus, Pasteurella, Citrobacter, Morganella, Streptococcus…

2. Age : sevrage des rats et Maladie de Tyzzer…

3. Sexe : cobaye femelle et Streptoccocus C ;3. Sexe : cobaye femelle et Streptoccocus C ;mâle non castré de souris et Citrobacter rodentium1. Expérience : infections post-chirurgicales

(Staphylococcus, Pseudomonas,E coli…)2. Immunodéficience expérimentale : passage d’un état

latent à un état clinique

Recommandations (Felasa,Hansen)

Echantillonnage

1. Population de référence : souris Nude, animal en sevrage

2. Calcul de la taille de l’échantillon : dépend de la prévalence de la maladie dans la colonieprévalence de la maladie dans la colonie

3. Fréquence : variable suivant les besoins

4. Unité de lieu : une cage, une salle, une unité ?

Transport et demande d’analyse

1. S’assurer de la possibilité de réception assez tôt

2. Maintenir les conditions de départ pendant le transport

3. Rester joignable à la réception et après

4. Joindre des informations utiles

Etapes du prélèvementEtapes du prélèvement

1. Conserver « la barrière » le plus longtemps possible

1. Avoir une procédure d’autopsie et de prélèvement, la 1. Avoir une procédure d’autopsie et de prélèvement, la remettre en question

2. Avoir un personnel qualifié en terme de stérilité

3. Avoir un personnel formé en terme de risques

Personnel compétent

Conserver la stérilité

Où prélever pour trouver quoi ?

Corynebacterium, Pasteurella, Pseudomonas, Staphylococcus,

Streptococcus

Bordetellla, Pasteurella, Pseudomonas, Streptobacillus,

Streptococcus, Klebsiella

Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium

Chez les malades : Bordetella, Corynebacterium,Klebsiella,Streptococcus, Pseudomonas

Où prélever pour trouver quoi ?

Où prélever pour trouver quoi ?

Bordetellla, Pasteurella, Pseudomonas, Streptobacillus,

Streptococcus, Mycoplasma

Corynebacterium kutscheri, Escherichia coli, Pasteurella,

Streptococcus

Campylobacter, Citrobacter, Escherichia coli, Klebsiella,

Salmonella, Yersinia, Helicobacter

Où prélever pour trouver quoi ?

Doit-on tout prélever ?

Foie, rate, reins,cœur,vessie

????

Œil, oreilles ???

Ensemencement

Identification préalable correcte Ensemencement et mise à l’étuve à 37°C

B.P.L

Prélever chez soi

• Affections cutanées• La désinfection de la surface cutanée sur le

site de prélèvement est déconseillée car elle tue les germes pathogènes autant que les contaminants.

• vésicules : aspiration du liquide vésiculaire• ulcérations : grattage du plancher• pustules : ouverture au scalpel stérile et • pustules : ouverture au scalpel stérile et

grattage des parois

• auriculaires : écouvillonnage profond après avoir enlevé le cérumen superficiel

• Pour les lésions cutanées profondes, il est possible de prélever une petite biopsie et de l’ensemencer en bouillon d’enrichissement.

Pus

aérobie et anaérobie

• Collections purulentes•• Lorsqu'on a affaire à un abcès circonscrit, il est

préférable après débridement chirurgical de prélever un morceau de la paroi de l'abcès ou d'écouvillonner les parois .

aérobie et anaérobie

• Les collections purulentes dans les grandes cavités sont aspirées à la seringue après préparation aseptique du site de ponction et transportées rapidement au laboratoire .On évitera d'introduire tout volume d'air dans la seringue pour pouvoir rechercher les germes aérobies et anaérobies

Poumons

aérobie et anaérobie

Affections pulmonaires• Seuls les lavages bronchoalvéolaires

sous fibroscopie ou par voie transtrachéale permettent le diagnostic bactériologique (ou mycologique) des infections pulmonaires.

• Les expectorations ou les écouvillonnages de gorge sont la plupart du temps ininterprétables en médecine des carnivores.

• Les biopsies pulmonaires, quand elles sont réalisables sont supérieures en qualité.

Urines

aérobie et anaérobie

• La qualité du diagnostic bactériologique des infections urinaires des carnivores domestiques est conditionnée plus que tout autre par la qualité du prélèvement. Les urines doivent être recueillies de façon stérile soit par cystocentèse, soit par soit par cystocentèse, soit par cathétérisme soigneux et conservées immédiatement à 4°C .

• Les urines prélevées par palpation-pression et élimination des premiers jets présentent l'inconvénient d'être potentiellement souillées par la flore urétrale ou vaginale.

Causes d’erreurs fréquentes

aérobie et anaérobie

1) le volume de l’échantillon est insuffisant :

• il faut préférer l'envoi de plusieurs millilitres d'un liquide pathologique à celui d'un écouvillon trempé dans le même liquide

2) le prélèvement est contaminé par des germes extérieurs :

3) un traitement antibiotique est déjà en place : il est recommandé de faire une "fenêtre" thérapeutique de 48 h avant d'effectuer le prélèvement

Conservation

aérobie et anaérobie

• La condition idéale est l'ensemencement immédiat de l'échantillon associé à la réalisation d’un frottis du site prélevé.

• Utilisation des écouvillons• L’écouvillon banal en bois et coton cardé sec

n’assure aux germes qu’une durée de vie inférieure à 30 minutes. Son utilisation pour les envois différés au laboratoire peut être responsable de cultures faussement négatives par assèchement

. Il est préférable d’utiliser des écouvillons en matériau neutre (dacron, polyester et alginate de calcium) associés à des milieux dits de transport (type Amies ou Stuart) dont la composition peut varier suivant le fournisseur ou l'agent infectieux recherché (aérobie, par assèchement infectieux recherché (aérobie, anaérobie, germe fragile) et transportés à température ambiante.Ces milieux permettent la survie des bactéries avec une croissance minimum indispensable pour la conservation des prélèvements polymicrobiens.

Transport

aérobie et anaérobie

• Envoi des prélèvements par la posteLe prélèvement ne doit pas dépasser un

volume de 50 ml, placé dans un récipient correctement clos d'où les liquides ne peuvent s'écouler,

ce container est placé à l'intérieur d'un autre emballage, l'espace entre les deux étant comblé par des matériaux absorbants et antichocs

Etapes de l’analyse bactériologiqueEtapes de l’analyse bactériologique

1. Déroulement temporel de l’analyse

2. La technique de mise en culture2. La technique de mise en culture

3. Les différentes croissances bactériennes

4. Les autres méthodes de dépistage

Déroulement de l’analyse

1. Mise en culture2. Repiquage 3. Deuxième lecture et

deuxième jourpremière lecturerepiquage

deuxième jourpremière lecturerepiquage

deuxième jour première lecturerepiquage

premier jour : ensemencement

3. Deuxième lecture et lecture des repiquages

4. Tests d’identification5. Lecture des

identifications6. Conservation éventuelle

quatrième jouridentifications

tests complémentaires

troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification

repiquage

quatrième jouridentifications

tests complémentaires

troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification

repiquage

quatrième jouridentifications

tests complémentaires

troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification

repiquage

Mise en culture et repiquage

•• Choix des milieuxChoix des milieux : sélectifs et non sélectifs•• EnrichissementEnrichissement préalable ?•• TempératureTempérature et atmosphère d’incubation

Enrichissement

•• Enrichissement non sélectifEnrichissement non sélectif : gélose enrichie

•• Enrichissement sélectifEnrichissement sélectif : spécimen multimicrobien

Identification bactérienne

• Ne pas sauter d’étapes : gram, oxydase, catalase, coagulase, biochimie…

Coloration de gram

Identification bactérienne

• Résultat d’une gamme : intervalle de confiance en % : Staphyloccocus aureus à 95 %

• Résultat d’un test rapide : ATTENTION !!!

Gammes de type API

Conservation et identification poussée

• Parfois pas de réponse univoque : existence d’un doute raisonnable

• Nécessité de faire appel à des techniques plus spécifiques

Trois catégories de bactéries

• Les bactéries à croissance facile aérobie

• Les bactéries • Les bactéries anaérobies

• Les bactéries ne cultivant pas en gélose classique

Classés suivant leur croissance

• staphylocoques• streptocoques• groupe des

Pasteurelles• groupe des

• Helicobacter• Campylobacter• Streptobacillus

moniliformis

• Clostridium piliforme• groupe des Entérobactéries

• groupe des Pseudomonas et apparentés

• Clostridium piliforme• Mycoplasmes• Leptospires• Lawsonia intracellularis• CAR bacillus• Chlamydiae

Autres méthodes de dépistage

• Sérologie bactérienne : recherche d’anticorps

• Techniques • Techniques moléculaires : PCR classique, PCR en temps réel, séquençage

Sérologie bactérienne

• En général ELISA sandwich

FAUX POSITIFSFAUX POSITIFS

Contamination externeContamination externe

Contamination interneContamination interne

Erreur d’identificationErreur d’identification

FAUX NEGATIFSFAUX NEGATIFS

Prélèvement inadéquatPrélèvement inadéquat

Quantité insuffisanteQuantité insuffisante

Mise en culture inadéquateMise en culture inadéquate

Limites des tests

Erreur d’identificationErreur d’identification

Faux positifs des techniques Faux positifs des techniques

sérologiques sérologiques

Manque de spécificité de la PCRManque de spécificité de la PCR

Contamination des PCRContamination des PCR

Mise en culture inadéquateMise en culture inadéquate

Identification inadéquateIdentification inadéquate

Temps de culture insuffisantTemps de culture insuffisant

Contamination par Contamination par ProteusProteus

Conséquences diverses

1. La bactériologie ne peut être réalisée dans l’urgence !

2. Le prélèvement pourquoi pas mais l’identification peut prendre du temps !

3. Faux négatifs et faux positifs : existent pour 3. Faux négatifs et faux positifs : existent pour toutes les méthodes !

4. Il faut savoir ce que l’on cherche, analyser ce que l’on trouve, se donner les moyens d’aller plus loin !

5. Dialogue, rigueur et bon sens !

Bibliographie : sites web : pubmed; bactériologie vétérinaire

• Pathology induced by opportunistic agentsin immunodeficient rodents: a case ofRalstonia pickettii -induced- ataxia in mice.

• Marion BERARD1, Christine MEDAILLE 2,• Marion BERARD1, Christine MEDAILLE 2,Meredith SIMON 3, Stéphanie SERRE 4,Kathleen Pritchett-Corning 4, VirginieDANGLES-MARIE 5, 6*

• 1 Institut Pasteur, Paris, France

CONCLUSION