Plasmid

Génétique bactérienne

Les plasmides bactériens

Stéphane CORVEC, Laboratoire de Bactériologie, UFR de Médecine - Nantes, 2009

1- Plasmides : généralités et fonctions

1.1- Généralités- définition : �Molécules d’ADN bicaténaire, circulaires en général

�Facultatifs (1 à 3% de l’ADN total)

�Extra-chromosomiques le plus souvent

�Capacité de réplication autonome (réplicons)

�Transmission stable au cours des générations

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�Transmission stable au cours des générations

�Codent pour des fonctions de meilleure adaptation de la bactérie hôte à l’environnement

�Maintien d’autant mieux qu’il procure

un avantage sélectif


1.2- Fonctions diversesnon indispensables mais utiles à l’adaptation de l’hôte à l’environnement :

�Fertilité, mobilisation d’autres éléments génétiques

�Résistance aux antibiotiques

�Chaînes dégradatives et métaboliques particulières supplémentaires

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supplémentaires

�Facteurs de virulence : toxines, adhésines


1.2- Fonctions diverses:

Plasmides conjugatifs : pili sexuel facteur F

Plasmides de Résistance: facteur R résistance aux antibiotiques et métaux lourds

Plasmides métaboliques: gènes permettant l’utilisation de

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certains nutriments (citrate, soufre, urée)

Plasmides de virulence : E. coli enterotoxinogène (tourista)

- plasmide : facteur de colonisation

- plasmide : toxine

2- Plasmides : structure et organisation

2.1- Structure (plasmides circulaires)

�Taille très variable de 1 à 400 kb ou plus

�Formé d’ADN double brin : 3 formes

�Forme I : circulaire covalente fermée

�Forme II : circulaire, relâchée, un des 2 brins est coupé

�Forme III : forme linéaire (deux brins coupés)

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�Forme III : forme linéaire (deux brins coupés)

Techniquesd’étude

Forme II : forme relachée

OC � Open Circle


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Forme I : Forme normale surenroulée

CCC� Covalent Close Circle


2.2- Organisation des plasmides�Flexible et variable suivant le plasmide

�Comporte une zone obligatoire de réplication � Réplicon

�Peut comporter aussi :

�Une région de transfert (opéron tra) chez les

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�Une région de transfert (opéron tra) chez les plasmides conjugatifs : pili et conjugaison

�Des éléments génétiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)

�Gènes divers (résistance aux antibiotiques, etc…)

Plasmides conjugatifs : même espèce ou différentes, conséquences et implication

Facteur FOperon tra

IS, Tn

Réplication


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Dissémination de

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Dissémination de l’information

génétique = gènes de résistance

3- Plasmides : méthodes d’étude

3.1- Méthodes génétiques :�La (les) fonction(s) est (sont) liées au plasmide

porteur:�Transferts plasmidiques�Cure plasmidique�Couplage des 2 méthodes

3.2- Méthodes physiques :

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3.2- Méthodes physiques :�Isolement et purification de plasmide�Ultracentrifugation à l’équilibre de densité

(CsCl + bromure d’ethidium) - colonne�Electrophorèse en gel (avec ou sans enzymes de

restriction)�Hybridation ADN-ADN (Southern blot)


3.1- Méthodes génétiques :�Transferts plasmidiques

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Hémolysine


3.1- Méthodes génétiques :�Cure plasmidique

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Elimination du plasmide par croissance dans des conditions inhibant spécifiquement sa réplicationPlasmide perdu et perte de fonctionEx. : résistance aux antibiotiques, marqueur de virulence

Pouvoir pathogène : Bacillus anthracis repose principalement sur la présence d'une capsule et sur la synthèse de toxines. Plasmides de Bacillus anthracis

–pXO1•174 kb portent les gènes codant

–Le facteur oedématiant (cya)I


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–Le facteur léthal (lef)III–L’antigène protecteur (pag)II

–pXO2•90 kb portant les gènes codant

–La synthèse de la capsule (capA, capB, capC)


3.2- Méthodes physiques :3.2.1- Isoler et visualiser le plasmide: extraction d’ADN

1- Rupture intégrité paroi bact.2- Dégradation des protéines et précipitation3- Récupération ADN et purification

=> Séparer le chromosome du plasmide

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Nombreuses techniques => lyse alcalineLyse : altération des enveloppes bactériennesAlcaline : dénaturation ADN

Forme surenroulée, circulaire, double brin : moins de rupture et renaturation possible

3.2.2- Techniques d’extraction

Ultracentrifugation à l’équilibre de densité : CsCl + bromure d’ethidium

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Techniques modernes :- lyse- colonnes : rapide

3.2.3- Electrophorèse conventionnelle

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Confection du gel (Agarose, Acrylamide)

Chargement des échantillons d’ADN

Migration dans un champ électrique constant

Coloration au BET (Bromure d’éthidium)

3.2.3- Electrophorèse après restriction

�Collection de fragments de nombre et tailles définis

�Fonction des GC% (site de l’enzyme et ADN)

�Grande spécificité � Grande reproductibilité (RFLP)

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Linéariser le plasmideComparaisondu contenu plasmidique

Typage moléculaire : profils de bande par restriction

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Profil plasmidique brutProfil plasmidique après restriction

4- Plasmides : réplication (1)

4.1- Généralités :

�Réplication de type θ uni ou bidirectionnelle (oriV)

�Réplication de type rolling circle � ouverture d’un brin, synthèse 5’-3’ et déplacement du brin coupé

�Le plasmide fait largement appel pour sa synthèse à l’équipement enzymatique de la bactérie hôte

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l’équipement enzymatique de la bactérie hôte

�Diversité des régulations du nombre de copies

4.2- Plasmides : réplication de type θθθθ

SC 2009 20Monodirectionnelle Bidirectionnelle

4.3- Réplication de type rolling circle

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4.3- Réplication de type rolling circle

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4.5- Plasmides : réplication

Les fonctions de la région oriV

�Spectre d’hôte : une ou plusieurs espèces

�Régulation du nombre de copies (1 à des centaines) : stringente ou rélâchée

�Répartition des copies entre les bactéries filles (par)

�Incompatibilité des plasmides

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�Incompatibilité des plasmides

5- Plasmides : classifications (1)

Selon la taille ou le phénotype

�Peu de valeur, car ne tient pas compte de la plasticité du plasmide

Selon la taille, conjugatif ou non, nombres de copies

�Petits plasmides, non conjugatifs, nombre élevé de copies, réplication relachée (peu contrôlée)

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copies, réplication relachée (peu contrôlée)

�Gros plasmides, conjugatifs, faible nombre de copies :réplication stricte

�Phénomène de mobilisation (un petit plasmide non conjugatif est mobilisé et transféré par un plasmide conjugatif)


5.1- Groupes d’Incompatibilité :�Certains plasmides ne cohabitent pas durablement dans

la même bactérie (F’gal et F’lac), culture en milieux non sélectifs (glucose) � Elimination de l’un des plasmides => compétition

�L’incompatibilité est un phénomène général

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�L’incompatibilité est un phénomène général

�Deux plasmides incompatibles ont un ancêtre commun et des systèmes de réplication ou de répartition semblables

�Leurs ADN sont fortement homologues (réplication)


5.2- Types piliaires :�Plasmides conjugatifs : pili sexuels récepteurs de

phages

�Pili identiques � Sensibilité aux mêmes phages

�Moins discriminants que les groupes d’incompatibilité : groupe piliaire F comprend différents groupes

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groupe piliaire F comprend différents groupes

6- Plasmides : quelque plasmides célèbres

Facteur F�Prototype du gros plasmide conjugatif à petit nombre de

copies (découverte de la conjugaison)Facteurs R

�Plasmides de résistance aux antibiotiques (conjugatifs le plus souvent)

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plus souvent)pBR322

�Vecteur de clonage très utilisé aux premier temps du clonage et du génie génétique

6- Plasmides

Gènes de

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Gènes de réplication

et répartition

7- Plasmides : clonage génétique

Intérêts :Biotechnologies production de médicaments (plasmides recombinants)

Application pour le séquençage

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séquençage

Etc…

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