Année: 1993

UNIVERSITÉ RENÉ DESCARTES DE PARIS

Pharmacie série n° :

THÈSE DE DOCTORATde l'Université René Descartes de Paris

Spécialité: Parasitologie

par Pascal RINGWALD

PLASMODIUM FALCIPARUM: ÉTUDE IN VITRO ETIN VIVO DU RÔLE DE LA CYTOADHÉRENCE ET DES

CYTOKINES DANS LA PHYSIOPATHOLOGIE DEL'ACCÈS PERNICIEUX

Soutenue le 8 décembre 1993

JURY

Président:Rapporteurs:

Examinateurs:

Monsieur Jean SAVELMonsieur Marcel HOMMELMonsieur Georges GRAUMonsieur François VACHüNMadame Geneviève MILONMonsieur Jacques LE BRASMonsieur Philippe DELORüN

A ChristineMaxime et Alexandre

Avec tout mon amourEn souvenir des années de "galère"

A ma mèrePour m'avoir permis de les supporter

A la mémoire de mon père

Je remercie le Professeur J. SAVEL pour sa disponibilité et l'amabilité aveclaquelle il m'a toujours reçu.

Au Docteur J. LE BRAS qui a guidé mes premiers pas dans la recherchemédicale et la paludologie.

Je remercie tous les membres de mon jury qui ont accepté d'examiner etde juger la qualité de cette thèse.

Je remercie les Professeurs J.P. COULAUD et F. VACHON pour m'avoirouvert les portes de leur service.

Au Professeur J. Roux, en souvenir de l'hiver malgache 1991.

A Philippe DELORON, en témoignage de mon amitié.

A tous mes collègues et amis du Centre National de Référence de laChimiosensibilité du Paludisme.

Je tiens également à remercier toutes les personnes qui ont collaboré à cetravail en particulier le Professeur F. PEYRON et le Docteur J.P. LEPERS.

Le travail rapporté ici a été réalisé dans le laboratoire de Parasitologie del'hôpital Bichat-Claude Bernard, à l'Unité de Recherches sur le Paludisme del'Institut Pasteur de Madagascar et au Département de Recherches sur lePaludisme de l'INSERM U13/Institut de Médecine et d'EpidémiologieAfricaines et Tropicales. La réalisation a été rendue possible grâce à une boursed'excellence AUPELF-UREF (1991), à une bourse de la Fondation Mérieux(1992) et à une subvention AUPELF-UREF (1991-1992).

INTRODUCTION 3

PHYSIOPATHOLOGIE DE L'ACCÈS PERNICIEUX 5I. LES LÉSIONS ANATOMO-PATHOLOCIQUES 61. La séquestration des hématies 62. L'oedème cérébral. 73. Les hémorragies en anneau 74. Les lésions immunologiques 8II. LES FAŒEURS D'HOTE ET PARASITAIRES 91. Rôle de l'immunité spécifique 92. Facteurs génétiques 93. Facteurs nutritionnels 104. Facteurs .parasitaires 11III. LES MÉCANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES DE L'ACCÈSPERNICIEUX 121. L'hypothèse mécanique 122. L'hypothèse de la perméabilité 133. L'hypothèse immunologique ; 14IV. LE PHÉNOMÈNE DE CYfOADHÉRENCE 151. Les ligands parasitaires 162. Les récepteurs membranaires 173. Les modèles de cytoadhérence .204. Actions des cytokines sur les cellules endothéliales 22V. LE PHÉNOMÈNE DE ..ROSETTINC 25VI. LES CYTOKINES DANS L'ACCÈS PERNICIEUX 271. Rôle dans le modèle expérimental Souris-P. berghei 272. Concentrations plasmatiques chez l'Homme infecté par P.[alcipar u m 28

SUJETS ET MÉTHODES 341. OBJECTIFS 35II. SUJETS 37III. MATÉRIEL 381. Les cellules endothéliales 382. Les cellules de mélanome amélanique C32 393. Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) 394. Les parasites ~ 405. Les cytokines 40IV. MÉTHODES 411. Test de cytoadhérence 412. Modulation de la cytoadhérence par les cytokines .423. Test de formation de rosettes .424. Test de chimiosensibilité in vitro .425. Dosage des cytokines plasmatiques .43

RÉSULTATS 45Article 1 51Article II 57Article 111 85Article IV 99

1

Article V 115

DISCUSSION 119

IMPLICATIONS THÉRAPEUTIQUES 143

CONCLUSION 148

RÉSUMÉ EN ANGLAiS 152

BIBLIOGRAPHIE 154

2

(~NIRODucnON )

Le paludisme reste l'une des endémies parasitaires les plus fréquentes

et les plus graves dans les pays en voie de développement. L'O.MS. estime à

200 millions le nombre annuel de cas de paludisme dus à Plasmodium

[alciparum, dont la mortalité est estimée entre 0,5 et 2 millions par an,

essentiellement des enfants africains âgés de 6 mois à 5 ans.

L'accès pernicieux, avec l'anémie sévère, sont parmi les formes

cliniques les causes de décès les plus fréquentes des accès palustres (WORLD

HEALTH ORGANIZATlON, 1990). Les chiffres concernant la prévalence de

l'accès pernicieux sont très variables en raison de la diversité des critères

d'inclusion. L'accès pernicieux représente 10% de tous les cas de paludisme

admis dans les hôpitaux dans les pays en voie de développement et peut

représenter, dans certaines études, jusqu'à 80% des décès imputables au

paludisme. La létalité au cours de l'accès pernicieux se situe entre 6 et 60%

suivant les études (\V ARRE L, 1987). Outre une létalité élevée, l'accès

pernicieux est responsable, dans 5 à 10% des cas, de séquelles neurologiques:

ataxie, aphasie, épilepsie, hypotonie, hémiplégie, spasticité généralisée,

cécité, surdité et retard mental (BREWSTER et coll., 1990; WARREL, 1987).

Les mécanismes physiopathologiques, brièvement décrits

ultérieurement, sont encore incomplètement élucidés. La séquestration

d'hématies parasitées dans les capillaires cérébraux reste actuellement l'une

des hypothèses privilégiées. Le rôle de certaines cytokines a également été

évoqué. Il n'a pas été clairement établi pourquoi une partie seulement des

cas évoluent vers les formes graves et décèdent. Des facteurs liés tant à

l'hôte qu'au parasite doivent vraisemblablement intervenir. En se basant

sur le modèle du paludisme cérébral expérimental de la Souris (GRAU et

coll., 1986; 1987a; 1987b; 1988; 1989a; 1990b, 1991) et en s'appuyant sur des

études de terrain, nous avons voulu étudier certains facteurs de virulence

parasitaire et le rôle de certaines cytokines au cours de l'accès pernicieux

chez l'Homme. Une meilleure compréhension du rôle de ces facteurs et des

mécanismes physiopathologiques de l'accès pernicieux en général pourrait

permettre la mise au point de traitements adjuvants car, malgré

l'instauration des traitements spécifiques, la létalité reste trop élevée. Ces

traitements adjuvants devraient permettre d'entraver les processus à

l'origine des complications neurologiques. La finalité en serait une

réversion plus rapide des troubles neurologiques, une diminution des

complications et, par conséquent, une baisse de la létalité. C'est dans cet

objectif général que se situe ce travail.

4

f>HVS~Of>ÂIHOlOG~E DEl~ACCfËS PE~N~C~EijX

I. LES LÉSIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES

L'étude microscopique et ultrastructurale des échantillons cérébraux

de sujets décédés d'accès pernicieux, a permis une nouvelle approche de la

physiopathologie de la maladie. Cependant, les lésions décrites sont très

variables suivant les auteurs et parfois même contradictoires. Trois

anomalies sont principalement décrites et prédominent dans la substance

blanche du cerveau par rapport au cortex et dans le cervelet par rapport au

cerveau: la séquestration d'hématies parasitées, l'oedème cérébral et la

présence d'hémorragies en anneau (JANOTA et DOSHI, 1979; NAGATAKE et

coll., 1992; SEINet coll., 1993; TORO et ROMAN, 1978; WALKER et coll., 1992).

1. La séquestration des hématies

Le blocage des capillaires et des veinules post-capillaires par des

hématies parasitées et non parasitées, est quasi systématique. Des agrégats

d 'hématies parasitées entourent des hématies non parasitées

(PONGPONRATN et coll., 1991; RIGANTI et coll., 1990). Les hématies parasitées

présentent à leur surface des protubérances ou "knobs" dont le nombre

augmente avec la maturation du parasite (MACPHERSON et coll., 1985; 00 et

coll., 1987). Tous les stades sont visibles depuis le jeune trophozoïte

jusqu'au schizonte mûr, avec une majorité de trophozoïtes âgés et de

schizontes. Une pigmentation est présente dans tous les parasites et certains

parasites montrent des signes de dégénérescence ou "crisis forrns"

(MACPHERSON et coll., 1985).

La séquestration au cours de l'accès pernicieux n'est pas limitée au

cerveau, mais elle est présente dans la plupart des organes : par ordre

décroissant d'importance: cerveau> coeur> foie> poumon, rein> réseau

vasculaire (MACPHERSON et coll., 1985; PONGPONRATN et coll., 1991). Une

séquestration est parfois observée dans les vaisseaux de diamètre supérieur à

celui des capillaires sans jamais entraîner de blocage (AI KA W A, 1988; 00 et

coll., 1987). Cependant, des cas d'accès pernicieux sans séquestration ont été

rapportés (BOONPUCKNAVIG et coll., 1990; ROMAN, 1991; TORO et ROMAN,

1978). A l'inverse, une séquestration a été observée chez des patients décédés

de paludisme mais n'ayant pas présenté d'accès pernicieux (environ 50% des

cas) (MACPHERSON et coll., 1985; PONGPONRATN et coll., 1991). Dans ce

dernier cas, une forte parasitémie circulante est vraisemblablement à

l'origine de la séquestration. Par contre, la séquestration est toujours plus

intense et atteint plus de capillaires et de veinules au cours de l'accès

pernicieux par rapport aux autres formes cliniques (MACPHERSON et coll.,

1985).

Les hématies parasitées adhèrent aux capillaires et sont en contact

intime avec la cellule endothéliale par l'intermédiaire ou non de "knobs".

Au point de contact, un espace est toujours présent, une fusion des cellules

n'a jamais été observée (MACPHERSON et coll., 1985; PONGPONRATN et coll.,

1985). Occasionnellement, des dépôts de fibrine et la présence de

neutrophiles, de lymphocytes, de macrophages et de plaquettes peuvent être

constatés au niveau des parois des capillaires (AI KA W A, 1988;

BOONPUCKNAVIG et coll., 1990; MACPHERSON et coll., 1985; 00 et coll., 1987;

PONGPONRATN et coll., 1985; PONGPONRATN et coll., 1991; SEIN et coll., 1993;

TORO et ROMAN, 1978; WALKER et coll., 1992).

Les cellules endothéliales sont parfois endommagées, présentant une

simple vacuolisation ou un état de dégénérescence avancée (00 et coll.,

1987; SEIN et coll., 1993). Elles émettent parfois des pseudopodes ou

prolongements membranaires qui facilitent le contact avec les hématies

mais la présence de pseudopodes n'est pas spécifique de l'accès pernicieux

(MACPHERSON et coll., 1985; PONGPONRATN et coll., 1985).

2. L'oedème cérébral

L'oedème cérébral est présent dans 30 à 40 % des cas, mais son

étiologie est difficile à interpréter. L'oedème n'est pas obligatoirement en

relation directe avec l'accès pernicieux, mais aussi avec l'hypoxie cérébrale

au moment de l'agonie ou avec les différents traitements entrepris

(AIKAWA,1988).

3. Les hémorragies en anneau

Des hémorragies en anneau ou périvasculaires sont souvent

observées au niveau de la substance blanche. Ces hémorragies sont parfois

centrées par une nécrose appelée granulome de DURCK, mais sa présence est

très rare (SEIN et coll., 1993; WALKER et coll., 1992). Le granulome de DURCK

est composé d'un capillaire central thrombosé entouré d'une nécrose, d'une

démyélinisation des fibres nerveuses et des cellules gliales et en périphérie

d'une hémorragie en anneau. L'étiologie de ces hémorragies est, soit

7

immunologique par dépôt d'immuns-complexes lésant les cellules

endothéliales, soit mécanique par augmentation de la perméabilité et

passage extra-vasculaire d'hématies non parasitées ou parasitées par de

jeunes trophozoïtes (AIKAWA, 1988; BOONPUCKNAVIC et coll., 1990; 00 et

coll., 1987; 00 et THAN, 1989; RICANTI et coll., 1990; TORO et ROMAN, 1978).

4. Les lésions immunologiques

Des études immuno-histochirniques ont mis en évidence la présence

d'IgG, d'IgM, d'antigènes de P. falciparum et d'antigènes spécifiques des

"knobs" au niveau des parois des capillaires cérébraux. Ces constatations

sont en faveur de lésions immunologiques au cours de l'accès pernicieux

(AIKAWA, 1988; AIKAWA et coll., 1990; BOONPUCKNAVIC et coll., 1990;

ICARASHI et coll., 1987; 00 et coll., 1987). La présence d'IgG, d'antigènes

parasitaires et de fraction C3 du complément au niveau des parois des

capillaires cérébraux est plus importante dans la substance blanche du

cerveau par rapport au cortex (NA CAT AKE et coll., 1992). Ces dépôts

d'antigènes associés à une réaction inflammatoire cellulaire ont également

été décrits à l'intérieur du tissu cérébral (BOONPUCKNAVIC et coll., 1990).

II. LES FACTEURS D'HÔTE ET PARASITAIRES

1. Rôle de l'immunité spécifique

L'accès pernicieux survient le plus souvent chez les adultes non

prémunis ou chez les enfants vivant en zone d'endémie. C'est le cas, par

exemple, de voyageurs européens ou lors de mouvements de population

d'une zone indemne de paludisme vers une zone d'endémie. Chez les

enfants, il est communément admis que la survenue des accès graves est

liée à l'âge et à l'absence ou à la faible immunité anti-palustre. Des études

menées en Gambie et au Kenya ont confirmé ce point pour l'anémie sévère

(BREWSTER et coll., 1990; GREENWOOD et coll., 1991). Par contre, l'âge des

enfants présentant un accès pernicieux est en moyenne plus élevé que celui

des enfants atteints d'anémie sévère, ce qui suggère qu'une sensibilisation

préalable au parasite est nécessaire pour développer cette complication. De

plus, le titre d'anticorps etui-Plasmodium n'est pas différent chez des

enfants gambiens ou des adultes thaïlandais présentant un accès pernicieux

ou un accès simple, sauf pour l'antigène Pf155/ RE5A et l'antigène

sporozoïtaire (BRASSEUR et coll., 1990; ERUNKULU et coll., 1992; FRIBOURC­

BLANC et coll., 1985; TAPCHAISRI et coll., 1985; THAMMAPALERD et coll., 1987;

THARAV ANIJ et coll., 1984; THARAV ANI} et coll., 1988).

Les mécanismes de la protection immunitaire, cellulaire ou

humorale, ne sont pas élucidés. Une grossesse, un état d'immuno­

suppression ou de baisse de l'immunité, une splénectomie peuvent

prédisposer une personne antérieurement protégée à développer un

paludisme sévère (LOOAREESUWAN et coll., 1993; WORLD HEALTH

ORCANIZATION, 1990). De nombreuses altérations de l'immunité cellulaire

ont été décrites au cours de l'accès pernicieux, mais il n'a pas été établi si ces

anomalies sont des causes ou des conséquences de la maladie (BRASSEUR et

coll., 1985; DRurLHE et coll., 1983).

2. Facteurs génétiques

Certaines anomalies génétiques, lœ- et la p-thalassémie, la

drépanocytose et le déficit en G-6-PD ont été décrites comme protectrices vis­

à-vis du paludisme et de l'accès pernicieux (GREENWOOO et coll., 1991; HILL

et coll., 1991; W ARRELL, 1987). En Asie du sud-est, l'ovalocytose, anomalie

des hématies caractérisée par une augmentation de leur rigidité, protège les

sujets du paludisme et, dans le cas d'une infestation, d'une augmentation

importante de la densité parasitaire (Foo et coll., 1992).

Peu de données sont disponibles à propos de la relation entre groupes

sanguins et paludisme. Une étude menée en Gambie a démontré une faible

mais significative relation entre le groupe sanguin 0 et la résistance à

l'infection palustre (HILL, 1992).

Récemment, un regain d'intérêt a été porté sur le système HLA et la

survenue de formes graves de la maladie. Toujours en Gambie, les sujets

porteurs des gènes codant pour les antigènes HLA de classe I Bw53 sont

moins susceptibles de développer un accès pernicieux ou une anémie

sévère. De même, les sujets porteurs des gènes codant pour les antigènes de

classe II DRw13 sont protégés contre la survenue d'une anémie sévère (HILL

et coll., 1991).

D'autres gènes codant pour des molécules impliquées dans la réponse

immunitaire de l'hôte telles que les récepteurs des lymphocytes T, les

composants du complément et les cytokines sont vraisemblablement

impliqués (MAR5H, 1992).

3. Facteurs nutritionnels

Une malnutrition protéino-calorique et un déficit en fer, à l'origine

d'une baisse de l'immunité cellulaire, n'apparaissent pas comme des

facteurs de susceptibilité aux formes graves. Les enfants en bon état

nutritionnel semblent développer plus facilement une forme grave. Les

convulsions sont plus fréquentes chez les enfants bien nourris que chez

ceux atteints de kwashiorkor ou de marasme (WARRELL, 1987; WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 1990). Mais les résultats restent souvent

contradictoires selon les différentes études. En effet, en Gambie, aucune

différence de poids n'a été observée entre les enfants présentant un accès

simple ou pernicieux (GREENwOOO et coll., 1991; MAR5H, 1992). De même, il

n'a pas été clairement établi la relation entre le déficit en fer et la gravité de

l'accès palustre. L'administration parentérale de fer aggraverait les

manifestations cliniques de paludisme alors qu'un apport en fer per os ne

modifierait pas la parasitémie (MA R5H, 1992; WORLD HE ALTH

ORGANIZATION, 1990).

la

4. Facteurs parasitaires

La différence de virulence entre les souches de P. falciparum a

souvent été évoquée pour expliquer la survenue de complications.

Nonobstant les facteurs génétiques et imrnunologiques de l'hôte, il est

étonnant que des souches entraînent un accès pernicieux alors que d'autres

souches, à parasitémie périphérique égale ou supérieure, ne créentpas de

complications. Ainsi, la mortalité chez le Singe Aotus infecté par P.

[alciparum varie avec le type de souche utilisée (SCHMIDT, 1978). Peu de

données sont disponibles chez l'Homme, mais au cours des séances de

"malariathérapie" pratiquées au début du siècle chez des patients neuro­

syphilitiques, des accès de gravité différente étaient survenus avec des

souches de P. falciparum d'origine géographique différente (CavELL, 1951).

La quantité de sporozoïtes injectés par le moustique au cours d'une

piqûre infestante a été évoquée comme facteur induisant des formes graves

(GREENWOOD et coll., 1991).

il est évident que les isolats de P. falciparum expriment des différences

génétiques et phénotypiques (MAR5H et HOWARD, 1986). Ainsi, la capacité invitro d'hématies parasitées par des souches de P. [alciparum à adhérer à des

cellules endothéliales et à former des rosettes, deux facteurs liés à

l'expression d'antigènes spécifiques, ainsi que la sensibilité aux

antipaludiques des souches de P. [alciparum, sont autant de facteurs de

virulence potentiels pouvant influer sur la gravité de la maladie

(GREENwooD et coll., 1991; MAR5H, 1992).

11

III. LES MÉCANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES DEL'ACCÈS PERNICIEUX

Aucune des lésions anatomo-pathologiques décrites n'est retrouvée

systématiquement au cours des accès pernicieux. Ces divergences sont à

rapprocher du dualisme des hypothèses physiopathologiques de l'accès

pernicieux. D'un côté, la théorie mécanique expliquant les troubles

neurologiques par le blocage des capillaires cérébraux, de l'autre la théorie

immunologique se basant sur les observations des modèles animaux dans

lesquels les lésions neurologiques sont une réponse immune inflammatoire

à la présence du parasite médiée par des facteurs solubles.

1. L'hypothèse mécanique

La théorie mécanique est basée sur le fait que la circulation cérébrale

est diminuée, entraînant une hypoxie et une ischémie locales. Décrite

anciennement sous le terme d'effet "sludge", la séquestration des hématies

parasitées permet une meilleure croissance du parasite dans une

atmosphère d 'hypoxie partielle, une invasion plus facile des hématies

saines par les mérozoïtes, et surtout permet aux hématies parasitées d'éviter

le passage par la rate où elles seraient détruites. Les hypothèses étiologiques

sont multiples.

La défonnabilité réduite des hématies parasitées rend plus difficile le

passage des hématies à travers les capillaires, entraînant une obstruction.

L'obstruction simultanée des capillaires et des veinules post-capillaires sans

répercussion en amont va à l'encontre de cette théorie. Les altérations de la

déformabilité des hématies n'expliquent pas la séquestration privilégiée des

hématies dans les capillaires cérébraux, alors que les capillaires de même

taille des autres organes sont libres (WARRELL, 1987).

La présence de thrombi a occasionnellement été décrite et la

coagulation intravasculaire disséminée est l'un des mécanismes évoqués.

Mais les anomalies de la coagulation sont très fréquentes au cours du

paludisme non compliqué. Une thrombose disséminée n'est pas compatible

avec l'absence de séquelles neurologiques observée chez la plupart des

adultes. Un arrêt complet de la circulation cérébrale de plus de quelques

secondes rend impossible un retour rapide à un état neurologique normal

après la phase comateuse. Il est possible que le flux sanguin soit réduit, mais

12

JamaiS totalement au point de créer un infarcissement irréversible

(WARRELL, 1987).

Des modifications de l'endothélium vasculaire cérébral peuvent

entraver le flux des hématies à travers les petits vaisseaux. L'endothélium

peut être endommagé par des hématies rigides ou par des substances

toxiques. Les pseudopodes observés au niveau des cellules endothéliales au

cours de l'accès pernicieux sont semblables à des pseudopodes induits

expérimentalement par des radicaux libres de l'oxygène (MACPHERSON et

coll., 1985).

L'examen au microscope électronique de fragments de cerveau a

montré l'existence d'une cytoadhérence entre les hématies parasitées et les

cellules endothéliales. Le phénomène de cytoadhérence est actuellement

l'une des hypothèses privilégiées de l'étiologie de l'accès pernicieux et sera

développé ultérieurement.

Cependant, l'étude de la circulation sanguine cérébrale au cours de

l'accès pernicieux n'a pas formellement prouvé une réduction du flux

circulatoire (WARRELL et coll., 1988). Par contre, il a été démontré une baisse

de la concentration artérielle en oxygène et une modification du

métabolisme du glucose par une glycolyse anaérobie se traduisant par une

augmentation des lactates dans le LCR (WHITE et coll., 1985).

2. L'hypothèse de la perméabilité

MAEGRAITH et FLETCHER (1972), les auteurs de travaux chez le Singe

Rhesus infecté par P. knowlesi, avaient conclu que certaines substances

(kinines, histamine, prostaglandines) pouvaient causer une augmentation

de la perméabilité capillaire avec une fuite de plasma et de protéines à

travers la barrière hémo-méningée. Cette perméabilité accrue serait

responsable de l'oedème cérébral, du coma et, dans un deuxième temps,

d'une hémoconcentration et d'une stase sanguine. Une augmentation de la

perméabilité capillaire avait également été retrouvée dans le modèle de la

Souris (NEILL et HUNT, 1992; POLDER et coll., 1992; THUMWOOD et coll., 1988).

Ces éléments avaient motivé l'utilisation de corticoïdes et de médicaments

anti-inflammatoires au cours de l'accès pernicieux. Les études chez

l'Homme n'ont pas confirmé cette hypothèse (DAVIS et coll., 1992). \VARREL

et colL (1986) ont prouvé, à l'aide de protéines marquées, que la barrière

13

hémo-méningée était intacte au cours de l'accès pernicieux. La pression du

LCR lombaire est le plus souvent normale sauf chez l'enfant (NEWTON et

coll., 1991; WAL KER et coll., 1992; WALLE R et coll., 1991), et la découverte

d'un oedème cérébral n'est pas systématique à l'autopsie. De plus, les

corticoïdes se sont avérés nocifs (HOFFMAN et coll., 1988; WARRELL et coll.,

1982).

3. L'hypothèse immunologique

La mise en évidence d'anticorps et d'antigènes de P. falciparum au

niveau des capillaires au cours de l'accès pernicieux a été interprétée comme

le résultat d'une réaction hyperergique du système nerveux central face à

une stimulation antigénique parasitaire. Le mécanisme supposé est une

vascularite à immuns-complexes circulants, d'autant que la présence

d'immuns-complexes circulants, de cryoglobulines et d'une baisse du

complément est observée plus fréquemment au cours de l'accès pernicieux

que dans les accès simples (ADAM et coll., 1981).

Le rôle de médiateurs, sécrétés par des macrophages stimulés, dans la

survenue des lésions neurologiques au cours de l'accès pernicieux a d'abord

été évoqué par CLARK et coll. (1981). La participation du Tumor Necrosis

Factor-a. (TNF-a.) a été confirmée chez la Souris infectée par P. berghe!

ANKA. Les radicaux libres de l'oxygène et les radicaux nitrés pourraient

également intervenir d'autant que le TNF-a. favorise leur sécrétion par les

macrophages, les polynucléaires neutrophiles et les cellules endothéliales

(CLARK et coll., 1989a; CLARK et coll., 1991; CLARK et coll., 1992c).

Nous développerons plus particulièrement les connaissances sur la

cytoadhérence et les cytokines, deux facteurs qui sont potentiellement

impliqués au cours de l'accès pernicieux et qui feront l'objet d'études plus

approfondies au cours de ce travail.

14

IV. LE PHÉNOMÈNE DE CYTOADHÉRENCE

La cytoadhérence des hématies parasitées par P. [alciparum est

considérée comme le principal événement à l'origine de la séquestration.

Dans la circulation cérébrale, cette séquestration ne survient qu'au niveau

des capillaires et des veinules post-capillaires et fait principalement

intervenir les hématies parasitées par des trophozoïtes âgés ou des

schizontes mûrs de P. jalciparum. En conséquence, au cours de l'accès

palustre à P. [alciparum, seuls les trophozoïtes jeunes sont présents dans la

circulation périphérique. La séquestration des hématies parasitées par des

stades plus âgés est d'une grande importance pour les parasites car les

hématies parasitées évitent le passage par la rate où elles seraient

phagocytées. Le rôle de la rate dans ce phénomène a par ailleurs été

démontré par la réduction de la cytoadhérence chez le Singe Saimiri

splénectomisé (DAVID et coll., 1983) et par la circulation dans le sang

périphérique de trophozoïtes et de schizontes mûrs chez des patients

splénectomisés (ISRAEL! et coll., 1987; LOOAREESUWAN et coll., 1993). De plus,

les parasites se développent mieux dans une atmosphère pauvre en

oxygène.

La cytoadhérence a été mise en relation avec la présence de

protubérances appelées "knobs" (K+) qui apparaissent tardivement dans le

cycle asexué parasitaire (HOWARD, 1988). La présence de "knobs" à la surface

des hématies parasitées semblait indispensable à la cytoadhérence en

facilitant le contact hématies parasitées et cellules endothéliales. Cependant,

le rôle des "knobs'' a été remis en question car les hématies parasitées par P.

malariae expriment aussi des "knobs" et n'adhèrent pas in vivo alors que

les hématies contenant des formes immatures de gamétocytes de P.

jalciparum n'expriment pas de "knobs" mais peuvent cependant adhérer

(SHARMA, 1991). De plus, certaines souches K+ ne provoquent pas

d'adhérence in vitro (UDEINYA et coll., 1983a) et des hématies parasitées par

des clones de P. jalciparum K- peuvent adhérer à des cellules de mélanome

amélanique C32 (BIGGS et coll., 1989; BIGGS et coll., 1990; OCKENHOUSE et

coll., 1991; RUANGJIRACHUPORN et coll., 1991; UDOMSANGPETCH et coll.,

1989a). Néanmoins, l'affinité pour les récepteurs cellulaires des isolats K+

semble meilleure que celle des isolats K- (RUANGJIRACHUPORN et coll., 1991).

Pour l'instant, seule la cytoadhérence de souches présentant des "knobs" a

été décrite au cours des examens histo-pathologiques de prélèvements post­

mortem .et dans les modèles dynamiques ill vitro de cytoadhérence

15

(RAVENTas-SUAREZ et coll., 1985). En outre, il a été récemment démontré

que les ligands parasitaires qui se fixent sur les récepteurs cellulaires sont

effectivement situés sur les "knobs'' (NA KA MURA et coll., 1992). Ces

différents éléments n'excluent cependant pas la possibilité d'adhésion

d'hématies parasitées par une souche sauvage K- (HOMMEL et SEMOFF, 1988).

1. Les ligands parasitaires

Le fait que seules les hématies parasitées par des formes matures

adhèrent aux cellules endothéliales, implique que les hématies parasitées

par des trophozoïtes jeunes et les hématies non parasitées n'expriment pas

les mêmes caractéristiques antigéniques.

De nombreux travaux ont recherché la nature des protéines

parasitaires impliquées dans le phénomène de cytoadhérence dont l'une des

caractéristiques principales est leur sensibilité à la trypsine et la

chymotrypsine (BIGGS et coll., 1990; DAVID et coll., 1983; LEECH et coll., 1984).

L'attention s'est portée sur une protéine membranaire PŒMP-l (P.

falciparum Erythrocyte Membrane Protein-l) dont le poids moléculaire

varie de 250 à 300 kD suivant les souches (ALEY et coll., 1984; BIGGS et coll.,

1992; LEECH et coll., 1984; MAGOWAN et coll., 1988). L'expression de cette

protéine de surface et la capacité de cytoadhérence apparaissent au même

moment du cycle asexué parasitaire. Cette protéine est sensible à la trypsine

et peut être immunoprécipitée par des sérums immuns homologues,

spécifiques de la souche, mais non par des sérums hétérologues. Chez des

souches K-, des protéines PŒMP-l-like de plus faible poids moléculaire ont

été mises en évidence à la surface des hématies parasitées (BIGeS et coll.,

1990). OCKENHOUSE et coll. (1991) ont démontré la participation d'une

protéine de 270 kD dénommée "séquestrine'' au phénomène de

cytoadhérence, en particulier son affinité pour le récepteur CD36. Cette

protéine pourrait appartenir à la grande famille de protéines de haut poids

moléculaire présentes à la surface des hématies parasitées (LEECH et coll.,1984; MAGOWAN et coll., 1988).

La participation d'autres protéines PŒMP-2 (ou MESA), PfHRP-l (P.

[alciparu m Histidine Rich Protein-l) et PfHRP-2 n'a pas été confirmée(PETERSEN et coll., 1989; ROCK et coll., 1988b).

16

Un anticorps monoclonal humain 33G2 (IgM, K) est capable d'inhiber

la cytoadhérence provoquée par une souche K- sur des cellules de

mélanome C32. Cet anticorps reconnaît une répétition d'un double résidu

acide glutamique entourant un résidu hydrophile (Glu-Glu-résidu

hydrophile-Glu-Glu). Cette répétition se retrouve dans plusieurs protéines

parasitaires : Pf155/RESA (Ring Infected Erythrocyte Surface Antigen),

l'antigène Pf11.1 et l'antigène 332, une protéine présente sur la surface des

hématies parasitées par des stades avancés de P. falciparutn, Cependant, ni

RESA, ni 11.1 ne sont des protéines de surface et le rôle précis de l'antigène

332 reste à définir (IQBAL et coll., 1993; UDOMSANGPETCH et coll., 1989a).

La similitude de certaines caractéristiques des hématies parasitées et

des hématies âgées a suggéré que la cytoadhérence pourrait être médiée par

la bande 3, et plus particulièrement par des fractions de la bande 3 modifiée.

Une protéine de 85 kD est reconnue spécifiquement par l'anticorps

monoclonal de type IgM 4A3 qui est capable d'inhiber la cytoadhérence

(WINOGRAD et SHERMAN, 1989). D'autres protéines de 65 et 240 kD ont été

isolées et semblent également provenir de la bande 3 (CRANDALL et

SHERMAN, 1991). L'invasion des hématies par les parasites pourrait

entraîner une altération de certaines protéines érythrocytaires, en particulier

de la bande 3. Il en résulterait des modifications structurales de la cellule­

hôte, une modification de l'antigénicité et l'apparition d'une capacité

d'adhérence.

2. Les récepteurs membranaires

2.1. La thrombospondine

La thrombospondine a été la première molécule identifiée comme

récepteur potentiel de cytoadhérence (ROBERTS et coll., 1985). Cette

glycoprotéine de 450-500 kD aux fonctions multiples est composée de 3 sous­

unités identiques de 180 kD environ. Elle intervient dans les interactions

cellule-cellule et cellule-matrice en vertu de sa capacité à fixer des molécules

comme l'héparine, la fibronectine, le fibrinogène, le collagène ou le

plasminogène. Par ailleurs, la thrombospondine partage des séquences

d'acides aminés avec la properdine, la "circumsporozoite protein" et avec

des antigènes des stades asexués de P. [alciparum (GoUNoIs et REID, 1988;

ROBSON et coll., 1988).

17

Des hématies parasitées par des trophozoïtes et des schizontes de P.

[aiciparum adhèrent spécifiquement à des surfaces en plastique recouvertes

de thrombospondine mais pas à des surfaces recouvertes de fibronectine, de

laminine, de vitronectine ou de facteur VIII de Willebrand (SHERWOOD et

coll., 1987). Des anticorps anti-thrombospondine et de la thrombospondine

soluble inhibent cette adhérence dans des modèles in vitro (ROBERTS et coll.,

1985) mais aussi dans le modèle ex vivo de microcirculation (ROCK et coll.,

1988a). L'adhérence des hématies parasitées se fait spécifiquement avec le

fragment carboxyl terminal de la thrombospondine (SHERWOOD et aL, 1990).

Cependant, la sécrétion et la présence de thrombospondine à la surface des

cellules, en particulier les cellules de mélanome, n'est pas un élément

déterminant dans le phénomène de cytoadhérence (PATON et coll., 1987;

SHERWOOD et coll., 1989).

2.2. Le récepteur CD36

Le rôle d'une autre glycoprotéine de 88 kD environ, a également été

évoqué (BARNWELL et coll., 1989; OCKENHOUSE et coll., 1989b). Elle est

exprimée par beaucoup de cellules et sa dénomination varie : glycoprotéine

IV ou IIIb (plaquettes), CD36 (monocytes), GP88 (cellules endothéliales,

cellules de mélanome). Elle intervient comme récepteur de la

thrombospondine et du collagène et comme récepteur de stimulation des

macrophages et des plaquettes (ASCH et coll., 1987; GREENWALT et coll., 1992;

SILVERSTEIN et coll., 1992).

L'adhérence des hématies parasitées à des monocytes, des cellules

endothéliales et des cellules de mélanome amélanique C32 est inhibée par

des anticorps OKM5 anti-CD36 (BARNWELL et coll., 1985; BARNWELL et coll.,

1989; OCKENHOUSE et coll., 1989a). L'incubation des hématies parasitées en

présence du récepteur CD36 soluble inhibe leur capacité à adhérer à des

cellules de mélanome, des cellules endothéliales, des monocytes et des

plaquettes (BARNWELL et coll., 1989; OCKENHOUSE et coll., 1989a;

OCKENHOUSE et coll., 1989b). L'induction de l'expression de récepteur CD36

sur les cellules myélomonocytaires U937 entraîne l'adhérence des hématies

parasitées (OCKENHOUSE et CHULAY, 1988). Des cellules COS exprimant des

récepteurs CD36 fixent des hématies parasitées et cette adhérence est

également inhibée par des anticorps anti-CD36 (OQUENDO et coll., 1989). Ces

différents travaux ont prouvé en outre que l'adhérence des hématies

18

parasitées pouvait se faire directement au récepteur CD36 et non pas

obligatoirement par l'intermédiaire de la thrombospondine. De plus,

l'adhérence des hématies parasitées au récepteur CD36 est indépendante de

la présence de Ca", alors que l'adhérence à la thrombospondine nécessite la

présence de Ca".

2.3. La famille des immunoglobulines

ICAM-1 (Intercellular Cell Adhesion Molecule-1), ICAM-2 et VCAM-1

(Vascular Cell Adhesion Molecule-L) sont membres de cette famille et

possèdent des séquences communes (de 2 à 7) avec les immunoglobulines.

ICAM-1 (ou CD54) est une protéine membranaire fortement

glycosylée de 95-112 kD exprimée sur les fibroblastes, sur les cellules

épidermiques, sur certaines lignées tumorales et sur l'endothélium

vasculaire. ICAM-1 est un récepteur pour LFA-1 (Lymphocyte Function

Associated Antigen-1). Il intervient à ce titre dans l'adhérence des

granulocytes, des monocytes, des cellules NK et des lymphocytes sur les

cellules endothéliales. Accessoirement, ICAM-1 intervient comme récepteur

pour le rhinovirus (BERENDT et coll., 1992; OCKENHOUSE et coll., 1992a) et

pour les hématies parasitées par P. falciparum (BERENDT et coll., 1989). En

effet, l'adhérence d'hématies parasitées par une souche de P. falciparum à

des cellules exprimant des récepteurs ICAM-1 est inhibée par des anticorps

anti-ICAM-l. ICAM-2 ne semble pas intervenir dans les phénomènes de

cytoadhérence de P. falciparum (SMITH et coll., 1992).

VCAM-1 (ou INCAM 110 - Inducible Cell Adhesion Molecule 110) sert

de récepteur pour les monocytes, les éosinophiles, les lymphocytes, les

basophiles, les cellules NK et certaines cellules tumorales. Son rôle dans la

cytoadhérence des hématies parasitées par P. falciparum a été récemment

décrit (OCKENHOUSE et coll., 1992b).

2.4. La famille des sélectines

Parmi les trois récepteurs de cette famille, L-sélectine (ou LA!vl-1), P­

sélectine (ou GMP 140 - Granule Membrane Protein 140) et E-sélectine (ou

ELAM-1 - Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule-L), seule l'E-sélectine

intervient dans la cytoadhérence d'hématies parasitées par P. falciparum

(OCKENHOUSE et coll., 1992b). E-sélectine est un récepteur pour les

19

neutrophiles, les monocytes, les lymphocytes, les éosinophiles et certaines

cellules tumorales.

3. Les modèles de cytoadhérence

3.1. Les modèles in vivo

Bien qu'une séquestration dans les capillaires cérébraux puisse

survenir chez le Singe Rhesus ou le Singe Macaca fuscata infecté par P.

fragile ou P. coatneyi ou chez le Singe Aotus ou Saimiri infecté par P.

falciparum, les troubles neurologiques ne sont pas systématiques (HOWARD

et GILLAOOGA, 1989). Ces modèles restent très coûteux et délicats (AIKAWA et

coll., 1992; GYSIN et coll., 1992; KAWAI et coll., 1993). Des rongeurs infectés

par P. yoelli (WEISS, 1989), P. berghei et P. vinkei (CLARK et coll., 1992b) ont

également été utilisés. Le modèle de la Souris infectée par P. berghei a été

particulièrement employé mais il est évident que ce modèle animal ne

reproduit pas parfaitement le modèle humain, d'abord, parce qu'il existe des

différences anatomo-pathologiques (séquestration d'hématies chez

l'Homme et de globules blancs chez la Souris; présence moins fréquente

d'oedème cérébral chez l'Homme), ensuite parce que les symptômes

neurologiques chez la Souris (mono-, hémi-, para-, tétraplégie, ataxie,

déviation de la tête, convulsions) sont différents du coma chez l'Homme.

Néanmoins, l'utilisation du modèle murin a permis une approche

différente et une meilleure compréhension des phénomènes

physiopathologiques chez l'Homme.

3.2. Les modèles in vitro

a. Les cellules endothéliales humaines

Ce modèle est généralement basé sur la culture des cellules

endothéliales obtenues à partir de cordons ombilicaux humains (HUVEC).

Leur culture est de courte durée, délicate, et les résultats obtenus varient

entre les laboratoires et les expérimentations successives nécessitent

l'utilisation de plusieurs cordons pour obtenir une reproductibilité des

mesures (UOEINYA et coll., 1981). Ce modèle a été modifié par l'utilisation

d'héparine et de facteurs de croissance (THORNTON et coll., 1983; UOEINYA,

1993) ou par l'utilisation d'un facteur mitogène permettant d'obtenir une

20

lignée de cellules endothéliales (EC-PF5) en culture continue (UOEINYA et

coll., 1989).

Outre les HUVEC, d'autres cellules endothéliales ont été isolées, en

particulier les cellules endothéliales des microvaisseaux cutanés (HDMEC)

(SWERLICK et coll., 1992a; SWERLICK et coll., 1992b) et les cellules

endothéliales des capillaires cérébraux (HBEC) (SM ITH et coll., 1992).

Contrairement aux HUVEC, les HDMEC et les HBEC expriment le récepteur

CD36, alors que ICAM-1 est exprimé aussi bien sur les HUVEC, les HDMEC

et les HBEC mais sa distribution en surface diffère selon les types de cellules

(SMITH et coll., 1992; SWERLICK et coll., 1992b).

b. Les cellules de mélanome amélanique C32

Ces cellules présentent les avantages d'une lignée continue: culture

aisée, manipulations reproductibles et disponibilité des cellules dans le

commerce (SCHMIDT et coll., 1982). Les cellules de mélanome expriment à

leur surface ICAM-1 et principalement CD36 mais présentent des

microvillosités pouvant interférer avec la cytoadhérence des hématies

(BERENDT et coll., 1990).

c. Les globules blancs

Les monocytes sont obtenus à partir du sang humain et sont utilisés

après une culture de courte durée (BARNWELL et coll., 1985). Des lignées de

cellules myélomonocytaires (U937 et THP 1) ont également été employées

(GOLDRING et coll., 1992; OCKENHOUSE et CHULAY, 1988). Contrairement aux

monocytes, les polynucléaires neutrophiles et les lymphocytes n'expriment

pas de récepteurs CD36 mais sont néanmoins capables de fixer des hématies

parasitées. Cette adhésion est vraisemblablement médiée par le récepteur

ICAM-1 (RUANGJIRACHUPORN et coll., 1992).

d. Les cellules COS

Les cellules COS sont des cellules de Singe qui ont intégré dans leur

génome une région précoce du génome du virus SV40. Ces cellules sont

utilisées comme hôte de transfection car elles permettent d'obtenir en

grande quantité le produit du gène inséré. Les gènes exprimant les

récepteurs membranaires CD36 et ICAr,,1-1 ont été transfectés dans des

21

cellules COS en culture continue. Ce modèle est particulièrement

intéressant pour l'étude des mécanismes spécifiques d'adhérence (BERENDT

et coll., 1989; OQUENDO et coll., 1989). Cependant, le modèle des cellules COS

qui présente de nombreux inconvénients (fixation d'hématies saines et

fixation d'hématies parasitées sur des cellules COS non transfectées) est en

train d'être remplacé par le modèle des cellules CHO (Chinese Hamster

Ovary) (HASLER et coll., 1990; HASLER et coll., 1993).

e. Les récepteurs purifiés

L'adsorption des différents récepteurs purifiés (thrombospondine,

CD36, ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine) sur des surfaces en plastique a

également été utilisée comme modèle de cytoadhérence in vitro (BARNWELL

et coll., 1989; BIGGS et coll., 1990; HASLER et coll., 1990; OCKENHOUSE et coll.,

1989b; OCKENHOUSE et coll., 1991; OCKENHOUSE et coll., 1992b; ROBERTS et

coll., 1985).

3.3. Les modèles ex vivo de microcirculation ou modèles dynamiques

RAVENTas-SuAREZ et coll. (1985) ont cathétérisé des vaisseaux du

méso-caecum de Rat et les ont perfusés avec des hématies parasitées par P.

falciparum, Ce système présente l'avantage d'être un modèle dynamique

permettant l'étude des paramètres rhéologiques parallèlement à la

cytoadhérence. Ce modèle a été réutilisé par ROCK et coll. (1988a) pour

confirmer le rôle de la thrombospondine, mais comme il n'est pas certain

que les caractéristiques des vaisseaux de Rat (récepteurs, flux et résistance

dynamique) soient semblables aux capillaires humains, des modèles

dynamiques, utilisant des hématies parasitées par P. falciparum et P. fragileet des HUVEC ou des HDMEC comme surface d'adhérence, ont été mis au

point (WICK et LOUIS, 1991; WICK et LOUIS, 1992).

4. Actions des cytokines sur les cellules endothéliales

L'action des cytokines sur les cellules endothéliales, et à plus forte

raison sur les phénomènes de cytoadhérence, est complexe. Les cytokines

seront réparties en deux groupes selon leurs actions : TNF-a, IL-1

(Interleukine-l ), IL-4 et IFN-y (Interféron-y) d'une part, et IL-3, GM-CSF

(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor), G-CSF et M-CSF,

d'autre part.

22

4.1. TNF-u, IL-l, IL-4 et IFN-y

Les cellules endothéliales sont capables, sous l'influence du TNF-a, de

l'IL-1 et de LPS de sécréter de l'IL-1 (NAWROTH et coll., 1986), de l'IL-6

(MANTOVANI et coll., 1992), du G-CSF, du M-CSF, du GM-CSF (BROUDY et

coll., 1986; MANTOVANI et coll., 1992; MUNKER et coll., 1986), de l'IL-8, de la

MCP (Monocyte Chemotactic Protein) (MANTOVANI et coll., 1992), des

prostaglandines et du PAF (platelet Activating Factor) (BRAQUET et coll.,

1989). l'IL-1 et le TNF-a modifient les propriétés anticoagulantes de la

surface des cellules endothéliales en induisant une activité procoagulante et

en inhibant la fibrinolyse (BEVILACQUA et coll., 1984; BEVILACQUA et coll.,

1986; NAWROTH et STERN, 1986). Le TNF-a et l'IFN-y modifient la structure

des cellules endothéliales en culture, en induisant un allongement et un

chevauchement des cellules (STOLPEN et coll., 1986). Le TNF-a et la

lymphotoxine augmentent l'expression des antigènes de classe 1 du

complexe majeur d'histocompatibilité présents sur les cellules endothéliales

à l'état basal, alors que l'IFN-y induit l'expression des antigènes de classe 1 et

II (POBER et coll., 1987; POBER, 1988).

Les cellules endothéliales peuvent exprimer spontanément des

récepteurs à leur surface (CD36, thrombospondine, GMP 140, EndoCAM ­

Endothelial Cell Adhesion Molecule - ou PECAM-1 ou CD31, ICAM-1 et

ICAM-2) dont l'expression peut être modulée pour certains par des

cytokines (ALBELDA et BUCK, 1990). Pour d'autres récepteurs, l'expression

n'apparaît qu'après stimulation par des cytokines. Ainsi:

• E-sélectine est transitoirement induit par l'IL-1, TNF-a et la

lymphotoxine (POBER et coll., 1986a; POBER et coll., 1987). L'expression de l'E­

sélectine est maximale 4 à 6 heures après la stimulation par les cytokines.

Elle décroît pour retrouver le niveau de base vers la 24è heure, malgré la

persistance de la stimulation. L'IFN-y n'intervient pas directement dans

l'expression de l'E-sélectine mais potentialise l'effet du TNF-a et de l'IL-1 et

allonge la durée d'expression de ce récepteur (DOUKAS et POBER, 1990);

• contrairement à l'E-sélectine, ICAM-1 est présent spontanément sur

la surface des cellules endothéliales. Son expression sur les HUVEC et

vraisemblablement sur les HBEC est augmentée par le TNF-a, l'IL-1, l'IFN-y

et les LPS et se maintient tout au long de la stimulation par les cytokines

(POBER et coll., 1986b; SOBEL et coll., 1990). Elle atteint un plateau 24 heures

après le début de la stimulation par TNF-a et IL-l, et quelques jours après la

23

stimulation par l'IFN-y. L'IL-4 inhibe l'expression d'ICAM-1 et de l'E­

sélectine (THORNHILL et HA5KARD, 1990). L'expression d'ICAM-2 n'est pas

modifiée par les cytokines;• VCAM-1 est faiblement exprimé (CARLOS et coll., 1990) ou est absent

des cellules endothéliales au repos (SWERUCK et coll., 1992a). Son expression

est induite par ·le TNF-a, l'IL-1, l'IL-4 et les LPS avec des paramètres

cinétiques semblables à ceux d'ICAM-1 (MANTOVANI et coll., 1992; SWERLICK

et coll., 1992a);

• l'expression de CD36 sur les cellules endothéliales est variable

suivant la taille des vaisseaux et l'organe d'origine (KNOWLES II et coll.,

1984). Ainsi, CD36 est absent des HlNEC mais présent sur les HDMEC et les

HBEC. L'IFN-yaugmente l'expression des récepteurs CD36 sur les HDMEC

avec un maximum se situant vers la 30è heure (SWERLICK et coll., 1992b);

• la sécrétion de thrombospondine est augmentée après stimulation

des HUVEC par le TNF-a (DUNN et coll., 1989);

• l'IFN-yaugmente l'expression sur les cellules endothéliales de

l'antigène Leu 13 (antigène présent sur les lymphocytes T et B) GAFFE et coll.,

1989) et la sécrétion de néoptérine par les cellules endothéliales qui est un

marqueur de l'activation cellulaire, en particulier des macrophages

(ANDERT et coll., 1992).

4.2. IL-3, GM-CSf, G-CSf et M-CSf

IL-3, GM-CSF, G-CSF et M-CSF n'ont pas d'action sur les propriétés

anticoagulantes des cellules endothéliales, ni sur l'expression des antigènes

du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (BUSSOLINO et coll.,

1991; YONG et coll., 1991). Par contre, le GM-CSF augmente l'expression des

antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (LESZCZYNSKI

et HAYRY, 1990) et le GM-CSF et le G-CSF induisent la migration et la

prolifération des cellules endothéliales (BUSSOLINO et coll., 1989; BUSSOLINO

et coll., 1991). L'IL-3 augmente l'adhérence des basophiles aux cellules

endothéliales, mais l'action de l'IL-3 se situe sur les récepteurs des

basophiles et non sur ceux des cellules endothéliales (BOCHNER et coll.,

1990).· Par contre, BRIZzr et coll. (1993) ont démontré récemment que l'IL-3

augmente l'adhérence des neutrophiles et des lymphocytes aux HUVEC par

l'induction de l'expression des récepteurs E-sélectine.

24

v. LE PHÉNOMÈNE DE "ROSETTING"

Certaines hématies sont capables d'adhérer ill vitro à des hématies

parasitées en formant des rosettes. Ce phénomène, encore appelé "rosetting"

(R+), a d'abord été décrit pour P. fragile puis pour P. [alciparum (DAVID et

coll., 1988; HANOUNNElTI et coll., 1989; UOOMSANGPETCH et coll., 1989b). Le

rôle présumé des rosettes est de faciliter l'invasion des hématies saines par

des mérozoïtes et de former des agglutinats au cours de l'accès pernicieux.

Les phénomènes de cytoadhérence et de "rosetting" partagent beaucoup de

caractéristiques biologiques, ce qui a amené certains auteurs à conclure à

l'interaction entre ces deux phénomènes au cours de l'accès pernicieux

(WAHLGREN et colL, 1989). En effet, seules les hématies parasitées par des

trophozoïtes âgés ou des schizontes sont capables de former des rosettes, et le

phénomène de "rosetting" n'intéresse que les espèces plasmodiales (P.

falciparum et P. fragile) capables d'adhérer, contrairement à P. vivax et P.

cynomolgi qui ne forment pas des rosettes et n'adhèrent pas (HANOUNNElTI

et colL, 1989). La splénectomie réduit la cytoadhérence et la formation de

rosettes (DAVIO et coll., 1988). Les deux phénomènes sont sensibles au pH

(effet optimal pour un pH acide), Ca" dépendants, sensibles au traitement

par l'héparine, la trypsine et les protéases (CARLSON et coll., 1990a; CARLSON

et coll., 1992; CRANOALL et coll., 1991; HOMMEL, 1990; TOURNEUR et coll., 1992;

UOOMSANGPETCH et coll., 1989b).

Comme le phénomène de cytoadhérence, le "rosetting" peu t être

inversé in vitro par des sérums et des immunoglobulines de sujets

prémunis (WAHLGREN et coll., 1990). Cependant, les antigènes plasmodiaux

potentiellement impliqués diffèrent dans les deux phénomènes : PfEMP-1

pour la cytoadhérence et les rosettines, 2 antigènes de 22 et 28 kD qui

présentent des réactions croisées avec PfHRP-1, pour le "rosetting"

(CARLSON et colL, 1990b; HELMBY et coll., 1993). Les sérums d'enfants atteints

d'accès pernicieux n'inhibent pas in vitro la formation de rosettes,

contrairement aux sérums d'enfants présentant des accès palustres simples

(CARLSON et coll., 1990a; TREUTIGER et coll., 1992).

La formation des rosettes se fait préférentiellement avec des hématies

du groupe A ou B par rapport au groupe 0 (CARLSON et WAHLGREN, 1992;

UOOMSANGPETCH et coll., 1993). Ces données peuvent être mises en relation

avec la protection relative de l'accès pernicieux chez tes sujets du groupe 0

(HILL, 1992). CARLSON et WAHLGREN (1992) ont démontré que les antigènes

25

des groupes sanguins A et B sont des récepteurs spécifiques mais pas

exclusifs intervenant dans la formation des rosettes, des constituants de

l'héparine semblent également intervenir.

Le rôle du récepteur CD36 a été démontré dans la formation des

rosettes. En effet, non seulement les hématies saines peuvent exprimer

CD36 (VAN SCHRAVENDIjK et coll., 1992), mais surtout des anticorps anti­

CD36 (OKM5, OKM8 et 8A6) peuvent inverser in vitro la formation de

rosettes et la cytoadhérence aux cellules de mélanome C32 (HANDUNNETII et

coll., 1992c). Néanmoins, la réversion par les anticorps anti-CD36 n'a été

observée que dans 10 %des cas.

26

VI. LES CYTOKINES DANS L'ACCÈS PERNICIEUX

1. Rôle dans le modèle expérimental Souris-P. berghei

L'importance des cytokines dans la survenue des troubles

neurologiques a été démontrée chez la Souris. GRAU et coll. (1986, 1987a,

1987b, 1988, 1989a, 199Db, 1991) ont utilisé des souris CBA/Ca infectées par

des souches de P. berghei ANKA. Ces souris sont génétiquement capables de

développer une symptomatologie neurologique et décèdent 6 à 14 jours

après l'infection par P. berghei. GRAU et coll. (1986) ont démontré que les

lymphocytes L3T4+ helper (CD4+) sont indispensables au développement des

lésions neurologiques. L'administration d'anticorps anti-Lô'Td" empêche

l'apparition de signes neurologiques. Des souris CBA/ Ca thymectomisées et

irradiées ne développent pas d'atteinte cérébrale. Le transfert de

lymphocytes L3T4+ de souris décédées de lésions neurologiques à des souris

infectées par P. berghei accélère l'évolution de la maladie. Parallèlement

GRAU et coll. (l987b) ont démontré que la cyclosporine à la dose de 1

mg/kg/j pendant 5 jours prévient l'apparition des troubles neurologiques

ainsi que l'administration d'anticorps anti-LFA-1, le ligand d'ICAM-1

(FALANGA et BUTCHER, 1991; GRAU et coll., 1991).

L'activation des lymphocytes T induit la sécrétion d'IT...-3, de GM-CSF

et d'IFN-y qui augmentent le nombre de macrophages et stimulent leur

activité. Des études histo-pathologiques ont en effet mis en évidence, chez la

Souris, une accumulation de macrophages au niveau des capillaires

cérébraux. Ces macrophages activés peuvent sécréter du TNF-a qui induit de

nombreuses modifications au niveau des cellules endothéliales, entre

autres, la sécrétion d'IL-1 et de GM-CSF. Le TNF-a est capable de réguler sa

propre sécrétion et, par un mécanisme d'auto-amplification, provoque

l'accumulation et la séquestration de macrophages au niveau des capillaires,

créant une hypersécrétion de TNF-a (GRAU et coll., 1987a). Le taux sérique de

TNF-a chez la Souris CBA/ Ca infectée par P. berghei et développant des

signes neurologiques, est supérieur à celui observé chez la Souris ne

développant pas de symptomatologie neurologique. Une injection

d'anticorps anti-TNF, 4 à 7 jours après le début de l'infestation, protège les

souris CBA/Ca vis-à-vis de lésions neurologiques.

GRAU et colL (1988) ont aussi montré l'importance de l'IL-3 et du GM­

CSF. L'injection simultanée d'anticorps anti-IL-3 et anti-GM-CSF prévient,

27

chez 80% des souns CBA/ Ca infectées, l'élévation du taux de TNF-a,

l'accumulation de macrophages dans la rate et les ganglions lymphatiques et

l'apparition de signes neurologiques. Cependant, l'injection isolée de l'un

ou de l'autre des anticorps n'a aucun effet protecteur.

L'implication de l'IFN-y a été démontrée par la prévention des

troubles neurologiques et de l'hyperproduction de TNF-a par l'injection,

chez la Souris, d'anticorps monoclonaux anti-IFN-y. Ce traitement par

anticorps monoclonaux n'a cependant pas d'effet sur l'augmentation du

nombre de macrophages spléniques et ganglionnaires (GRAU et coll., 1989a).

De faibles doses de IL-1-a ou IL-1-~ injectées à des souris parasitées par

P. berghei évitent l'apparition de troubles neurologiques ainsi que

l'élévation de la parasitémie (CURFS et coll., 1990).

Contrairement aux autres cytokines, l'IL-6 n'est pas impliquée dans la

survenue des troubles neurologiques mais est vraisemblablement un

médiateur dans l'hypergammaglobulinémie de l'infection palustre. Une

élévation marquée du taux d 'IL-6 est décelable dans le sérum de souris

infectées par P. berghei, et l'injection d'anticorps monoclonaux anti-IL-6 4

jours après l'infestation prévient de manière significative l'élévation des

taux d'IgG mais pas d'IgM au jour 7 (GRAU et coll., 1990b).

2. Concentrations plasmatiques chez l'Homme infecté par P. falciparum

Plusieurs études ont rapporté une élévation de la concentration

plasmatique des cytokines, que ce soit au cours d'un accès simple ou sévère

dû à P. falciparum (nous ne parlerons pas dans ce chapitre des infections par

d'autres espèces plasmodiales chez l'Homme) :

2.1. Le TNF-a

L'élévation du TNF-a au cours des parasitoses et en particulier au

cours du paludisme a été décrite par SCUDERI et coll. (1986). La relation entre

l'augmentation du TNF-a et la rupture des schizontes a été rapportée par

KWIATKOWSKI et coll. (1989). ln vitro, la stimulation des monocytes et des

macrophages humains par des antigènes bruts ou purifiés de P. falciparum

induisent la sécrétion de TNF-a qui peut être inhibée par la chloroquineet

la pentoxifylline (BATE et coll., 1988; PICOT et coll., 1990; PICOT et coll., 1991;

28

PRADA et coll., 1993; TAVERN E et coll., 1990a; TAVERN E et coll., 1990b). La

relation entre sévérité de l'accès palustre et concentrations élevées de TNF-a

a été décrite dans plusieurs études:

• GRAU et coll. (1989c) ont dosé le TNF-a dans le sérum et le LCR de

65 enfants malawites présentant des troubles de la conscience et/ ou des

vomissements. Sur les 65 enfants, 53 ont évolué favorablement, 10 sont

décédés et 2 ont gardé des séquelles neurologiques. Le taux moyen de TNF-a

chez 38 enfants était de 148 ± 25 pg/ml au moment de l'accès et de 15,7 ± 3

pg/ml 1 mois plus tard. Chez les 10 enfants devant décéder au cours de

l'hospitalisation, le taux moyen était supérieur (709 ± 312 pg/ml) par rapport

à celui des 55 autres enfants (184,7 ± 31,5 pg/ ml). GRAU et coll. ont montré

que le taux de TNF-a était un facteur pronostique; il existe en effet une

corrélation inverse entre le taux sérique et le délai du décès. Le taux dans le

LCR chez 17 enfants était de 22,1 ± 5,4 pg/ml;

• une deuxième étude au Malawi, effectuée chez 133 enfants, a

confirmé que le taux de TNF-a était supérieur chez les enfants présentant

une altération de la conscience par rapport aux enfants sans complication

neurologique. De plus, il existe une corrélation entre la profondeur du coma

et les taux de TNF-a (GRAU et coll. 1990a; MOLYNEUX et coll., 1991);

• KWIATKOWSKI et coll. (1990) ont comparé le taux de TNF-a chez 288

enfants gambiens, 110 ont été hospitalisés pour accès pernicieux dont 28

devaient décéder, et 178 ont présenté un accès palustre simple à P.

jalciparum. Le taux était 2 fois supérieur chez les 110 enfants et 10 fois

supérieur chez les 28 décès par rapport aux 178 enfants ne présentant pas de

complication.

Mais l'élévation importante du TNF-a ne semble pas être spécifique

de l'accès pernicieux, les taux pouvant augmenter lors de toute

manifestation d'un paludisme sévère, comme l'attestent des études menées

en Gambie, au Zaïre et chez des voyageurs européens atteints d'un

paludisme sévère (troubles de la conscience, insuffisance rénale, anémie

sévère, atteinte hépatique, trouble de la coagulation et atteinte pulmonaire)

(HEMMER et coll., 1991; KERN et coll., 1989; KWIATKOWSKI et coll., 1989;

SHAFFER et coll., 1991).

Les concentrations plasmatiques et rachidiennes de TNF-a sont plus

élevées chez des patients présentant une ataxie cérébelleuse séquellaire par

rapport à des sujets ne présentant pas de séquelles (DE SILVA et coll., 1992).

29

Les concentrations plasmatiques de TNF-a sont en relation avec de

nombreux facteurs cliniques et biologiques indicateurs de gravité, la

température (BUTCHER et coll., 1990; GRAU et coll., 1990a), la parasitémie

(BUTCHER et coll., 1990; GRAU et coll., 1989c; GRAU et coll., 1990a; HEMMER et

coll., 1991; KERN et coll., 1989; KWIATKOWSKI et coll., 1990; MOLYNEUX et

coll., 1991; MSHANA et coll., 1991; SHAFFER et coll., 1991), la concentration de

lactate (GRAU et coll., 1990a), et inversement liées avec le nombre de

plaquettes (HEMMER et coll., 1991), la glycémie (GRAU et coll., 1989b; GRAU et

coll., 1990a; KWIATKOWSKI et coll., 1990; SHAFFER et coll., 1991)/ le taux

d'hémoglobine (SHAFFER et coll., 1991) et l'âge (GRAU et coll., 1989c;

MSHANA et coll., 1991; SHAFFER et coll., 1991).

La lymphotoxine ou TNF-~ partage beaucoup de fonctions avec le

TNF-a mais est sécrétée de manière prédominante par les lymphocytes T. La

lymphotoxine est également augmentée au cours du paludisme, mais les

concentrations ne sont pas corrélées à celles du TNF-a (CLARK et coll.,

1992a).

2.2. L'IL-6

Les concentrations plasmatiques élevées d'IL-6 ont aussi été

considérées comme facteur de gravité au cours du paludisme (KERN et coll.,

1989; MOLYNEUX et coll., 1991). Au cours de l'accès pernicieux, les

concentrations d'IL-6 sont plus élevées chez les enfants qui décéderont au

cours de la maladie ou qui garderont des séquelles (COT, données non

publiées). Comme pour le TNF-a, les concentrations plasmatiques et

rachidiennes d'IL-6 sont plus élevées chez des patients présentant une ataxie

cérébelleuse séquellaire par rapport à des sujets ne présentant pas de

séquelles (DE SILVA et coll., 1992). De plus, les concentrations d'IL-6 sont

corrélées à celles du TNF-a (CLARK et coll., 1992a; DE SILVA et coll., 1992;

KERN et coll., 1989; MOLYNEUX et coll., 1991; MSHANA et coll., 1991) et à la

parasitémie (KERN et coll., 1989; MSHANA et coll., 1991; TABONE et coll.,

1992).

2.3. L'IL-2

L'IL-2 joue un rôle essentiel dans la régulation de la réponse

immune, mais nécessite pour son action la présence de son récepteur

30

spécifique (IL-2R) sur la surface des cellules cibles. L'IL-2R peut se trouver

sous forme soluble dans le plasma et dans les urines et représente un

témoin de l'activation des cellules immuno-compétentes en particulier les

lymphocytes.

Les concentrations d'IL-2 sont abaissées au cours de l'accès palustre

(KREM5NER et coll., 1990). Les concentrations plasmatiques et rachidiennes

d'IL-2 sont plus élevées chez des patients présentant une ataxie cérébelleuse

séquellaire par rapport à des sujets ne présentant pas de séquelles (DE SILV A

et coll., 1992).

L'augmentation de l'IL-2R sous forme soluble a été observée dans les

parasitoses et dans le paludisme par JOSIMOVIC-ALA5EVIC et coll. (1988), puis

par Ho et coll. (1988), par DELORON et coll. (1989) et par KREM5NER et coll.

(1990) au cours des accès à P. falciparum et P. vivax. Les concentrations d'IL­

2R sont corrélées à la parasitémie et inversement corrélées à l'âge

(CHUMPITAZI et coll., 1990; KREM5NER et coll., 1990; RILEY et coll., 1993). Alors

que les concentrations d'IL-2R sont plus élevées chez les sujets non

prémunis par rapport aux sujets prémunis, l'inverse est observé pour les

concentrations d'IL-2 (KREMSNER et coll., 1990). Les concentrations dTL-2R

sont plus élevées chez des enfants zaïrois (n=14) présentant un accès

pernicieux (moyenne géométrique d'IL-2R = 6470 U 1ml) par rapport aux

enfants sans complications (n=60) (moyenne géométrique d'IL-2R = 3608

Ulml) (NGUYEN-DHIN et GREENBERG, 1988). A l'inverse, des enfants

présentant le trait drépanocytaire (Hb AS) ont des concentrations d 'IL-2R

plus basses que des enfants normaux (Hb AA) au cours d'un accès palustre

(ABU-ZEID et coll., 1992).

2.4.IL-l

Les résultats obtenus concernant l'IL-1 sont contradictoires. L'IL-1

existe sous 2 formes, une forme essentiellement membranaire, l'IL-1-a, et

une forme sécrétée et circulante, l'IL-1-~ (CONLON et coll., 1987).

KWIATKOWSKI et coll. (1990) ont rapporté que les concentrations d'IL-1-a

étaient corrélées avec la gravité de la maladie et avec les concentrations de

TNF-a et d'IFN-y. A l'inverse, aucune augmentation n'a été observée chez

des adultes présentant un accès simple au Brésil, dans les Iles Salomon, au

cours d'infestation expérimentale chez l'Homme ou chez des enfants

présentant un accès pernicieux au Malawi ou au Burundi (ALVES et coll.,

31

1992; BUTCHER et coll., 1990; DELORON, données non publiées; HARPAZ et

coll., 1992, Mo Ly NEUX et coll., 1991). Contrairement à l'IL-1-a, les

concentrations d'IL-1-J3 sont augmentées au cours d'un accès simple et sont

corrélées avec la parasitémie (MSHANA et coll., 1991).

2.5. L'IL-S

L'élévation de l'IL-8 a été rapportée au cours d'accès sévères avec une

persistance de l'augmentation pendant la période de convalescence

(FRIEDLAND et coll., 1993).

2.6. L'IFN-y

Au cours d'un accès simple ou permcleux à P. falciparum, les

concentrations plasmatiques d'IFN-y ne sont pas augmentées (BUTCHER et

coll., 1990; KREMSNER et coll., 1989; MOL YNE UX et coll., 1991) ou sont

faiblement élevées avec un retour rapide à la normale dans les 24 heures

(BROWN et coll., 1990; GRAU et coll., 1990a). Les concentration d'lFN-y sont

corrélées avec celles du TNF-a et de l'IL-1-a et inversement corrélées à l'âge

(KWIATKOWSKI et coll., 1990; MSHANA et coll., 1991). L'augmentation des

concentrations d'IFN-y n'est pas liée à la gravité de la maladie (KERN et coll.,

1989; KWIATKOWSKI et coll., 1990) et des concentrations modérément

élevées en. dehors de toute infection palustre semblent protéger de la

survenue d'un éventuel accès palustre en zone d'endémie (DELORON et

coll., 1991).

2.7. La néoptérine

La néoptérine est un métabolite de la guanosine triphosphate sécrétée

par les macrophages activés en particulier par l'IFN-y (HENDERSON et coll.,

1991). Les concentrations urinaires (BROWN et coll., 1990; REIBNEGGER et

coll., 1987) et plasmatiques (KERN et coll., 1989; KREMSNER et coll., 1989;

PEYRON et coll., 1991; PICOT et coll., 1993) sont augmentées au cours du

paludisme mais sont moins élevées chez des sujets prémunis par rapport

aux sujets non prémunis. Les concentrations urinaires ou plasmatiques sont

corrélées avec la parasitémie, la température et la concentration de TNF-a

ou d'IL-6 (BROWN et coll., 1990; KERN et coll., 1989; KREMSNER et coll., 1989)

et inversement corrélées avec l'âge (RElBNEGGER et coll., 1987).

32

2.8. L'IL-IO

Des études récentes ont suggéré le rôle régulateur de l'IL-ID dans

certaines maladies parasitaires. Ainsi, l'IL-ID inhibe l'action des

macrophages activés par l'IFN-y contre les formes intra-cellulaires de

Toxoplasma gondii, Trypanosoma cru zi et Leishmania major et les

schistosomules de Schistosoma mansoni. L'action de l'IL-ID est liée à une

inhibition de la sécrétion des radicaux NO. De plus, les souris

génétiquement susceptibles à une infestation par Trypanosoma cruzi

produisent de l'IL-ID contrairement aux souris génétiquement résistantes.

(MOORE et coll., 1993).Ces résultats nous ont amené à étudier l'importance

de l'IL-ID au cours de différentes formes cliniques de paludisme d'autant

qu'aucun travail n'avait été effectué auparavant dans ce domaine.

33

(SlUJElS El MÉlHODES )

I. OBJECTIFS

L'objectif global de notre travail a été d'étudier certains aspects des

mécanismes et des interactions cellulaires intervenant dans la

physiopathologie de l'accès pernicieux. En raison de son implication

probable dans le développement de l'accès pernicieux, nous avons choisi

d'étudier le phénomène de cytoadhérence à l'aide de plusieurs modèles in

vitro. L'implication également probable des cytokines nous a amené à

rechercher l'influence des cytokines sur le phénomène de cytoadhérence.

Enfin, afin de compléter les résultats in vitro, nous avons mesuré les

concentrations plasmatiques de cytokines chez des sujets atteints d'accès

palustres à P. falciparum dans différentes situations cliniques.

Nous avons essayé de répondre à cet objectif :

• en comparant plusieurs modèles cellulaires de cytoadhérence in

vitro en fonction de l'expression de leurs récepteurs;

• en étudiant les capacités d'adhérence in vitro d'isolats de P.

falciparum prélevés chez des sujets présentant des accès palustres de gravité

différente et en recherchant une relation avec d'autres facteurs de virulence;

• en étudiant l'influence des cytokines (en particulier les cytokines

intervenant dans le modèle murin) sur la cytoadhérence d'isolats de P.

falciparum;

• en mesurant les concentrations plasmatiques de cytokines chez des

sujets présentant des accès palustres dans le but de rechercher:

- une relation entre les concentrations plasmatiques des cytokines et la

gravité de la maladie;

- des relations entre les différentes cytokines et certains facteurs

biologiques marqueurs de gravité;

- l'évolution des concentrations plasmatiques des cytokines au cours

de la maladie;

- une relation entre les concentrations plasmatiques des cytokines et le

statut immunitaire des malades.

Pour réaliser notre étude, nous avons été amenés à recruter des

malades, en particulier des sujets atteints d'accès pernicieux. Nos travaux

ont débuté dans le laboratoire de Parasitologie (Pr. SAVEL - Dr. LE BRAS) et le

recrutement dans le Service de Maladies Infectieuses et Tropicales (Pr.

COULAUD) et dans le Service de Réanimation Infectieuse (Pr. VACHON) du

groupe hospitalier Bichat-Claude Bernard. Dans un deuxième temps, nous

35

avons souhaité poursuivre notre étude sur le terrain, à Madagascar. Ce

choix a été motivé, d'une part, par les possibilités d'accueil dans un

laboratoire convenablement équipé à l'Unité de Recherche sur le Paludisme

(Dr. LEPERS) de l'Institut Pasteur de Madagascar (pr. ROUX) et, d'autre part,

par le caractère particulier de transmission du paludisme. En effet, après

avoir quasiment disparu de la région des Hauts Plateaux malgaches, le

paludisme à P. falciparum est réapparu de façon épidémique en 1986-1987,

entraînant plusieurs milliers de morts souvent par accès pernicieux, tant

chez les adultes que chez les enfants. Le recrutement des malades a été

effectué à Antananarivo, la capitale, et à Ankazobe. A Antananarivo, deux

hôpitaux ont participé à l'étude, le service de Réanimation (Dr. MARSAN) et

de Pédiatrie (Dr. CANDITO) de l'hôpital militaire et le service de Maladies

Infectieuses (Dr. RA KOTO MAL ALA) et le service de Pédiatrie (Pr.

RAZANAMPARANY) de l'hôpital de Befelatanana. Ankazobe est un village

situé à 100 km au nord-ouest de la capitale, qui dispose d'un hôpital et d'un

dispensaire où l'Institut Pasteur avait détaché un médecin en permanence.

Notre étude a été complétée grâce à la collaboration de l'INSERM U13 (Dr.

DELORON) qui avait entrepris une étude sur les accès pernicieux au Burundi.

36

II. SUJETS

Les sujets inclus dans l'étude ont répondu aux critères de diagnostic

de l'accès pernicieux et de l'accès sévère à P. falciparum élaborés par l'O.MS.

(1990), et ont été répartis en 3 groupes selon la gravité de la maladie:

• Groupe 1 accès pernicieux: sujets hospitalisés pour accès palustre à

P. [alciparum avec une parasitérnie supérieure à 1 % et développant un

accès pernicieux. Il s'agit d'un corna profond dont les autres étiologies ont

été exclues et persistant plus de 30 minutes après une crise convulsive afin

d'éliminer un corna post-critique. La profondeur du corna est définie par

l'absence de réponse ou une réponse inadaptée à une stimulation

douloureuse.

• Groupe 2 accès sévères: sujets hospitalisés pour accès palustre à P.

falciparum avec une parasitémie supérieure à 1 % et développant une

forme sévère, ce qui correspond selon l'O.MS. à la survenue de l'un des

symptômes suivants :

· anémie sévère (Hb < 5 g]dl)

· insuffisance rénale (créatininémie > 265 umol Zl)

· hypoglycémie (glycémie < 2,2 mmol/ 1)

· collapsus circulatoire (TA < 70 mmHg)

· saignement spontané et!ou CIVD

· convulsions généralisées répétées

· troubles de la conscience, prostration

· ictère (bilirubine totale> 50 umol/ l)

• Groupe 3 accès simples: sujets consultant ou hospitalisés pour accès

palustre à P. falciparum avec une parasitémie supérieure à 1 % et ne

développant pas de forme sévère, en particulier pas de signes neurologiques.

Tous les sujets ont été traités par la chloroquine, par l'halofantrine ou

par la quinine seule ou en association à une eycline aux doses standards.

37

III. MATÉRIEL

1. Les cellules endothéliales

Les cellules endothéliales sont obtenues à partir de cordons

ombilicaux humains suivant la méthode de JAFFE et coll. (1973) et de

. GIMBRONE et coll. (1974). Les cordons sont récupérés à partir des placentas,

après l'accouchement, et placés dans un récipient stérile contenant une

solution tampon (NaCI 0,8 g/l, Na2HP04.2H20 0,1 g/l, KCI 0,3 g/l, KH2P04

0,02 g/l, glucose 2 g/l) additionnée de pénicilline (100 UI/ml) et de

streptomycine (100 f.lg/ml). Les cordons sont conservés, à +4°C moins de 3

jours avant la récupération des cellules endothéliales. Trois cordons au

moins, de plus de 15 cm, sont utilisés à chaque manipulation, dans le but

d'obtenir un mélange suffisamment hétérogène de cellules endothéliales

assurant la reproductibilité des tests de cytoadhérence avec des isolats

parasitaires différents.

Avant la manipulation, les cordons sont inspectés et les extrémités

ischémiées sont excisées. La veine ombilicale est cathétérisée par une canule

à bout olivaire (CARRIÉRI MÉDICAL) fixée à l'aide d'une ligature. La veine est

rincée avec 50 ml de solution tampon afin d'éliminer le sang, avant d'être

cathétérisée à l'autre extrémité par une canule similaire et rincée une

seconde fois avec 50 ml de solution tampon. Dix ml de solution de

collagénase grade II de Closiridium histolvticum (BOEHRINGER MANNHEIM)

diluée à 10 % dans de la solution tampon sont injectés, par une aiguille,

l'autre extrémité étant montée sur une seringue de 2 ml. Le cordon ainsi

préparé est plongé pendant 15 minutes dans une solution de chlorure de

sodium 0,9 %préchauffée à 37°C. La veine ombilicale est ensuite rincée avec

30 ml de solution tampon. Les 10 ml de collagénase et les 30 ml de solution

tampon contenant les cellules endothéliales sont recueillis dans 10 ml de

milieu de culture E199 (FLOW) enrichi à 20 % de sérum de veau foetal

inactivé (INTERMED). Les cellules sont isolées par centrifugation à 1200

t/ minute pendant 5 minutes. Les culots de cellules endothéliales récupérés à

partir des cordons d'une manipulation sont mêlés, lavés et centrifugés. Le

culot global est placé dans 5 ml de milieu de culture E199 avec 20 % de

sérum de veau foetal inactivé, 2 mM de glutamine (FLOW), 15 mM de

NaHC03 (FLOW), 15 mM d'HEPES (acide hydroxy-éthyl-pipérazine-éthane­

sulfonique) (SIGMA) et des antibiotiques (pénicilline 100 Ur/ml et

streptomycine 100 ~g/mI). Les cellules endothéliales sont alors cultivées

jusqu'à confluence dans un flacon de 25 cm2 PRIMARIA® (FALCON)

spécialement traité pour la croissance rapide de cellules (KLEI N-SOYER et

coll., 1989), en couche monocellulaire dans une atmosphère de 5 r;:, de C02

dans l'air à 37°C et 95 % d'humidité.

Pour obtenir une sous-culture, les cellules endothéliales arrivées à

confluence sont lavées avec du PBS sans Ca"t ni Mg" " (BIOMÉRIEUX) puis

sont traitées par un mélange EDTA 0,02 %-trypsine 0,5 % (BIOMÉRI EUX)

pendant 3 minutes. Les cellules ainsi récupérées sont lavées puis distribuées

dans des puits de culture de 16 mm de diamètre (boîte de culture FALCON 24

puits) dans 500 !-lI de milieu de culture à raison de 2x1Q4 à 4x1Q4 cellules par

cm2. Les puits de culture contiennent une lamelle THERMANOX® 15 mm de

diamètre (NUNC) prétraitée par de la fibronectine d'origine humaine (2

!-lg / cm/) (SIGMA). L'utilisation de sous-culture, de fibronectine et de lamelles

ne modifie pas les résultats des tests de cytoadhérence (SHERMAN et VALDEZ,

1989). Les sous-cultures sont maintenues jusqu'à confluence dans les

mêmes conditions que les primo-cultures.

2. Les cellules de mélanome amélanique C32

Les cellules de mélanome amélanique C32 (désignation CRL 1585 à

l'American Type Culture Cells) sont maintenues en culture dans les mêmes

conditions que les HUVEC dans du milieu RPMI 1640 (GIBCO) à 10 % de

sérum de veau foetal inactivé. Pour le test de cytoadhérence, les cellules sont

traitées par de l'EDTA 0,02%pour être distribuées dans des puits de culture

comme pour les cellules endothéliales à raison de 2x104 cellules par cm-.

Après 48 heures de culture, les cellules sont fixées avec 1 % de formol

pendant 1 heure et stockées dans du PBS à +4°C jusqu'au moment du test de

cytoadhérence (UDEINYA et coll., 1985)

3. Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary)

Des cellules CHO (gracieusement fournies par RJ. Ho W AR0)

transfectées par le gène du récepteur CD36 et rCAM-1 ont été utilisées, ainsi

que des cellules non transfectées comme témoin. Les cellules CHO sont

maintenues en culture dans les mêmes conditions que précédemment dans

du milieu RPMI 1640 à 10 % de sérum de veau foetal inactivé, et distribuées

à raison de 2x104 cellules par cm2 pour le test de cytoadhérence. Après 24

heures de culture, les cellules sont soit fixées et stockées dans les mêmes

39

conditions que les cellules de mélanome, soit utilisées immédiatement pour

le test de cytoadhérence.

4. Les parasites

Dix ml de sang veineux (5 ml pour les enfants) sont prélevés chez les

sujets inclus dans l'étude, sur acide citrique dextrose (ACD) et le culot

globulaire est lavé 3 fois avec du milieu RPMI 1640. Une partie des hématies

contenant les hématies parasitées est immédiatement utilisée, le cas

échéant, pour le test de chimiosensibilité in vitro à la chloroquine et à la

quinine. Le reste des cellules est réparti dans des tubes de cryoconservation

(NUNC) à volume égal avec une solution de cryoconservation (maruùtol 30

g/l, glycérol bidistillé 28 % (v/v), NaCI 6,5 g/l) ; ces tubes sont placés dans

l'azote liquide.

Pour le test de cytoadhérence et la formation de rosettes in vitro, les

hématies sont décongelées et lavées avec une solution hypertonique de

NaCI (35 g/l) puis 3 fois avec du milieu RPNII 1640. Les parasites sont mis en

culture selon la technique de TRACER et JENSEN (1976) pendant 24 à 40

heures jusqu'à l'obtention de trophozoïtes âgés et de schizontes nécessaires

à la réalisation du test de cytoadhérence (UOEINYA et coll., 1981) et de

formation de rosettes (UDOMSANCPETCH et coll., 1989b). Le milieu de

culture, RPMI 1640 tamponné par du bicarbonate (25 mNI) et par de l'HEPES

(25 mM) et supplémenté en sérum humain à 10 % et en glucose (2 g/l), est

changé toutes les 12 heures ou toutes les 24 heures en fonction de la

parasitémie.

5. Les cytokines

Quatre cytokines, le TNF-a, l'IL-6, l'IL-3 et le GM-CSF (GENZYME) sous

forme de protéine humaine recombinante sont utilisées pour étudier leur

influence sur la cytoadhérence in vitro. Les cytokines sont diluées dans du

PBS à 1 % de sérum-albumine bovine (MERCK-CLEVENOT), aliquotées et

congelées à -70°C. Le TNF-a, l'IL-3 et le GM-CSF sont utilisés aux dilutions

finales de 5, 10 et 20 ng/ ml, et l'IL-6 aux dilutions finales de 10, 50 et 100

ng/ml

40

IV. MÉTHODES

1. Test de cytoadhérence

Le milieu de culture des cellules ou le PBS, dans le cas des cellules

fixées, est aspiré et les cellules sont lavées 3 fois avec du milieu RPMI 1640.

Une suspension d'hématies parasitées par des trophozoïtes âgés ou des

schizontes de P. falciparutn, à un hématocrite de 4 ou 8 % dans 500 III de

RPMI 1640 à pH 6,9 contenant 10 % de sérum AB, est déposée sur les sous­

cultures de cellules. Les cellules sont incubées pendant 90 minutes dans une

atmosphère de 5 % de C02 dans l'air à 37°C et à 95 % d'humidité. Les

plaques sont agitées toutes les 30 minutes (MARSH et coll., 1988). Les tests

sont effectués à la parasitémie de décongélation ou à une parasitémie de 1 %dans le cas où les capacités d'adhérence des différents isolats sont comparées.

Après incubation, les lamelles sur lesquelles sont fixées ·les cellules sont

retirées du puits et plongées dans 3 bains de RPMI. Les cellules et les

éventuels globules rouges parasités adhérents (GRPA) sont fixés dans le

glutaraldéhyde à 2 % (SIGMA), et colorés au GIEMSA à 5 % pendant 30

minutes. Les lamelles THERMANüX® sont alors collées sur des lames en

verre pour la lecture au microscope optique objectif 100 x immersion.

Tous les tests sont effectués en double et le résultat final est représenté

par la moyenne des 2 tests. La lecture se fait de manière identique pour tous

les tests, à savoir lecture au milieu de la lamelle, et du haut vers le bas. Les

lamelles collées sur les lames en verre sont codées et lues en insu. Le

nombre de GRPA à 500 cellules cibles est déterminé et les résultats sont

exprimés en nombre de GRPA pour 100 ou 500 cellules cibles.

Une deuxième méthode de lecture des résultats par une technique de

comptage isotopique est aussi employée. Cette technique, précédemment

adaptée au test de cytoadhérence avec des cellules de mélanome, nécessite

l'incubation des hématies parasitées avec du milieu de culture contenant 3

~tCil ml [3HJhypoxanthine (AMERSHAM) pendant 24 heures (\VRIGHT et coll.,

1990). Le test est pratiqué dans les mêmes conditions que précédemment.

Après lavage, les lamelles sont placées dans des fioles contenant 2 ml de

liquide scintillant pour la lecture au compteur à scintillation.

41

2. Modulation de la cytoadhérence par les cytokines

Lorsque les sous-cultures de cellules endothéliales sont parvenues à

confluence, les cellules endothéliales sont stimulées pendant 24 heures par

la fll de solution contenant les cytokines isolées ou associées, aux différentes

concentrations préparées. Un test avec 10 ul de PBS à 1 % de sérum­

albumine bovine sert de test témoin. Les résultats sont exprimés en

pourcentage de modulation (PM) qui est établi de la manière suivante:

• pour la lecture optique

PM = (GRPA avec cytokine-GRPA avec sérum albumine)x100

GRPA avec sérum albumine

• pour la lecture isotopique

PM = <Cpm avec cytokine-cpm témoin)x100

cpm témoin

Le seuil de significativité du pourcentage de modulation est fixé à >

+50 ou < -50 (SINCHet coll., 1988).

3. Test de formation de rosettes

Dix ul de milieu de culture contenant des hématies parasitées par des

trophozoïtes âgés ou des schizontes de P. falciparum sont mélangés avec de

l'acridine orange à 0,001 % et placés entre lame et lamelles (22 x 22 mm). La

lecture du test est effectuée en microscope optique objectif 40 x en lumière

incidente ultra-violette. Sont considérées comme rosettes les hématies

parasitées ayant fixé au moins 2 hématies non parasitées. Le taux de

formation de rosettes pour chaque isolat est exprimé par le nombre

d'hématies parasitées ayant formé des rosettes pour 100 hématies parasitées

par des trophozoïtes ou des schizontes (UDOMSANGPETCH et coll., 1989b).

Tous les tests sont effectués en double à la parasitémie de décongélation.

4. Test de chimiosensibilité in vitro

Le test de chimiosensibilité des isolats de P. [alciparu m à la

chloroquine et à la quinine est pratiqué suivant la version isotopique du

semi-microtest (LE BRAS et coll., 1984; LE BRAS et DELORON, 1983). Après

lavage, les hématies sont mises en suspension à un hématocrite de 2,5 %dans du RPMI 1640 tamponné par du bicarbonate (25 rnM) et par de l'HEPES

42

(25 mM) et supplémenté en sérum humain à 10 %. La suspension contenant

les hématies parasitées est distribuée à raison de 700 u l par puits dans des

plaques de 24 puits contenant des concentrations croissantes de chloroquine

ou de quinine préparées à l'avance, puis incubée pendant 42 heures dans

une atmosphère de 5 % de C02 et de 5 %de 02 dans l'air à 37°C et à 95 %d'humidité. Après 18 heures de culture, 1 u.Ci [3H]hypoxanthine est ajoutée

dans chaque puits pour mesurer le taux de croissance des parasites. A la fin

de la période d'incubation, les plaques sont congelées et décongelées afin

d'obtenir la lyse des hématies. Le contenu de chaque puits est récupéré sur

des disques de papier filtre qui sont séchés et placés dans des fioles contenant

1,5 ml de liquide scintillant pour lecture.

Les résultats sont exprimés en concentration inhibitrice 50 % (Clso)

calculée à partir d'une courbe de régression semi-logarithrnique. Le seuil de

résistance est fixé à 100 nM pour la chloroquine et à 450 nM pour la quinine.

5. Dosage des cytokines plasmatiques

Dix ml de sang veineux (5 ml pour les enfants) sont prélevés sur

EOTA et, après centrifugation, le plasma est aliquoté et congelé à -70°C. Les

prélèvements sont effectués systématiquement à l'admission. Pour certains

malades, un suivi est pratiqué toutes les 8 heures pendant 48 heures avec un.

contrôle à ]7. Pour d'autres malades, le suivi consiste en un prélèvement à

JO, JI, le premier jour de négativation de la parasitémie et ]7.

Les concentrations plasmatiques des cytokines et de la néoptérine sont

mesurées en utilisant des kits commerciaux selon les instructions du

fabricant, excepté pour l'IL-lO. Les concentrations de TNF-a et de néoptérine

sont déterminées par des tests immunoradiométriques (RIA) (MEDGÉNIX et

NEOPTERIN RIACIO HENNING, respectivement). Le seuil de détection pour le

TNF-a est de 6 pg/ml. Un test ELISA est utilisé pour l'IL-6 (AMER5HAM),

l'IL-3 (AMER5HAM), l'IL-2R (IMMUNOTECH), l'IL-1-a (GENZYME), le GM-CSF

(GENZYME), et l'IFN-y (HOLLAND BIOTECHNOLOGY BV et GENZYME). Le seuil

de sensibilité est de 3,1 pg/ml, 7,4 pg/ml, 12,5 pM (= 525 pg/ml = 100 U/ml),

15 pg/ml, 4 pg/ml, 100 pg/ml (= 2,5 U/ml), respectivement.

Pour l'IL-10, un test ELISA est pratiqué utilisant 2 anticorps,

l'anticorps monoclonal de Rat 907 préalablement fixé dans les puits et

l'anticorps monoclonal 12GB de Rat marqué à la biotine. Le seuil de

43

sensibilité est de 100 pg/ ml. Pour éliminer des valeurs faussement positives

dues à des facteurs rhumatoïdes, un deuxième anticorps monoclonal de Rat

non spécifique anti-IFN-y 827 est utilisé. Les plasmas présentant une

réaction positive avec cet anticorps ont été exclus.

Les plasmas de sujets sains européens (n compris entre 9 et 50),

malgaches (n=6) et burkinabés (n=43) sont utilisés pour déterminer les

concentrations normales. Tous les sujets vivant en zone d'endémie

présentent une goutte épaisse négative.

Pour des raisons statistiques, les plasmas présentant des taux

indétectables de cytokines ont été assignés d'une valeur égale à la moitié de

la valeur seuil, sauf pour l'IL-lD où la valeur seuil a été attribuée.

44

( R~SUllAlS )

Lors de nos travaux en France et à Madagascar, différents aspects de la

physiopathologie de l'accès pernicieux ont été abordés en particulier l'étude

des mécanismes et des interactions cellulaires intervenant dans la

physiopathologie de l'accès pernicieux. Les résultats ont fait l'objet de

publications incluses dans ce travail et qui concernent:

• la cytoadhérence d'isolats de P. falciparum sur différents modèles

cellulaires en fonction de la gravité de la maladie et les relations entre la

cytoadhérence et d'autres facteurs de virulence parasitaires (articles 1 et II);

• la modulation de la cytoadhérence d'isolats de P. falciparum sur des

HUVEC après stimulation par le TNF-a, l'IL-3, l'IL-6 et le GM-CSF (articles II

et III);

• le dosage des concentrations plasmatiques de TNF-a, d'IL-3, d'IL-6,

d'IL-2R, d'IL-I-a, d'IL-ID, de GM-CSF, d'IFN-y et de néoptérine en fonction

de la gravité de la maladie et de la prémunition des malades (articles II, IV etV).

Article I. Pascal RINGWALD, Béatrice DUBOIS, Jacques LE BRAS,

Philippe DELORON.

Plasmodium [alciparum : in vitro models of cytoadherence of

infected erythrocytes and an analysis with eight different

isolates on different target cells.

Experimental Parasitology, 1993, 76, 442-446.

Article II. Pascal RINGWALD, François PEYRON, Jean Paul LEPERS,

Patrick RABARISON, Charles RAKOTOMALALA, Marcel

RAZANAMPARANY, Meja RABODONIRINA, Jean ROUX,

Jacques LE BRAS.

Parasite virulence factors during falciparum malaria: rosetting,

cytoadherence and its modulation by cytokines.

Injection and lmmunitu, sous presse.

Article III. Pascal RINGWALD, Jacques LE BRAS, Jean SAVEL.

Participation des cytokines et des sérums immuns à la

cytoadhérence des hématies parasitées par Plasmodium

[alciparum sur des cellules endothéliales en culture.

Comptes Rendus des Séances de le Société de Biologie, 1992,

186,215-225.

46

Article IV. François PEYRON, Nicolas BURDIN, Pascal RINGWALD, Jean

Philippe VUILLEZ, Françoise ROUSSET, J a cq u e s

BANCHEREAU.

High levels of circulating IL-ID in human malaria.

Clinical and Experimental lmmunologu, soumis.

Article V. Pascal RINGWALD, François PEYRON, Jean-Philippe

VUILLEZ, Jean-Etienne TOUZE, Jacques LE BRAS, Philippe

DELORON.

Levels of cytokines in plasma during Plasmodium [alciparum

malaria attacks.

Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29, 2076-2078.

47

Etude de la cytoadhérence d'isolats de P. [alciparum sur différents

modèles cellulaires en fonction de la gravité de la maladie et des relations

entre la cytoadhérence et d'autres facteurs de virulence parasitaires (articles 1

et II).

• La première partie de notre travail avait pour objectifs spécifiques:

- d'étudier plusieurs modèles cellulaires de cytoadhérence in vitro en

fonction de l'expression de leurs récepteurs;

- d'étudier les capacités d'adhérence in vitro d'isolats de P. [alciparum

prélevés chez des su.jets présentant des accès palustres de gravité différente;

- et de rechercher une relation entre les capacités d'adhérence in vitro

et d'autres facteurs de virulence.

• Nous avons comparé l'adhérence d'hématies parasitées par 8 isolats

différents de P. falciparum sur 4 types cellulaires: les HUVEC exprimant

ICAM-l, les cellules de mélanome C32 exprimant CD36 et ICAM-l et des

cellules CHO exprimant spécifiquement soit ICAM-l (CHO-ICAM-l) soit

CD36 (CHO-CD36). Les 8 isolats ont été obtenus à partir de patients

hospitalisés à l'hôpital Bichat-Claude Bernard pour accès pernicieux (n == 2),

accès sévère (n = 2) ou accès palustre simple (n = 4).

Nous avons. montré que l'adhérence des hématies parasitées est plus

importante sur les cellules de mélanome que sur les cellules CHO-CD36 (p <

0,02), mais les résultats sont fortement corrélés (r' == 0,93; P = 0,01).

L'adhérence sur les HUVEC et les CHO-ICAM-l est comparable. L'adhérence

des hématies parasitées est plus importante sur les cellules exprimant CD36

(cellules de mélanome et CHO-CD36) que sur les cellules exprimant ICAM-l

(HUVEC et CHO-ICAM-l) (p < 0,02). L'adhérence sur des cellules CHO non

transfectées est négligeable et la fixation des cellules CHO par le formol à 1 %ne modifie pas leur pouvoir de fixation. Quel que soit le modèle cellulaire

utilisé, pour un isolat donné l'adhérence est fortement corrélée à la

parasitémie (article I) (PHOTOS 1 et 2).

• Après avoir montré que l'adhérence des hématies parasitées était

plus importante sur le récepteur CD36 que sur le récepteur ICAM-l, nous

avons comparé la capacité d'adhérence d'isolats de P. [alciparum en

fonction de la gravité de la maladie. Nous avons utilisé, d'une part, 21

isolats prélevés chez des sujets malgaches, les HUVEC et les cellules de

mélanome comme modèle cellulaire, et, d'autre part, 13 isolats prélevés

chez des sujets burundais, les cellules CHO-CD36 et CHO-ICAivf-1.

-+8

Aucune différence d'adhérence à parasitémie égale (l %) n'a été

observée sur les HUVEC et sur les cellules de mélanome entre les isolats

malgaches prélevés chez des patients présentant un accès simple (n = 9), un

accès sévère (n = 6) ou un accès pernicieux (n = 6). Nous confirmons que

l'adhérence sur les cellules de mélanome exprimant principalement CD36

est plus importante que sur les HUVEC exprimant ICAM-1 (p = 0,001)

(article II). De même, aucune différence d'adhérence à parasitémie égale (1

%) n'a été observée entre les 5 isolats d'accès pernicieux et les 8 isolats

d'accès simple du Burundi sur les cellules CHO-CD36 et les cellules CHO­

ICAM-l. L'adhérence (médiane; extrêmes) est également plus importante

sur les CHO-CD36 (75; 0-401) que sur les CHO-ICAM-1 (16; 0-65) (p = 0,005)

(données non publiées, cf. tableau).

accès pernicieux accès simple

(n=5) (n=8)

CHD-C036 75 94 N5

(33-120) (0-401)

CHD-ICMvI-1 16 16,5 N5

(0-23) (0-65)

• Bien que nous n'ayons pas trouvé de relation entre la capacité

d'adhérence des isolats et la gravité de l'accès palustre, nous avons

recherché, pour les 21 isolats malgaches, une relation entre leur capacité

d'adhérence sur HUVEC et sur cellules de mélanome, leur capacité à former

des rosettes in vitro et leur sensibilité à la chloroquine et à la quinine in

vitro, ces différents facteurs ayant été considérés comme des facteurs de

virulence pouvant être à l'origine d'un accès palustre grave. Contrairement

au phénomène de cytoadhérence, la capacité à former des rosettes varie en

fonction de la gravité de la maladie. Le pourcentage de formation de rosettes

est plus élevé pour les isolats d'accès pernicieux et d'accès sévère que pour

les isolats d'accès simple (p < 0,05). La capacité à adhérer varie en sens

inverse à la capacité à former des rosettes, mais la relation est non

significative (r' = -0,13 pour les HUVEC et r' = -0,18 pour les cellules de

mélanome). La sensibilité à la chloroquine et à la quinine ne varie pas en

fonction de la gravité et n'est pas liée à la capacité de cytoadhérence ou de

formation de rosettes (article II).

49

IJIHlt() 1 (y to.ld hl'rl'Ilcl· in vitro cil- g l\lb u ll'" rll ug l' s p.l r,l 'I les p.lr P fnh, pt/Ii l/ IIsur d es ccl lu lcs l' [l(Jll thé li.l1 l's d l' co rdons o m b i lic.iu v hu m a ins (1I L \ ' F<') (xlb()(1)

Pho to 2. ( ·y todd hé rl' rlCl' in vitro d l' g lllbu ll's ro uges pa ras ites p.lr P. fnlc/F(/t /lll1sur d es ce llu les (ï I( ) (Chi lll""(, l l.un s te r ( ) V,1f\ ' ) tr,ll1Sfl'd l' l'S par Il' gl' li l' d urécepteur CI noh I l, ( 0)

[XI'[IlIM[NTAL l'AItASITOLOGY 76,442-446 (1993)

RE8EARCH BRIEF

Plasmodium falciparum: ln Vitro Models of Cytoadherence ofInfected Erythrocytes and an Analysis with Eight Different

Isolates on Different Target Cells

PASCAL RINGWALD ... ·t· 1 I3ÉATRICE Dunois." JACQUES LE I3RAS.t

AND PHILIPPE DELORON"

"lnstltut National de la Saille' C'I de ln RI'c1,C'rcl,C' Mc'di('(/IC', Unité J3. JMEA. 75944 Paris, Frunce; andî Ccntrc National de Référence de ln Chimioscnslbilué du Paludisme; Hôpitul Bichat-Cluudr Bernard, 75877

and Laborutairc de Biologie Parasitaire, Université Paris V, " CII'C'1111C de l'Obsrrvatoirc, 75005 Paris, Frunce

RINGWALD. P.• DURais, B.. LE URAS, J.. AND Dr:LORON. P. 1993. Plasnuulinm [alci­p arum: JII vitro rnodcls of cytoudhcrcnce of infcctcd erythrocytes and an anulysis withcight different isolutcs on different tnrgct cclls. Expcrimcntol l'ara,l'i/oloJ;Y 76, 442­446. 0 I!I9J Aeudemie rre... Ine.

Cerebral malaria is Ihe most serions complication ofPlasmodium fulripurum infection. Red blood cells(RBC) infcctcd with mature forms of l'. fa lcipururu arc'scqucstcrcd within cerebral capillarics and postcnpil­lary vcnulcs hy adherence to cndothcliul cells(Mac Pherson C'/ al. 19R5). Scvcral laborutorics re­portcd that three putative rcceptors wcrc involvcd incytoadhcrcncc: thrornbospondin, CD36 (platclct gly­coprotcin l l lb or IV), and intcrccllular adhesion mol­ecule 1 (ICAM-Il or CD54 (Barn weil C'I al. 1989; Be­rendt C'/ al, 1989: Roberts C'/ al, 1985). Only post mor­lem histological studies can be done in hurnans. andanimal models arc either rare and costly or cxpcrirncn­lai lesions diITer from humans (Aikawa ct al. 1992).Suitablc target cells grown in vitro and ex pressingthèse rcccptors, such as C32 arnelanouc mclanornaccii. hurnan urnbilical vein endothelial ccII (H UV EC),human monocyte, and U937 rnyelornonocytic ccIIhave bccn used 10 study the cytoadherence mccha­nisrns (Udcinya 1990). Ali thcsc cells bind l'. fa/ci­pnrulll-parasilized RBC (PRBC) but diITer in biologicalcharactcristics and reccptor expression. HU V ECshow low-Icvcl basal ICAM-! expression (Sherman C'I

al. 1992) and lack CD36 (Swerlick C'I al. 1992). Mela­norua cells express both rcccptors, predominantlyCD36. Reccnrly, COS-7 and Chinese hamster ovary(CHO) cclls wcrc iransfcctcd with genes coding forCD36 or ICAM-I and arc potcntiul turgcts for cytoud­hercnce «(-(asler C'/ al. 1993). Wc cOlllpared the adher­ence of RBC infected wilh several J'. fa/cipartllll iso­laIes to C32. IIUVEC, and CI-IO cclls transfecled withCD36 or ICAM-! gene.

1 Currelll address: ORSTOM/OCEAC. BP 2R8.Yaoundé, Camcr('lon.

00 l,l-'I1'()·1!9~ S.~.(I()

c('ryrirhl t:'. IIN\ t,~ AC;IIil"rnic l'rC'\\. Inc.

Ali rirhl' ur ICI'I(.;hIClil'n in nnr C(Hm rC"C'r\'C'd.

l'. [alcipurum isolai es wcre obtuined from eighl pa­ticnts corning buck from Africa (Carucroon. Togo. Ni­ger. Ivory Coast. Scncgal, Guinca, Comoro) and pre­scnting with <1 malaria auack (parusitcrnia > 1'i;'). Clin­ical signs varicd from cerebral malaria (CM 1 andCM2). hcpatic dysfunction (SM 1), and obnubilntion(SM2) to unscvcre malaria (UM 1 to 4). RUC wcrcwashcd in RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Scotland) andstored in liquid nitrogcn, For cytoadhcrence icsting.RBC wcre thawcd , washcd in RPMI, and l'. fa/ci­p arum was culturcd ill vitro for 25 to 40 hl. Aftcr cul­turc. laie trophozoite s and schizonts rcprcscnicd>1l0% and rings <10% of ail Iorrns ,

HUVEC wcrc isolatcd and cullurcd as dcscribcd(JaITe C'/ al. 1973). Bricfly, at lcast thrcc hurnan umbil­ical cords wcre trcaicd with collugcnasc (1 mg/mil. andcells were culturcd 10 confluence in 25-cm~ Prirnariaflasks (Bccton-Dickinson, Lincoln Park. NJ) in EI99medium (Flow Lnborntorics. Irvinc, Scotland) wilh20% Ictal calf serum. 2 mM ghnuminc. 15 mM bicar­benate. !5 mM Hcpcs , 100 lU/mi penicillin, and 100~g/ml strcptoruycin. C32 cells (CRL 1585/CJ2r; Amer­icnn Type Culture Collection, Rock ville, MD) andCHO cells wcre maintaincd in RPMI with JO'/(, Ictulcalf serum. CHO cells transfcctcd wiih the genes en­coding CD~6 (CHO-CD36) and ICAM-I (CHO-ICAM­1) wcrc uscd (Huslcr C'I al. 1993): nontransfcctcd CliOcells wcre used as controls. For lesling. cells \\'eredelaehed wilh 0,(15<;;. trypsin--{l.02% EDTA and plaledin 24-well plates on round !S-mm Thermanox co ver­slips (Nunc. Naperville. IL). To oplilllize ccII dcnsilYarler subcullure, HUVEC. CJ2. and CHO eells wereplaled at 4 x lU'. 2 x 10', and 2 x 10'/em'. respee­livel~'. for H UVEC. coverslips ll'erc precoaleC! will1fibrollcclin (Si[:ma ClJcmical Co. SI. Louis. MO) (2

I-lg/cm'). CyloadlJcrenee le:;ling was perforllled aflcr

/'. [alcipanun: IN "I7RO MODELS OF CYTOAOIIERENCE -143

4, 2, and 1 days of subculture , lime for maximal re­ccptor expression (Mnrsh ct nI. 1988).

Cytoadhcrcnce tests wer e carr icd ouI as dcscribcd(Mar sh ct at, 1988). Briel!y, 500 ,d of l'RUC in RrMIwith 107<- human serum (1'116.9) wcrc dcpositcd on thecells. Ali tests wcrc cart ied out with a parasitcrnià of

1% and a 4% hcrnntocrit. Plates were incubatcd al37"C with 5% COl for 1.5 hr with gcntle rocking evcry30 min. Then, cover slips were washcd III/ee limes inRrMI, glutnrnldchydc Iixcd , and Giernsa staincd,EOIch covcr slip was cxnmincd by lighl microscope .1IIdthe mean numbcr of l'RIIC l'cr 500 I;I/I:el cclls in du­plicntc wells was calculatcd , In ail rnodcls , ring­inlccicd R IlC did not adhere and more thun 95% ofadherent RIlC were parasitized.

Adherence of the ei!:ht isolatcs to the four largel ccII

types is shown Fi!:. 1. Regur dlcss of the rnodcl, udhcr­ence level of isolntes varied widcly. Adherence to non­transfecled CliO cclls was ncgtigible (median, 2;range, 0-10). More rRUC adhercd 10 C32 than 10

CIlO·CD36 cclls (1' < 0.02) (Table 1), but rcsultsstronply correlated (r' = 0.93; l' = 0.01). Adherence10 CIIO·ICAM-I and IIUVEC wns comparable. Cellsexpr cssing CD36 (Cn and CHO-CD36) bore morel'ROC thnn cells ex pressing ICAM-I (HUVEC andCHO·ICAM-I) (1' < 0.02).

IlUVEC were first uscd to study trophozoite adher­ence 10 cndothclia, bUI wcrc rnpidly supplantcd by theensily-cultur cd C32 cells, dcspitc differences in rcccp­tor expression [Schmidt ct al. 1982). IIUVEC and hn­

man brain cndorhclinl cclls (llBEC) present differentbiochcrnical mal kers and rnorphology (Beike 1988), as

TABLE 1Compnrison of the Adherence of Er ythrocvtcs

Purnsitized with Eiglu lsolatcs of l'. [ulc ipnrurn 10

CcII Modcls Exnressing CD36 Rcccpior (CD36Modcl] and ICAM-I Rcccptor (ICAM·I Model)

CD36 ICAM·l

Cel1s model rnodcl

C321HUVEC 174.5 35.5l' < 0.02

(84-315) ( 10-78)

CIIO·CD36/ 137.5 38.5l' < 0.02

CIIO-ICAM-\ ("2-243) (Hl-55)l' < 0.02 NS

No/t'. The eells ex pressing CD36 comprise amelan­otie melanoma cn cell line (CJ2) and Chincse hamsterovary eells transfectcd with CD36 gene (CHO-CD36).The cells exprcssing ICAM-\ comprise hurnnn umbil­ical endothelial cells (IlUVEC) und CIIO-ICAM-1.The median value and range for the cight lests areindicatcd for cach ccll type. togcther with sipnificantdifferences (Fricdrnan's lest). Rcsults arc cxprcsscdby the number of parasitizcd erythrocvtcs/Süü target

eells.

weil as different capacitics for binding rRIlC (Shcr­man Cf al, 1992). l lowcvcr , IIUVI~C have Ihe highcstIunctional sirnilarity to IIBEC. Sclectcd cytokines in­

creuse ICAM-I expression at the surface of both ccIItypes (l'aber cf (II. 19R6; Sobcl Cf nI. I(90). IIUVEC

are only rnaintaincd for short pcriod and lest rcpr o-

400.,-------------------------------,

700 .ari. ~. ;l

~nL,~.

~ ~~

" ~ ~.(.

.I~.,

100· Wi

IL./CMI CM7 SMI UM' UI~2 UMJ UM·'

• CJ2

El CHD COJG

JOO ra CIlD·ICAM'

0 IlN[C

..D

E:lC

'j;j..>­uooC

F~.. -e'tl _.. ..- '"u ~

~!!

.~ 0

~. 0

Isolntes

1'10. 1. Cytoudhc reucc propcrtie s of eighl isolntcs of l'. [alciporum to cn amclanotic mclnnomnccII lille (C321. 10 Chincsc hnrnster ovary cclls transfccted with the gene of CDJ6 (CIIO-CUJ(,) andICAM-\ (CIIO·ICAM -1) amI 10 hurnan umbilical vein endothelial cclls (1IUV ECl. Result s are e x­pi cssed by the numbcr pf infeetcd cr ythr ocytcs l'cr 500 target cclls. Ali tests wcr c pcr lor mcd in

dlll'licale.

53

444 RINGWALD ET A.L.

ducibility is pOOL !CAM-I is present on <20% of en­dothclinl cclls in their basal statc, and there are largevariations of this perccntage (Hirornatsu cl ni. 1991).Thus, cach cxpcrirncnt rcquir cs at lcast thrce urnbilicnlcor ds to obtain ccII mixture hetcrogcneous enough10 reducc bctwecn-test variations. Adnptation ofIl UV EC 10 continuous culture reduces their bindingcapacity (Sherman cl ni. 1992). In our experience,IlUVEC stimulation with endothelial cell rnitogcn(Udcinya cl ol, 1989) lcads to a change in morphology.Recently, IIIlEC wcre shown to ~IO\V in culuuc, 10posscss CL>36 and ICAM-I, and 10 bind l'RUC (Smithcl al, 1992). Althougl, il is not known to whnt cxtentcullured IIDEC are similar 10 Iresh cells, Ihis may con­stitutc a new modcl of intcrest,

C32 and CHO cells are continuons celllines provid­ing a high degree of reproducibilit y. C32 cclls possesssurface microvilli that may interfere with cytoadher­cnce and express both CD36 and (CAM-I. Tr ansfcctcdClIO cells express a delined reccptor. and this prop­erty can be uscd 10 study the specifie adherence ofl'RDe. As wirh cn and I!UVEC (Udcinya Cl ol,1985), no ditference in adherence was found bctweenIormalin-Iixed and unfixed CIIO-CD36 or CHO­ICAM-I cells (data nol shown).

The nurnbcr of PRDC adherent 10 the different tar­gel cclls wns lower thau the se in the lit ernture(Schmidt cl al, 1982: Udcinya Cl al. 1985; lIerendl cl

nI. 19B9; Smilh Cl nI. 1992). l'Iowever, Ihe Inller dala\\'ere oblained \Vilh r. !nlcif'nrtlm lines selecled 10 in­duce highly differenl dcgrees of adherence. Furlher­1II0rc, cytondherence properlies of l'. ["fcif'nrtlm iso­laIes differ mnrkedly \\'ilh Iheir geographical origin(Golc1,in~ Cl ,,1. 1992). The level of cyloadherence de­pends on Ihe smfnce receplors on Ihe Inrgel cells andthe capacily of rRIlC 10 bind 10 Ihem, ns conlirmed inour sludy. The resulls oblained \\'ilh C32 and CliO·CD36 cclls cOllelated slrongly. The adherence ofl'RUC 10 melnnoma cells appears rnedialed rnainly byCD36. The dilTerence belween C32 and C/IO-CD36eells (abolll 20%) may be relaled 10 the facl Ihal C32cells have al Icasll\\'ice Ihe surface mea of CHO cells(Ilnsler Cl nI. 1993) or 10 Ihe concomilanl presence "fICAM-I or olher receplor "n melanoma cells. There\\'as no difference bel\\'ecn resulls of IJUVEC andCIIQ-ICAM·I cells, bolh ex pressing only ICAM-I.The receplor densily on these cells should nol inler­fere wilh Ihe lesulls, as \Vilh the four Iypes ofcells IhelII11nber of mlherenl 1'1~IlC ""as proportiollnl 10 para­silcmin ([rom 0.1 103%), sllggesling an ahsence of le­ceplN salmalioll in fIlII expelimelllai cOlldilions (dnlnnol sho\\'n). lu conlrasl, vnlues \Vere sevenfold higher\\'ilh en cells Ihan \\'ilh IIUVEC. Similarly, adher­ence 10 CI10·CIH(, was f(l\lr limes hi(:her Ihnn IhalloCl1()·ICAM·' cclls. a ,nlio simil~r to Ihat {l!Jlained",ilh plaslic-b{lund rurilied CD36 or ICAM·) (OCkCll'

house cl al. 1991). These rcsults confirm thnt sorne P.[alclparum isolate s adhere more to CD36 than 10

ICAM-', even though the contribution of ICA/I1-1 isfar Irom negligible. Contrary 10 pre vious findings[Schmidt cl al, 1982), Ihe rcsults obraincd with thernclanorna and Ille IIUVEC modcls differed.

Although in vitro studios may have sorne rclcvance10 sequestration in \';\'0, they need to he dcvclopcd,Indeed the presence of CL>36 and ICAM-I on cndo­thclinl cells of brain cnpillary vesscls rcmains contro­vcrsiul (Aiknwa cl al, 1992; llam\Vell cl III. 19~9). andother still unidentified rcceprors may play a role inadherence ill \';"0. Available modcls nllowcd 10 idcn­tification of ccII recepiors and para sile ligands l'Olen­tially involvcd in cytoadhcrence. They also le stcd theability of sera or imrnunoglobulins 10 rcvcrsc/inhibitadherence (Goldring cl al. 1992: Singh cl CIl. Inn lncontrnst, thcrc is lirnitcd relntionship bctwcen diseusesevcrity and isolat es' capncity 10 adhere 10 ruclauornacclls (110 cl ol, 1991), IIUVEC (pcrsonul data), andplasiic-bound purificd CD3fi or ICAM-I (Ockcnhousecl al . 1991). Although a limitcd number of isolatcs wastested, wc found no difference in adherence 10 any ofthe four ccll typcs bctwccn isolatcs Irom palients withcerebral malaria or with ncurologicnl symptoms andthose frorn patients with milder Iorrus. Howcvcr , ill

vitro cytoadhcrcnce assays arc stutic tests and rhco­logical and irnruunological phcnomcna cnn intervcnc ill";"0. l'bis point may justify the use of dynamic ruod­e1s.

ln conclusion, C32 and CIIO-CD36 cc Ils are close ill

"ilm models of cyloadherence. Contrary 10 cn cells,CIlO-eD36 cells only express CD36 receplors. AI­11I01lgh CHO-ICAM-I cells arc ensier 10 grow IhanIl UVEe. Ihe choice of a l1\odel del'ends {lll Ihe infor­matiun required. Finally. ollr dala snggest Ihal l'. ji"­cif'{//lIm-infecled RIlC ndhere more 10 CD36 Ihan 10ICAM-!.

(Wc Ihank R. 1. Iloward for gift of CliO cells, J. l'.C{llliaud, F. Vnchon, nnd r. Falan~:l for c{lllahoraiion,;",d e. Ch{lugnel and G. Miloll for crilicnl comments.This \\'ork wns rinancially snpporled by INSEI{t>1.l'.R. was a rccipienl of a fcllo\\'ship frolll FondalionMérieux.)

REfERENCES

AII:"W", M., UnowN. A., SMIIII, e. D., Tr.COOS111.l'., 1I0W"RO, R. J., Il "SI.I:R. T. II., 110, Y.,rEnnY. G.• C(lI.I.INS, W. E.. "Nl> \\'I.IISIr.R, K.1992. A prÎIIl:l\e modcl for human cerebral lIIalnria:/'III.!/Iwcfilllll ("(l(I/llr.l'i·infected IU,eslls 1II0nke~·s.

11111("/;,1111 '/"/11"/,,,1 o[ TI"I,icIII /I1n/icjllc 111/11 1/)".gicllc 46, 391-397.

54

P. [nlcip arurn: IN I-'ITRO MODELS OF CYTOADIIERENCE 445

[lARNWELL. 1. W.. Ascu, A. S .. NACIIMAN. R. L..YAM,\YA. M .. AIKAWA, M .. AND INGIlAVALLO, P.19H9. A human 88-kD membrane gtycoprot cin(CD36) funciions in vitro as a rcccptor for a cytoad­hcrcnce ligand on Plasmodium f{/lci"t1r1/III-infectedcr yrhrocyrcs. Journal of Clinical Invcstigation 84,765-772.

BEIKE. M. A. 1988. Vascular endothelium in irnmunol­ogy and infections disease. Revicw of lnfectiousDiscase 11. 273-283.

BERENOT. A. R.• SIMMONS, D. L.. TANSEY. J .• NEW.!lOLO. C. 1.. AND MARSIl. K. 1989. lnterccllular ad­he sion molecule-I is an endothelial cell adhesion re­cc ptor for Plasmodium [alciporum, Nature 341. 57­59.

GOLDRING. J. O.. MOLYNEUX. M. E.• T...vt.on, T .•WIRIMA, J .. AND HOMMEL. M. 1992. Plasmodtum[alciparum : Divcrsity of isolaics from Malawi intheir cytoadhercnce to rnelanorna cells and mono­cytes in vitro. British Ioumal of Haematology 81,413-418.

HASLER. T .• AL!lRECtlT, G. R.• VAN SCIlRAVENDIlK.M. R .• AGUI AR, 1. C., MOREIIEAD, K. E .•PASLOSI:E, B. L., MA. C.. BARNWELL. 1. W.,GREENWOOD, B., AND HOWARD, R. 1. 1993. An irn­proved rnicroassay for Pcfolciparum cytoadhcrcnceusing stable transformants of Chincse hamster ovarycclls ex pressing CD36 or intcrccllular adhesion mol­ecule-L American Jal/niai af Tropicol Medicine andIIn:icI/(' 48, 332-347.

HIROMATSU. Y., SATO, M.• YAMADA. K .• "'ND NON,"'KA. K. 1991. lnhibitory effccts of nicotinamide onrecombinant human interferon-v-induccd intcrccllu­lar adhesion molcculc-l ((CAM·I) and H LA-DR an­t igen expression on culturcd hurnan endothelialcc Us. [17I1III/nl/[o}:)' Lctters 31, 35-40.

Ho, M.• SINGtl. [J .• LOOAREESUWAN. S.• DAVIS.T. M. E., BUNN"'G. D., AND WUITE. N. J. 1991.Clinical corrclnte s of in vitro Plasmodium [alci­pari/III cytoadhcrence. Infection al/cl lmmunity 59,873~78.

JArrE. E. A.• N"'CtlMAN, R. L., BECKER. C. G.. ANDMINICK, C. R. 1973. Culture of hurnan endothelialcclls dcrived from urnbilical vcins: Identification byrnorphologic and immunologie criteria. Jonrruil ofCtiuical [III'esrif.:{/(ÏtIII 52, 2745-2756.

M...CPHERSON, G. G .• WARRELL, M. J.• WUITE,N. J., LOO"'REESUWAN, S.• AND WARRELL. D. A.1985. Hurnan cerebral malaria: A quantitative ultra­structural analysis of parasitizcd erythrocyte sc­questration. Amcrican Journal of Parlwlo}:y [19,385-40 l.

MARSU. K.. MARSIl, V. M., BROWN. J., WllITIU.•H. C., "'ND GREENWOOD. B. M. 1988. Plasmodium[ulcipurum: The behaviour of clinical isolates in anin vitro model of infected red blood ccII sequestra­lion. Experimental Parasitology 65, 202-208.

OCI:ENIIOUSE, C. F., Ho, M.. TANDON, N. N., VANSEVENTER, G. A .• SIIAW. S.. WIlITE, N. J .. JAMIE­SON, G. A., CIIULAY, 1. 0 .. AND WEnSTER, 1-1. K.1991. Molecular basis of sequestration in severe anduncoruplicatcd I'la s modùnn fil 1ci" afil III malaria:Differentiai adhesion of infected erythrocytes toCD36 and [CAM·I. Journal of Injections Dise ases164, 163-169.

PonER, J. S .. GRIMnRONE, M. A.• JR.• LArIERRE.L. A., MENDRICK. D. L.. FIERS. W.• ROTHLEIN.R.• AND Sr'RINGER. T. A. 1986. Ovcrlapping pat­terns of activation of buman endothelial cells by in­terleukin 1. turner nccrosis factor. and immune in­terferon. Journal of luununniogy 137, 1893-1896.

RODERTS. D. D.• StlERWOOD, 1. A.. SrIT"'LNIK,S. L.. PANTON, L. 1., HOW"'RD. R. 1.. DIXIT.V. M.• FRAZIER. \V. A., MILLER, L. H.• "'ND GINS'DURG. V. 1985. Thrombospondin binds Ialciparurnmalaria parasitized erythrocytes and may mediatecytoadherence. Nature 318, 64-66.

SCHMIDT. J. A.• UOEINY.... 1. J .. LEECll, J. H., HAY,R. J .• AIKAWA. M.• BARNWELL. J., GREEN. 1., "'NDMILLER, L. H. 1982. An amclanotic melanorna ccIIfine bcars receptors for the knob ligand on infectederythrocytes. Journa! of Clinicat lnvestigation 70,379-386.

SHERMAN, 1. W., CR...ND...LL. 1.. AND S~IITtl, H.1992. Membrane proteins involved in the adherenceof Plasmodium faiciparrrl/l-infectetl erythrocytes tothe endothelium. Biology of lire CcII 74, 161-178.

SINGH, B.. Ho. M.. Loo"'REEsuwAN, S .• MATHAl.E.• WARRELL. D. A.. AND HOMMEL, M. 1988. l'las­I/II/dill/II [alclp arutn: Inhibition/reversai of cytoad­herence of Thaï isolatcs to rnelanorna cells by localimmune sera. Clinicat and Experimenta! 11/11/11/1101­ou» 72, 145-150.

SMITIl, ~I., NELSON.J. A.. GAII~tnERG, C. G., CRAN­DALL, 1.. AND SIIERMAN, 1. W. 1992. Plasmodium[nlcip ar um: Cytoadherence of malar ia-infc cte derythrocytes 10 human brain capillary and urnbilicalvein endothelial cells-A comparative study of ad­hesive ligands. Espcrimcntal Parasltology 75. 269­280.

SODEL. R. A., MITCIIELL. M. E.• AND FONDREN. G.1990. lntcrcellular adhesion molecule-l (lCAM-1) incellular immune reactions in the hurnan central ncr­vous system. American Journal of Pathology 136,1309-1316.

SWERLlCI:, R. A.• LEE. K. II.. \VICK. T. M.. ANDLAWLEY. T. J. 1992. Hurnan dermal microvascularendothelial bUI nol hurnan umbilical vcin endothelialcclls express CD36 in vivo and in vitro. Journal of[l11l11l1/lOlo1:Y 148. 7&-S3.

UDEIN\"i\, 1. 1. 1990. In vitro and ex-vivo modcls ofsequestration in Plnsmodium [olcipnrum infection.

446 RINGWALD ET .AL.

Amrricall Jal/mal of Tropical Medicine and If)'­

gicnc 43 (Suppl.), 30-37.UOEINYA, 1. 1., LEECIl, 1., AII:AWA, M., AND

MILLER, L. H. 1985. An in vitro assay for seques­tration: Binding of Plasmodium falciflamm-infectederythrocytes to formalin-fixed endothelial eells andarnelanotic melanoma cells. Jal/mal of Protozool­ogy 32, 88-90.

UDEINYA, 1. J., MAGOWAN, c., AND CIlULAY, J. D.1989. Long-terra eullured human vascular endothe­lium eclls (EC·FP5) bind Plasmodium falcinanm, in­fected erythrocytes. Amcrican Journal of TropicalMedicine and Hyglcnc 41, 400-405.

Reeeived 9 Novembcr 1992;acccpted with rcvision 23March 1993

,:..-

".'

.~•.r.........,.

; ~.. .:, '..

AIR.1rJICILIB JIJI

article sous presse dans "Infection and Immunity"

PARASITE VIRULENCE FACTORS DURING FALCIPARUM MALARIA:

ROSETTING, CYTOADHERENCE AND rrs MODULATION BY

CYTOKINES

running title : P. falciparum virulence factors

PASCAL RINGWALD 1,2'*, FRANÇOIS PEYRON 3, JEAN PAUL LEPERS 1,

PATRICK RABARISON 1, CHARLES RAKOTOMALALA 4, MARCEL

RAZANAMPARANY 4, MEJA RABODONIRINA 3, JEAN ROUX 1 ,

JACQUES LE BRAS 2

1 Unité de Recherches sur le Paludisme, Institut Pasteur de Madagascar,

Antananarivo, Madagascar

2 Centre National de Référence de la Chimiosensibilité du Paludisme,

IMEA, Hôpital Bichat-Claude Bernard, and Université Paris V, Paris, France

3 Département de Parasitologie et de Médecine Tropicale, Université Claude

Bernard, Lyon, France

4 Services de Maladies Infectieuses et de Pédiatrie, Hôpital Befelatanana,

Antananarivo, Madagascar

* Corresponding author and present address:

RING''''ALD PascalORSTOM/OCEAC

BP288

Yaoundé

CAMEROUN

Phone: 237 23 22 32

Fax: 237 23 00 61

58

AB5TRACT

To determine virulence factors of isolates of Plasmodium [alciparuin

and the potential role of cytokines in cerebral malaria, 46 Malagasy patients

presenting with cerebral (n=lO), severe (n=lO) and uncomplicated malaria

(n=26) were enrolled. The capacity of 21 of the 46 P. falciparum isolates to

form rosettes in vitro and to adhere to human umbilical vein endothelial

cells (HUVECs) that express ICAM-1 receptors, and C32 amelanotic

melanoma cells that express mainly CD36 receptors, were investigated,

together with the effects of TNF-a, GM-CSF, IL-3 and IL-6 alone and in a

two-by-two combination on the cytoadherence of infected erythrocytes to

HUVECs. Plasma levels of these cytokines were also measured in the

patients at admission. The percentage of rosette formation was higher for

the isolates from patients (n=6) with cerebral malaria (19.5%) and those

(n=6) with severe malaria (30.5%) than for the isolates from patients (n=9)

with uncomplicated malaria (5%) (P < 0.002). The cytoadherence properties

of the isolates did not differ among the three groups whatever the target cell

used, but adherence to melanoma cells was systematically higher than to

HUVECs. Adhesion to HUVECs was increased more after TNF-a

stimulation than after GM-CSF, IL-3 or IL-6 stimulation (P < 0.01). Only the

combination of TNF-a and IL-3 enhanced cytoadherence more than TNF-a

used alone (P < 0.02). No difference in the modulation of cytoadherence by

cytokines was found in relation to the severity of the disease. TNF-a and IL­

6 levels in peripheral blood were higher in the patients with cerebral and

severe malaria than in the patients with uncornplicated malaria (P < 0.005).

Most of the patients' sera contained little or no IL-3 or GM-CSF. Our resu1ts

challenge the role of ICAM-1 as the principal receptor mediating the

cytoadherence of P. falciparum-infected erythrocytes and contrast with data

obtained in the murine model.

59

Cerebral malaria (CM) is the most severe complication 0 f

Plasmodium falciparum infection, and one of the main causes of infant

mortality in Africa. The pathophysiology of CM is starting to be elucidated.

The main hypothesis involves sequestration of red blood cells infected with

P. [alciparum trophozoites and schizonts in cerebral capillaries and post­

capillary veinules (19). This phenomenon has been observed in necropsy

specimens; it occurs in all organs, but is more marked in the brain during

. CM. The main event leading to sequestration and altered microcirculation

is cytoadherence of parasitized erythrocytes to endothelial cells, and / or

rosette formation, i.e. agglutination of non-infected erythrocytes around

erythrocytes parasitized with trophozoites and schizonts (40). At least five

endothelial cell receptors able to bind infected erythrocytes have been

identified: thrombospondin, CD 36 (platelet glycoprotein IlIb or IV), and

intercellular adhesion molecule-l (ICAM-l), vascular cell adhesion

molecule-l (VCAM-l) and endothelial leukocyte adhesion molecule-1

(ELAM-l) (1, 2, 23, 28).

The involvement of cytokines in the pathophysiology of CM has also

been suggested. In vitro, tumor necrosis factor-a (TNF-a) can modulate the

expression of ICAM-l on endothelial cells (25). In man, peripheral blood

concentrations of TNF-a and IL-6 are markedly raised in severe and cerebral

malaria (9, 16, 17) but their direct pathogenic role is much debated. TNF-a,

interleukin-3 (IL-3), and granulocyte macrophage-colony stimulating factor

(GM-CSF) are essential for the onset of neurological symptoms in mice

infected with P. berghei (6, 8). To our knowledge GM-CSF and IL-3 have

never been measured in CM patients.

It is not clear why only 1-2% of patients infected with P. falciparum

develop severe or cerebral malaria, although several genetic, nutritional

and immunological host factors have been implicated, together with

behavioural factors such as delayed or inappropriate treatment. Strain

virulence, particularly the capacity to adhere to endothelial cells, to form

rosettes, and to multiply are also probably involved (10). To determine

whether parasite virulence factors are associated with clinical gravity

markers, we studied the capacity of P. [alciparum isolates to form rosettes

and to adhere to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and

human C32 amelanotic melanoma cells, in two in vitro models of

cytoadherence, together with the sensitivity of the isolates to chloroquine

and to quinine in vitro. We also studied the effects of TNF-a, IL-3, IL-6, and

GM-CSF on the cytoadherence of parasitized erythrocytes ta cultured

hO

endothelial cells. Finally, we measured plasma levels of TNF-a, IL-3, IL-6,

and GM-CSF in the corresponding patients at admission ta hospital.

MATERIA LS AND METHODS

Stndy area. The study was carried out between [anuary 1991 and March 1992

in the high plateau area of Madagascar in Antananarivo, the capital city, and

in Ankozobe, a village situated 100 km north of Antananarivo. The high

plateau area is endemie for malaria and is characterised by uns table seasonal

transmission between [anuary and June.

Patients. Ali adults and children admitted to Befelatanana Hospital or the

Military Hospital at Antananarivo, or to Ankazobe Hospital, and presenting

with P. jalciparum malaria and parasitemia above 1% were enrolled. The

diagnosis was confirmed by examination of Giemsa-stained thin blood

smear and parasite density was determined by counting the number of

parasitized erythrocytes per 10,000 erythrocytes. On admission, full clinical

histories were recorded, and a complete physical examination and routine

haematological (haemoglobin, red blood cell, white blood cell and platelet

counts) and biochemical (serum bilirubin and creatinine) tests were

performed. Patients were classified into three clinical groups according to

World Health Organisation criteria (41), as follows. Group 1: patients with

CM. Group 2: patients with severe malaria (SM). Group 3: acute

uncomplicated malaria (UM). Informed consent to participate in the study

was given by the patient or by the family.

Parasites. After haematological and biochemical tests, 10 ml (5 ml in the case

of children) of venous blood was drawn onto EDTA on admission before

treatment. Plasma was aliquoted, frozen and stored at -70°C until cytokines

assay. The erythrocytes were washed three times with RPMI 1640 medium

(Gibco, Paisley, Scotland); 1 ml of the pellet was immediately used for in

vitro sensitivity testing and the remainder was mixed with an equal

volume of 30 g/l mannitol, 28% glycerol and 6.5 g/l NaCI and cryopreserved

in liquid nitrogen. For the cytoadherence and rosette formation assays,infected erythrocytes were thawed and cultured until the parasites matured

to late trophozoite and schizont stages in candIe jar in standard conditions

(36). For isotopie counting in the cytoadherence test, infected erythrocytes

were labelled for at least 24 hours in hypoxanthine-free culture medium

containing 3 /lCi/ml [3H]hypoxanthine (Amersham, Buckinghamshire,UK).

61

Cell culture. HUVECs were obtained from four to nine human umbilical

cords as previously described (15). They were cultured in candle jar in 25

cm- Primaria® culture flasks (Becton-Dickinson, Lincoln Park, N.J.) with

E199 medium (Flow Laboratories, Irvine, Scotland) supplemented with 15

mM HEPES (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 15 mM NaHC03, 2 mM L­

gIutamine (Flow Laboratories), penicillin (100 U/ ml), streptomycin (100

Ilg/ml), and 20% inactivated foetal calf serum. For the binding assay,

confluent ceIls were subcultured for 2 to 3 days to confluence on 15-mm

round Thermanox® tissue-culture coverslips (Nunc, Naperville, Il.)

precoated with fibronectin 2 Ilg/ cm- (Sigma) in 24-well flat-bottorned plates

(Becton-Dickinson). C32 human amelanotic melanoma cells (ATCC CRL

1585, designation C32r; Ameriean Type Culture Collection, Rockville, Md.)

were cultured under the same conditions with RPMI 1640 medium

supplemented with 10% inactivated foetal calf serum and plated on 15-mm

round coverslips at 2x104 cells/ cm-'. After 48 hours of culture, the

monolayer was fixed with 1% formalin and stored at 4°C until the binding

assay (38).

In vitro sensitivity testing. Sensitivity to chloroquine and to quinine was

determined using the isotopie semi-micro in vitro drug sensitivity test (18).

The 50% inhibitory concentration (ICso) was calculated by log dose/ probit

analysis. The threshold of resistance to chloroquine and quinine was

defined as LCSO >100 nmol/l and > 500 nmol/l, respectively.

Rosette formation assay. Ten microliters of the parasite culture was mixed

with a small amount of 0.001% acridine orange and distributed under a

coverslip (22 by 22 mm); 100 consecutive parasitized erythrocytes were

examined with a 40x lens under incident ultra-violet light (4). Tests were

performed in duplicate at the thawing parasite density (1 to 3%). The

percentage of parasitized erythrocytes to which two or more uninfected

erythrocytes were attached was noted.

Binding assay. Lmmediately prior to use, confluent endothelial cens, fixed

melanoma cells and cultured parasitized erythrocytes were washed three

times with RPIvn 1640 medium. RPMI 1640 medium (0.5 mI), supplemented

with 10% pooled human serum pH 6.9 containing erythrocytes (4%

hematocrit) was added to each well with adherent endothelial ceIls or

melanoma cells. AIl tests were performed in duplicate at 1% of parasitized

erythrocytes. The plates were incubated at 37.5°C in candIe jar for 1.5 hour

with gentle rocking every 30 min. The coverslips were then washed three

times in RPML 1640 medium, fixed with 2% gIutaraldehyde, stained wi th

10% Giemsa, mounted on glass slides and examined under a light

62

microscope. The number of parasitized erythrocytes attached per 500 target

cells was then determined. The mean of duplicate counts was calculated and

expressed as the number of infected erythrocytes per 100 target cells. An

alternative assay using an isotopie counting method previously adapted to

the melanorna cell binding assay (42) was used to study the effects of

cytokines on cytoadherence (see below), To compare the isotopie and optical

assay results, we tested the binding of 3 isolates at 5 different parasite

densities. Results of the two methods were strongly related (r'=l in each

case).

Effects of cytokines on cytoadherence. Recombinant TNF-a, GM-CSF, IL-3

and IL-6 (Genzyme Co., Boston, Mass.) were diluted in phosphate-buffered

saline pH 7.2 supplemented with 1% bovine serum albumin to ob tain

working concentrations, then aliquoted and stored at -70°C until cell

stimulation. Confluent HUVECs were incubated for at least 24 hours with

high concentrations of TNF-a (5, 10 and 20 ng/ml) to obtain maximal

ICAM-1 expression (25, 26). GM-CSF, IL-3 and IL-6 were also used at three

high concentrations (5, 10 and 20 ng/ml; 5, 10 and 20 ng/ml; 10, 50 and 100

ng/ml, respectively). The effects on cytoadherence were also investigated

with the two by two combinations of the four cytokines at the highest

concentrations. Unstimulated HUVECs were used as controls. Before the

binding assay, unincorporated [3H]hypoxanthine was removed from the

culture medium by washing the erythrocytes three times with RPMI 1640

medium containing 50 ~g/ml hypoxanthine. The erythrocytes were then

suspended and the cytoadherence assay was performed as described above.

Following incubation, the coverslips were washed three times with RPMI

1640 medium and transferred directIy to scintillation vials. The results were

expressed as the percentage of modulation for each cytokine as follows :

percentage of modulation = (cpm after cytokine stimulation - cpm control) x

100/cpm control. Modulation of cytoadherence was considered significant

when binding was enhanced by 50% or more (31).

Cytokines assay. Plasma cytokine concentrations were assayed using

commercial kits according to the manufacturers' instructions. Enzyme­

linked immunosorbent assays were used to measure the concentration of

IL-3 (Amersham), IL-6 (Amersham) and GM-CSF (Genzyme). Plasma TNF-a

was assayed with a competitive inhibition radioimmunoassay (IRE­

Medgenix, Fleurus, Belgium). The detection limits were 7.4 pg/ ml for IL-3, 3

pg/ml for lL-6, 4 pg/ml for GM-CSF, and 6 pg/ml for TNF-a. For statistical

purposes, samples in which cytokines were undetectable were arbitrarily

assigned values of one-half the detection Iimits. Plasmas from six healthy

63

Malagasy volunteers with negative thick-blood smears were used as

controls.

Statistical analysis. Unpaired comparisons between groups were performed

with the Mann-Whitney U test and the Kruskal-Wallis test. Paired

comparisons within groups were made using the Wilcoxon signed-rank test

and the Friedrnan's test. Correlations were identified by using the

Spearrnan's rank correlation coefficient. Differences in proportions were

tested for with the Fisher's exact test. P value 0.05 or less were considered

significant.

RESULTS

Patients. Forty-six patients were enrolled in the study (10 with CM, la with

SM and 26 with UM). The clinical and the laboratory features of the three

groups of patients are summarized in Table 1. In the CM group coma was

usually associated with other organ dysfunctions consisting of renal failure

(n=4), pulmonary or urinary tract infection (n=2), massive bleeding (n=2),

hepatic dysfunction (n=2), severe anaemia (n=2), and circulatory collapse

(n=l). In the SM group, patients presented with one (n=6) or several of the

following organ dysfunctions : obnubilation (n=5), renal failure (n=2),

hepatic dysfunction (n=3), severe anaemia (n=5) and spontaneous bleeding

(n=l). On admission, 38 patients (81%) had an axillary temperature > 37.5°C

and the remaining patients reported a history of fever in the past 24 hours.

Patients were given standard chloroquine or quinine treatment. One patient

in whom chloroquine therapy failed was successfully treated with

amodiaquine (25 mg/kg for 3 days). The outcome was favourable in all but

three patients (all with CM) who died l, 2 and 3 days after initiation of

treatment.

In vitro sensitivity. Forty-six in vitro tests were performed with a success

rate of 83%. Two isolates were resistant in vitro to chloroquine (ICso = 218

and 359 nmol/l); the remaining isolates had a median ICso of 29.5 nmol/l

(range 12.5-87) and no isolates were resistant in vitro to quinine (median

ICso = 143 nmol/l; range 25-418).

In vitro cytoadherence and rosette formation. After thawing 21 isolates grew

to the trophozoite and schizont stages at a parasitemia above 1% and could

thus be included in the study of cytoadherence and rosette formation;

respectively 6/ 6 and 9 isolates were from patients with Cïvl, SM and UM.

The isolates were cultured for 25 to 40 hours. In each case, trophozoites and

schizonts represented more than 80% of the parasite stages.

64

(i) Rosette formation. Rosette formation was observed in 17 (81%) of the 21

isolates with considerable differences in the percentage of rosette formation

(range 5-43%). All the isolates obtained from patients with CM and SM

formed rosettes in vitro compared to only 5 of the 9 isolates from patients

with UM (P < 0.03). The median number of rosettes per 100 parasitized

erythrocytes was significantly different between the three groups (P < 0.002);

the median value was higher in the CM group (19.5%) and SM group

(30.5%) than in the UM group (5%) (P < 0.05 and P < 0.002, respectively) (Fig.

1).

(ii) Binding. Whatever the target ceil used, cytoadherence properties varied

widely among the isolates. No difference was found in the pattern of

binding to HUVECs and to melanoma ceils between isolates from the three

groups of patients (Fig. 2). Cytoadherence was significantly higher on

melanoma ceUs (median 50 parasitized erythrocytes/100 melanoma cells;

range 14-350) than on HUVECs (median 18 parasitized erythrocytes/100

HUVECs; range 7-91) (P = 0.001). There was no correlation between binding

to HUVECs and melanoma cells.

(iii) Effects of cytokines on cytoadherence. TNF-a stimulation 'induced a

morphological modification of endothelial ceUs into an elongated

fibroblastic shape, whereas IL-3, IL-6 and GM-CSF did not. The combination

of TNF-a with each of the other three cytokines induced the same

modification. For each cytokine, no difference in the pattern of

cytoadherence modulation was observed with the three concentrations

used. Cytoadherence varied markedly after cytokine stimulation. TNF-a

enhanced cytoadherence significantly (percentage of modulation> 50%) in

5/21 isolates (4 .isolates from patients with SM and 1 isolate from a patient

with UM). Adhesion to HUVECs was more increased after TNF-a

stimulation (percentage of modulation median value 24%; range -12% and

126%) than after GM-CSF (-3%; -34% and 44%), IL-3 (11%; -20% and 52%) and

IL-6 (8%; -22% and 50%) stimulation (ail P < 0.01) (Fig. 3). Contrarily to the

other cytokines, GM-CSF seems to decrease cytoadherence. Only the

combination of TNF-a and IL-3 enhanced adherence more than TNF-a

alone (P < 0.02). No difference was observed in HUVEC cytoadherence

modulation by the cytokines according to the severity of the disease (Fig. 4).

For a given isolate, the capacity of TNF-a to modula te cytoadherence

correlated with the binding capacity of this isolate to unstimulated HUVECs

(r' = 0.47; P < 0.05).

Plasma cytokines concentrations. In contrast to GM-CSF, plasma

concentrations of TNF-a, and IL-6 were higher in the patients than in the

65

controls (aIl P < 0.02) (Table 2). TNF-a and IL-6 levels correlated positively

with the parasitemia, serum bilirubin and temperature (all r' ~ 0.35; all P <

0.03), and correlated negatively with the platelet count (all r' =:;; -0.5; all P <

0.002). TNF-a levels correlated positively with IL-6 levels (r' = 0.76; P =

0.0001) and with the percentage of rosette formation observed with the

corresponding isolate (r' = 0.57; P < 0.02). TNF-a levels in peripheral blood

differed between the 3 groups of patients (P < 0.005). The geometrie mean

TNF-a concentration was higher in CM and SM than in UM (all P < 0.03)

and patients with complicated malaria (i.e. CM and SM) had higher

geometrie mean IL-6 levels (116 pg / ml) than the patients with UM (32.7

pg/ml) (P < 0.03). In the three patients who died, TNF-a and IL-6

concentrations on admission were 186,96,313 pg/m1 and 240, 17,471 pg/ml

respectively. IL-3 was detectable in one patient with CM, two patients with

SM and one patient with UM (7.4-12.5 pg / ml).

DISCUSSION

Among the various virulence factors studied in vitro (rosette

formation and cytoadherence), only rosette formation was related to the

severity of the disease. Our results confirm previous studies performed in

the Gambia (4, 37), in which all isolates from CM patients led to rosette

formation. Nevertheless, the pathophysiologic significance of rosettes in

c:rvr remains to be established. Rosettes have rarely been described in the

brain post-mortern (27) and rosette formation is negatively correlated with

adherence, suggesting that isolates of P. falciparuin have a propensity for

either rosette formation or cytoadherence, but not both (13). Alternatively,

infected erythrocytes that have formed rosettes may not be able to adhere

unless the rosettes are disrupted first (11). Nevertheless, we and other

workers (39) observed formed rosettes binding to HUVECs and melanoma

cells although they have not been disrupted. Furthermore, disruption of

rosettes prior to incubation with melanoma ceIls did not affect the

cytoadherence capacity of wild isolates (37). The role of cytokines in rosette

formation has not been studied, and why TNF-a levels in blood should be

positively correlated with in vitro rosette formation is not clear and requires

further investigations.

Although resistance to antimalarial drug cannot be considered as a

truc virulence factor, we studied it because resistance, and therefore

ineffective treatement, can lead to the development of CM (lO). The

66

chloroquine and quinine ICso values did not correlate with the severity of

the disease in this study, in which 35% of the patients stated they had taken

chloroquine before admission to hospital.

Cytoadherence is thought to be the essential factor at the origin of CM.

In vitro models of cytoadherence are numerous but their receptor

expression differs. HUVECs show low-level basal ICAM-1 expression and

lack CD36 receptors (34). Therefore, HUVECs are not representative of

endothelial cells in general because endothelial cells from other tissues,

including human dermal microvascular endothelial cells and human brain

endothelial cells, express receptors such as CD36 (32, 34). As there are large

variations in ICAM-1 expression on HUVECs (12), we pooled cells from at

least four cords. C32 melanoma cells express both types of receptor, with a

predominance of CD36 which is mainly responsible for cytoadherence in

this model. In the present study, we used both HUVECs and melanoma cells

because the respective pathophysiological roles of ICAM-l and CD36 are still

controversial. The modulation of cytoadherence by cytokines was only

studied with HUVECs as cytoadherence of parasitized erythrocytes to

melanoma cells is unaffected by cytokines (14). A relationship between in

vitro cytoadherence to CD36/ICAM-l and disease severity has not been

formally demonstrated. Isolates from SM patients adhere more to

melanoma cells and plastic absorbed CD36 than do isolates from UM

patients, but binding does not differ between isolates from CM and UM

patients (14, 20, 22). Our results are consistent with these studies, as no

difference in adherence to either cell types was observed between the

isolates from patients with CM, SM and UM. Isolates did, however,

consistently adhere more to melanoma cells than to HUVECs. The absence

of any relationship between the results of in vitro models of cytoadherence

and clinical features raises a further hypothesis. Such cell systems may not

be accurate models of sequestration or CM, and should thus perhaps be

considered rather as binding models reflecting the ability of isolates to

adhere to specifie receptors. On the other hand, it has not been formally

demonstrated that clinical manifestations stem from sequestration and

cytoadherence. Sequestration of parasitized erythrocytes is observed more

often in patients dying of CM, but also occurs in patients with no

neurological symptoms (19). CM withno evidence of cerebral sequestration

has also been reported (3, 35). Conversely, rosette formation is related to the

severity of the disease, but the presence of rosette formation during CM is

still controversial.

67

High TNF-a levels have been considered as a prognostic factor in

children with CM (9). TNF-a increases the in vitro adherence of

erythrocytes infected with P. falciparum ITü4 strain to endothelial cells by

causing ICAM-1 over-expression (2). It has therefore been suggested that a

TNF-a-induced increase in surface expression of ICAM-1 on endothelial

cells in brain capillaries could lead to sequestration and, thus, CM. Isolates

from patients with CM would therefore be expected to show higher binding

to HUVECs stimulated with TNF-a. In our study, TNF-a enhanced the

binding (percentage of modulation> 50%) of only 5/21 isolates. TNF-a

stimulation of HUVECs did not enhance the binding of any isolates from

CM patients, but enhanced the binding of isolates that spontaneously show

high binding to unstimulated HUVECs.

Although we did not formally demonstrate the exclusive role of the

ICAM-1 receptor in the enhancement of cytoadherence after TNF-a

stimulation, ICAM-1 may participate in 75% at least (23). Therefore, the

involvement of other receptors including receptors that remain to be

identified in cytoadherence phenomena is probable, but to a lower extent.

TNF-a induces thrombospondin secretion by cultured endothelial cells (5)

and although thrombospondin could alone mediate the binding of infected

erythrocytes, CD36 is most probably the receptor for thrombospondin (30).

CD36 is not, however, expressed on HUVECs (34). VCAM-1 and ELAM-1 are

absent from unstimulated endothelial cells but their expression can also be

increased by TNF-a. However, the kinetics and the concentrations required

to obtain maximum expression are different from those of ICAM-1 (24, 33).

The TNF-a concentrations used for stimulation were more than 2.5

times higher than the concentration in the peripheral blood of children

dying of CM (9). The IL-6 concentrations used were also more than 20 times

higher than the highest concentration found in the patients. These high

levels were chosen to ob tain a maximal effect, and it should be noted that

levels of cytokines in peripheral blood do not necessarily reflect local

secretion in the brain. In our results, GM-CSF, IL-3 and IL-6 did not modify

cytoadherence but their effects on ICAM-1 and CD36 expression on HUVECs

has not yet been studied. The increased adherence observed with the

combination of TNF-a and IL-3 suggests an additive effect and probably a

different mode of action of IL-3 and TNF-a.

These results suggest that ICAM-1 is not the principal cytoadherence

receptor, particularly in CM but do not rule out its involvement. Indeed,

high ICAM-1 expression on HUVECs induced by TNF-a stimulation

68

enhanced cytoadherence of 5/21 isolates only, and showed no relation to

disease severity. Moreover, more isolates seem to express the ligand for

CD36 (a receptor expressed mainly by melanoma cells) than that for ICAM-1

(a receptor expressed by HUVECs), as confirmed by our in vitro results and

by a previous study using plastic plates coated with purified CD36 and

ICAM-1 receptors (22).

To complete the in vitro results, we also measured cytokine levels in

the patients. Our results confirmed previous studies in which TNF-a and

IL-6 levels were related to clinical and biological markers of severity (9, 16,

17, 21, 29), but high levels in peripheral blood were not specifically

associatedwith CM or death. Most of the patients' sera contained little or no

IL-3 or GM-CSF. Only TNF-a is elevated during the course of malaria and

also enhances cytoadherence to stimulated HUVECs. But, the combination

of high levels of TNF-a in the peripheral blood and increased binding is not

specifie for CM, as it was observed in two cases of SM and one case of UM.

Our results also underline the contrast between human disease and the

murine model. The mechanisms involved in man and in mice are quite

different, particularly with regards to cell sequestration in brain capillaries.

ln the murine model, GM-CSF and IL-3 are essential mediators of CM,

whereas IL-6 is rather involved in hypergammaglobulinemia (7). In man,

IL-6 is a marker of severe malaria, whereas GM-CSF and IL-3 are increased

little if at aIl during malarial attack. Furthermore, these cytokines did not

modify in vitro cytoadherence to HUVECs.

ln summary, only rosette formation in vitro correlated with the

severity of the disease in this study. TNF-a enhanced in vitro ·cytoadherence

of P. jalciparum-infected erythrocytes to HUVECs, but only with isolates

with high capacity for binding to unstimulated HUVECs. Further studies are

required to elucidate the role of the receptors potentially involved in

cytoadherence and the role of cytokines during cerebral malaria.

ACKNOWLEDGEMENTS

We wish to thank D. Candito, P. Marsan (Military Hospital,

Antananarivo), C. Genin and L. Raharimalala (Institut Pasteur of

Madagascar) for their collaboration, C. Chougnet, P. Deloron and G. Milon

for critical comments. This study was supported by AUPELF/UREF. P. R.

was a recipient of a fellowship from Fondation Mérieux.

69

REFERENCES

1. Barnwell, J. W., A. S. Asch, R. L. Nachman, M. Yamaya, M. Aikawa, and P.

Ingravallo. 1989. A human 88-kD membrane glycoprotein (CD36)

functions in vitro as a receptor for a cytoadherence ligand on

Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes. J. Clin. Invest. 84:765-772.

2. Berendt, A. R., D. L. Simmons, J. Tansey, C. I. Newbold, and K. Marsh.

1989. Intercellular adhesion molecule-1 is an endothelial cell adhesion

receptor for Plasmodium falciparum . Nature 341:57-59.

3. Boonpucknavig, V., S. Boopucknavig, R. Udomsangpetch, and P.

Nitiyanant. 1990. An immunofluorescence study of cerebral malaria. A

correlation with histopathology. Arch. Pathol. Lab. Med. 114:1028-1034.

4. Carlson, J., H. Helmby, A. V. S. Hill, D. Brewster, B. M. Greenwood, and

M. Wahlgren. 1990. Human cerebral malaria : association with

erythrocyte rosetting and lack of anti-rosetting antibodies. Lancet ii:1457­

1460.

5. Dunn, S., A. J. Hillam, F. Stomski, B. Jin, C. M. Lucas, A. W. Boyd, G. W.

Krissansen, and G. F. Burns. 1989. Leukocyte adhesion molecules

involved in inflammation. Transpl. Proceed. 21:31-34.

6. Grau, G. E., L. F. Fajardo, P. F. Piguet, B. Allet, P. H. Lambert, and P.

Vassalli. 1987. Tumor necrosis factor (cachectin) as an essential mediator

in murine cerebral malaria. Science 237:1210-1212.

7. Grau, G. E., K. Frei, P. F. Piguet, A. Fontana, H. Heremans, A. Billau, P.

Vassalli, and P. H. Lambert. 1990. Interleukin 6 production in

experimental cerebral malaria: modulation by anticytokine antibodies

and possible role in hypergammaglobulinemia. J. Exp. Med. 172:1505­

1508.

8. Grau, G. E., V. Kindler, P. F. Piguet, P. H. Lambert, and P. Vassalli. 1988.

Prevention of experimental cerebral malaria by anticytokine antibodies.

Interleukin 3 and granulocyte macrophage colony-stimulating factor are

intermediates in increased tumor necrosis factor production and

macrophage accumulation. J. Exp. Med. 168:1499-1504.

9. Grau, G. E., T. E. Taylor, M. E. Molyneux, J. J. Wirima, P. Vassalli, M.

Hommel, and P. H. Lambert. 1989. Tumor necrosis factor and disease

70

severity in children with falciparum malaria. New Engl. J. Med. 320:1586­

1591.

10. Greenwood, B. M., K. Marsh, and R. Snow. 1991. Why do sorne African

children develop severe malaria? Parasitol. Today 7:277-281.

11. Handunnetti, S. M., T. H. Hasler, and R. J. Howard. 1992. Plasmodium

falciparum-infected erythrocytes do not adhere well to C32 melanoma

cells or CD36 unless rosettes with uninfected erythrocytes are first

disrupted. Infect. Immun. 60:928-932.

12. Hiromatsu, Y., M. Sato, K. Yamada, and K. Nonaka. 1991. Inhibitory

effects of nicotinarnide on recombinant human interferon-gamma­

induced intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-l) and HLA-DR

antigen expression on cultured human endothelial cells. Immunol.

Letters 31:35-40.

13. Ho, M., T. M. E. Davis, K. Silamut, D. Bunnag, and N. J. White. 1991.

Rosette formation of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from

patients with acute malaria. Infect. Immun. 59:2135-2139.

14. Ho, M., B. Singh, S. Looareesuwan, T. M. E. Davis, D. Bunnag, and N. J.

White. 1991. Clinical correlates of in vitro Plasmodium falciparum

cytoadherence. Infect. Immun. 59:873-878.

15. Jaffe, E. A., R. L. Nachman, C. G. Becker, and C. R. Minick. 1973. Culture

of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification

by morphologie and immunologie criteria. J. Clin. Invest. 52:2745-2756.

16. Kern, P., C. J. Hemmer, J. Van Damme, H. J. Gruss, and M. Dietrich. 1989.

Elevated tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 serum levels as

markers for complicated Plasmodium [alciparum malaria. Am. J. Med.

87:139-143.

17. Kwiatkowski, D., A. V. S. Hill, I. Sambou, P. Twumasi, J. Castracane, K.

R. Manogue, A. Cerami, D. R. Brewster, and B. M. Greenwood. 1990. TNF

concentration in fatal cerebral, non-fatal cerebral, and uncomplicated

Plasmodium [alciparum malaria. Lancet ii:1201-1204.

18. Le Bras, J., B. Andrieu, I. Hatin, J. Savel, and J. P. Coulaud. 1984.

Plasmodium fa lei pa ru m : interprétation du semi-microtest de

71

chimiosensibilité in vitro par incorporation de 3H-hypoxanthine. Path.

Biol. 32:463-466.

19. MacPherson, G. G., M. J. Warrell, N. J. White, S. Looareesuwan, and o.A. Warrell. 1985. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural

analysis of parasited erythroeyte sequestration. Am. J. Pathol. 119:385-401.

20. Marsh, K., V. M. Marsh, J. Brown, H. C. Whittle, and B. M. Greenwood.

1988. Plasmodium falciparum : the behavior of clinical isolates in an in

vitro model of infected red blood cell sequestration. Exp. Parasitol. 65:202­

208.

21. Molyneux, M. E., T. E. Taylor, J. J. Wirima, and G. E. Grau. 1991. Tumour

necrosis factor, interleukin-6, and malaria. Lancet i:1098. (Letter.)

22. Ockenhouse, C. F., M. Ho, N. N. Tandon, G. A. Van Seventer, S. Shaw,

N. J. White, G. A. Jamieson, J. o. Chulay, and H. K. Webster. 1991.

Molecular basis of sequestration in severe and uncornplicated

Plasmodium falciparum malaria : differential adhesion of infected

erythroeytes to CD36 and ICAM-1. J. Infect. Dis. 164:163-169.

23. Ockenhouse, C. F., T. Tegoshi, Y. Maeno, C. Benjamin, M. Ho, K. E. Kan,

Y. Thway, K. Win, M. Aikawa, and R. R. Lobb. 1992. Human vascular

endothelial cell adhesion receptors for Plasmodium falciparum-infected

erythroeytes : roles for endothelial leukocyte adhesion molecule 1 and

vascular cell adhesion molecule 1. J. Exp. Med 176:1183-1189.

24. Pober, J. S., M. P. Bevilacqua, O. L. Mendrick, L. A. Lapierre, W. Fiers, and

M. A. Grimbrone.: Jr. 1986. Two distinct monokines, interleukin 1 and

tumor necrosis factor, each independently induce biosynthesis and

transient expression of the same antigen on the surface of cultured

human vascular endothelial cens. J. Immunol. 136:1680-1687.

. 25. Pober, J. S., M. A. Grimbrone, Jr., L. A. Lapierre, o. L. Mendrick, W. Fiers,

R. Rothlein, and T. A. Springer. 1986. Overlapping patterns of activation

of human endothelial cells by interleukin l, tumor necrosis factor, and

immune interferon. J. Immunol. 137:1893-1896.

26. Pober, J. S., L. A. Lapierre, A. H. Stolpen, T. A. Brock, T. A. Springer, W.

Fiers, M. P. Bevilacqua, o. L. Mendrick, and M. A. Grimbrone, Jr. 1987.

Activation of cultured human endothelial cells by recombinant

72

lymphotoxin : comparison with tumor necrosis factor and interleukin 1

species. J. Imrnunol. 138:3319-3324.

27. Riganti, M., E. Pongponratn, T. Tegoshi, S. Looareesuwan, B.

Punpoowong, and M. Aikawa. 1990. Human cerebral malaria in Thailand

: a clinico-pathological correlation. Immunol. Letters 25:199-206.

28. Roberts, D. D., J. A. Sherwood, S. L. Spitalnik, L. J. Panton, R. J. Howard,

W. M. Dixit, W. A. Frazier, L. H. Miller, and V. Ginsburg. 1985.

Thrombospondin binds falciparum malaria parasitized erythrocytes and

may mediate cytoadherence. Nature 318:64-66.

29. Shaffer, N., G. E. Grau, K. Hedberg, F. Davachi, B. Lyamba, A. W.

Hightower, J. G. Breman, and P. Nguyen-Dinh. 1991. Tumor necrosis

factor and severe malaria. J. Infect. Dis. 163:96-101.

30. Silverstein, R. L., M. Baird, S. K. Lo, and L. M. Yesner. 1992. Sense and

antisense cDNA transfection of CD36 (glycoprotein IV) in melanoma

cells. Role of CD36 as a thrombospondin receptor. J. Biol Chem.

267:16607-16612.

31. Singh, B., M. Ho, S. Looareesuwan, E. Mathai, D. A. Warrell, and M.

Hommel. 1988. Plasmodium [alcipurum : inhibition/ reversal 0 f

cytoadherence of Thai isolates to melanoma cells by local immune sera.

Clin. Exp. Immunol. 72:145-150.

32. Smith, H., J. A. Nelson, C. G. Gahmberg, I. Crandall, and I. W. Sherman.

1992. Plasmodium [alciparum : cytoadherence of malaria-infected

erythrocytes to humain brain capillary and umbilical vein endothelial

cells - a comparative study of adhesive ligands. Exp. Parasitol. 75:269-280.

33. Swerlick, R. A., K. H. Lee, L. J. Li, N. T. Sepp, S. W. Caughman, and T. J.Lawley. 1992. Regulation of vascular cell endothelial molecule 1 on

human derrnal microvascular endothelial cells. J. ImmunoL 149:698-705.

34. Swerlick, R. A., K. H. Lee, T. M. Wick, and T. J. Lawley. 1992. Human

dermal microvascular endothelial but not human umbilical vein

endothelial cells express CD36 in vivo and in vitro. J. Immunol. 148:78­

83.

35. Toro, G., and G. Roman. 1978. Cerebral malaria. A disseminated

vasculomyelinopathy. Arch. Neurol. 35:271-275.

73

36. Trager, W., and J. B. Jensen. 1976. Human malaria parasites ln

continuous culture. Science 193:673-675.

37. Treutiger, C. J., I. Hedlung, H. Helmby, J. Carlson, A. jepson, P. Twumasi,

D. Kwiatkowski, B. M. Greenwood, and M. Wahlgren. 1992. Rosette

formation in PLasmodium falciparum isolates and anti-rosette activity of

sera from Gambians with cerebral or uncomplicated malaria. Am. J. Trop.

Med. Hyg. 46:503-510.

38. Udeinya, I. J., J. Leech, M. Aikawa, and L. H. Miller. 1985. An in vitro

assay for sequestration: binding of PLasmodium jaLciparum-infected

erythrocytes to formalin-fixed endothelial cells and amelanotic

melanoma cells. J. ProtozooI. 32:88-90.

39. Udomsangpetch, R., H. K. Webster, K. Pattanapanyasat, S. Pitchayangkul,

and S. Thaithong. 1992. Cytoadherence characteristics of rosette-forming

PLasmodium [alciparum. Infect. Immun. 60:4483-4490.

40. Wahlgren, M., J. Carlson, R. Udomsangpetch, and P. Perlmann. 1989.

Why do PLasmodium jaLciparum-infected erythrocytes form spontaneous

erythrocyte rosettes? ParasitoI. Today 5:183-185.

41. World Health Organization. 1990. Severe and complicated malaria.

Trans. R. Soc. Trop. Hyg. 84 suppl. 2:1-65.

42. Wright, P. S., D. Cross-Doersen, P. P. MacCann, and A. j. Bitonti. 1990.

PLasmodium [alciparum : a rapid assay for cytoadherence of [3H]

hypoxanthine-Iabeled infected erythrocytes to human melanoma cells.

Exp. ParasitoI. 71:346-349.

74

FIG. 1. Comparison of rosette formation with 21 isolates of P. falciparum

from patients with cerebral, severe and uncomplicated malaria. The bars

indicate the median values and the asterisks indicate fatal outcome.

FIG. 2. Cornparison of cytoadherence to human umbilical vein endothelial

cells and to C32 amelanotic melanoma cells of erythrocytes infected with 21

isolates of P. [alciparum, in relation to the severity of the disease. The bars

indicate the median values and the asterisks indicate fatal outcome.

FIG. 3. Modulation of cytoadherence after human umbilical vein

endothelial cell stimulation with TNF-a (20 ng/ ml), GM-CSF (20 ng/ ml), IL­

3 (20 ng/m!), IL-6 (100 ng/ml) and with two by two combinations of the

cytokines. The binding assay was performed with 21 isolates of P.

[alciparum, Results are expressed as median percentages of modulation

relative to controis (without cytokine stimulation).

FIG. 4. Comparaison of cytoadherence modulation after human umbilical

vein endothelial cell stimulation with TNF-a (20 ng/m!), GM-CSF (20

ng/ ml), IL-3 (20 ng/ mI) and IL-6 (100 ng/ mI) with 21 isolates of P.

[a lcip ar u m from patients with cerebral (n=6), severe (n=6) and

uncomplicated malaria (n=9). Results are expressed as median percentages

of modulation relative to controls (without cytokine stimulation).

75

TABLE 1. Clinical and laboratory features of patients with cerebral, severe, and uncomplicated malaria

'-JQ'\

Parameters

Age (yrs)

Sex ratio (M/ F)

Duration of symptoms (days)

Parasite density

(geometrie mean/ ul)

Haemoglobin (g/ dl)

Red blood cell count (106/ ul)

Whi te blood cell count (/ ul)

Platelet count (103/ ul)

Serum bilirubin (umol/I)

Serum creatinine (umol/I)

tl mean ±SD.

cerebral malaria (n=10)

25.4 ± 9.7

1

3.2 ± 2.1

99761

8.6 ±3.8

3.1 ± 1.4

6750 ± 3865

68.1 ± 54.4

31.8 ± 24.7

227.4 ± 245.3

Values for patients groupa

severe malaria (n=lO)

19.9 ± 10

2.3

3.3 ± 2.7

115570

7.6 ±3.9

2.7 ± 1.4

4000 ± 2582

65.9 ± 54.8

25.4 ± 15.5

118 ± 61.8

uncomplicated malaria (n=26)

15.3±11.9

1.4

1.3 ± 1.9

80574

11.2 ± 2.4

4.1 ± 0.8

7569 ± 3598

134.7 ± 78

12 ± 7.1

78.1 ± 31

TABLE 2. Comparison of levels of TNF-a, IL-6, and GM-CSF in plasma in patients

with cerebral, severe and uncomplicated malaria

Cytokine concentrationsa

Patient

group

Controls

(ne-ô)

Cerebral malaria

(n=lO)

Severe malaria

(n=lO)

Uncomplicated malaria

(n=26)

lNf-a

pg/ml

< 6b

lIIe(44-280)

149c

(71-312)

45C

(29-71)

IL-6

pg/ml

<3b

101(38-266)

133

(69-253)

33

(15-71)

GM-CSf

pg/ml

4.9

(4.3-5.6)

4.1

(3.4-4.8)

4.5

(3.8-5.3)

5.2

(4.4-6.3)

'""-J'""-J

a geometric mean (95% CI).

b P <0.003, Mann-Whitney U test versus patients.

cp <0.005, Kruskall-Wallis test.

'-l(Xl

501

n=6 n=6 n=9

cr0

140 -

C0

1 h.......l'Cl

E1 1...

030"Tj -QJ.-. ... a*C1Q ...

QJ

t: fi) b0 k"1 ...ft) - c~

0 20 1QJ - mel) d nl'Cl 0... e*c pQJ\,J...QJ

10..Jp..

1f* -q-

o ,1 , i , rstu

i

cerebral severe uncomplicatedmalaria malaria malaria

'-J'-D

l n~6 n=6 n=9

200~ n=6

n=6 n=9h 350 5 317

1 80 q 91 In 253- -l/)II)~

~ 40 ........ >.>. \J\J 0 , r0 '"'... ..c:..c:lI} h.... - .... li}

ê'Qj r ê'= 150~ \J ~ ~

"'0"'; m "'0 \J

ja*~ cu

~ .... e* 'tJ e e*.... -\J ~~ 0

~.::: ..... c f*.........l'Tj c 0 f*

c cu.... "'0 .... -""". Cl ~ 100OCJ .....c:

-gj-o ~ 20 '"' e 1 c n= "'0 a* t ~o --p-loi ~o ;r- .0 0rt) .or"l er"le -- uN ::s k 5 ::s

Z d 0 Z501 gkc tu

b i n clJ 0

bq

111

01 1 1 1 acerebral severe uncomplicated cerebral severe uncomplicatedmalaria malaria malaria malaria malaria malaria

Percentage of modulation

-10 o 10 20 30 40 50

TNF

CM-CSF

IL-3

IL-6

TNF+CM-CSF

TNF+IL-3

TNF+IL-6

CM-CSF+IL-3

GM-CSF+IL-6

IL-3+IL-6

* P < 0.01 versus TNF alone** P < 0.02 versus TNF alone

Figure 3

80

TNF

GM-CSF

IL-3

IL-6

Percentage of modulation

-10 0 10 20 30 40 50 GO

Il CM~ SMDI DM

Figure 4

81

Etude de la modulation de la cytoadhérence d'isolats de P. falciparum

sur des HUVEC après stimulation par le TNF-a, l'IL-3, l'IL-6 et GM-CSF

(articles II et III).

La deuxième partie de notre travail avait pour objectif spécifique l'étude

de l'influence des cytokines (en particulier les cytokines intervenant dans le

modèle murin) sur la cytoadhérence d'isolats de P. falciparum, Le phénomène

de cytoadhérence tel qu'il peut être exploré in vitro n'est qu'un reflet imparfait

des phénomènes survenant effectivement dans les capillaires humains. Outre

les mécanismes rhéologiques et la protection humorale de l'hôte, les tests de

cytoadhérence classiques in vitro ne prennent pas en compte toutes les

interactions cellulaires, en particulier, la modulation des récepteurs des cellules

endothéliales par les cytokines sécrétées dont l'importance au cours de l'accès

palustre simple et pernicieux a été démontrée.

L'influence des cytokines sur la cytoadhérence d'isolats de P. falciparum a

été étudiée uniquement pour les HUVEC car, parmi les trois types cellulaires à

notre disposition, les HUVEC sont les seules cellules dont l'expression des

récepteurs (ICAM-l, VCAM-1 et E-sélectine) peut être modulée par des

cytokines. Nous avons étudié l'influence de 4 cytokines à 3 concentrations

chacune, isolément ou en association pour certaines de ces cytokines: le TNF-a

et l'IL-6 qui sont des marqueurs de gravité au cours de l'accès palustre chez

l'Homme, l'IL-3 et le GM-CSF qui sont deux cytokines intervenant dans le

recrutement et l'activation des macrophages dans les capillaires cérébraux au

cours de l'accès pernicieux expérimental chez la Souris.

L'étude a porté sur les 21 isolats malgaches et sur 9 isolats prélevés chez

des patients (3 accès pernicieux, 3 accès sévères et 3 accès simples) hospitalisés

à l'hôpital Bichat-Claude Bernard. Au cours de ces travaux, nous avons utilisé

deux techniques de comptage des tests de cytoadhérence : un comptage

optique classique et un comptage isotopique. Afin de comparer les résultats

obtenus par lecture optique et isotopique, nous avons étudié la cytoadhérence

de 3 isolats à 5 parasitémies différentes. Dans tous les cas, les résultats avec les

deux méthodes sont fortement corrélés (r' = 1) (article II).

La stimulation des HUVEC par le TNF-a induit une élongation des

cellules. Cette modification morphologique est retrouvée lorsque le TNF-a est

associé à l'IL-3, à l'IL-6 et au GM-CSF, mais non lorsque ces 3 dernières

cytokines sont utilisées isolément (PHOTOS 3 et 4). Aucun effet dose/ réponse

82

n'a été observé pour les 4 cytokines utilisées à 3 concentrations différentes. A la

plus forte concentration, le TNF-a modifie significativement la cytoadhérence

(pM> 50 %) pour 6/30 isolats (5 accès sévères et 1 accès simple) et l'IL-3 pour 1

isolat d'accès pernicieux. L'association de l'IL-3 au TNF-a et l'association de

l'IL-3 et du GM-CSF au TNF-a augmentent significativement la cytoadhérence

par rapport au TNF-a utilisé seul (p < 0,02). Aucune autre association

n'augmente la cytoadhérence par rapport à la cytokine util~sée isolément. La

modulation de la cytoadhérence par les cytokines n'est pas fonction de la

gravité de la maladie mais, pour un isolat donné, la capacité du TNF-a à

augmenter la cytoadhérence est liée à la capacité de cet isolat à adhérer sur les

HUVEC à l'état basal (articles II et ID).

83

Ph otos :1 et" <. ,ttf7/ri /1f1ll IJ1l "ur de.o1Lf\'H .) <timuh' '

dh ér n-llule

p.u du I l

» in itro d e globu les rouge, pa r sites pa r P.ndoth élia lc ... d e o rdo ns o mbilica ux hu m ains

r u ( la dose dl' 20 ng l m l pendan t 24 h (x 1000)

AIR.1rJ[CIL]E J[JIJ[

SOCI~rt DE BIOlOOlI!

C. R. Soc. Biol., 1992, 186, 215-225.

Biologie parasitaire,

Participation des cytokines et des sérums immunsà la cytondhérence des hématies parasitées

par Plasmodium falciparumsur des cellules endothéliales en culture

215

par PASCAL RJNOWALO, JACQUES LE BRAS et JEAN SAVEL

Centre National de Référencede la Chimiosensibilité du Paludisme (IMET),

Hôpital Bichat-Claude Bernard, 46, me Henri-Huc/lard, 75877 Pariset Laboratoire de Biologie Parasitaire; Université Paris V,

4, avenue de l'Observatoire, 75006 Paris.

(reçue le 12 mai 1992).

Summary, - ln vitro binding capaclty of erythrocytes inf'eeted withP. folciparum and the modulation of cytoadherence on human endothe­lial cells by cytokines and sem from serni immune subjects in relationto cytoadherence were studied. Tumor necrosis factor and lnterleukin-J,alone or in combination with granulocyte macrophage-colony stimulatingfactor. enhaneed in vitro cytoadherence, Contrary to pooled immune sera,patients' sera obtained during acute or convalescent phase did not reversenor inhibit in vitro cytoadherence,

Rësumë. - La capacité des hématies parasitées par des souches deP. falciparum à adhérer sur des cellules endothéliales humaines en culture,ainsi Que la modulation de la cytoadhérence par des cytokines et pardivers sérums, ont été étudiées. Le /( tumor neerosis factor" etl'Iruerleukine-J utilisés seuls ou leur association avec le Cl granulocyternacrophage-colony stimulating factor" peuvent augmenter la cltoadhé­renee in vitro. Les sérums de sujets semi-immuns inhibent et réversentla cytoadhérence in vitro, contrairement au:'( sérums de malades à la phaseaiguë ou en convalescence d'un accès palustre.

La physiopathologie de l'accès pernicieux à Plasmodium falciparumn'est que partiellement connue. L'une des hypothèses est la séquestra­tion des hématies infectées par des formes matures de P. falciparutttdans les capillaires. Au cours de l'infestation par P. falciparum, leshématies parasitées par des formes matures ne sont pas visibles dans

86

216 SOClllTl~ DE BIOLOoII!

le sang périphérique mais adhèrent à J'endothélium des capillaires pro­fonds, évitant ainsi leur destruction lors du passage par la rate. Cetteséquestration survient dans tous les organes, mais au cours de l'accèspernicieux (neuropaludisme stricto sensu), elle est plus importante auniveau du cerveau, ce qui serait à "l'origine des troubles neurolo­giques (1,0).

Les modèles de cytoadhérence ;11 vitro sont nombreux, mais de repro­ductibilité et de spéciflcité variables. La plupart des travaux récentsont été menés avec des lignées de mélanomes amélaniques C32 (6, 8).Bien qu'il ne soit pas certain que les cellules endothéliales de cordonsombilicaux humains (HUVEC) soient tout à fait semblables aux cel­lules endothéliales des capillaires cérébraux, ces deux types de cellulesendothéliales expriment en grande quantité des récepteurs ICAM-I,l'un des trois récepteurs supposés intervenir dans les phénomènes decytoadhérence entre les hématies parasitées et les cellules endothéliales,à l'inverse des mélanomes C32 exprimant majoritairement les récep­teurs CD36 (3). Nous avons préféré utiliser le modèle HUVEC, carvraisemblablement plus proche morphologiquement des cellules endo­théliales des 'capillaires cérébraux que les mélanomes, afin d'étudierla cytoadhérence d'isolats de P. falciparum et l'effet sur cette cytoadhérence de sérums de sujets non immuns ou serni-lmmuns, du« tumor necrosis factor-a » (TNF-a), de l'interleukine-3 (IL-3) el du« granulocyte macroplrage-colony stimulating factor» (GM-CSf), troiscytokines, médiateurs essentiels dans la survenue des complicationsneurologiques chez la Souris infectée par P. berghei (5).

SUJETS, MATÉRIEL ET MÉTHODES

Parasites

Neuf isolats de P. falclparum ont été prélevés chez des maladesprésentant un accès palustre de gravité différente: accès pernicieux(neuropaludisme) (n = 3), accès grave avec présence de troubles neu­rologiques autres que le coma (n = 3) ou accès palustre simple (n = 3).Les isolats étaient originaires du Cameroun (n = 3), du Sénégal(n = 2), du Kenya (n = 1), de la Côte-d'Ivoire (0 = 1), du Mali(n = 1) et du Togo (n = 1). Les hématies parasitées ont été prélevéesavant traitement et cryoconservées en azote liquide jusqu'au test decytoadhérence. Après décongélation, une maturation préalable de i4à 48 heures en culture a été effectuée pour obtenir les trophozoïleset les schizontes nécessaires cl la réalisation du test (14).

Cellules endothéliales

Les cellules endothéliales ont été obtenues à partir d'au moins3 veines de cordons ombilicaux humains, par action de la collagénase

87

socrsrs DI! DIOLOOII! 217

(1 mg/ml) (Boehringer Mannheim), et cultivées jusqu'à confluence (7).Pour le test, les cellules ont été mises en sous-cultures dans des plaquesde 24 puits sur des lamelles de culture de 15 mm de diamètre pré­enduites par de la fibronectine (Sigma).

Cytokines

Le l'NF-a, l'IL-3 et le GM-CSF recombinants (Genzyme) ont étédilués dans du tampon PBS additionné de 10 oro de sérum albuminebovine, aliquotés et congelés à - 80 0 C.

Sérums

Ont été étudiés: le sérum des malades à l'admission (phase aiguë),le sérum 7 jours plus tard (phase de convalescence), un mélange desérums de 7 adultes zaïrois, un mélange de sérums de 24 adultes came­rounais, un mélange de sérums de 19 adultes malgaches et un mélangede sérums de 20 donneurs européens groupe AB (sérums témoins). Lesadultes africains vivaient en zone d'endémie palustre et sont consi­dérés comme semi-irnmuns. Les sérums ont été adsorbés sur des glo­bules rouges AB, aliquotés et congelés. Les sérums des 9 malades ontété étudiés uniquement vis-à-vis des souches correspondantes.

Tests de cytoadhérence

Après lavage des cellules endothéliales avec du milieu RPMI (Gibco),50 J.lI d'hématies parasitées en suspension dans 450 JII de RPMI sup­plérnentés de 10 % de sérum humain AB, pH 6,9, sont ajoutés auxsous-cultures de cellules endothéliales et incubés pendant 90 minutesà une atmosphère enrichie de 5 % de C02 à 37 0 C. La lecture destests au microscope (objectif IOOX) se fait après lavage des lamellesdans 3 bains de milieu RPMl, fixation par le glutaraldéhyde et colora­tion par le Giemsa. Les résultats sont exprimés en nombre d'hématiesparasitées fixées pour 500 cellules endothéliales. La lecture microsco­pique des tests est faite en double aveugle et de la même manièrepour tous les tests, à savoir lecture sur la ligne médiane de la lamellede haut vers le bas puis de gauche vers la droite. Tous les tests sonteffectués en double et le résultat final est la moyenne des 2 tests.

Influence des cytokines

Les cellules endothéliales sont mises en contact avant le test pendantau moins 24 heures avec 20 ng/ml (400 U) de TNF-a, 20 ng/ml deIL-3 et 20 ng/ml de GM-CSF et par l'association des trois cytokinesà 20 ng/rnl chacune. Un contact avec du PBS à 10 f1{o de sérum albu­mine bovine sert de témoin. Le test de cytoadhérence est pratiquécomme il est décrit ci-dessus. Les résultats sont exprimés Cil pourcen­tage de modulation (PM) = (test - témoin) x lOO/témoin.

I!lOl00". CO"'T" "~oU'. - N" l. 1992. T. 1B6. 15

88

218 SOCI~T1! DB BIOlOOIE

Inhibition par les sérums

Dans un premier temps, 50 Jil de globules rouges parasités sont misen présence de SO ul des différents sérums pendant 30 minutes à 37° c.Les 100 111 du mélange des hématies et de sérum sont dilués dans 400 Idde milieu RPMI à pH 6,9 et le test de cytoadhérence est effectué co IIIIlleprécédemment. L'incubation des hématies avec le sérum AB est cousi­dérée comme le témoin et les résultats sont exprimés en pourcentaged'inhibition (PI) = (test - témoin) x lOO/témoin.

Réversion par les sérums

Après le test de cytoadhérence, les hématies non fixées sont aspiréeset SOO 111 de sérum dilué au 1:2 dans du milieu RPMI pH 6,9 sontajoutés pendant 30 minutes à 37° C. Le lavage. la fixation et [a colo­ration sont effectués de manière identique au test classique. La réver­sion des hématies parasitées avec le sérum AB est considérée commele témoin et les résultats sont exprimés en pourcentage de réversion(PR) = (test - témoin) x lOO/témoin.

Un seuil de slgniflcativité a été fixé à 20 % pour le PM, PI et le PRo

RÉSULTATS

Tests de cytoadhérence

Les résultats des tests ainsi que le pourcentage d'hématies parasitéesaprès décongélation sont indiqués dans le Tableau I. Les souches deP. falciparum ont été cultivées entre 25 et 40 heures, les trophozoïtes

TABLEAU L - Tests de eytoadhérence in vitro de 9 isolats de P, falciparum,

KEN CAMI TOO IVC MAL SENI CAM2 CAM3 SEN2

Tests de eytoadhé- 156 188 257 30 101 84 385 182 49renee (.,

Pourcentage d'héma- 2.9 3,7 1,8 2 2,7 3 6,2 3,2 1,8tics parasitées

Valeurs calculées ,.) 54 51 143 15 37 28 62 57 27

(., Résultats exprimés en nombre d'hématies parasitées adhérentes pour 500 cellulesendothéliales (moyenne de 2 tests),Les isolats de P. falciparum sont classés en fonction de leur origine géographique:Cameroun (CAM), Côte-d'Ivoire (IVC), Kenya (KEN), Mali (MAL). Sénégal lSEN).Togo (TOO). Les tests sont effectués au pourcentage d'hématies parasitées aprts décou­gélation (tests de cytoadhérence) el les valeurs sont ramenées à un pourcentage d'héma­lies parasitées de l "10 (valeurs calculées).

89

socrârê DE BIOLOGIIi 219

et les schizontes représentant plus de 80 % des formes parasitaires.L'importance numérique de la cytoadhérence des souches de P. falci­parum est fortement corrélée à la parasitémie, r compris entre 0,97et 0,99 (Fig. 1). Ainsi, afin de comparer la cytoadhérence entre les

400.,...._----------------,......----------,

41 1PourclIntllgll d"httmlltllls pllrlls/lélls

O+--=-~--.,...._--~--_r_--~--.,...._--~-____i

o

Fla. 1. - lnfluence du pourcentage d'hématies parasitées par des trophozoi'teset des schizontes de P. falciparum sur la cytoadhérence étudiée pour J isolats.

souches, les résultats peuvent être calculés pour une parasitémie de1 %. Néanmoins. l'étude de la relation entre la cytoadhérence et lagravité de la maladie n'est pas possible en raison du nombre tropfaible de sujets par groupe. Le seuil de 20 % fixé pour la slgnificati­vité des tests de modulation de la cytoadhérence par les cytokines etles sérums prend en compte la moyenne des variations pour chaquetest effectué en double, soit 16,8 %. La valeur de 20 % correspondà l'intervalle supérieur de confiance 95 % pour les 162 tests effectués.En effet, pour chaque isolat, ont été pratiqués 18 tests de cytoadhé­renee (un test témoin, un test avec du sérum albumine bovine, 4 testsavec les différentes cytokines et leur association, 6 tests d'inhibitionet 6 tests de réversion avec les différents sérums), soit au total 162 testspour les 9 isolats.

Inl1uence des cytokines

La stimulation par le TNF-a induit une transformation fibroblas­tique des cellules endothéliales. Cette modification est aussi observéeaprès la stimulation par l'association TNf'-a, IL-3 et GM-CSF, maispas pour l'IL-3 et le GM-CSF utilisés isolément. Le TNF-a et l'IL-3augmentent la cytoadhérence significativement dans 3 cas, alors que

90

220 soclI!Té DE BIOLOGl!!

le GM-CSF la réduit dans 3 cas (Tableau Il). L'association des troiscytokines augmente la cytoadhérence dans tous les cas, mais significa­tivement dans 8 cas.

TAIII.F.AU II. - Influence du « turner neerosls racrcr-n Il (TNf-l1), de l'Interleukine-J(IL·J), du 'l granulocyte macrophage-colony Slirnllialing factor Il (OM-CSf) el de leurassoelation è la dose de 20 ng/ml sur la cytoadhérence in vitro d'hématies parasitéespar P. jalciparum.

TNF.Q Col IL-J Col GM.CSF (01 TNF·Q + IL·J+ GM-CSF '01

KEN - 8 + 7 _ 25 Ibl + 126 Ibl·

CAMI + J6 cbl - 9 + 8 + 74 Ibl

TOO + 2J Ibl + 4 + 4 + 20 Ibl

IVC - 6 + 6 _ 26 Ibl + 26 Ibl

MAL + 8 - J + 1 + 14SENI + 68 cbl + 33 (bl - 2 + 71 Ibl

CAM2 + J + 29 Ibl _ 20 Ibl + 102 cbl

CAMJ + 4 + 45 (bl + 10 + 77 lb'

SEN2 -11 + 4 - 8 + J7 Ibl

loI Résultats exprimés en pourcentage de modulation (PM) = (test - témoin)x loo/Iémoin.

Ibl PM modirié significativement (PM > 20 ou < - 20).

Inrluence des sérums

Le PI est significativernent abaissé dans 2 cas sur 9 par les sérumsde JO et malgaches, dans 3 cas sur 9 par les sérums de 17 et dans6 cas sur 9 par les sérums camerounais et zaïrois (Fig, 2). Les sérumsde JO ne modifient pas significativement le PR, alors que celui-ci estsignificativement réduit dans 2 cas sur 9, 3 sur 9, 4 sur 9 et 4 sur 9par les sérums malgaches, de 17, camerounais et zaïrois, respective­ment (Fig. 3). Comparés aux sérums témoins, les sérums de JO, 17et malgaches ne modifient pas significativement le Pl et le PR, àl'inverse des sérums camerounais et zaïrois (p < 0,05). De plus lesPI et les PR sont fortement corrélés (r 0,60; p < 0,01),

DISCUSSION

Des travaux récents ont déterminé 3 types de récepteurs potentielle­ment impliqués dans les phénomènes de cytoadhérence : la thrombo­spondine, le CD36 et l'ICAM-I (4). L'expression de ces récepteursau niveau des capillaires cérébraux reste débattue. Elle a été mise enévidence au niveau des capillaires cérébraux au cours d'autopsie mais

91

20

0

f~~ ~ 1"

l~• KEN

C;~0<.- 1 o CAI"II

....-~. -20 <

• rOGs:c

f3 IVC- ..."0 -<10F2J MAL

~in.'"4

lU

""Cl~ SENI 0ro

ra.... -60f3 CAM2

CIlcÔlU

8u.. CAM3l-

iii:::J0 -ao

Il 5EN2a.

-100JO J7 Cameroun zarre rtaoaqascar

Sérum s

\0N

FIO. 2. - lnhlbltion de la cytoadhérence in ...itro par le sérum des malades à l'admission (10), 7 jours plus lard(17) et par des mélanges de sérums immuns du Cameroun. du Zaïre et de Madagascar. Les isolats de P. jalcipaTTlmsont classés en Ionction de leur origine géographique, comme indiqué dans le Tableau 1.

NN

20

c00-

(fJ

l-eu>

-4l-20l-

eu"0

QJ

en -40ro~

CQJ

U

3 -600Q.

-80JO J7 Cameroun

Sérum sZaire rtaoaqascar

• KEN

o CAMI

• rOG

El IVC

~ MAL

§ SENI

I::J CAM2

• CAM3

III 5EN2

..........

~in.~l:lfil

caôscëil

'.D(.;J

FIG. 3. - Réversion de la cyroadhérence in vitro par le sérum des malades à "admission (10), 7 jours plus lard(J7) et par des mélanges de sérums immuns du Cameroun, du Zaïre el de Madagascar. Les isolats de P. [alclparumsont classes en fonction de leur origine géographique, comme indiqué dans Je Tableau 1.

SOCIÉTÉ DB BIOLOOIE 223

chez des patients décédés d'une autre cause que le paludisme (1). Laplupart des études il, vitro ont été effectuées avec les mélanomes plutôtqu'avec les cellules endothéliales en raison de la facilité de la culture,alors que la morphologie et l'expression des récepteurs sont diffé­rentes (2,13). La présence des récepteurs (CAM-l pouvant varier entreles populations de cellules endothéliales en culture, nous avons utilisépour chaque test au moins 3 cordons ombilicaux différents afind'obtenir un mélange supposé hétérogène de cellules et d'éviter desvariations entre les tests, une suspension différente de cellules endo­théliales ayant été utilisée pour chaque isolat. Pour les mêmes raisons,tous les tests ont été effectués après 4 jours de sous-culture des cel­lules endothéliales et après 25 à 40 heures de culture de Plasmodium.La lecture microscopique des tests, bien que faite en insu, reste sub­jective. Une mesure isotopique, dont la technique est en train d'êtremise au point, permettra un gain de temps et de sensibilité.

La congélation des isolats de P. falcipanun induit une perte de maté­riel et pourrait sélectionner des clôues. Néanmoins, des études anté­rieures ont montré qu'il n'existait pas de différence d'adhérence desisolats avant et après congélation (8). Comme pour le modèle des méla­nomes C32, les isolats de P. falciparum possèdent des caractéristiquesdifférentes de cytoadhéreuce selon les souches avec le modèle HUVECet la cytoadhérence est corrélée à la parasitémie (6). Le TNF-a induitune augmentation de l'expression des récepteurs ICAM-I à la surfacedes cellules endothéliales (9). Une élévation conjointe du taux de TNF-aet de l'expression accrue de récepteurs ICAM-I pourrait expliquer laséquestration des globules rouges parasités dans les capillaires céré­braux au cours de l'accès pernicieux. Cependant, l'augmentation duTNF-a n'est pas spécifique de l'accès pernicieux et peut se rencontrerau cours d'accès palustre grave (11). D'autre part, le TNF-a n'a aug­menté la cytoadhérence que dans 3 cas sur 9. Le mode d'action del'IL-3 et du GM-CSF et leur concentration au cours de l'accès perni­cieux ne sont pas connus. L'augmentation de la cytoadhérence parl'association des trois cytokines suggère, si ce n'est une synergie, aumoins une association des effets. Nos différents résultats confirmentque le TNF-a n'est pas un médiateur isolé au cours de l'accès perni­cieux.

Le mélange de sérums de patients senti-immuns entraine l'inhibitionet la réversion de la cytoadhérence in vitro d'hématies parasitées SUrdes cellules endothéliales, à l'inverse des sérums de malades à la phaseaiguë et de convalescence. La capacité des sérums à diminuer la cyto­adhérence est plus importante pour les sérums en provenance du Came­roun et du Zaïre (zones de transmission de paludisme stable) Que pourles sérums de sujets des Hauts Plateaux malgaches (zone de paludismesaisonnier instable). Notre étude confirme que des sérums de patientssenti-Immuns peuvent entrainer une inhibition et une réversion de lacytoadhérence de souches de P. falciparum d'une même région géo­graphique, mais en plus montre que ces sérums peuvent agir sur des

94

224 socràrâ 06 810LOOIl!

souches de zones géographiques différentes, l'action des sérums étantnéanmoins meilleure dans la première situation (12). L'inhibition dela cytoadhérence ill vitro pourrait correspondre ill vivo à la capacitédu sérum, chez des sujets senti-immuns, à limiter ou à empêcher lacytoadhérence dans les capillaires. Le "test de réversion est lin meilleurreflet des possibilités thérapeutiques éventuelles par des sérums ou pardes immunoglobulines G, bien que l'action in vitro de ces dernièresn'ait pas encore été totalement prouvée.

En conclusion, cette étude montre les possibilités de modulation dela cytoadhérence de P. falciparum ill vitro aux cellules endothélialeshumaines par des cytokines et par des sérums semi-immuns. D'autresétudes sont nécessaires pour préciser le mécanisme d'action des cyto­kines, en particulier la modification de l'expression des récepteurs desurface. L'efficacité des sérums serni-immuns pour prévenir la cyto­adhérence avec le modèle HUVEC ou mélanome C32 a été prouvée.Le rôle des immunoglobulines G dans cette action reste à démontrer.Ces résultats obtenus ill vitro permettent d'entrevoir des possibilitésthérapeutiques adjuvantes. L'utilisation d'immunoglobulines, d'anti­corps anti-TNF ou de récepteurs solubles du TNF est une perspectiveséduisante mais leur innocuité et leur efficacité restent à démontrer.

BIBLlOORAPIIIB

1. Aikawa M.• Iseki M.• Barnwell J. W., Taylor D.• 00 M. M. & Howard R. J.,The pathology of human cerebral malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg .• 1990. 43(suppl.), 30-37.

2. Berendt A. R.• Fergusson D. J. & Newbold C. J.. Sequestration in Plasmodiumfolciparum malaria: sticky cells and sticky problems. Parasitol. Today, 1990,6. 247-254.

3. Berendt A. R., Simmons D. L.• Tansey J .• Newbold C. 1. & Marsh K.• lutercel­lular adhesion molecule-I is an endothelial receptor for Plasmodium [alciparum.Nature, 1989, 341. 57-59. .

4. Chulny J. D. & Ockenhouse C. F., Host receptors for malaria-infected erythrocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg.• 1990, 43 (suppl.), 6-14.

5. Grau G. E., Kindler V.• Piguet P. F.• Lambert P. H. & Vassalli P., Preventionof experhnental cerebral malaria by anticytokine antibodies. lnterleukin 3 andgranulocyte macrophage colony-stirnulating factor are intermediates in increasedturner necrosis production and macrophage accumulation. J. Exp. Med.• 1988,168. 1499-1504.

6. Ho M .. Singh B., Looareesuwan S., Davis T. M. E.• Bunnag D. & White N. J.•Clinical eorrelates of in vitro Plasmodium falciparum cytoadherence, Infect,lmmun., 1991, .59, 873-878.

7. Jaffe E. A., Nachrnan R. L., Becker C. G. & Minick R. C., Culture of humanendothelial cells derived from urnbilicaJ velns, J. CIi". lnvest.• 1973, .52. 2745-2756.

8. Marsh K., Marsh V. M., Brown J., Whiule Il. C. & Greewood B. M., Plasmo­dium fakiporum: the behavior of clinlcal isolates in a ill vitro model of infectedred blood cell sequestration. Exp. Parasitol.• 1988. 6.5, 2U2-2U8.

95

SOCŒTé DB BIOLOOlli ·225

9. Pober J. 5,. Girnbrone M. A., Lapierre L. 1\., Mendrick D. L., Fiers W., Roth­lein R. & 5pringer T. A., Overlapping patterns or activarion or human endothe­liai cells by interleukin l, tumor necrosis taeror, and immune interferon. J.Immunot.• 1986, IJ7, 1893-1896.

10. (>ongJlonratn E.. Riganli M., Punpoowong n. & Aikowa M., Microvascular seques­tratlon or parasited erythrocvres in humnn [alciparum lIIo/ari:l: :1 pathological5ludy. Am. J. Trop. M~d. lIY1f., 1991, 44. 168-175.

II. 5harrer N., Grau G. E.. Hedberg K.• Davachi F., Lyamba B., Hightower 1\. W.•Dreman J. G. & Nguyen-Dlnh (>., Tumor necrosis raclor and severe malaria.J. Infec, o«, 1991, 16J, 96-101.

12. 5ingh B., Ho M., Looareesuwan 5., Malhai E., Warrel D. A. & Hommel M.,Plasmodium fatciparum: inhibilion/reversal or cytoadherence or Thai Isolatesto melanoma cells by local immune sera. Clin. Exp. Immunol., 1988. 71, 145-150.

13. Swerlick R. A., Lee K. H., Wick T. M. & Lawley T. J., Human derrnal microvas­.cular endothelial but nol hurnan umbilical vein endothelial cells express CD36in vi,·o and in vitro. J. Immunol., 1992. 148. 78-83.

14. Trager W. & Jensen J. B., Human malaria parasites in continuous culture, Science.1976, 19J, 673-675.

96

Dosage des concentrations plasmatiques de TNf-a, d'IL-3, d'IL-6, d'IL­

2R, d'IL-l-a, d'IL-10, de GM-CSf, d'IFN-y et de néoptérine en fonction de la

gravité de la maladie et de la prémunition des malades (articles II, IV et V).

• Afin de compléter nos résultats in vitro, la dernière partie de notre

travail s'est intéressée à la participation des cytokines à la physiopathologie de

l'accès pernicieux. Outre la modulation de la cytoadhérence par certaines

cytokines, les objectifs spécifiques ont été:

- de comparer les concentrations plasmatiques en fonction de la gravité

de la maladie et du statut immunitaire des malades;

- de rechercher leur évolution au cours de la maladie;

- et de rechercher les relations entre les concentrations des différentes

cytokines entre elles et avec des facteurs cliniques et biologiques.

• Afin de comparer les concentrations de cytokines en fonction de la

gravité de la maladie, nous avons dosé, à l'admission, les concentrations

plasmatiques de TNF-a, d'IL-6, d'IL-3, d'IL-1-a, de GM-CSF, d'IFN-y chez 46

patients malgaches (la accès pernicieux, 10 accès sévères et 26 accès simples) et

les concentrations d'IL-ID chez 47 patients malgaches (12 accès pernicieux, Il

accès sévères et 24 accès simples) ainsi que chez 14 patients hospitalisés à

l'hôpital Bichat-Claude Bernard (6 accès pernicieux, 4 accès sévères et 4 accès

simples).

Parmi les cytokines étudiées, seules les concentrations de TNF-a, d'IL-lO

et d'IL-6 varient en fonction de la gravité de la maladie. Les concentrations de

TNF-a et d'IL-lO sont plus élevées au cours des accès pernicieux et des accès

sévères par rapport aux accès simples. Pour les concentrations d'IL-6, la

différence n'est significative que si le groupe des accès simples est comparé à

l'ensemble des accès graves (accès pernicieux et accès sévères confondus)

(articles II et IV).

Les concentrations d'IL-3, d'IL-l-a, de GM-CSF et d'IFN-y ne varient pas

en fonction de la gravité de la maladie. L'IL-1-a a été détectée dans le plasma de

7 malades malgaches (2 accès pernicieux et 5 accès simples) (extrêmes 18-585

pg/ml) et l'IL-3 dans le plasma de 4 malades malgaches (l accès pernicieux, 2

accès sévères et 1 accès simple) (extrêmes 7,4-12,5 pg1ml). Aucun témoin n'a

présenté de concentration détectable de ces deux cytokines. Les concentrations

de l'IFN-y (moyenne géométrique; IC9S %) en Ulml sont données dans le

tableau suivant (article II et données non publiées).

97

Témoins Accès pernicieux Accès sévères Accès simples

(n = 6) (n = 10) (n = 10) (n = 26)

4,4 6,5 5,6 6,7

2,7-7,4 4,8-8,8 4,5-7,4 5,5-8,3

• La comparaison des concentrations de TNF-a, d'IL-2R, de GM-CSF,

d'IFN-y et de néoptérine entre des sujets non prémunis et des sujets prémunis a

été menée chez 11 sujets européens et 5 sujets africains hospitalisés pour accès

palustre simple à l'hôpital Bichat-Claude Bernard. Les concentrations d'IL-2R,

d'IFN-y et de néoptérine au cours d'un accès palustre simple sont plus élevées

chez les sujets non prémunis que chez les sujets ayant des antécédents de

paludisme. Il n'existe pas de différence pour le lNF-a et le GM-CSF, sauf pour

le TNF-a à J7 (article V).

• L'évolution des concentrations de TNF-a, d'IL-2R, de GM-CSF, d'IFN-y

et de néoptérine au cours de l'accès palustre et pendant la phase de

convalescence a été étudiée chez 16 patients européens et africains hospitalisés

pour accès palustre simple à l'hôpital Bichat-Claude Bernard et pour l'IL-10

chez 11 patients. Ce suivi a montré que les concentrations de TNF-a, d'IL-lO,

d'IL-2R, de GM-CSF, d'IFN-y et de néoptérine baissent après l'instauration du

traitement antipaludique, sans pour autant revenir à des valeurs normales

après la phase aiguë de la maladie, en particulier 7 jours après le début de la

maladie alors que la parasitémie s'est négativée (articles IV et V).

• Au cours de ces différents travaux, nous avons rapporté que les

concentrations plasmatiques de TNF-a et d'IL-6 sont corrélées avec la

parasitémie, la bilirubinémie, la température et inversement corrélées au

nombre des plaquettes. En outre, les concentrations plasmatiques de TNF-a

sont corrélées avec les concentrations d'IL-6, d'IL-2R et avec le pourcentage de

formation de rosettes observé pour l'isolat infectant correspondant. Par contre,

la relation mise en évidence entre les concentrations plasmatiques de TNF-a et

celles d'IL-10 n'était pas statistiquement significative (r' = 0,37; P = 0,06). Les

concentrations plasmatiques d'IFN-a, d'IL-2R et de néoptérine sont corrélées

entre elles (articles II, IV et V).

98

AIP{JfJICCJLJE rv

article soumis à "Clinical and Experimental Immunology"

High levels of circulating IL-10 in human malaria

short title: IL-10 in P. falciparum malaria.

François Peyron(*), Nicolas Burdin(t), Pascal Ringwald(t), JeanPhilippe Vuillez(*t), Françoise Rousset(t), Jacques Banchereau(t)

(*) Service de parasitologie. Hôpital de La Croix Rousse 69317 Lyon, France and

Faculté de médecine, Université Claude Bernard Lyon, France.

(t) Schering-Plough, Laboratory for Immunological Research. Dardilly, France.

(t) Institut Pasteur de Madagascar, Laboratoire de Biologie Parasitaire Université

Paris V Paris, France.

(*t) Service de médecine nucléaire. Hôpital de Grenoble. Grenoble, France.

N. Burdin and P. Ringwald were recipients of grants fram the Fondation

Mérieux. Lyon, France.

Correspondence: F. PEYRON, département de parasitologie et pathologie exotique,

Université Claude Bernard. 8 avenue Rockefeller, 69373 Lyon cedex FRANCE

100

Abstract

Interleukin 10 is a monocytellymphocyte derived cytokine which has been shown

to inhibit certain cellular immune responses such as delayed hypersensitivity . In

particular, the production of TNF, IL1 and ILB which are involved in malaria

patnoloqy, are strongly inhibited by IL-10. Accordingly, we examined whether IL­

10 could be involved in a human acute parasitic infection such as Plasmodium

falciparum malaria. Human IL-10 levels in plasma were determined by 2 site

ELISA method, taking care of avoiding non specifie reactions due to

autoantibodies. Fourteen cerebral, 11 severe, and 20 mild malaria cases had

mean IL-10 levels of 2812. 2882, 913 pg/ml respectively, while 98% of healthy

individuals had undetectable (Iess than 100pg/ml) circulating IL-10. Thirteen of

the 25 cerebrall severe cases nad >200'0 pg/ml. In 11 hospitalized patients.

circulating IL-10 levels were found to decrease back to virtually normal levels

after 7 days when biological and clinical malaria features had disappeared (mean

levels tell trom 3880 to 333 pg/ml). Further studies are required to determine

whether these elevated levels of IL-10 play a beneficial role by reducing the

parasite induced inflammatory response, or a detrimental one by decreasing the

cellular immune responses.

key words: IL-10, ELISA. Plasmodium falciparum. cerebral malaria, TNFa.

101

Introduction

Malaria remains a major public health problem because of its important morbidity

and mortality. Cerebral malaria represents the most dramatic and Iife threateningcomplication of the disease [1]0 Recent studies have shown the pivotai role of TNFu

in the pathogeny of the disease [2]. In particular, the plasma levels of this cytokine

have been correlated with the seve rit y of the disease [3]. Other

monocytes/macrophages derived cytokines such as IL1 and IL6 have also beén

detected in the plasma of malaria patients [4-5].

Human IL-10 was recently found to be produced by monocytes [6-7] as weil as T

and 8 lymphocytes [8-9]. 1L-10 was round to rather act as an "antiinflammatory"agent able to block the production of IL6, TNFu, IL1 and other cytokines by

monocytes/macrophages [6]. This property, together with an inhibitory effect on the

expression of MHC Class Il antigens on monocytes/macrophages results in a strong

inhibition of the antigen presenting capacity of these cells and a consequent

inhibition of T lymphocyte proliferation [10]. In addition, IL-10 was recently shown to

induce the proliferation of 8 lymphocytes and most notably their differentiation into

plasma cells secreting immunoglobulins at high rate [11-12]. Taken together, IL-10

inhibits delayed type hypersensitivity reactions and stimulates humoral responses.

Recent studies carried out in mice beth in vivo and in vitro have suggested a

regulatory role for IL-10 in the mediation of susceptibility to acute parasiticinfections. In particular IL-10 inhibits the microbicidal activity of IFN y treated

macrophages against intracellular parasites as Toxoplasma gondii [13J

Trypanosoma cruzi [14] Leishmania major [15J and the extracellular killing of

Schistosoma mansoni schistosomulas [13-16]. This effect is associatec with

inhibition of the production of the toxic nitrogen oxyde metabolites [17]. Although 1:.:.falciparu m is an intraerythrocytic parasite, it may be cleared from the blood by

phagocytosis and killed by oxygen intermediates released by macrophages. These

results prompted us to examine whether IL-10 could a/so be involved in a human

acute parasitic infection such as severe malaria. The present study demonstrates

the presence of high levels of circulating IL-1 0 in cerebral, severe, and mild malaria.

102

Patients and methods

Population

The study was conducted in 2 different sites. In Antananarivo (Madagascar), a

malaria endemic area, the clinical and biological status of patients were

recorded only at admission to hospital. In French hospitals (hôpital Bichat,

Paris, and hôpital de la Croix Rousse, Lyon) patients could be followed for 7

days . Ail patients included in the study had Plasmodium falciparum infection

and parasitemia was counted on Giemsa stained thick smear. On day 0 (00)

patients underwent a physical examination and were classified, according to

W.H.O.,into 3 groups: cerebral malaria: patients with unrousable coma, severe

malaria: patients with hyperparasitemia (above 5%), anaemia, neurological

signs or hypoglycemia, mild malaria: patients with positive parasitemia but

without features of severe malaria.

Sampie collection

Venous blood was drawn on EOTA tube for full blood count , and examination

for malaria parasites. Plasma was immediately collected and frozen at -70°C.

The study was conducted on the surplus of blood withdrawn to perfom

diagnostic procedures prescribed bya physician.

Cytokines assav .

Plasma IL-10 levels were determined by a two-slte sandwich ELISA format,

kindly provided by John Abrams (ONAX, Palo Alto,CA) (18). One assay

quantitated both human IL-10 (hIL-1 0) and BCRF1 (viral IL-10) while the other

one was specific of BCRF1. Both assays relied on the same catcher antibody

Mab 907 and the specificity was determined by the tracer biotinylated antibody

: Mab 12G8 for the h1L-10 and BCRF1 ELISA and Mab 6B11 for the BCRF1

ELISA. Technically, the rat anti-IL-1a Mab 907 was coated at 5 pg/rnl 2 hours

at 37°C, under 100 pl, in 96-well flat-bottomed microtiter plates (Nunc

Immunoplate, Oenmark). After 3 hours of saturation with bovine serum alburnin,

plasma diluted at 112 were incubated 2 hours at room temperature. The

standards consisted of CHO derived purified hIL-10, which concentration was

determined by amino acid quantification technic and Cos7 derived BCRF1,

calibrated against purified recombinant BCRF1. The tracer biotinylated Mabs

were then incubated 2 hours at room temperature : Mab 12GB was added at

0.05 pg/ml and Mab 6B11 was added at 0.1 pg/ml. The binding of the

lm

biotlnylated antibodies was revealed with the alkaline phosphatase-conjugated

streptavidin (Tago, Burlingame, CA) / phosphatase substrate (Sigma, Saint

LOUIS, MO) system as previously described (18). Furthermore, 10 j1g/rnl of hlL­

10 dld not react in the BCRF1 ELISA and the BCRF1 similarly reacted in both

IL-10 ELISA. The lower detection levels were 100 and 50 pg/ml for the h1L-10

and the BCRF1 respectively. As a control to eliminate the non-specifie signal

given by rheumatoid factor, a non relevant biotinylated anti-IFNy monoclonal

antibody (Mab 827 at 0.05 tlg/ml) was used as a second monoclonal antibody,

for each sample. Ali samples giving positive reactions under these conditions

were elirninated from the study. Normal levels of IL-10 in plasma were

determined i) in 63 European blood donors and ii) in 43 Africans living in rural

malarial endemic area in Burkina Faso, who had a negative thick smear and

showed no clinical signs of malaria for at least 2 weeks prior to blood sampling.

Plasma Tf\lFa levels were assayed by radioimmunoassay (Medgenix ,Fleurus,

Belgium).

Statistical analysis

The Mann - Withney test was used to compare IL-10 values among different

groups with use of Wilcoxon paired test to compare results in acute disease

and convalescence. Spearman's rank test was used to assess the relationship

between IL-10 and TNFa. Results are expressed as mean value ± SEM.

Results

Patients: Among 47 Madagascan patients, 12 had cerebral malaria, 11 had

severe, and 24 miId malaria, but because of non specifie scores in 1L-1 0 assay,

4, 4 and 8 patients respectively were removed from the study. Of the patients

admitted to French hospitals, 6 suffered from cerebral malaria (1 died after 3

days) 4 had severe malaria while the remaining 4 presented with a mild malaria

(see Table 1). This unusual high proportion of non specifie scores is most likely

due to the hyperstimulation of antibody production, in particular rheumatoid

factor, which is described in malaria [19]. Ali patients were given intravenous

quinine for treatement.

Levels of IL-10 in control groups: Of 63 European blood donors, three were

excluded for positive reaction with BCRF1. In the remaining 60, the level of IL­

10 in the plasma was below the detection limit of 100pg/ml. Of 43 African

contrais, eight subjects being positive for BCRF1and rheumatoid factor, and 4

positive only for BCRF1 were excluded. Among the remaining 31, 27 had Jess

than 100pg/mIIL-10, while 4 showed levels of IL-10 between 100 and 189

pg/ml (mean = 140 pg/ml :!: 0.03). For statistical analysis the value of 100pg/ml

104

was assigned to patients displaying undetectable IL-10 tevels. The mean value

for the 91 healthy individuals was therefore 112 pg/ml ± 4.18.

Level of IL-10 in malaria patients: Fig 1 shows the plasma IL-10 levels of

patients on admission in the three malaria graups. The IL-10 levels in the 14

patients suffering from cerebral malaria were extremely high with a mean valueof 2812 pg/ml ± 626 and a wide range: 8038-100 pg/m. These levels were

significantly higher than those of contrais (p = 0,0004). The mean plasma levels

of IL-10 in 11 patients suffering fram severe malaria were not significantly

different trorn those observed in the cerebral malaria group (2882 pg/ml ± 1229,

range: 11705-100 pg/ml ). The levels of IL-10 observed in patients with

cerebral/severe malaria were very high and 13 of them displayed more than

2000 pg/ml IL-10. Although 3 patients with cerebral malaria and 2 patients with

severe malaria had low levels of IL-10 (between 100 and 200pg/ml). Twenty

patients with mild malaria had much lower plasma IL-10 values than those with

cerebral/severe malaria. Nonetheless, these patients displayed levers of IL-10

which were significantly raised above the normal controls (mean =913 ± 281,

range 4600 -100 pg/ml p= 0.0001). Among the 14 patients fram the French

hospitals, 11 were monitored 7 days after treatment for any change in plasma'

1L-10 levels (1 died after 3 days, 2 had non specifie score in 1L-1 0 assay on

day 7). As shown in Fig 2 their levels of circulating 1L-1 0 were greatly reduced

fram a mean level of 3880 pg/ml at day 0 to a mean level of 333 pg/m (p=

0.0007 ). At day 7, ail patients were cured and had a negative thick smear.

Blood samples were drawn at various times during 7 days in 7 patients. 1L-1 0

levels decreased within 24 hours in 3 patients (as shown in Fig 3A for 1

cerebral malaria case), and more slowly in the four other patients (depicted in

Fig 3B, for 1 severe case). One patient who died after 3 days had circulating IL­

10 levels between 2218 and 4404 pg/ml. During this period, the kinetics of the

disappearance of 1L-1 0 from the circulation did not correlate with either the

severity of the disease or other parameters such as parasitemia or fever (data

not shown).

IL-10 andTNF: The TNFa levels determined in ail of these patients at the onset

of the disease were 172.2 ng/ml ± 186.4, ranqe» 6 -910 ng/ml (normalvalue-n Ong/ml).There was no correlation between the levers of IL 10 and TI\JFa

(r = 0.37, p=0.06).

Discussion

This study has measured the level of IL-10 in the plasma of patients suffering

trorn acute and mild malaria. Most patients suffering fram cerebral and severe

malaria were found to display strikingly high levels of circulating IL-10 with

105

mean values of 2812 and 2882 pg/m 1 respectively. 1ndeed 13/25 patients

suffering from cerebral and severe malaria were tourte to display IL-10 levels

higher than 2000 pg/ml, a level which we found earlier only in a single case of

Iymphoma (out of 150 Iymphoma and 140 myeloma plasma tested) [20-21]. The

detected IL-10 was of human rather than viral origin as positive samples did not

score in an ELISA assay specifie of BCRF1. Patients with mild malaria also

displayed elevated levels of circulating IL-10 although much less than observed

in patients with severe disease. A follow up of the patients with the most acute

malaria showed that levels of circulating IL-10 decreased markedly within one

week after treatment with antimalarials and who no longer showed clinical

signs of ma./aria. Thus, there is a link between the presence of circulating 1L-1 0

and the presence of clinical symptoms. However there was no correlation

between the levels of IL-10 and fever orparasitemia. The decrease of IL-10

occurred between 24 hours and a few days in a manner which was apparently

not related to the severity of the disease. The very quick decrease of circulating

IL-10 observed in three severely affected patients may explain why four

patients suffering from cerebral/severe malaria had only low levels of circulating

IL-10 as these patients may have been admitted in the hospital relatively late

after the onset of the attack. It is difficult to determine at which time of the

malaria infestation does circulating IL-10 become detectable, as it is known

that, in malaria, cytokine secretion may be abrupt or graduai, sometimes

preceeding the onset of clinical manifestations [22]. In this context, it will also

be important to identify the cell population producing IL-10, either monocytes,

T/B lymphocytes, or another cell type not yet known to produce this cytokine.

The presence of circulating IL6 and TNF together with IL-10 in the early stage

of malaria may represent activation of monocytes but this requires furtherinvestigation. Although IL-10 has been shown to inhibit the production of TNF a

by monocytes, there was no positive or negative correlation between the IL-10

and TNF levers in the plasma of malaria patients.

The role of the cytokine network in malaria remains to be elucidated. High

concentrations of pro inflammatory cytokines such as Tf\IF, IL1, IL6 or nitric oxid

products seem to be deleterious for the host, but at low doses, these agents

facilitate the clearance of the parasites. Whether high levels of IL-10 observed

during malarial episodes are beneficial by reducing the inflammatory response,

or detrimental by decreasing the cellular response, remains to be elucidated.

Acknowledgements

We wish to thank Dr John Abrams (DI\JAX) for providing the anti-IL-10

antibodies.

100

References

1. Brewster DR, Kwiatkowski 0 and White. N. Neurological sequelae of

cerebral malaria in children. Lancet. 1990; ii:1039-43.

2. Grau GE, Fajardo LF, Piguet PF, Allet B, Lambert PH and Vassali P.

Tumor Necrosis Factor (Cachectin) as an essential mediator in murine cerebral

malaria. Science.. 1987;237:1210-12.

3. Grau GE, Taylor TE, Molyneux ME, Wirima JJ, Vassali P, Homel M and

Lambert P. TurnorNecrosis Factor and dtsease severity in children with P.

falciparum malaria. N. Engl. J. Med. 1989; 320:1586-91.

4. Kwiatkowski D, Hill l, Sambou l, Twamasi PJ, Castracane J, Manogue KR,

Cerami A , Brewster DR and Greenwood BM. TNF concentration in fatal

cerebral, non-fatal cerebral, and uncomplicated Plasmodium falciparum

malaria. Lancet .1990; ii:1201-04.

5. Kern P., C. Hemmer, J. Van Damme, H.J. Gruss and M. Dietrich. 1989.

Elevated Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin-6 plasma levels as

markers for complicated Plasmodium falciparum malaria. Am. J. Med. 87:139­

143.

6. De Waal Malefyt R, Abrams J , Bennett B, Figdor CG and De Vries JE.

Interleukin 10 (IL 10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: An

autoregulatory role of IL 10 produced by monocytes. J. Exp. Med. 1989; 17 :

1209-20.

7. Chomarat P, Rissoan M, Banchereau J and Miossec P. Interferon inhibits

înterleukin-10 production by monocytes. J. Exp. Med. 1993; 177:523-27.

8. Yssel HR, De Waal Malefyt R . Roncarolo MG, Abrams JS , Lahesmaa R,

Spits H and de Vries JE. IL 10 produced by subsets of human CD4+ T cell

clones and peripheral blood T cel/s. J. Immunol . 1992; 149:2378-84.

107

9. Burdin N, Péronne C, Banchereau J and Rousset F. Epstein-Barr virus­

transformation induces B lymphocytes to produce human Interleukin-10. J Exp.

Med. .1993; 177:295-304.

. 10. De Waal Malefyt R, J Haanen J, Spits H, Roncarolo M, Te Velde A,

Figdor C, Johnson K, Kastelein R, Yssel H and de Vries JE. Interleukin 10 (IL­

10) and virallL-10 strongly reduce antigen - specifie human T cell proliferation

by diminishing the antigen - presenting capacity of monocytes via

downregulation of class Il major histocompatibility cornplex expression. J Exp.

Med.. 1991;174:915-924.

11. Defrance T, Vanbervliet B, Brière F, Durand I, Rousset F and BanchereauJ. Interleukin 10 and transforming growth factor ~ cooperate to induce anti

-CD40 - activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. JExp.

Med. 1992;175:671-682.

12. Rousset F, Garcia E, Defrance T, Péronne C, Vezzio N, Hsu OH,

Kastelein R, More KW and Banchereau J. Interleukin 10 is a potent growth and

differentiation factor for activated human B Lymphocytes. Proe. Natl. Aead. Sei.

USA. 1992; 89:1890-93.

13. Grazzinelli RT, Oswald IP, James SL and SherA. IL 10 inhibits parasiteskilling and nitrogen oxide production by IFI\J Yactivated macrophages.

J Immunol. 1992; 148:792-96.

14. Silva JS, Morrissey PJ, Grabstein KH, Mohler KM, Anderson 0 andReed SG. Interleukin 10 and Interferon y regulation of experimental

Trypanosoma cruzi infection. J. Exp. Med. 1992 ;175:169-174.

15. Heinzel FP, Sadick MD, Mutha SS and Locksley RM.Production ofInterferon ô , Interleukin 2, Interleukin 4, and Interleukin 10 by CD4+

Lymphocytes in vivo during healing and progressive murine leishmaniasis.

Proc. Natl. Acad. Sci..USA. 1991; 88:7011-15.

16. Sher A, Fiorentino D, Caspar P, Pearce E and Mosmann T. Production

of IL 10 by CD4+ T Lymphocytes correlates with down-regulation of Th1

cytokine synthesis in helminth infection. J. Immunol. 1991; 147:2713-16.

108

17. Bogdan C, Vodovotz Yand Nathan C. Macrophage deactivation by

Interleukin 10. J. Exp. Med. 1991; 174:1549-55.

18. Abrams JS, Roncarolo Mt Yssel H, Andersson U, Gleich GJ and Silver

JE. Strategies of Anti - Cytokine Monoclonal Antibody Development:

Immunoassayof IL-10 and IL-5 in Clinical Samples. /mmuno/ Reviews. 1992;

27: 5-24.

19. Greenwood BM, Muller AS and Valkenburg HA. Rheumatoid factor in

Nigerian sera. Clin. Exp. tmmunot. 1971;8:161-173.

20. Blay JY, Burdin Nt Rousset F, Lenoir G, Biron P, Philip T, Banchereau J

and Favrot M. Plasma IL-10 levels as pronostic factor in patients with

nonhodgkin's Iymphoma. B/ood. In press.

21. Merville P, Rousset F, Banchereau J, Klein B and Bataille R. Elevated

interleukin-10 (IL-10) in the plasma of patients with early stage multiple

myeloma. Lencet. 1992; 340:1544-1545.

22. Harpaz R, Edelman R, Wasserman SS, Levine MM and Davis JR. 1992.

Plasma Cytokine profiles in experimental human malaria. J. Clin ./nvest.

1992;90:515-523.

109

Figures legends

Table 1 : General characteristics of patients: age (range) and parasitaemia

(range). Only patients who showed specifie reactivity for human 1L-10 are

representee.

Figure 1 : Distribution of admission IL-10 levels in 3 groups of patients

Horizontal bars show mean values.

Figure 2: Comparison of IL-10 values at DO and 07 in patients followed in

French hospitals.

Figures 3 A and B : 2 types of IL-10 evolution in malaria patients followed in

French hospitals. A: Cerebral malaria case. B: Severe malaria case. Time after

admission and treatment.

110

cerebral

Madagascarn 8

age (years) 24.4(8-36)

parasitaemla(%) 5.1(0.4-13.7)

French hospltaln 6

age (years) 38.4(25-60)

parasitaemia (%) 5.7(0.4-13.7)

severe

7

19(5-42)

6.2(0.3-15.5 )

4

37.2(28-47)

11. 7(2-28.2)

mlld

16

16(2-41 )

1.7(0.01-4.1)

4

40(36-45)

3.8 (2.9-4.2)

111

12000 •

10000

•8000 •.-..-E........

C') 6000a. •"-"

~0 •""'". T""" 4000 •

~1

'"-1~ -""'t ••re 2000~ • ..

100 _1 ___ 5L __ ï_0

." ,.• t ",. ••• " ,.•• ,.".~ ~ ~.' ••••• t '.' •••••........... ,.....:.:': :.::::::! :.::~::

CEREBRAL(14)

SEVERE(11)

MILD(20)

CONTROL(91)

12000

10000

..- 8000E-C)c.- 60000~

1

...J

4000

2000

Day 0

Figure 2

Day 7

113

Time (hours)

81500

1250--E 1000--Clc.

750-0T"""• 500...J

250

00 24 48 72 96 120 144 168 192

Time (hours)

Figures 3

114

VOl.. 21). )1)1)1 NOTES 2077

TAilLE 2. Comparison of lcvcls of l'NF-o. GM-CSF. IFN--y. neopterin, and soluble 11.-21{ ill plasma iu European and African puticntsprcscnring with a l'. [alriparum maluria auack

D..y ,,1'SiUliplillg

DO

DI

Dneg

Cylnkinc concu (mean ::!.: su) in pla="ll1a1'''licntgnmp l'NF-a GM-CSF IFN·y NC4.lplcrin IL·2H

(l'c/ml) (l'c/ml) (li/mil (IIm"l/lilerl (l'mul/liler!

Europeans 35.3 :!: 31.2 24.4 :!: 19.4 8.6 :t 12.3 73.1 :!: 38.2 680 :!: 441.4Africans 37.5 :!: 33.1 34.6 :!: 20.4 0.8 :t 1.5" 26 :!: 13.6" 263.1 :!: 65.9"

Europeans 31.5 :!: 29.7 21.3 :!: 13.4 4.5 :!: 5.9 77.3 :!: 41.6 609 :!: 388.9Africans 9.5 :!: 2.4 43.2 :!: 28.7 0.8:!: 1.2" 29 :!: 9.5 b 214.5 :!: 100.7"

Europeans 22.1 :!: 15.4 21.11 :!: 11.4 3.6 :!: 4.1 72.7 :!: 37.7 603.2 :!: 348.7Africans 6.5 :!: 2.5" 58.2 :!: 34.1 1.3 :!: 1.3 26.2 :!: 7.2" 205.9 :!: 28.5"

u P < 0.115. Mann-Whilnc)' U lest versus European patients,b P < 0.01. Mann-Whitney U lest versus European patients.

thin or thick blood smear exarnination until parasile clear­ance. Differences in cytokine levels were compared by theMann-Whilney U test. The Spearman rank test was used 10assess correlations.

On admission. the geometrie mean parasiternia (95% con­tidence interval) was 14.343 (5.258 to 39.125) asexual para­sites per !LI of blood. The mean erythrocyte count (±standard deviation) was 4.4 :!~ U.6 x 101> per !LI. the meanleukocyte count was 4.70() z; 1.630 per !LI. and the meanplatelet count was 97.200 ± 45,180 per ul of blood. Plasmaconcentrations of ail cytokines cxcept 1FN-'Y were higher inpatients than in healthy controls (ail l' < 0.05; Table 1).TNF-o: levels correlated positivcly with parasite densities(P < 0.01), whereas concentrations of soluble IL-2R corre­lated ncgatively with the numbers of erythrocytes, leuko­cytes, and platelets (ail P < 0.05). Similarly, neopterin levelscorrelated negatively with the numbers of erythrocytes andleukocytes (both P < 0.05).

The c1inical outcomes after treatrnent were favorable in ailcases. Parasitemia cleared on day 2 in nine patients and on

day 3 in seven patients, The mean levels of GM-CSF inplasma were still elevared when the parasites clcarcd,whereas those of TNF-o:, neoprerin, and soluble IL-2Rremained elevated for at Ieast 1 wcek (ail P < 0.05!.Concentrations of soluble 1L-2R in plasma correlated posi­tively with those of TNf-c , IFN-'Y. and neopterin (ail P <0.01). In addition, neopterin levels correlated positively withthose ofTNF-o: and IFN-)'(bolh P < 0.01). During the wholecourse of infection. the concentrations of 1FN-'Y. neopterin.and soluble IL-2R in plasma were higher in European than inAfricun patients (ail P < (1.(15. cxcept for 1FN·'Yon Dncg. l'orwhich P was not sigruficum) (Table 2 and Fig. 1). HigherTNF-a levels in European thun in African patients were alsuobserved on the day of parasite clearance (1' < 0.051.Conversely, GM-CSF conccntrat ions hud a tendency 10 belower in European (han in African patients, bUI the diflcr­ence was nol significant.

The elevation of the concentmtions of the various cytok­ines studied dernonstrutes massive cellular activation duringacute falciparum malaria attack. The corrclutions bctwecn

...z...

TNF

1000

•D.,

GM~SF

•D.,

IFN-y

100

..._, ..--.rt

•o.,

Necpterin

1000

1•

•IJ ..,.

IL-21!

10000

1 n.,.

FIG. 1. Evolution ,,1' plasma lcvcls ofTNF-u. GM-CSF. IFN-'Y. ocoplcrin. and soluble 11.·21{ in Il European (solid Iines l und 5 African(broken lincs) patients prcscnting with a t', }(,Iâl'III'IIIII malaria uuuck , Two Europeuns und olle Atricuu prcscntcd rcpcatcdly wirhuudctcctublc lcvcls or Il:N·'Y in l''',sma. and daru for ihcru are lIol visible ill the ligure.

117

2117R NOTES J. CUN. Mrcnonror..

thc conccntrutions in hh.od,.f varions cytokines continu Ihcresults of a prcviuus study (7, ami exlcnd lhis ohscrvation toueopterin and soluble Il.-2R. Thcse correlations may rellcctthe relutionship in Ihe production or thcsc mediators. Anli­gcn-presenting cells induce Ihe activation or CD4' T cells,which in IlIIn secrete rcgulatory factors. such as 1FN--y.IL-2. and UM-CSF.1I1l11 activate macrophages and cytotoxicT cells. Activaicd Iymphocytcs and mouonuclcar cells ex­press specilic-IL-2R on Ihcir surfaces that are rcleased inloIhc serum during Ihc immune response, Activated macro­ph:lgcs secrete TN F-a and neupteriu (2, 3).

ln Ihese pnticnts. concentratious or TNP'-a in plasmacorrelatcd positivcly with parusitemia, as previously re­ported in ether studies (4. 7). On admission. Ihe patients didnot present with anemia but with thrombopeuin and slighlleukopcnia. Why holh ncoptcrin and soluble 1L-2R arcncgntivcly correlatcd with hlood ccII counts is not clear andrcquires lurther studies. In addition. Ihe concentrations orcytokines or related pruducts (except (jM-CSF, in plasmawere lowcr or decreased more rapldly alter the initiation ortrcaunent in African patients. Aflcr the initiation of trent­ment, UM-CSr levels increased in African patients. whereasthey rernaincd constant in European patients. In Ihc case ofneopterin. 1hc highcr levcls in plasma sumples from nonim­munc thau Irum partially immunc individuals support thcündings of Rcihncggcr cl al. (9). who rcpOlted li dccreasc innC(lpterin levels with age and duration or nmhnia exp('sure.Althollgh the prcsent sludy involved a limiled number ofpalients (cspccially of Arricans). the ohscrved dil1crences incytokinc concentrations in plasma. between Arrican amiEuropcan paticnts suggcst Ihat dill"ercnt meclmnisms areinvolved in controlling lIIalaria parasile prolircmli,.n in int­1\IIIIlC and 1I0nillllnllne individllals. Fllrlher stlldies arcnl'eded to prccisely e1ucidatc the role or Ihese cylokines inIhc regllialion or Ihc cclllliar immune response during falci­pan/lll nmlaria.

We Ihallk Tchll l'I:IIIC(' ;11111 111IIIIullnlech France gratefully fllrprllvidillg OM-CSF lIud snluhle IL-2R kils. 1CSllcclivcly. Wc lhauk

Jeun l'icllc Coulaud :lIId JC:III Louis Vilde for lhcir cooperation iuthis slluly.

This study wns liuuncinlly snpplllicli by Ihc Institut Nalillllai de laSanté cl de la Recherche Médicale.

ItEliEIŒNCF$

1. I)rloron, l' .• .1. l'. l.epers, nnd l'. Clllllnll~es. l '1R'I. Evnlut ion ofIhc Ievcls of soluble interleukin-Z receptors during "/II.I",O//i"",./i,/d/,,,,·,,,,, aIII1 P, I·i\"(/.t IIInlnl in. J. Clin. MiCIobiol, 27: 1RR7­IRR9.

2. I)lIrlllll, S. K.• Alld .1 . .1. ()1'I,cllheh". 19R9. Macillphaj!e·delivedmediators: intcrleukin 1. 111111111" nccrosis fuclm. interleukin ('.interferon, nnd related cytokines, p. (139-(,61. '" W. Punl ted.},l'II IIII;IIlIe litni illlmUlIlll('gy. 211d cd. Raven ('ress. Lld .. NewY\IIk.

3. c:lllis, S. 19119. 'I-cetl-derived IYlllphokines. p. (,21-63R. ln W.l'aul tcd.I, l'lIn<l:lInelllal illlfllllll\.lllgy. 2nd ed. Raven l'ress, Lul..Ncw York.

4. C;rnll. C;. I~•• T. K TAllllr, 1\1. E. I\IlIlynclIll • .1 • .1. \Vlrhllll. l'.Vnssalll. M. II(11l11l1cl. nml l'. Il. I.nlllhCII. 1'18'1. TIIII'\'I" nccrosisfactnr und disense severity ill children with fn1cip:1I11111 mahu ia.N. RlIgl. J. Mell. 3211:I:'iR(..-1:'i91.

S. JIIShllll\'Ic·Alnsevlc, o., Il. Feldlllt'lt'r, K. Z\\'III~cllhcrl!cr. Cj.IInrllls, Il. IIahll, M. Shrislllthnlllllll, And T. Uinmnlllsicill. 19RR.Interleukin 2 receptor ill p~'liellts with localized and sysremicpllmsitic diseuses. Clin. Exp. lnnnunol. 72:249-2.~4.

6. Krclllsllcr. l'. C;•• Il. Ft'Idlllcier. C;. M. 7.lIlIcr. R..Ianseu-Rnsseek,W. C;rallhII!Cr, R.I\I. Rnchn, nmlll. mell7.le. 19119. tnnnuuotogicnlIIllenllillns in nncllmpliculed "la.fII,o,/i"", .Ii,ki/,,,,m,, nmlaria.Rclalionship belween pnUlsilllelnia und illllicah.rs (.f nmcruphagencliv:llion. Aclll Trllp. 46:.1:'i1-35'1.

7. K\\'lnlkll\\'skl, n., A. V. S. 11111. 1. S:lIl1hllll. l'. T\I"lIl11nsl•.1.~nsllncnllc. K. R. I\hlllll~lIe, A. C:ernllli. 1>. R. lhc,,·slcr. 111111

Il. 1\1. C;recn\\,'HIII. 19911. TN l' "lIl1ccnlmlilln in fal:ll cerehml.IIl1n-falul cerebral. ulld 1Il1Clllllplic:llell "Ia.""",/i,,,,, .fi,/d/N,,.,,,,,..mlnrin. Lnllcel 336:12111-12114.

R. N~lIlt'II-Ulllh. l' .. nllli A. E. C;rct'lIhcr~. l'1RR. lncleased levels (,freie:lsell inlerlellkill-2 leceplllrs in "Ia.m,mli"", .fi'/d/'",·"", lIIa­1:'lia . .1. Infect. Dis. 15R:1403-14114.

9. Relhllr~~er. C;•• U. Fuchs. A. IInnscn. E. Schnlllt7.har. E. R.\Verner, nnd Il. Wnchler. \9R7. The depelllience lIf celi-lIIedialellinllllfllle activ<llioll in malaria ('" age 1I11l1 ellllelllicily. TIIIIIS. R.SIIC. TI"p. Med. IIyg. 111:729-733.

118

Parmi les différents modèles cellulaires existants, nous avons choisi 4

types de cellules: les HUVEC, les cellules de mélanome C32 et les cellules CHO

transfectées par le gène du récepteur CD36 et ICAM-l. L'isolement et la culture

des HBEC et des HMDEC et leur utilisation comme modèle de cytoadhérence

sont des techniques récentes (SMITH et coll., 1992; WrCK et Laurs, 1991). Le

choix de ces modèles a été motivé par des caractéristiques propres à chaque

type de cellules.

Les HUVEC ont été les premières cellules utilisées pour étudier

l'adhérence d'hématies parasitées par des trophozoïtes ou des schizontes de P.

faiciparum (UOEINYA et coll., 1981).Les HUVEC en culture sont caractérisées par

leur aspect cuboïde, la présence intra-cytoplasmique de corps de WEIBEL­

PALAOE, de facteur VIII/VON WILLEBRANO et de vésicules de pinocytose

assurant la captation et le transport de fluides et de macromolécules. La surface

de ces cellules n'est pas thrombogène sauf en cas d'altération mécanique,

d'infection ou de stimulation par des cytokines. Les cellules endothéliales sont

capables de lier la lipoprotéine lipase et de sécréter l'enzyme de conversion de

l'angiotensine et des prostaglandines. Les HUVEC sont des cellules humaines

de croissance lente, difficiles à maintenir sur une longue période et ne pouvant

être cultivées avec des milieux simples comme le RPMI 1640 (SMITH et coll.,

1992). Les cellules sont issues de cordons d'individus génétiquement très

différents, ce qui entraîne une reproductibilité médiocre des tests et des

résultats variant considérablement entre les auteurs. Nous avons essayé de

remédier à ce problème en utilisant les cellules d'au moins 3 cordons afin

d'obtenir un mélange suffisamment hétérogène pour réduire la variabilité entre

les tests. L'utilisation de facteur mitogène a été suggérée (UOEINYA et coll.,

1989), mais, dans notre expérience, la stimulation des HUVEC avec le facteur

mitogène entraîne des modifications morphologiques et l'adaptation de

HUVEC en culture continue réduit leur capacité à fixer des hématies parasitées

(SHERMAN et coll., 1992).

Les HBEC se caractérisent par rapport aux autres cellules endothéliales et

en particulier par rapport aux HUVEC par l'absence de vésicules de

pinocytose, par l'existence de jonctions très serrées entre les cellules et par des

capacités de métabolisation supplémentaires (BEIKE, 1988). Les 2 types de

cellules se différencient surtout par leur capacité à fixer des hématies parasitées.

Non seulement le nombre des hématies parasitées adhérant par cellule est plus

élevé pour les HBEC que pour les HUVEC, mais surtout le nombre de cellules

capables de fixer des hématies parasitées est plus important pour les HBEC que

120

pour les HUVEC (SM ITH et coll., 1992). La croissance des HBEC en culture est

plus rapide que celle des HUVEC et contrairement aux HUVEC, les HBEC

gardent leur caractéristique de fixation des hématies parasitées après une

quinzaine de repiquages. Les HBEC deviendront vraisemblablement le modèle

de référence en matière de test de cytoadhérence mais le problème de la

variabilité entre les laboratoires se posera également et il n'est pas certain que

les HBEC en culture gardent toutes leurs caractéristiques d'origine (ALBELDA et

BUCK, 1990). La majorité des HBEC présentent à leur surface des récepteurs

CD36 mis en évidence par des anticorps monoclonaux OKM5 et OKM8, alors

que ces récepteurs sont absents de la surface des HUVEe, contrairement à ce

qui avait été antérieurement publié (BARNWELL et coll., 1985). Bien que ICAM-1

soit présent sur HUVEC et sur HBEC, sa distribution et l'intensité de son

expression sont différentes. La présence de ICAM-1 sur les HBEC est limitée à

la périphérie des cellules, alors qu'elle est diffuse dans le cas de HUVEC (SMITH

et coll., 1992). De plus, l'expression de ICAM-1 sur les HUVEC est très faible

(moins de 20 %des HUVEC) (HIROMASTU et coll., 1991) et très variable suivant

les expériences (rapport de 1 à 4) (DOUKAS et POSER, 1990). L'existence des

différents récepteurs, thrombospondine, CD36, ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine

au niveau des capillaires cérébraux a été longtemps controversée, mais le

recours à des anticorps monoclonaux spécifiques au cours d'examens post­

mortem a permis de prouver la présence des 5 récepteurs sur les cellules

endothéliales des capillaires cérébraux dans l'accès pernicieux (OCKENHOUSE et

coll., 1992b).

Malgré de grandes différences entre les HUVEC et les HBEe, nous avons

souhaité garder pour la totalité de notre travail le modèle HUVEC car

l'expression des récepteurs sur les cellules endothéliales peut être modulée par

des cytokines. Cette caractéristique se retrouve pour les HUVEC dont

l'expression des récepteurs ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine est augmentée

après stimulation par le TNF-a, l'IL-1 et l'IFN-y (POSER et coll., 1986b), pour les

HDMEC dont l'expression des récepteurs CD36, ICAM-1 et VCAM-1 est

augmentée après stimulation par l'IFN-y, le TNF-a et l'IL-1 (SWERLICK et coll.,

1992a; SWERUCK et coll., 1992b) et pour les HBEC (SOSEL et coll., 1990).

Le modèle des HUVEC a été rapidement remplacé par les cellules de

mélanome C32 plus faciles à cultiver, malgré la différence d'expression de

récepteurs des 2 types de cellules (SCHMIDT et coll., 1982). Les cellules de

mélanome et les HBEC partagent l'expression en commun d'au moins 4

récepteurs (thrombospondine, CD36, ICAM-1 et ICAM-2) (SHERWOOD et coll.,

121

1989; SMITH et coll., 1992). La participation d'autres récepteurs que CD36 aux

phénomènes de cytoadhérence sur les cellules de mélanome et les HBEC est

très probable car les anticorps anti-CD36 n'inhibent que partiellement la

cytoadhérence sur ces 2 types de cellules et la participation des récepteurs

rCAM-1 est négligeable (SMITH et coll., 1992). Les cellules de mélanome

présentent à leur surface des microvillosités pouvant interférer avec l'adhérence

d'hématies parasitées d'autant que les récepteurs CD36 sont fortement exprimés

à ce niveau (BERENDT et coll., 1990; NAKAMURA, données non publiées). li n'en

demeure pas moins que l'adhérence sur HBEC est plus importante que sur les

cellules de mélanome (SMITH et coll., 1992).

Les cellules COS transfectées avec le gène des récepteurs CD36 et ICAM-

.1 n'ont pas été considérées comme un bon modèle. D'abord, parce que

l'expression des récepteurs est transitoire, ensuite parce que des hématies saines

peuvent se fixer sur des cellules COS transfectées et que des hématies parasitées

peuvent se fixer sur des cellules COS non transfectées (HA5LER et coll., 1990). La

purification et la fixation de récepteurs CD36 et ICAM-1 sur des surfaces en

plastique nécessitent beaucoup de temps et sont très coûteuses avec un risque

d'induire des modifications structurales des récepteurs (HA5LER et coll., 1993).

Nous avons été une des premières équipes à utiliser des cellules CHa

transfectées par les gènes des récepteurs CD36 et ICAM-1 comme modèle de

cytoadhérence. Ces cellules expriment une forte concentration de récepteurs

CD36 et ICAM-1 à leur surface et cette expression est stable au moins 6

semaines (HA5LER et coll., 1993). Les cellules CHa présentent un temps de

dédoublement (12 heures) inférieur à celui des cellules de mélanome C32 (2

jours) et n'expriment qu'un seul récepteur permettant une étude spécifique de

la cytoadhérence par rapport à ce récepteur. Contrairement aux cellules COS,

les cellules CHa ne fixent pas d'hématies saines et les cellules CHa non

transfectées fixent pas ou peu d'hématies parasitées. Comme pour les HUVEC

et les cellules de mélanome, les cellules CHa peuvent être fixées par du formol,

ce qui permet le stockage des cellules à +4° C et la reproductibilité des tests

(UDElNYA et coll., 1985).

122

Les valeurs des tests de cytoadhérence que nous avons déterminées avec

les différents types de cellules sont en général inférieures aux données de la

littérature (BERENDT et coll., 1989; HASLER et coll., 1993; SCHMIDT et coll., 1982;

SMITH et coll., 1992; UOEINYA et coll., 1985). Cependant, la plupart de ces

travaux ont été effectués avec des clones sélectionnés pour leur capacité

d'adhérence. De plus, la capacité d'adhérence est fortement fonction de l'origine

géographique des isolats de P. falciparum (GoLORING et coll., 1992). Par contre,

il apparaît clairement que la cytoadhérence pour un isolat ou un clone donné

est linéairement corrélée avec la parasitémie quel que soit le modèle : les

HUVEC, les cellules de mélanome (HAsLER et coll., 1990; Ho et coll., 1991b;

MARSH et colL, 1988), la thrombospondine (HAsLER et coll., 1990; SHERWOOO et

coll., 1987), les récepteurs CD36 et ICAM-1 fixés sur plastique (HAsLER et colL,

1990; HASLER et coll., 1993), les CHD-CD36 (HAsLER et colL, 1993) et les CHO­

ICAM-l.

Outre la parasitémie, la cytoadhérence varie en fonction de la présence

des récepteurs sur la surface des cellules et de la capacité des isolats à se fixer

spécifiquement aux différents récepteurs:

• les résultats que nous avons obtenus avec les cellules de mélanome et

les CHO-CD36 sont fortement corrélés. L'adhérence des hématies parasitées sur

les cellules de mélanome est médiée principalement par le récepteur CD36. La

différence observée entre les 2 types de cellules (environ 20 %) peut être liée à la

différence de taille des cellules, les cellules de mélanome étant au moins 2 fois

plus grandes que les CHO (HAsLER et coll., 1993) ou à la présence d'autres

récepteurs sur les cellules de mélanome. Il n'y a pas de différence pour les

résultats obtenus avec les HUVEC et les CHO-ICAM-1, les 2 types de cellules

exprimant seulement ICAM-l. La densité des récepteurs à la surface des

cellules ne devrait pas interférer avec les résultats. En effet, pour les 4 types de

cellules, l'adhérence pour un isolat donné est fonction de la parasitémie (de 0,1

% à 3 %), ce qui suggère que, dans nos conditions expérimentales (l % de

parasitémie), les récepteurs n'étaient pas saturés;

• par contre, comme pour les tests effectués avec des clones (BIGGS et

coll., 1990; UOOMSANGPETCH et coll., 1992), il apparaît que les valeurs de

cytoadhérence sont en moyenne 7 fois plus élevées avec les cellules de

mélanome qu'avec les HUVEC. De même, l'adhérence sur les CHO-CD36 est en

moyenne 4 fois plus importante que sur les CHO-ICA!vl-1, un rapport similaire

à celui obtenu avec les récepteurs CD36 et ICAM-1 purifiés fixés sur plastique

(OCKENHOUSE et coll., 1991). Nos résultats montrent que dans nos conditions

expérimentales in vitro, l'adhérence d'hématies parasitées par des isolats de P.

123

falciparum est plus importante sur le récepteur CD36 que sur le récepteur

ICAM-l dans la majorité des cas, ce qui est d'autant plus important que la

cytoadhérence in vitro sur les HBEC est principalement médiée par CD36

(SMITH et coll., 1992). L'absence de récepteurs CD36 sur les HUVEC explique la

faible adhérence de la plupart des isolats de P. falciparum. UDOMSANGPETCH et

coll. (1992) ont par contre démontré que l'adhérence sur les monocytes est

médiée principalement par CD36. La différenciation des monocytes entraîne

une inversion de l'expression des récepteurs CD36 et ICAM-1 ayant pour

conséquence une baisse de l'adhérence des hématies parasitées. Il faut

néanmoins préciser que, parmi tous les isolats que nous avons étudiés, deux

isolats présentaient une meilleure adhérence sur CHO-ICAM-1 que sur CHO­

CD36 et deux isolats une meilleure adhérence sur HUVEC que sur cellules de

mélanome, phénomène déjà évoqué dans la littérature (l-IASLER et coll., 1993).

Ces différents résultats montrent que l'adhérence in vitro d'hématies

parasitées par des isolats de P. falciparum est principalement médiée par CD36

mais n'excluent pas la participation d'autres récepteurs, en particulier ICA!vI-1,

dont le rôle n'est pas négligeable. Les isolats expriment plus fréquemment des

ligands pour les récepteurs CD36 que pour ICAM-1, mais pas

systématiquement. Cette différence phénotypique est soit génétiquement

déterminée, soit correspond à une sélection s'opérant sur les récepteurs

exprimés par les cellules endothéliales des capillaires cérébraux de l'hôte. En

effet, au cours de la maladie, les parasites vont se multiplier plusieurs fois chez

l'hôte et au cours de chaque cycle, les hématies parasitées par des formes âgées

du parasite vont adhérer aux cellules endothéliales, les hématies non

adhérentes étant détruites au niveau de la rate. Cette séquestration in vivo est

tout à fait comparable aux techniques de sélection in vitro des clones en fonction

de leur capacité spécifique d'adhérence (BIGGS et coll., 1992). Il n'en demeure

pas moins que la séquestration des hématies parasitées peut être médiée par

différents récepteurs selon les tissus et que l'expression phénotypique observée

in uitro n'est que le reflet du phénotype dominant de l'isolat (OCKENHOUSE et

coll., 1991).

A l'inverse de la théorie d'un récepteur dominant, des travaux avec les

modèles statiques et dynamiques ont suggéré la participation de tous les

récepteurs mais pour des fonctions différentes (BIGGS et coll., 1990). Ainsi, la

thrombospondine et les récepteurs CD36 pourraient initier la liaison hématies

parasitées et cellules endothéliales et les récepteurs ICA~d-1 stabiliseraient cette

liaison. En effet, IC;\1vl-1 semble présenter une meilleure affinité pour son

124

ligand que CD36. L'affinité est d'autant plus importante que les forces

dynamiques s'exerçant sur les hématies augmentent (NASH et coll., 1992). La

densité des récepteurs sur les cellules endothéliales des capillaires cérébraux

n'étant pas exactement connue, ces travaux demandent confirmation car ils

limitent l'intérêt des modèles mono-spécifiques comme les cellules transfectées.

La participation d'autres récepteurs hormis les cinq candidats déjà

retenus est très probable. Au cours des tests in vitro un grand nombre

d'hématies par des formes matures de P. falciparum n'adhèrent pas aux

différents types de cellules ce qui contraste avec les données cliniques et ce qui

prouve que d'autres récepteurs qui ne sont pas exprimés sur les modèles à

notre disposition, interviennent dans le phénomène de cytoadhérence

(GoLDRING et HOMMEL, 1992).

12~

Une relation entre l'adhérence à la thrombospondine ou aux récepteurs

CD36/ICAM-1 et la gravité de la maladie n'a pas été clairement établie. Les

isolats prélevés chez des patients présentant des signes cliniques ou biologiques

de gravité semblent adhérer plus à des cellules de mélanome et à des récepteurs

CD36 que des isolats prélevés chez des patients sans signe de gravité, mais

aucune différence n'a été observée pour des isolats d'accès simple et d'accès

pernicieux (HO et coll., 1991b; MARSH et coll., 1988; OCKENHOUSE et coll., 1991;

SHERWOOD et coll., 1987; TREUTIGER et coll., 1992). Nos résultats sont en accord

avec les données de la littérature, nous n'avons pas mis en évidence, pour les 4

types de cellules, de différence d'adhérence entre les isolats d'accès simple,

d'accès sévère et d'accès pernicieux. Seuls les monocytes humains prélevés

chez des enfants atteints d'accès sévères présentent une capacité à fixer des

hématies parasitées plus importante en phase aiguë qu'en phase de

convalescence, contrairement aux monocytes prélevés chez des enfants atteints

d'accès simple (GoLDRING et HOMMEL, 1992).

L'absence de relation entre les résultats de cytoadhérence in vitro et les

données cliniques appelle 2 hypothèses:

• il n'a pas été formellement démontré que les manifestations

neurologiques de l'accès pernicieux soient directement liées à la séquestration et

à la cytoadhérence des hématies parasitées dans les capillaires cérébraux. La

séquestration des hématies parasitées est souvent observée chez les patients

décédés d'accès pernicieux, mais des sujets décédés de paludisme sans avoir

développé un coma ont présenté à l'autopsie une séquestration d'hématies

parasitées dans une partie de leurs capillaires cérébraux (IvlAC PHERSON et coll.,

1985; RIGANfI et coll. 1990). Des accès pernicieux sans séquestration d'hématies

parasitées dans les capillaires cérébraux ont été rapportés (BOONPUCKNAVIC et

coll., 1990; TORO et ROMAN, 1978). De plus, la séquestration dans des organes

nobles comme le coeur n'entraîne pas de trouble fonctionnel;

• les types de cellules utilisées sont un mauvais modèle de la réalité et

devraient seulement permettre d'étudier la capacité d'isolats ou de clones à se

fixer sur des récepteurs spécifiques. Outre la présence des récepteurs, des

facteurs locaux au niveau des capillaires cérébraux (modification du pH,

immunité de l'hôte, influence des cytokines et facteurs dynamiques) doivent

vraisemblablement intervenir, ce qui justifie pleinement l'utilisation de modèle

dynamique ou la stimulation des cellules endothéliales par des cytokines.

Malgré l'absence de corrélation avec les données cliniques, les modèles

cellulaires justifient à être développés. Les nombreux travaux ont en effet

126

permis de mettre en évidence et de caractériser les récepteurs et les ligands

parasitaires potentiellement impliqués dans les phénomènes de cytoadhérence.

L'utilisation de ces modèles a démontré l'action inhibitrice du phorbol

dibutyrate, un antagoniste de la protéine C kinase, de certains sucres aminés et

de certaines glycoprotéines sur la cytoadhérence d'hématies parasitées

(JOHNSON et coll., 1993;SINGH et coll., 1987; WRIGI-IT et coll., 1991). Ces modèles

ont surtout permis une approche in vitro des possibilités thérapeutiques de

l'accès pernicieux par des anticorps monoclonaux anti-thrornbospondine

(ROBERTS et coll., 1985; ROCK et coll., 1988a), anti-CD36 (BARNWELL et coll.,

1985; BARNWELL et coll., 1989; OCKENHOUSE et coll., 1989b; OQUENOO et coll.,

1989) ou antî-ICAM-1 (BERENOT et coll., 1989) ou par des sérums ou des

immunoglobulines de sujets prémunis.

L'efficacité des sérums et des immunoglobulines in vitro a été étudiée

tant avec les modèles statiques qu'avec les modèles dynamiques (ROCK et coll.,

1988a). Ainsi, UOENYIA et coll. (1983b) ont démontré que la cytoadhérence

pouvait être bloquée (inhibée et inversée) par des anticorps de singes

immunisés vis-à-vis de la souche. SINGH et coll. (1988) et SOUTHWELL et coll.

(1989) ont recherché la capacité de blocage de la cytoadhérence par des sérums

prélevés chez des sujets prémunis et par des sérums prélevés chez des malades

atteints de paludisme à l'admission et 3 à 4 semaines plus tard pendant la phase

de convalescence. Alors que les mélanges de sérums de sujets prémunis

bloquent la cytoadhérence, les sérums de sujets prémunis utilisés

individuellement sont moins efficaces. Les sérums des malades au cours de la

phase aiguë et ceux de la phase de convalescence sont également peu efficaces.

Les anticorps impliqués dans ce phénomène sont des IgG, les IgM n'ayant pas

d'activité (GoLORING et coll., 1992; UOENYIA et coll., 1983a). La fraction Fe

terminale des Ig n'est pas indispensable à l'action in vitro des Ig sur la

cytoadhérence étant donné que la fraction F(ab')2 des Ig s'est avérée aussi

efficace que l'Ig complète (HOMMEL et SEMOFF, 1988). Au cours de nos travaux,

nous avons eu l'occasion de vérifier avec le modèle HUVEC l'efficacité de

sérums provenant du Cameroun, de Madagascar et du Zaïre, les

expérimentations décrites dans la littérature ayant été pratiquées avec des

cellules de mélanome ou des monocytes. Alors que les auteurs ont utilisé des

sérums ou des immunoglobulines de sujets prémunis originaires de la même

région que les souches de P. falciparum, le Malawi, la Thaïlande et la Papouasie

Nouvelle Guinée, (GOLDRING et coll., 1992; SINGH et coll., 1988; SOUTHWELL et

coll., 1989), nous avons montré que des sérums peuvent bloquer la

cytoadhérence de souches de régions totalement différentes.

127

Parmi les facteurs de virulence que nous avons étudiés (capacité de

cytoadhérence, formation de rosettes, sensibilité aux antipaludiques) seule la

formation de rosettes in vitro est en relation avec la gravité de la maladie. Des

résultats similaires ont été rapportés en Gambie où le pourcentage de formation

de rosettes était plus élevé parmi les isolats provenant de sujets présentant un

accès pernicieux par rapport aux isolats provenant de sujets présentant un accès

simple (CARLSON et coll. 1990a; TREUTJGER et coll., 1992). De plus, des hématies

parasitées par des formes matures de P. falciparum capables de former des

rosettes ont été isolées dans le sang périphérique d'un patient atteint de

paludisme grave (Ho et coll., 1991a). La signification physiopathologique des

rosettes n'est pas connue et contrairement à la cytoadhérence, les rosettes ont

été rarement décrites au cours des examens post-mortem (PONGPONRATN et

coll. 1991; RJGANTI et coll., 1990). Plusieurs arguments ont conduit à la

conclusion que la capacité d'un isolat à former des rosettes est un facteur de

virulence et une condition à la survenue des processus pathologiques à l'origine

des manifestations cliniques de l'accès pernicieux. Outre la relation rosettes et

gravité de la maladie, dans le modèle des vaisseaux de meso-caecum de Rat, les

hématies parasitées par des lignées de P. falciparum pouvant former des rosettes

entraînent une obstruction plus importante que des lignées ne formant pas de

rosettes (KAUL et coll., 1991). La présence d'anticorps anti-rosettes prévient la

survenue d'un accès pernicieux (CARLSON et coll., 1990a; TREUTJGER et coll.,

1992).

Le phénomène de cytoadhérence peut à lui seul expliquer la

séquestration des hématies parasitées dans les capillaires cérébraux, mais la

formation de rosettes permettrait d'obtenir une accumulation d'hématies

suffisamment importante pour entraîner les signes neurologiques de l'accès

pernicieux. La complémentarité des phénomènes de "rosetting" et de

cytoadhérence est cependant controversée. Une relation inverse a été rapportée

entre la capacité d'isolats de P. [alciparum à adhérer sur des cellules de

mélanome et leur capacité à former des rosettes in vitro (Ho et coll., 1991a;

UDOMSANGPETCH et coll., 1989b), tendance que nous avons également

observée. L'absence d'adhérence après traitement des hématies par de

l'héparine, suggère que les isolats possèdent l'une ou l'autre des capacités mais

pas les deux (Ho et coll., 1991a). A l'inverse, les hématies parasitées peuvent

exprimer à la fois les ligands pour la cytoadhérence et la formation de rosettes

(HANDUNNEITI et coll., 1992b; HASLER et coll., 1990; RUANCJIRACHUPORN et

coll., 1992; UDOMSANCPETCH et coll., 1992). Pour HANDUi\NFITI et coll. (1992b),

l'absence d'adhérence de certains isolats est causée par la formation de rosettes

128

empêchant les hématies parasitées d'adhérer, ce qui nécessite la rupture

préalable des rosettes pour étudier la cytoadhérence des isolats. Ce dernier

point est critiquable. Les travaux qui ont amené à cette conclusion, ont été

menés avec un clone sélectionné et les résultats ne sont pas obligatoirement

généralisables à tous les isolats. La rupture préalable des rosettes n'a pas

modifié l'adhérence de 33 isolats de P. [alciparum provenant de Gambie

(TREUTIGER et coll., 1992). Nous avons observé des rosettes adhérant sur les

HUVEC, phénomène déjà décrit par HA5LER et coll. (1990) et par

UOOMSANGPETCH et coll. (1992) qui ont décrit des rosettes adhérant à des

monocytes, à des plaquettes et à de la thrombospondine. La plupart des

résultats tendent à prouver que les mécanismes d'attachement au cours de la

formation des rosettes et au cours de l'adhérence des hématies parasitées aux

cellules endothéliales sont partiellement différents. Les ligands parasitaires

participant aux deux phénomènes sont distincts et en culture, les isolats ou les

clones perdent plus rapidement le phénotypes R+ que le phénotype C+

(HANOUNNETII et coll., 1992a; UOENYIA et coll., 1983a). Les anticorps anti-22

kD et anti-28 kD n'inhibent pas la cytoadhérence sur les cellules endothéliales.

L'anticorps humain 33G2 n'inhibe pas la formation des rosettes, alors que les

anticorps anti-CD36 ne sont efficaces que pour 10 % des isolats étudiés. Par

contre, il est probable que les deux mécanismes partagent des récepteurs en

commun. Les cellules endothéliales des capillaires cérébraux expriment les

antigènes des groupes sanguins GAFFE et coll., 1973) et les récepteurs CD36 qui

interviennent à la fois dans la formation des rosettes et dans la cytoadhérence

des hématies parasitées sur les cellules endothéliales. Enfin, les études

hémodynamiques ont prouvé que les forces de liaison entre les hématies

parasitées et les hématies saines sont cinq fois plus fortes que les forces de

liaison entre hématies parasitées et cellules endothéliales, ce qui implique que

les pressions équivalentes à celles du flux artériel ne sont pas capables de

rompre des rosettes (NASH et coll., 1992). Si l'on considère que la cytoadhérence

et la formation des rosettes surviennent au niveau des post-capillaires

cérébraux et que les deux phénomènes sont complémentaires, il n'existe pas

d'explication quant à la nécessité de rompre les rosettes pour permettre aux

hématies d'adhérer ru des mécanismes permettant cette rupture.

129

La dernière partie de notre travail sur la cytoadhérence a porté sur les

possibilités de sa modulation, en particulier par les cytokines. Se basant sur le

principe que les récepteurs ICAM-1 sont inductibles sur les cellules

endothéliales par le TNF-a et l'IL-1, BEREN DT et coll. (1989) ont stimulé des

cellules endothéliales pendant 12 h avec ces deux cytokines. Ils ont constaté une

majoration de la cytoadhérence du clone ITOA qui possède une forte affinité

pour le récepteur ICAM-l. L'hypothèse émise après cette étude avait suggéré

que les manifestations neurologiques au cours de l'accès pernicieux étaient liées

à l'infestation d'un sujet exprimant beaucoup de récepteurs ICAM-1 au niveau

de ses capillaires cérébraux par un isolat ayant une forte affinité pour les

récepteurs ICAM-l (CHULA y et OCKENHOUSE, 1990). En outre, les

concentrations plasmatiques élevées de TNF-a fréquemment observées au

cours de l'accès pernicieux, pouvaient être à l'origine d'une augmentation de

l'expression des récepteurs ICAM-l sur les cellules endothéliales des capillaires

cérébraux. Dans ces conditions, on pouvait s'attendre, pour les isolats

provenant de malades souffrant d'accès pernicieux, à une augmentation de la

cytoadhérence après stimulation des HUVEC par du TNF-a. Nous avons

observé une augmentation significative de la cytoadhérence pour 6/30 isolats.

Aucun des 6 isolats n'avait entraîné un accès pernicieux, par contre l'adhérence

avait été augmentée pour des isolats présentant spontanément une forte

adhérence sur HUVEC.

Bien que nous n'ayons pas formellement démontré le rôle exclusif des

récepteurs ICAM-l après la stimulation par le TNF-a, leur participation

représenterait au moins 75 % (OCKENHOUSE et coll., 1992b). La participation

d'autres récepteurs est probable, mais à un degré moindre. Le TNF-a augmente

la sécrétion de la thrombospondine (DUNN et coll., 1989). Bien que la

thrombospondine puisse médier la cytoadhérence d'hématies parasitées, elle se

fixe vraisemblablement sur les récepteurs CD36 absents des HUVEC. VCAM-1

et E-sélectine ne sont pas exprimés sur les HUVEC à l'état basal, mais leur

expression peut aussi être majorée après stimulation par le TNF-a. Cependant,

les concentrations de cytokines requises pour obtenir le maximum d'expression

de VCAM-1 et E-sélectine et leur cinétique sont différentes de celles du

récepteur ICM1-1.

Nos résultats ont été complétés par deux études récentes. Dans la

première, UDEINYA et AKOCYERAM (1993) ont stimulé pendant 12 heures des

HUVEC et ont recherché les modifications de l'adhérence du clone ITG2F6.

Malgré l'augmentation de la cytoadhérence pour des doses de 50 ou 100 C / ml

Ba

de TNF-a, les auteurs ont conclu à la participation d'autres récepteurs que

ICAM-1. Il faut préciser que tant dans l'étude de UDEINYA et AKOCYERAM

(l993) que dans celle de BERENDT et coll. (1989), la stimulation des HUVEC n'a

duré que 12 heures et que les conclusions des deux études sur la participation

d'ICAM-1 sont contradictoires. Dans une autre étude, JOHNSON et coll. (l993)

ont utilisé un modèle dynamique et ont stimulé des HDMEC par du TNF-a et

de l'IFN-y. Contrairement à l'IFN-y qui majorait la cytoadhérence des clones

HB3 et FC27 par l'intermédiaire de l'augmentation de l'expression des

récepteurs CD36, le TNF-a n'avait aucun effet sur la cytoadhérence alors qu'il

augmentait l'expression des récepteurs ICAM-l. Ces différents travaux

confirment que ICAM-l n'est pas le principal récepteur dans le phénomène

de cytoadhérence dans les modèles in vitro.

Le GM-CSF, l'IL-3 et l'IL-6 ne modifient pas la cytoadhérence des

hématies parasitées sur les HUVEC. L'augmentation de la cytoadhérence

observée après la stimulation des HUVEC par l'association TNF-a, GM-CSF et

IL-3 est vraisemblablement liée à un effet additif du TNF-a et de l'IL-3 (le GM­

CSF ne modifiant pas l'effet du TNF-a) et suggère un mécanisme d'action

différent pour le TNF-a et l'IL-3.

Pour certains auteurs, le phénomène de cytoadhérence ne peut pas

expliquer les troubles neurologiques de l'accès pernicieux (CLARK et coll., 1992c;

LEECH, 1991). Il n'est pas concevable qu'une obstruction des capillaires même

partielle n'entraîne pas des lésions irréversibles dans un organe noble comme le

cerveau ni des séquelles. La cytoadhérence pourrait être un épiphénomène qui

permettrait aux parasites de vivre dans une atmosphère d'hypoxie et d'éviter le

passage par la rate où ils seraient détruits. Par contre, il est tout à fait

concevable que l'accumulation d'un nombre important d'hématies parasitées

par des formes parasitaires en pleine croissance dans les capillaires cérébraux

induise un coma soit par des perturbations métaboliques (consommation

d'oxygène, de glucose, ou d'autres nutriments), soit par des toxines sécrétées en

grande quantité par les parasites, soit enfin par des médiateurs sécrétés par

l'hôte en réponse à la stimulation antigénique plasmodiale (GOLDRINC et

HOMMEL, 1993).

131

Le rôle de médiateurs solubles, et plus particulièrement celui des

cytokines a été évoqué par CLARK et coll. (1981). Plusieurs cytokines ont été

incriminées dans la survenue de l'accès pernicieux chez l'Homme, en particulier

le TNF-a. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons choisi d'étudier le

rôle potentiel des cytokines au cours de l'accès pernicieux.

La participation du TNF-a à la physiopathologie de l'accès pernicieux a

été suggérée suite aux travaux menés chez la Souris infectée par P. berghei. Dans

ce modèle, les concentrations de TNF-a sont augmentées lors de la survenue de

troubles neurologiques (GRAU et coll., 1987a). L'injection de TNF-a reproduit

les lésions observées au cours de la phase finale d'une infestation par P. uinkei

ou P. berghei ANKA (CLARK et coll., 1987; CLARK et coll., 1990; CLARK et coll.,

1992b; CURFS et coll., 1993; GRAU et coll., 1989b) alors que l'injection d'anticorps

anti-TNF-a prévient la survenue des troubles neurologiques (GRAU et coll.,

1987a). Chez l'Homme, les effets secondaires induits lors d'un traitement anti­

cancéreux par le TNF-a sont comparables aux symptômes cliniques et aux

modifications biologiques observés au cours d'un accès palustre: nausée,

vomissement, fièvre, céphalées, myalgies, arthralgies, hypotension, herpès

labial, troubles neurologiques, thrombopénie, leucopénie et augmentation des

taux plasmatiques de la C-réactive protéine (CRP) (CLARK et coll., 1989b).

L'élévation du TNF-a au cours des parasitoses et en particulier au cours du

paludisme a été décrite par SCUDERI et coll. (1986). La sécrétion de TNF-a est

liée à la stimulation des monocytes et des macrophages humains par des

antigènes de P. falciparum lors de la rupture des schizontes (BATE et coll., 1988;

KWIATKOWSKI et coll., 1989; PrcOT et coll., 1990; TAVERNE et coll., 1990a;

TAVERNE et coll., 1990b). La relation entre sévérité de l'accès palustre et

concentrations plasmatiques élevées de TNF-a a été rapportée au cours

d'études menées au Malawi, en Gambie, au Zaïre et chez les voyageurs

européens (GRAU et coll. 1989c; HEMMER et coll., 1991; KERN et coll., 1989;

KWIATKOWSKI et coll., 1990; MOLYNEUX et coll., 1991; SHAFFER et coll., 1991). A

Madagascar, nous avons retrouvé une élévation plus importante des

concentrations plasmatiques de TNF-a au cours des accès palustres sévères

(pernicieux ou non) par rapport aux accès palustres simples. De plus, les

concentrations de TNF-a sont corrélées avec des facteurs cliniques et

biologiques de gravité (la parasitémie, la bilirubinémie, la température) et

inversement corrélées au nombre des plaquettes.

Par contre, il n'existe pas de différence entre les accès pernicieux et les

accès palustres sévères sans coma. Les concentrations plasmatiques de TNF-a

132

très élevées ne sont pas systématiquement associées à un décès ou à un accès

pernicieux et au sein de chaque groupe, il existe une très grande variation entre

les sujets (SHAFFER et coll., 1991). Ces discordances vont à l'encontre du rôle

causal du lNF-a dans l'accès pernicieux et ont été argumentées par la demi-vie

courte du TNF-a, par la durée de l'évolution de la maladie avant

l'hospitalisation et par une sensibilité individuelle au TNF-a (tolérance,

neutralisation et/ou inactivation du TNF-a in vivo) (GRAU et coll., 1989c;

KARUNAWEERA et coll., 1992). Mais, un autre argument est venu infirmer le rôle

causal du lNF-a dans l'accès pernicieux: aucune atteinte neurologique n'est

décrite au cours d'une infestation par P. vivax alors que les pics plasmatiques de

TNF-a mesurés sont plus élevés mais de durée plus courte que les

concentrations plasmatiques de TNF-a au cours d'un accès palustre à P.

[alciparum, même pernicieux (BUTCHER et coll., 1990; KARUNAWEERA et coll.,

1992;MENDIS, 1992).

D'autre part, il est probable que les concentrations périphériques

mesurées ne soient qu'un reflet des quantités sécrétées dans les capillaires et de

la fraction fixée sur les tissus. KERN et coll. (1992) ont rapporté des

concentrations élevées de récepteurs solubles du TNF-a au cours d'accès

palustres dont la fonction serait de contrôler la sécrétion excessive de TNF-a.

Dans ces conditions, les concentrations de TNF-a mesurées par IRMA ou

ELISA ne correspondent pas à la fraction active du TNF-a circulant

(KWIATKOWSKI et coll., 1993). A l'inverse, des concentrations élevées de

récepteurs solubles du TNF-a sont retrouvées chez des sujets sains et leur rôle

serait plus de permettre une libération lente et prolongée de TNF-a plutôt

qu'une désactivation (CHOUAIB et coll., 1991).

Si la participation du TNF-a reste discutable pour certains auteurs, son

mode d'action dans la cadre de l'accès pernicieux est par contre pour l'instant

inconnu.

L'hypothèse la plus séduisante était la modulation de l'expression des

récepteurs ICAM-1 sur la surface des cellules endothéliales des capillaires

cérébraux. Nos résultats ont montré que le récepteur ICAM-1 n'est pas le

principal récepteur dans le phénomène de cytoadhérence in vitro, mais

n'excluent pas sa participation. Avec le modèle HUVEC, le TNF-a a augmenté

l'adhérence de 6 isolats, sans aucune relation avec la gravité de la maladie. De

plus, l'association concentration plasmatique élevée et augmentation de

l'adhérence in vitro n'a été retrouvée que pour 4 isolats (trois accès sévères et un

accès simple). Le TNF-a peut aussi induire la sécrétion de formes solubles

133

d'ICAM-1 et d'E-sélectine (LEEUWENBERG et coll., 1992; PIGOTI et coll., 1992).

Au cours du paludisme, les concentrations plasmatiques des récepteurs ICAM­

1 et E-sélectine solubles sont augmentées (Hv Il D et coll., 1993). Les

concentrations des récepteurs solubles ICAM-1 sont corrélées avec la gravité de

la maladie (ELlNG, données non publiées) et pourraient être un marqueur de là

sévérité des lésions vasculaires (FURUKAWA et coll., 1992). Bien que la fonction

des formes solubles des récepteurs ICAM-1 et E-sélectine ne soit pas connue,

elles pourraient se fixer sur les hématies parasitées et par conséquent empêcher

leur fixation sur les cellules endothéliales.

Les propriétés pro-coagulantes du TNF-a sur les cellules endothéliales

ont été incriminées. Bien que les troubles de la coagulation soient fréquents au

cours du paludisme, les CND et les thrombi sont rarement observés au cours

des accès pernicieux.

L'hypoglycémie et l'acidose lactique sont deux complications

fréquemment rencontrées au cours du paludisme à P.falciparum. Contrairement

au modèle murin, la participation du TNF-a à ces deux complications

métaboliques chez l'Homme n'a pas été formellement prouvée bien que les

concentrations de TNF-a soient inversement corrélées à la glycémie.

Une action directe du TNF-a a été suggérée par CLARK et coll. (l989b),

d'autant que les troubles neurologiques sont passagers et ne laissent la plupart

du temps aucune séquelle. A l'inverse, l'action du TNF-a pourrait être médiée

par des substances parmi lesquelles on retrouve le PAF et les radicaux libres de

l'oxygène (BRAQUET et coll., 1989; CLARK et coll., 1989a). Le TNF-a

interviendrait alors soit comme initiateur, soit comme potentialisateur de

l'action de ces médiateurs. Le PAF, sécrété par les cellules endothéliales activées

par le TNF-a, est à l'origine de lésions des cellules endothéliales, d'une

augmentation de la perméabilité vasculaire et d'une thrombose. Le PAF est un

puissant agent chimiotactique des polynucléaires neutrophiles, des

éosinophiles, des macrophages et induit la dégranulation ou la sécrétion par ces

cellules de radicaux libres de l'oxygène, de leucotriène ou de la "Major Basic

Protein", substances capables d'endommager les parois vasculaires. TI existe une

boucle d'auto-amplification entre la sécrétion de PAF par les cellules

endothéliales et la sécrétion de TNF-a par les macrophages et une

potentialisation des effets entre le PAF et le TNF-a, TNF-a et PAF ayant par

ailleurs tous les deux une action directe de rétraction des cellules endothéliales

à l'origine d'une perméabilité vasculaire accrue. La participation du PAF à la

survenue des troubles neurologiques chez la Souris n'a cependant pas été

confirmée (GRAU et coll., 1989b). Le TNF-a induit aussi la sécrétion de radicaux

libres de l'oxygène par les macrophages et les polynucléaires neutrophiles. Le

134

rôle des radicaux libres dans la survenue de l'accès pernicieux reste une

hypothèse, des agents anti-oxydants pouvant prévenir la survenue de troubles

neurologiques chez la Souris (CLARK et coll., 1986; CLARK et coll., 1989a) et les

pseudopodes observés au niveau des cellules endothéliales au cours de l'accès

pernicieux sont semblables aux pseudopodes obtenus expérimentalement en

présence des radicaux libres de l'oxygène (MACPHERSON et coll., 1985).

Un autre moyen par lequel le TNF-a pourrait occasionner des troubles

neurologiques est l'induction et la sécrétion d'oxyde nitrique (NO) (CLARK et

coll., 1991; CLARK et coll., 1992c). Outre les macrophages activés par l'IFN-y, les

cellules endothéliales, les hépatocytes et les neutrophiles sont capables de

produire du NO qui intervient dans les phénomènes de neurotransmission, et

qui induit une vasodilatation par relâchement de la musculature lisse, une

inhibition de l'agglutination des plaquettes et une inhibition de l'adhérence des

leucocytes (JAMES, 1991). Le TNF-a participe à la production de NO étant

donné que l'hypotension après injection de TNF-a peut être inhibée par la NG­

monornéthyl-Learginine, un inhibiteur de la NO synthétase. CLARK et coll.

(1991) ont proposé que la séquestration des hématies parasitées était à l'origine

d'une sécrétion par les cellules endothéliales de TNF-a puis de NO. Ce dernier

diffusant dans le cerveau, occasionnerait des troubles neurologiques. De plus le

NO, puissant vasodilatateur, provoquerait une hypotension systémique,

complication fréquente au cours du paludisme, et un oedème cérébral.

Cependant, l'utilisation d'inhibiteur de la NO synthétase n'a aucun effet sur la

prévention des troubles neurologiques chez la Souris, et le NO aurait plus un

effet protecteur que délétère (ASEN510 et coll., 1993; KREMSNER et coll., 1992;

KREMSNER et coll., 1993; SENALDI et coll., 1992). Bien que les concentrations

sériques de NO soient plus élevées au cours de l'accès pernicieux qu'au cours

d'un accès palustre simple (NÜSSLER, données non publiées), les conœntrations :

de NO s'élèvent au cours de l'évolution de l'accès pernicieux et sont

inversement corrélées à la durée du coma (COT, données non publiées).

Aucune hypothèse n'est entièrement satisfaisante. Il est probable que, si

le TNF-a intervient dans la physiopathologie de l'accès pernicieux, sa

participation n'est pas isolée, mais son action s'associe à celle de plusieurs

cytokines partageant des activités communes ou ayant une action

potentialisatrice. Ainsi, le TNF-a est capable d'induire la sécrétion par les

cellules endothéliales de l'IL-l, de l'IL-6, du G-CSf, du M.,CSF, du GM-CSF et

de l'IL-8 (CLARK et coll., 1989b). Les nombreuses corrélations entre les

135

concentrations des différentes cytokines que nous avons observées, reflètent

les étroites relations existant dans la production de ces cytokines.

Non seulement l'IL-1 partage beaucoup d'activités avec le TNF-u, mais

de plus l'IL-1 agit le plus souvent en synergie avec le TNF-u (AKIRA et coll.,

1990; LE et VILCEK, 1987; MANTOVANI et coll., 1992). Au niveau des cellules

endothéliales, ces activités concernent l'action pro-coagulante, la production de

PAF, de prostacyclines, de NO, de l'IL-1, de l'IL-6, du G-CSF, du M-CSF, du

GM-CSF et de l'IL-8, l'augmentation de la perméabilité vasculaire et

l'augmentation de l'expression des récepteurs ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine.

Comme le TNF-u, l'IL-1 est un pyrogène et participe au phénomène du

sommeil. Les travaux sur l'IL-1 ont été décevants. Les concentrations d'IL-1 ne

sont pas élevées chez la Souris infectée par P~ berghei et les anticorps anti-IL-1-u

n'ont pas d'effet sur la prévention des troubles neurologiques (GRAU et coll.,

1989b). De faibles doses de IL-1-u ou IL-1-f) injectées à des souris parasitées par

P. berghei évitent l'apparition de troubles neurologiques ainsi que l'élévation de

la parasitémie (CURFS et colL, 1990). Chez l'Homme, les études sur l'IL-1 sont

contradictoires. Contrairement à KWlATKOWSKI et colL (1990), nous n'avons pas

mis en évidence d'augmentation d'IL-l-u ce que corroborent les études menées

au Malawi et au Burundi et au cours des infestations expérimentales chez

l'Homme (DELORON, données non publiées; HARPAZ et colL, 1992; MOLYNEUX

et colL, 1991). Les faibles concentrations d'IL-1 circulantes observées seraient

liées à un défaut de sécrétion par les macrophages. En effet l'apport exogène

d'IL-1 rétablit partiellement la prolifération in vitro de lymphocytes prélevés

chez des sujets présentant un accès palustre à P. falciparum (ALVES et colL,

1992).

Chez la Souris, l'IL-6 n'est pas impliquée dans la survenue des troubles

neurologiques mais est vraisemblablement un médiateur dans

l'hypergammaglobulinémie (GRAU et coll., 199üb). Chez l'Homme, les études de

l'IL-6 au cours de l'accès pernicieux ou sévère sont peu nombreuses (FRIEDLAND

et colL, 1993; KERN et colL, 1989; MOLYNEUX et colL, 1991). Les sujets

malgaches hospitalisés pour un accès grave (accès pernicieux et accès sévères

confondus) ont présenté des concentrations plus élevées d'IL-6 que les sujets

malgaches atteints d'un accès palustre simple. Comme pour le TNF-u, les

concentrations plasmatiques d'IL-6 sont corrélées avec des facteurs cliniques

et biologiques de gravité (la parasitémie, la bilirubinémie, la température) et

inversement corrélées au nombre des plaquettes. L'IL-6 intervient

essentiellement dans la différentiation et la multiplication des lymphocytes et

136

des cellules souches de la moelle, et dans la production par le foie des protéines

de l'inflammation (CRP, haptoglobine, ...). La synthèse de ces protéines est

augmentée au cours du paludisme (GILLESPrE et coll., 1991; GRAt\IINGER et coll.,

1992; HARPAZ et coll., 1992; NAIK et VOLLER, 1984) et leur rôle important, en

particulier celui de la CRP, dans la défense de l'organisme contre les formes

pré-érythrocytaires a été démontré chez la Souris (FrED et coll., 1989). Il semble

que la participation du TNF-a et de l'IL-1 à cette réponse inflammatoire soit

médiée en partie, si ce n'est totalement, par l'IL-6 (AKJRA et coll., 1990). Outre

les protéines de l'inflammation, la destruction des stades pré-érythrocytaires

par l'IL-6 serait également médiée par le NO (NÜSSLER et coll., 1991). Etant

donné que la production d'IL-6 n'est pas spontanée mais induite par de

nombreux facteurs dont le TNF-a, il est possible que l'élévation des

concentrations de l'IL-6 ne soit pas un marqueur de gravité en soi, mais une

conséquence de l'augmentation des concentrations de TNF-a comme tend à le

prouver la corrélation des concentrations plasmatiques de ces deux cytokines

retrouvée systématiquement au cours des différentes études.

L'IFN-y est un médiateur essentiel dans la survenue de l'accès pernicieux

chez la Souris. L'injection d'anticorps monoclonaux anti-IFN-y prévient les

troubles neurologiques et l'hyperproduction de TNF-a (GRAU et coll., 1989a). A

l'inverse, comme pour le TNF-a, l'IFN-y possède un rôle protecteur pour l'hôte

contre les formes exo-érythrocytaires et érythrocytaires de PLasmodium. Ces

données ont été partiellement confirmées chez l'Homme pour le TNF-a et l'IFN­

y au cours d'études longitudinales (DELORON et coll., 1991; PEYRON et coll.,

1990). Nous n'avons pas montré de relation entre la gravité de la maladie et

les concentrations plasmatiques d'IFN-y qui, au cours de nos études, sont

faiblement augmentées avec un retour rapide à la normale dans les 24 heures.

Au cours des infestations expérimentales chez l'Homme, il a été démontré que

l'augmentation de l'IFN-y est très précoce et transitoire au cours de la maladie

ce qui explique que des concentrations élevées d'IFN-y sont rarement détectées

au cours des études cliniques en particulier si le délai de consultation a été long.

L'augmentation des concentrations d'IFN-y précède celle du TNF-a et l'IFN-y

serait aussi un facteur pyrogène (HARPAZ et coll., 1992). Paradoxalement, la

stimulation des HDMEC par l'IFN-y occasionne une majoration de l'adhérence

des hématies parasitées par l'augmentation de l'expression des récepteurs CD36

dont nous avons décrit l'importance dans les phénomènes de cytoadhérence in

vitro.

137

De même, l'IL-3 et le GM-CSF sont des médiateurs essentiels dans la

survenue de l'accès pernicieux chez la Souris. L'injection simultanée d'anticorps

anti-IL-3 et anti-GM-CSF prévient l'élévation du taux de TNF-a, l'accumulation

de macrophages dans la rate et les ganglions lymphatiques et l'apparition de

signes neurologiques (GRAU et coll., 1988). Nous n'avons pas mis en évidence

de variation des concentrations plasmatiques d'IL-3 ou de GM-CSf avec la

gravité de la maladie chez l'Homme. La stimulation des HUVEC par ces deux

cytokines n'entraîne pas d'augmentation de l'adhérence des hématies

parasitées. L'effet additif du TNF-a et de l'IL-3 mériterait néanmoins des études

complémentaires d'autant que l'IL-3 augmente l'expression des récepteurs E­

sélectine sur les HUVEC (BRIZZI et coll., 1993).

Les autres cytokines ont été peu étudiées au cours de l'accès pernicieux.

La lymphotoxine ou TNF-~ partage beaucoup de fonctions avec le TNF-a et les

concentrations plasmatiques sont également augmentées au cours du

paludisme mais ne sont pas corrélées à celles du TNF-a (CLARK et coll., 1992a).

La lymphotoxine induit chez la Souris une hypoglycémie, une augmentation de

la concentration d'IL-6 et une sécrétion de NO (CLARK et coll., 1992a; ROCKEIT

et coll., 1992). Comme le TNF-a, l'IL-2 injectée à des patients atteints de cancer

entraîne des troubles neurologiques transitoires vraisemblablement par

l'intermédiaire du TNF-a et du NO (CLARK et coll., 1989b; CLARK et coll.,

1992c). L'IL-8 est un puissant activateur des neutrophiles qui induit leur

dégranulation et la sécrétion de radicaux libres de l'oxygène. Les concentrations

d'IL-8 au cours du paludisme sévère sont faiblement augmentées, comparées

aux concentrations décrites au cours du syndrome de détresse respiratoire

aiguë de l'adulte (DONNELLYet coll., 1993; FRIEDLAND et coll., 1993).

Les travaux récents en immunologie ont permis de montrer l'existence,

d'abord chez la Souris puis chez l'Homme, de deux types de lymphocytes T

helper, les Th1 et les Th2. Si les deux types de lymphocytes sécrètent l'IL-3 et le

GM-CSF, seuls les Th1 produisent du TNF-~, de l'IFN-y et de l'IL-2 et les Th2 de

l'IL-4, de l'IL-S et l'IL-6. Les Th1 interviennent dans les réponses de type

hypersensibilité retardée et les Th2 dans la réponse humorale. L'IFN-y inhibe la

prolifération des Th2 et la possibilité que les Th2 inhibent l'action (prolifération

et sécrétion des cytokines) des Th1 a permis de découvrir l'IL-lO. L'IL-10 est

également sécrétée par les monocytes, les macrophages et les lymphocytes B.

Parmi ses autres fonctions, l'IL-lO inhibe la production par les macrophages de

nombreuses cytokines (IL-1-a, IL-l-l3, IL-6, IL-8, GM-CSF et TNF-a) et des

radicaux NO (DE WAAL MALEFYT et coll., 1991; HOWARD et O'CARRA, 1992).

118

Schématiquement, FINKELMAN et URBAN (1992) ont proposé que, dans les

maladies parasitaires, les Thl et les cytokines correspondantes protègent contre

les infections parasitaires intracellulaires de type leishmaniose alors que la

réponse des Th2 est plutôt délétère. A l'inverse, les Th2 et leurs cytokines

protègent de l'infestation par les helminthes intestinaux. Etant donné le rôle

inlùbiteur de l'IL-ID de la sécrétion du TNF-a par les macrophages, nous avions

postulé que l'IL-ID pourrait prévenir au cours du paludisme l'augmentation du

TNF-a et par conséquent la survenue d'un accès pernicieux (dans l'éventualité

où le TNF-a serait l'agent causal). A notre grande surprise, non seulement les

concentrations d'IL-IO étaient plus élevées au cours des accès pernicieux ou

des accès palustres sévères par rapport aux accès palustres simples, mais de

plus les concentrations d'IL-IO et de TNF-a était positivement corrélées (mais

pas de manière significative). Nos résultats sont d'autant moins surprenant, que

la sécrétion de l'IL-ID par les Thl a été démontrée chez l'Homme (DEL PRETE et

coll., 1993). Comme pour le TNF-a, il existe de grandes variations des

concentrations d'IL-ID dans les différents groupes de sujets. Nos résultats

conduisent aux deux hypothèses suivantes: l'IL-ID est soit un facteur inhibant

les réponses immunitaires au cours du paludisme à l'origine de formes graves

de paludisme, soit un des nombreux marqueurs de l'activation du système

immunitaire dont la réponse inappropriée pourrait conduire à l'accès

pernicieux. Il existe de nombreux arguments en faveur de l'une ou de l'autre de

ces théories.

Le paludisme à P. falciparum est caractérisé par un déficit de la réponse

immune (HVIID et coll., 1992). Cette immuno-suppression, caractérisée par

l'absence ou la réduction de la réponse in vitro des lymphocytes T circulant

dans le sang périphérique à la stimulation par des antigènes plasmodiaux, est

plus importante dans les atteintes sévères de la maladie et est réversible

quelques semaines après la disparition de la parasitémie. Plusieurs mécanismes

ont été proposés pour expliquer cette immuno-suppression (Ho et coll., 1988) :

• un déficit de la production d'Ilzl:

• un déficit primitif de l'expression d'IL-2R sur les lymphocytes;

• un déficit de la production d'IL-2 qui pourrait secondairement

induire un déficit en IL-2R, l'IL-2 stimulant la synthèse de son propre

récepteur;

• le blocage de l'activité de l'IL-2 par l'IL-2R circulant d'autant que les

concentrations d'IL-2R sont plus élevées au cours des accès pernicieux

par rapport aux accès simples;

• l'augmentation des lymphocytes m8 circulant;

• la sécrétion d'IL-lO.

139

A l'opposé, CARTER et coll. (1992) ont suggéré que la gravité de l'accès

palustre serait la conséquence d'une réponse du système immunitaire contre

l'hôte. Alors que le parasite serait à l'origine de la réponse immunitaire, c'est

une réponse inappropriée qui induirait les lésions observées au cours des accès

palustres graves. Plusieurs arguments peuvent plaider en faveur de cette

hypothèse.

Nous avons rapporté une élévation simultanée des concentrations

plasmatiques de plusieurs cytokines et de la néoptérine, ce qui signe une

activation massive des cellules immuno-compétentes au cours d'un accès

palustre. Ces résultats ont confirmés d'autres études cliniques et suggèrent la

présence de lymphocytes et de macrophages activés au cours de la phase aiguë

de la maladie. L'absence de prolifération cellulaire à la stimulation par des

antigènes plasmodiaux ne signifie pas l'absence totale de réponse cellulaire, car

il n'y a pas de corrélation entre la capacité des lymphocytes à proliférer et à

produire certaines cytokines. D'autre part, les tests in vitro utilisent des

lymphocytes circulant dans le sang périphérique alors qu'il est possible que les

lymphocytes activés soient séquestrés au niveau des organes profonds.

HILL et coll. (1991) ont évoqué la relation entre le système HLA et la

gravité de l'accès palustre. Les sujets porteurs des gènes codant pour les

antigènes HLA de classe 1 Bw53 sont moins susceptibles de développer un

accès pernicieux ou une anémie sévère. De même, les sujets porteurs des gènes

codant pour les antigènes de classe II DRw13 sont protégés contre la survenue

d'une anémie sévère. Une interprétation différente des résultats a été proposée

par CARTER et coll. (1992). Les sujets porteurs de ces antigènes auraient une

capacité réduite à reconnaître les parasites ayant, pour conséquence, une

réponse immunitaire moindre et l'absence d'emballement du système

immunitaire à l'origine des formes graves. Cette théorie est à mettre en parallèle

avec la prédisposition génétique à produire du TNF-a. En effet, la capacité de

production de TNF-a est étroitement liée aux antigènes de classe II DR, avec

des conséquerices directes sur la prédisposition de certaines maladies auto­

immunes comme le lupus érythémateux disséminé et le diabète insulino­

dépendant QACOB et coll., 1990; POCIOT et coll., 1993). Les sujets porteurs des

haplotypes HLA DR3 et DR4 sont capables de produire de fortes quantités de

TNF-a, alors que l'haplotype DR2 est associé à une faible production. Dans le

cas du paludisme, un excès de TNF pourrait être lié à une infestation par un

isolat virulent induisant une stimulation accrue des macrophages (HOMMEL,

1993) mais aussi au système HLA de l'hôte prédisposant à une forte réponse

immunitaire, à une production excessive de cytokines et à la survenue d'une

140

forme grave de paludisme. La prédisposition génétique pourrait

éventuellement aussi s'appliquer à la capacité d'un individu à exprimer ou à

induire l'expression après stimulation par des cytokines des récepteurs au

niveau des capillaires cérébraux. Ainsi, la séquestration des hématies parasitées

se produirait chez des individus susceptibles d'exprimer beaucoup de

récepteurs CD36. Ce point reste néanmoins à démontrer.

Nous avons montré que la réponse immunitaire de type cellulaire en

cas d'accès palustre à P. falciparum est différente chez les sujets européens

non prémunis et les sujets prémunis. Les concentrations de cytokines sont

moins élevées chez les sujets prémunis avec un retour plus rapide à la

normale. Des résultats similaires ont été décrits au cours du paludisme à P.

vivax. L'élévation moins importante des concentrations de cytokines chez des

sujets prémunis pourrait être liée soit à une tolérance des macrophages aux

antigènes plasmodiaux, soit à l'élaboration au cours des infestations

précédentes d'une réponse humorale dont les anticorps pourraient bloquer la

stimulation des macrophages par les antigènes plasmodiaux. Cette dernière

théorie corrobore la notion que les concentrations d'IL-4 et l'apparition des

anticorps sont corrélées avec l'âge en zone d'endémie contrairement aux

concentrations de certaines cytokines et de la néoptérine (MSHANA et coll.,

1991). Nous avons participé à une étude sur les populations lymphocytaires

montrant que les sujets partiellement prémunis présentaient moins de

lymphocytes activés circulant (CD3+HLADR+) (CHOUGNET et coll., 1992). Une

baisse des lymphocytes CD4 et une augmentation des lymphocytes CD8 plus

marquées chez des sujets non prémunis par rapport à des sujets prémunis

avaient déjà été rapportées (KREMSNER et BIENZLE, 1989; KREMSNER et coll.,

1990). Bien que la plupart de ces études aient été menées chez des patients

atteints d'accès palustres simples, ces résultats confirment que la réponse

immunitaire cellulaire chez les sujets prémunis est différente et moins intense

que chez les sujets non prémunis. Par rapport à la théorie de CARTER et coll.

(1992), ces résultats corroborent la notion que les adultes vivant en zone

d'endémie développent rarement des accès pernicieux.

Paradoxalement, les enfants vivant en zone d'endémie développent des

accès pernicieux vers un âge moyen de 40-45 mois (GREENwOOD et coll., 1991).

La survenue d'un accès pernicieux nécessiterait soit une sensibilisation

préalable, ce qui n'est pas le cas chez les voyageurs européens qui peuvent

développer un accès pernicieux au cours de leur première expérience palustre,

soit plus vraisemblablement une maturation, puis dans un deuxième temps un

emballement du système immunitaire de l'enfant.

141

Enfin, l'augmentation des concentrations plasmatiques et rachidiennes

de certaines cytokines au cours des séquelles neurologiques est un autre

argument en faveur d'un mécanisme immunologique à l'origine des troubles

neurologiques (DE SrLVA et coll., 1992).

142

~MPl~CAl~ONS

IHllÈRAP[EUl~QU[ES

Comme nous l'avions annoncé dans notre introduction, l'étude des

mécanismes physiopathologiques de l'accès pernicieux et leur meilleure

compréhension devraient permettre la mise au point de traitements adjuvants

car, malgré l'instauration des traitements adaptés, la létalité reste très élevée.

Nous rappellerons rapidement les données de la littérature.

Suite aux résultats obtenus in vitro avec les différents modèles cellulaires,

l'application clinique la plus évidente était celle du traitement par des sérums

de sujets prémunis. Dans un premier temps, ces sérums ont été utilisés pour le

traitement de l'accès palustre simple. Dans leurs études menées en Gambie et

au Nigéria, COHEN et coll. (1961)et EOOZIEN et coll. (1962) ont démontré qu'une

injection d'un mélange de gamma-globulines prélevées chez des adultes ou à

partir de sang de cordon, pouvait guérir des enfants originaires du même pays

atteints de paludisme. Les sérums d'adultes gambiens se sont révélés moins

efficaces, dans les mêmes conditions, contre des souches de P. [alciparum

infectant des enfants d'Afrique de l'Est (MACGREGOR et coll., 1963).

SABCHAREON et coll. (1991) ont traité neuf sujets thaïlandais dont aucun ne

souffrait d'accès pernicieux, parasités par des souches de P. falciparum

résistantes à la quinine. Les anticorps purifiés à partir de donneurs ivoiriens ont

réduit la parasitémie mais aucune forme mature de P. [alciparum n'a été

retrouvée dans le sang périphérique après l'injection d'anticorps, amenant les

auteurs à conclure que les anticorps n'ont pas agi sur la cytoadhérence. Ces .

résultats diffèrent des travaux menés chez le Singe Saimiri infecté par P.

falciparum chez qui l'injection d'anticorps spécifiques anti-P. falciparum avait

entraîné la libération dans la circulation sanguine d'hématies parasitées par des

trophozoïtes et des schizontes. L'injection d'anticorps avait par conséquent

inversé la cytoadhérence in vivo et la parasitémie avait rapidement baissé dans

les 24 heures (DAVID et coll., 1983). L'injection d'anticorps spécifiques à des

malades atteints d'accès pernicieux était par conséquent une perspective

intéressante. Malheureusement, l'association d'une perfusion

d'immunoglobulines à la quinine s'est avérée inefficace dans une étude au

Malawi (TAYLOR et coll., 1992). Les auteurs n'ont cependant pas exclu la

possibilité d'utiliser des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre

les ligands parasitaires.

Les travaux les plus intéressants sur les anticorps anti-cytokines ont été

réalisés avec le modèle murin par GRAU et coll. (1987a; 1988; 1989a). Une

injection d'anticorps monoclonaux anti-TNF-a ou simultanée d'anticorps anti­

IL-3 et anti-GM-CSF protège la Souris des lésions neurologiques.

144

L'hyperproduction de TNF-a est inhibée par l'injection d'anticorps

monoclonaux anti-IFN-y. Chez l'Homme, l'utilisation d'anticorps anti-TNF-a au

cours de l'accès pernicieux a eu une action sur la fièvre mais n'a pas modifié

l'évolution de la maladie (KWIATKOWSKI et coll., 1993). Il faut néanmoins

remarquer que l'injection des anticorps anti-TNF-a a été effectuée à l'admission

alors que les enfants étaient déjà comateux. La prévention des troubles

neurologiques chez la Souris nécessitait une injection d'anticorps 4 à 7 jours

après le début de l'infestation c'est à dire avant l'apparition des signes

neurologiques (GRAU et coll., 1987a). A l'inverse, le TNF-a possède une activité

anti-parasitaire bénéfique. L'injection simultanée de P. uinkei et d'anticorps anti­

TNF-a à des souris, provoque une majoration de la parasitémie aux 5 et 6è

jours. Le phénomène ne se reproduit pas si les anticorps sont injectés 4 jours

après l'infestation (NEIFER et coll., 1989). De même, la dexaméthasone, qui

inhibe la production de TNF-a mais qui ne peut empêcher un processus déjà

engagé, s'est révélée inefficace dans le traitement des accès pernicieux chez

l'Homme, peut-être à cause de son utilisation trop tardive. A l'inverse, la

dexaméthasone prévient l'apparition des troubles neurologiques et la mort chez

la Souris infectée par P. berghei lorsque le traitement est débuté précocement

(CURFS et coll., 1993). En théorie, le traitement par des anticorps anti-TNF-a

devait être effectué à titre préventif chez des malades atteints de paludisme

simple pour prévenir l'évolution vers un accès pernicieux, ce qui en pratique est

irréalisable et illogique compte tenu de l'action thérapeutique espérée.

L'action inhibitrice sur la cytoadhérence des anticorps dirigés contre la

thrombospondine, les récepteurs CD36 et ICAM-1 ou celle des formes solubles

de ces récepteurs a été décrite avec la plupart des modèles in vitro. Un intérêt

particulier a été porté au récepteur ICAM-l. Aucune application thérapeutique

n'a pour l'instant été entreprise dans le domaine du paludisme, mais

l'utilisation d'anticorps anti-ICAM-1 a connu des succès dans la prévention des

rejets de greffe chez la Souris et chez le Singe (COSIMI et coll., 1990; ISOBE et

coll., 1992). L'utilisation de formes solubles d'ICAM-1 s'est avérée efficace dans

le traitement local de l'asthme induit expérimentalement et prévient in vitro

l'infection par le rhinovirus (GAHMBERG et coll., 1992). Cependant, la fixation

des hématies parasitées et du rhinovirus ne s'effectue pas sur le même site du

récepteur ICAM-1 (BERENDT et coll., 1992; OCKENHOUSE et coll., 1992a) et la

participation du récepteur ICAM-1 est beaucoup moins importante que celle du

récepteur CD36 aux mécanismes de cytoadhérence des hématies parasitées in

vitro. Parallèlement, l'administration d'anticorps anti-LFA-1, qui est le ligand

des globules blancs pour le récepteur ICAM-1 prévient l'accès pernicieux chez

145

la Souris, mais contrairement à l'Homme, ce sont les globules blancs qui sont

séquestrés dans les capillaires cérébraux chez la Souris au cours de l'accès

pernicieux. La synthèse d'une IgG chimère, formée des domaines CH2, CH3 et

de la région charnière de la chaîne lourde et des deux premiers domaines du

récepteur ICAM-1, a permis d'obtenir in vitro une inhibition de la

cytoadhérence des hématies parasitées et une meilleure phagocytose par les

monocytes et offre des perspectives thérapeutiques intéressantes (STAUNTON et

coll., 1992).

L'utilisation de l'héparine est controversée en raison du risque potentiel

d'hémorragie alors que ses effets bénéfiques n'ont pas été démontrés. ln vitro,

des fractions de l'héparine ayant une faible affinité pour l'antithrombine III se

sont avérées aussi efficaces que l'héparine pour la rupture des rosettes

(CARLSON et coll., 1992).

Plusieurs substances pharmacologiques ont prouvé leur efficacité dans

la prévention des lésions neurologiques dans le modèle murin mais le plus

souvent l'efficacité dans l'accès pernicieux n'a pas été ou reste à démontrer chez

l'Homme. Ainsi, l'iloprost, un analogue synthétique des prostacyclines,

empêche la survenue des accès pernicieux chez la Souris en inhibant la

synthèse du TNF-a par les macrophages in vivo et in vitro (SUWA et coll., 1991).

C'est aussi le cas pour la cyclosporine A, l'éthoxyquine et l'hydroxyanisole

butylé (CLARK et coll., 1989a; GRAU et coll., 1987b). A l'inverse, la NG­

monométhyl-L-arginine, un inhibiteur de la NO synthétase, agit sur

l'hypotension induite par le NO dans le choc septique chez l'Homme (NAV A et

coll., 1991; PETROS et coll., 1991), mais son action est nulle voire délétère au

cours de l'accès pernicieux chez la Souris (KREMsNER et coll., 1992; KREMSNER

et coll., 1993). Seule la prostacycline, puissant vasodilatateur et anti-aggrégant

plaquettaire, a été utilisée avec succès dans un cas d'accès pernicieux (WESTON

et coll., 1982). Deux substances semblent être particulièrement intéressantes en

thérapeutique. La pentoxifylline prévient les troubles neurologiques chez la

Souris en agissant sur la sécrétion du TNF-a et l'IL-1 par les macrophages et

par les cellules de la microglie. ln vitro, elle réduit la synthèse de NO induite

par l'IFN-y et la sécrétion de TNF-a par les macrophages (CHAO et coll., 1992;

KREMSNER et coll., 1991; KREMSNER et coll., 1993; PRADA et coll., 1993). La

déféroxamine est un chélateur de fer qui inhibe la croissance des parasites par

déplétion en fer. Mais surtout, elle inhibe la formation de radicaux libres

toxiques à partir du fer qui est un puissant agent réducteur. Ces deux

substances se sont avérées efficaces dans l'accès pernicieux chez l'Homme, mais

146

d'autres études sont nécessaires pour confirmer ces données et pour déterminer

leurs mécanismes d'action (GORDEUK et coll., 1992; GRANINGER et coll., 1991;

LANDAU et AlTAU, 1993).

Les hématies parasitées expriment à leur surface différents antigènes

selon le stade parasitaire. La vaccination spécifique visant à prévenir la

séquestration des hématies dans les capillaires cérébraux est une stratégie

vaccinale qui a été proposée (HOWARD et GALLlDOGA, 1989). Les anticorps

protecteurs devront être dirigés plutôt contre les ligands parasitaires exprimés

sur la surface des hématies que contre des structures érythrocytaires modifiées,

comme la bande 3, risquant d'induire une maladie auto-immune. Le clonage

des gènes, en particulier celui de l'antigène PfEMP-1, de la séquestrine ou des

rosettines, facilitera la mise au point de ces vaccins. Malheureusement, au cours

de sa multiplication dans l'hôte, le Plasmodium est capable d'induire des

modifications antigéniques dans l'expression de ses antigènes à la surface des

hématies parasitées. Ces modifications antigéniques nécessiteront peut-être

l'utilisation pour le vaccin de plusieurs variants antigéniques pour une même

protéine (BIGGS et coll., 1992; ROBERTS et coll., 1992).

147

(CONCUJS~ON )

Malgré les nombreux travaux sur le sujet, les mécanismes de l'accès

pernicieux sont loin d'être élucidés. Parmi les hypothèses étiologiques, nous

nous sommes intéressés au phénomène de cytoadhérence et à la participation

des cytokines.

Dans le domaine de la cytoadhérence, nos résultats ont montré que les

modèles cellulaires à notre disposition ne permettaient pas une bonne

reproduction des phénomènes observés in vivo. L'adhérence des hématies

parasitées semble être principalement médiée par le récepteur CD36, la

participation des autres récepteurs en particulier ICAM-l est moins importante

mais non négligeable. Bien que la séquestration des hématies parasitées dans

les capillaires cérébraux soit plus fréquente et plus importante au cours des

accès pernicieux, il n'existe aucun argument qui puisse prouver le rôle causal de

la séquestration des hématies parasitées dans la survenue des troubles

neurologiques. Nos résultats aboutissent d'ailleurs à un paradoxe. L'adhérence

in vitro des hématies parasitées n'est pas corrélée avec la gravité de la maladie

alors que la séquestration est très souvent rapportée au cours des examens post­

mortem de patients décédés d'accès pernicieux. A l'inverse, la présence de

rosettes n'est que très rarement décrite alors que la capacité à former des

rosettes in vitro semble être un facteur de virulence pour un isolat donné. Il ne

faut pas oublier que la séquestration des hématies parasitées permet déjà aux

parasites un développement meilleur dans une atmosphère d'hypoxie et leur

évite le passage par la rate où ils seraient détruits. Mais c'est également par ce

mécanisme d'adhérence par l'intermédiaire des récepteurs CD36 et ICAM-l que

les leucocytes et les monocytes peuvent se fixer aux hématies parasitées et

induire leur destruction. La mise au point du modèle à partir de cellules

endothéliales de capillaires cérébraux permettra sûrement la découverte

d'autres récepteurs impliqués et une meilleure compréhension du phénomène.

Suite aux travaux effectués avec le modèle murin, la participation des

cytokines, et plus particulièrement du TNF-a, a été suggérée. Nos résultats

s'accordent avec la théorie de la participation de médiateurs solubles (cytokines

ou autres) à la survenue des troubles neurologiques étant donné la rapidité de

la résolution du coma après traitement et l'absence de séquelles. Mais, comme

pour le phénomène de cytoadhérence, il n'existe pas de preuve formelle quant à

la relation cause/ effet entre l'augmentation des concentrations plasmatiques de

TNF-a et la survenue des troubles neurologiques. L'augmentation du TNF-a

pourrait être une cause ou une conséquence de la maladie. Pour autant qu'elle

soit effective, la participation du TNF-a à l'accès pernicieux n'intervient pas par

149

une augmentation de l'expression des récepteurs ICAM-l ni par l'intermédiaire

du NO. Paradoxalement, l'IFN-y, dont les concentrations plasmatiques sont

transitoirement et faiblement augmentées au cours du paludisme, majore

l'expression des récepteurs CD36 et la contribution de l'IFN-y pourrait être

majeure dans le phénomène de cytoadhérence.

Nos résultats suggèrent deux hypothèses quant à la participation des

cytokines à l'accès pernicieux, si toutefois elles y participent. La première serait

un état d'immuno-suppression relative, induit ou non par l'IL-IO, qui

entraînerait une forme grave de la maladie. Les cytokines ont une action

bénéfique dans la défense contre les parasites comme le prouve l'absence

d'infestation chez des sujets prémunis présentant spontanément des

concentrations élevées de TNF-a ou d'IFN-y. Le défaut de sécrétion d'IT...-I par

les macrophages est une autre preuve d'une relative immuno-suppression.

Mais, cet élément va à l'encontre des concentrations élevées de TNF-a sécrété

par les mêmes macrophages à moins que, dans le cas de l'accès pernicieux, le

TNF-a ne soit produit par d'autres cellules que les cellules immunitaires telles

que les cellules endothéliales. La deuxième hypothèse retient au contraire une

stimulation excessive du système immunitaire soit en relation avec une

prédisposition génétique, soit causée par une souche de P. falcipatum

particulièrement virulente. Au cours de l'accès palustre, nous avons montré une

stimulation massive du système immunitaire avec des relations étroites entre la

sécrétion des différentes cytokines mais surtout nous avons montré une

réponse immunitaire différente entre les sujets prémunis et les sujets non

prémunis.

Tous ces résultats soulèvent quelques commentaires. Le premier

concerne la méthode de dosage et de détection des cytokines dans le plasma. La

majorité des études (et les conclusions qui en sont issues) ont eu recours à des

techniques de dosage ne permettant pas de mettre en évidence la fraction

biologiquement active de la cytokine dosée. A l'inverse, certaines techniques ne

sont pas assez sensibles pouvant être à l'origine d'un défaut de détection.

L'utilisation de tests biologiques plus adaptés permettra peut-être une meilleure

approche du problème. Par ailleurs, il devient de plus en plus évident que les

mécanismes décrits dans le modèle murin diffèrent de la physiopathologie de la

maladie chez l'Homme. Les différences les plus marquées se situent au niveau

de la clinique et des lésions histologiques, en particulier la séquestration des

cellules dans les capillaires cérébraux, les globules blancs pour la Souris et les

hématies parasitées pour j'Homme. Contrairement à la pathologie humaine, le

150

rôle des cytokines a été très bien démontré chez la Souris dans la survenue des

troubles neurologiques et dans d'autres complications comme l'hypoglycémie,

l'acidose lactique, l'hypotension. Nos travaux n'ont d'ailleurs pas retrouvé

d'augmentation des concentrations plasmatiques d'IL-3 ou de GM-CSF ni la

participation de ces deux cytokines au phénomène de cytoadhérence. Les

travaux menés chez la Souris nous ont servi de modèle pour notre démarche et

ont eu le grand mérite d'orienter les recherches dans le domaine de l'accès

pernicieux vers des perspectives différentes. Malheureusement, les récents

échecs des thérapeutiques adjuvantes par les immunoglobulines ou par les

anticorps an ti-TNF-a prouvent que notre compréhension de l'accès pernicieux

est encore bien modeste.

151

11,

~ÊSijM~

~N ANGLA~S

ABSTRACT

The pathophysiology of Plasmodium [alciparum cerebral malaria is yet

incompletely cleared up. Because of its probable implication in the evolution of

cerebral malaria, we have studied the cytoadherence phenomenon using

human umbiIical vein endothelial cells (HUVEC), amelanotic melanoma cells

and Chinese hamster ovary (CHa) cells transfected with CD36 and ICAM-l

receptor gene. The also possible implication of cytokines led us to find out their

incidence on the cytoadherence phenomenon and to determine plasma

concentrations of cytokines in relation with the severity of the disease and the

immune status of the patients. Using P. falciparum isolats obtained from patients

presenting with cerebral, severe or uncomplicated malaria, we have shown that

the adherence of parasitized erythrocytes is more important on CD36 receptor

than on ICAM-I receptor. Whatever the cellular model used, adherence is not

related to the severity of the disease. For a given isola te, the adherence capacity

is not correlated with the ability to form rosettes. Contrarily to the

cytoadherence phenomenon, the ability to form rosettes varies with the severity

of the disease. Inversely to granulocyte macrophage-colony stimulating factor

(GM-CSF), interleukin-3 (IL-3) and IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-a

enhances the cytoadherence of 6/30 isolates but not specifically for isolates

collected From cerebral malaria cases. IL-3 raises significantly the effect of TNF­

a. Plasma concentration of TNF-a, IL-6 and IL-IO vary in relation with the

severity of the disease and are correlated to clinical and biological factors of

. severity, what is not the case with IL-l, IL-3, GM-CSF and interferon-y.

Cytokines concentrations are less higher and decrease faster in immune

patients than in non immune subjects.

Our results show that ICAM-I is not the main receptor for parasitized

erythrocytes. The role of cytokines in the outcome of cerebral malaria remains

debatable because our results do not pennit us to differentiate a state of relative

immuno-suppression with a burst of immune system responsible of the host

lesions.

1~3

· ~.

ABU-ZEID Y.A.,THEANDER T.G., ABDULHADI N.H., HVIID L., SAEED B.O., JEPSEN S.,JENSEN j.B., BAYOUMI R.A.Mod ulation of the cellular immune response d uring Plasmodiutn[alciparuminfections in sickle cell trait individuals.Clin. Exp. lmmunol., 1992,84, 112-118.

ADAM C, GENITEAU M., GOUGEROT-POCIDALO M., VERROUST P., LE BRAS j.,GIBERT C, MOREL-MAROGER L.Cryoglobulins, circulating immune complexes, and complement activation incerebral malaria.Infect. lmmun., 1981, 31, 530-535.

AIKAWAM.Human cerebral malaria.Am. r Trop. Med. Hyg., 1988,39,3-10.

AIKAWA M., BROWN A., SMITH C.D., TEGOSHI T., HOWARD R]., HASLER T.H., ITOY., PERRY G., COLLINS W.E., WEBSTER K.A primate model for human cerebral malaria: Plasmodium coatneyi-infectedRhesus monkeys.Am. rTrop. Med. Hyg., 1992,46,391-397.

AIKAWA M., ISEKI M., BARNWELLJ.W., TAYLOR D., 00 M.M., HOWARD RJ.The pathology of human cerebral malaria.Am. J. Trop. lvIed. Hyg., 1990, 43 suppl., 30-37.

AKIRA S., HIRANO T., TAGA T., KISHIMOTO T.Biology of multifunctional cytokines: IL-6 and related molecules (IL-1 andTNP).FA5EB ï; 1990,4,2860-2867.

ALBELDA S.M., BUCK CA.Integrins and other cell adhesion molecules.FA5EB ï; 1990,4, 2868-2880.

ALEYS.B., SHERWOOD J.A., HOWARD RJ.Knob-positive and knob-negative Plasmodium [alciparum differ in expression ofa strain-specific malarial antigen on the surface of infected erythrocytes.rExp. Med., 1984, 160, 1585-1590.

ALVES M.f.C, SANT05-NETO L.L.,JUNQUEIRA M.I.M., COSTA CE.Cytokines and dysregulation of immune response in human malaria.Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 1992,87, suppl. III, 331-336.

ANDERT S.E., GRIESMACHER A., ZUCKERMANN A., MÜLLER M.M.Neopterin release from human endothelial cells is triggered by interferon­gamma.Clin. Exp. lmmunol., 1992, 88, 555-558.

ASCH A.S., BARNWELL].W., SILVERSTEIN R.L., NACHMAN R.L.Isolation of the thrombospondin membrane receptor.J. cu« lnuesi., 1987, 79, 1054-1061.

ASENSIO V.C, OSHIMA H., FALANGA P.B.Plasmodium berghei : is nitric oxide involved in the pathogenesis of mousecerebral malaria?Exp. Parasitol., 1993,77,111-117.

BARNWELLJ.W., ASCH A.S., NACHMAN R.L., YAMAYA M.,AIKAWA M.,INGRAVALLO P.A human 88-kD membrane glycoprotein (CD36) functions in vitro as a receptorfor a eytoadherence ligand on Plasmodium jalciparum-infected erythroeytes.J. Clin. Invest., 1989,84,765-772.

BARNWELLJ.W., OCKENHOUSE CF., KNOWLES II D.M.Monoclonal antibody OKM5 inhibits the in vitro binding of Plasmodiumjalciparum-infected erythroeytes to monocytes, endothelial, and C32 melanomacells.,. Immunol., 1985, 135,3494-3497.

BATE CA.W., TAVERNE J., PLAYFAIR J.RL.Malarial parasites induce TNF production by macrophage.lmmunologu, 1988,64,227-231.

BEIKEM.A.Vascular endothelium in immunology and infectious disease.Rev. Infect. Dis., 1988, 11, 273-283.

BERENDT A.R., FERGUSON D.J.P., NEWBOLD CI.Sequestration in Plasmodium falciparum malaria: sticky cells and stickyproblems.Parasiiol. Today, 1990, 6, 247-254.

BERENDT A.R., MacDOWALL A., CRAIG A.G., BATES P.A., STERNBERG M.J.E., MARSHK., NEWBOLD CL, HOGG N.The binding site on ICAM-l for Plasmodium jalciparum-infected erythroeytesoverlaps, but is distinct from, the LFA-l-binding site.Celi, 1992, 68, 71-81.

BERENDT A.R., SIMMONS D.L., TANSEY J., NEWBOLD CI., MARSH K.Intercellular adhesion molecule-l is an endothelial cell adhesion receptor forPlasmodium [alciparum.Nature, 1989,341,57-59.

BEVILACQUA M.P., POBER J.S., MAJEAU G.R., COTRAN R.S., GIMBRONE Jr, M.A.Interleukin 1 (IL-l) induces biosynthesis and cell surface expression ofprocoagulant activity in human vascular endothelial cells.J. Exp. Med., 1984, 160,618-623.

BEVILACQUA M.P., POBER J.S., MAJEAU G.R., FIERS W., COTRAN R.S.,GIMBRONEJr. M.A.Recombinant tumor necrosis factor induces procoagulant activity in culturedhuman vascular endothelium : characterization and comparison "vith theactions of interleukin 1.Pme. Nat!. Acad. Sei. USA, 1986, 83, 4533-4537.

II

BIGGS B.A., ANDERS R.f., DILLON RE., DAVERN K.M., MARTIN M., PETERSEN C,BROWN G.V.Adherence of infected erythrocytes to venular endothelium selects for antigenicvariants of Plasmodium faiciparum.J. lmmunol., 1992, 149,2047-2054.

BIGGS B.A., CULVENOR J.G., NG J.S., KEMP D.J., BROWN G.V.Plasmodium falciparum : cytoadherence of a knobless clone.Exp. Parasiiol., 1989, 69, 189-197.

BIGGS B.A., GOOZE L., WYCHERLEY K., WILKINSON D., BOYD A.W., fORSYTH K.P.,EDELMAN L., BROWN G.V., LEECHJ.H.Knobs-independent cytoadherence of Plasmodiumfalciparum to the leucocytedifferentiation antigen CD36.J. Exp. Med., 1990, 171, 1883-1892.

BOCHNER B.S., MacKELVEY A.A., STERBINSKY S.A., HIDRETH J.E.K., DERSE CP.,KLUNK D.A., LICHTENSTEIN L.M., SCHLEIMER R.P.IL-3 augments adhesiveness for endothelium and CD11b expression in humanbasophils but not neutrophils.J. lmmunol., 1990, 145, 1832-1837.

BOONPUCKNAVIG V., BOONPUCKNAVIG S., UDOMSANGPETCH R., NITlYANANT P.An immunofluorescence study of cerebral malaria. A correlation withhistopathology.Arch. Pathol. Lab. Med., 1990,114, 1028-1034.

BRAQUET P., HOSfORD D., BRAQUET M., BOURGAIN R., BUSSOLINO F.Role of cytokines and platelet-activating factor in microsvascular immune injury.Int. Arch. Allergy App!. Immunol., 1989, 88, 88-100.

BRASSEUR P., BALLETJ.J., DRUILHE P.Impairment of Plasmodium falciparum-specific antibody response in severe malaria.J. Clin. Micrcbiol., 1990,28,265-268.

BRASSEUR P., BALLETJ.J., DRUILHE P., WARRELL M.J., CHANTAVANICH P.,LOOAREESUWAN S., AGRAPART M.,THARAVANIJ S.Immunological evaluation of cell-mediated and humoral immunity in Thaipatients with cerebral and non-cerebral Plasmodiumfalciparum malaria: I.Cutaneous delayed hypersensitivity, blood leukocytes and in vitrolymphocytes responses.SoutheastAsian J. Trop. Med. Pub. Hlth., 1985, 16,302-305.

BREWSTER D.R., KWIATKOWSKI D., WHITE N.J.Neurological sequelae of cerebral malaria in children.Lancei, 1990, ii, 1039-1043.

BRIZZI M.F., GARBARINO G., ROSSI P.R., PAGLIARDI G.L., ARDUINO C, AVANZIG.C, PEGORARO L.Interleukin 3 stimulates proliferation and triggers endothelial-Ieukocyteadhesion molecule 1 gene activation of human endothelial cells.J. Clin. lnoesi., 1993, 91, 2887-2892.

III

BROUDY V.C, KAUSHANSKY K., SEGAL G.M., HARLAN J.M., ADAMSON J.W.

Tumor necrosis factor type a stimulates human endothelial cells to producegranulocyte/ macrophage colony-stimulating factor.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986,83,7467-7471.

BROWN A.E., WEBSTER RK., TEJA-ISAVADHARM P., KEERATITHAKUL D.Macrophage activation in falciparum malaria as measured by neopterin andinterferon-gamma.cu« Exp. lmmunol., 1990, 82, 97-101.

BUSSOLINO F., WANG J.M., DEFILIPPI P., TURRINI F., SANAVIO F., EDGELL CJ.S.,AGLIETTA M., ARESE P., MANTOVANI A.Granulocyte- and granulocyte-macrophage-colony stimulating factors inducehuman endothelial cells to migrate and proliferate.Nature, 1989,337,471-473.

BUSSOLINO F.,ZICHE M., WANG J.M., ALESSI D., MORBIDELLI 1., CREMONA O.,BOSIA A., MARCHISIO P.c., MANTOVANI A.In vitro and in vivo activation of endothelial cells by colony-stimulating factors.J. Clin. Invest., 1991,87,986-995.

BUTCHER G.A., GARLAND T., AJDUKIEWICZ A.B., CLARK I.A.Serum tumor necrosis factor associated with malaria in patients in the Solomon

. Islands.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1990,84,658-661.

CARLOS T.M., SCHWARTZ B.R., KOVACH N.L., YEE E., ROSSO M., OSBORN 1., CHI­ROSSO G., NEWMAN B., LOBB R., HARLAN J.M.Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine­activated cultured human endothelial cells.Blood, 1990, 76, 965-970.

CARLSON J., ERKE H.P., HELMBY R, GYSIN J., GREENWOOD B.M., WAHLGREN M.Disruption of Plasmodium falciparum erythrocyte rosettes by standard heparinand heparin devoid of anticoagulant activity.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992, 46, 595-602.

CARLSON J., HELMBY H., HILL A.V.S., BREWSTER D., GREENWOOD B.M.,WAHLGRENM.Human cerebral malaria: association with erythrocyte rosetting and lack ofanti-rosetting antibodies.Lancei, 1990a, ii, 1457-1460.

CARLSON J., HOLMQUIST G., TAYLOR D.W., PERLMANN P., WAHLGREN M.Antibodies to a histidine-rich protein (PfHRP1) disrupt spontaneously formedPlasmodium jalciparll1n erythrocyte rosettes.Pme. Natl. Acad. Sei. USA, 1990b, 87, 2511-2515.

CARLSON J., WAHLGREN M.Plasmodium falcipa ru111 erythrocyte rosetting is mediated by promiscuous lectin­like interactions.J. Exp. Med., 1992, 176, 1311-1317.

IV

CARTER R., SCHOFIELD L., MENDIS K.,HLA effects in malaria: increased parasite-killing immunity or reducedrimmunopathology?IParasitol. Todau, 1992,8,41-42.1 .7

rHAO c.e., HU S., CLOSE K., CHOl C.S., MOLITOR T.W., NOVICK W.J., PETERSON P.K.Cytokine release from microglia : differential inhibition by pentoxifylline anddexamethasone.J. Infect. Dis., 1992, 166, 847-853.

CHOUAIB S., BRANELLEC D., BUURMAN W.A.More insights into the complex physiology of TNF.lmmunol. Today, 1991, 12, 141-142.

CHOUGNET c.,TALLET S., RINGWALD P., DELORON P.Kinetics of lymphocyte subsets from peripherical blood during a Plasmodiumfalciparum malaria attack.Clin. Exp. lmmunol., 1992, 90, 405-408.

CHULAY j.n, OCKENHOUSE C.F.Host receptors for malaria-infected ery throcytes.Am. J. Trop. A1ed. Hyg., 1990,43 suppl., 6-14.

CHUMPITAZI B.F.F., PEYRON E, SIMON J., BOUDIN c, SHEICK-ZAKIUDDIN 1., PICOTS., AMBROISE-THOMAS P.Longitudinal survey in an endemie region of plasma soluble interleukin-2receptor and antibody levels in Plasmodium jalciparum malaria.t. Clin. Mierobiol., 1990,28, 1545-1550.

CLARK I.A., CHAUDHRI G., COWDEN W.B.Sorne roles of free radicals in malaria.Eree Radical Biology and Medicine, 1989a, 6, 315-321.

CLARK I.A., CHAUDHRI G., COWDEN W.B.Roles of tumour necrosis factor in the illness and pathology of malaria.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1989b, 83, 436-440.

CLARK I.A., COWDEN W.B., BUTHER G.A., HUNT N.H.Possible roles of tumor necrosis factor in the pathology of malaria.Am. J. Pathol., 1987, 129,192-199.

CLARK I.A., GRAY K.M., ROCKETT aj., COWDEN W.B., ROCKETT K.A., FERRANTE A.,AGGARWAL B.B.Increased lymphotoxin in human malarial serum, and the abili ty of thiscytokine to increase plasma interleukin-6 and cause hypoglycaemia in mice :implications for malarial pathology.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1992a, 86, 602-607.

CLARK LA., HUNT N.H., COWOEN W.B.Oxygen-derived free radicals in the pathogenesis of parasiric disease.Adv. Parasitol., 1986, 25, 1-44.

v

CLARK I.A., 1LSCHNER S., MacMICKING J.O., COWDEN W.B.TNF and Plasmodium berghei ANKA-induced cerebral malaria.lmmunol. Leiters, 1990,25, 195-198.

CLARK LA., MacMICKING J.O., GRAY KM., ROCKEIT KA., COWDEN W.B.Malaria mimicry with tumor necrosis factor. Contrast between species ofmurine malaria and Plasmodium jalciparum.Am. J. Pathol., 1992b, 140,325-335.

CLARK I.A., ROCKEIT K.A., COWDEN W.B.Proposed link between cytokines, nitric oxide and human cerebral malaria.Parasitol. Today, 1991, 7, 205-207.

CLARK I.A., ROCKEIT KA., COWDEN W.B.Possible central role of nitric oxide in conditions clinically similar to cerebralmalaria.Lancet, 1992c, ii, 894-895.

CLARK I.A., VIRELIZIERJ.L., CARSWELL E.A., WOOD P.R.Possible importance of macrophage-derived mediators in acute malaria.Infect. Immun., 1981, 32, 1058-1066.

COHEN S., MacGREGOR I.A., CARRINGTON S.Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.Nature, 1961, 192,733-737.

CONLON P., GRABSTEIN KH., ALPERT A., PRICKEIT KS., HOPP T.P., GILLIS S.Localization of human mononuclear cell interleukin 1.f. lmmunol., 1987, 139, 98-102.

COSIMI B., CONTI O., DELMONICO F.L., PREFFER F.I., WEE S.L., ROTHLEIN R.,FAANES R., COLVIN R.B.In vivo effects of monoclonal antibody to ICAM-1 (CD54) in nonhumanprimates with renal allografts.J. lmmunol., 1990, 144,4604-4612.

COVELLG.Clinical, chemotherapeutic and immunological studies on induced malaria.Br. Med. Bull., 1951, 8, 51-55.

CRANDALL 1.,SHERMAN LW.Plasmodium falciparum (human malaria)-induced modifications in humanerythrocyte band 3 protein.Parasiiologu, 1991,102,335-340.

CRANDALL 1., SMITH H., SHERMAN LW.

Plasmodium falciparum : the effect of pH and Ca2+ concentration on the in vitrocytaadherence of infected erythrocytes ta amelanatic melanoma cells.Exp. Parasiiol., 1991, 73,362-368. .

\

1"·:·tl;.~~.'b~~·r·

.~ CURFS J.H., HERM5EN c.e., KREMSNER P., NEIFER S., MEUWISSEN J.H.E.T., VANROOYEN N., ELING W.M.C

Tumour necrosis factor-a and macrophages in Plasmodium bcrghei-inducedcerebral malaria.Parasitology, 1993, 107, 125-134.

CURFS J.H., VAN DER MEER J.W., SAUERWEIN R.W., ELING W.M.CLow dosages of interleukin 1 protect mice against lethal cerebral malaria.J. Exp. Med., 1990, 172, 1287-1291.

DAVID P.H., HANDUNNETTI S.M., LEECHJ.H., GAMAGE P., MENDIS K.N.Rosetting : a new cytoadherence property of malaria-infected erythrocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1988,38,289-297.

DAVID P.H., HOMMEL M., MILLER L.H., UDEINYA I.J., OLIGINO L.D.Parasite sequestration in Plasmodium falciparum malaria: spleen and antibodymodulation of cytoadherence of infected erythrocytes.Proc. Nat!. Acad. Sei. USA, 1983,80, 5075-5079.

DAVIS T.M.E, SUPUITAMONGKOL Y.,SPENCER J.L., FORD S., CHIENKUL N.,SCHULENBlIRG W.E., WHITE N.J.Measures of capillary penneability in acute falciparum malaria: relation toseverity of infection and treatment.Clin. Infect. tu«. 1992, 15, 256-266.

DE SILVA H.J., HOANG P., DALTON H., DE SILVA N.R.,JEWELL D.P., PEIRISJ.B.Immune activation during cerebellar dysfunction following Plasmodiumfalciparum malaria.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1992,86, 129-131.

DE WAAL MALEFYf R., ABRAMS J., BENNETT B., FIGDOR CG., DE VRIES J.E.Interleukin 10 (IL-ID) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: anautoregulatory role of IL-lO produced by monocytes.J. Exp. Med., 1991,174, 1209-1220.

DEL PRETE G., DE CARLI M., ALMERIGOGNA F., GUIDIZI M.G., BIAGIOTTI R.,ROMAGNANI S.Human IL-10 is produced by both type 1 helper (Th1) and type 2 (Th2) T cellclones and inhibits their antigen-specific proliferation and cytokine production.J. lmmunol., 1993, 137, 2348-2354.

DELORON P., CHOUGNET C, LEPERS J.P., TALLET S., COULANGES P.Protective value of elevated levels of gamma interferon in serum againstexoerythrocytic stages of Plasmodium Jalciparum.1- cu« Microbiol., 1991,29, 1757-1760.

DELORON P., LEPERS J.P., COULANGES P.Evolution of the levels of soluble interleukin-Z receptors during Plasmodiumfalcipanun and P. uioax malaria.J. Clin. Miciobiol., 1989,27,1887-1889.

VIl

DONNELLy s.c, STRIETER R.M., KUNKEL S.L., WALZ A., ROBERTSON c.n, CARTERD.e., GRANT I.S., POLLOK A.J., HASLETI e.Interleukin-8 and development of adult respiratory distress syndrome in at-riskpatient group.Lancet, 1993, i, 643-647.

DOUKAS J., POBER J.S.

IFN-y enhances endothelial activation induced by tumor necrosis factor but not IL-l.J. lmmunol., 1990, 145, 1727-1733.

DRUILHE P., BRASSEUR P., AGRAPART M., BALLET J.J., CHANTAVANICH P.,LOOAREESUWAN S., WHITE N., WARRELL M., WARRELL D., THARAVANIJ S.,GENTILINI M.T-cell responsiveness in severe Plasmodium falciparum malaria.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1983, 77, 671-672.

DUNN S., HILLAM A.J., STOMSKI r, JIN B., LUCAS e.M., BOYD A.W., KRISSANSENG.W., BURNS G.F.Leukocyte adhesion molecules involved in inflammation.Transpl. Proceed., 1989,21,31-34.

EDOZIEN j.c, GILLES H.M., UDEOZO LO.K.Adult and cord-blood gamma-globulin and irrununity to malaria in Nigeria.Lancet, 1962,ii, 951-955.

ERUNKULU O.A., HILL A.V.S., KWIATKOWSKI D., TODD J.E., IQBAL J., BERZINS K.,RILEY E.M., GREENWOOD B.M.Severe malaria in Gambian children is not due to lack of previous exposure tomalaria.Clin. Exp. lmmunol., 1992,89,296-300.

FALANGA P.B., BUTCHER E.e.Late treatment with anti-LFA-1 (CD11a) antibody prevents cerebral malaria in amouse model.Eur. l.Lmmunoi., 1991,21,2259-2263.

FINKELMAN F.D., URBAN Jr. J.F.Cytokines: making the right choice.Parasiiol. Today, 1992,8,311-314.

FOO t,c, REKHRAJ V., CI-llANG G.L., MAKJ.W.Ovalocytosis protects against severe malaria parasitemia in the Malayanaborigines.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992,47,271-275.

FRIBOURG-BLANC A., DRUILHE P., BRASSEUR P., RHODE5-FEUILLETTE A., BALLETJ.J., THARAVANIJ S.Immunological evaluation of cell-mediated and humoral immunity in Thaipatients with cerebral and non-cerebral Plasmodiumfalciparum malaria: II.Evolution of serum levels of immunoglobulins, antimalarial antibodies,complement fractions and alpha interferon.Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. ni»: 1985, 16,307-313.

VUI

FRIEDLAND J.S., HO M., REMICK D.G., BUNNAG O., WHITE N.J., GRIFFIN G.E.Interleuk.in-8 and Plasmodium falciparum malaria in Thailand.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1993,87, 54-55.

FURUKAWA S., IMAI K, MATSUBARA T., YONE K, YACHI A., OKUMURA K,YABUTAKIncreased levels of circulating intercellular adhesion molecule 1 in Kawasakidisease.Arthritis Rheum., 1992,35,672-677.

GAHMBERG CG., NORTAMO P., LI R., VALMU L.Leukocyte cell adhesion proteins : from molecular dissection to clinicalapplications.Ann. Med., 1992,24,329-335.

GILLESPIE S.R, DOW C, RAYNES J.G., BEHRENS R.H., CHIODINI P.L.,MacADAM KP.W.J.Measurement of acute proteins for assessing severity of Plasmodium[alciparutnmalaria.J. Clin. Paihol., 1991,44,228-231.

GIMBRONEJr. M.A., COTRAN R.S., FOLKMAN J.Hurnan vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.J. Cel/. Biol., 1974, 60, 673-684.

GOLDRING J.O., HOMMEL M.Variation in the cytoadherence characteristics of malaria parasites: is this a truevirulence factor?Mem. lnsi. Osuialdo Cruz, 1992,87, suppl. III, 313-322.

GOLDRING J.O., MOLYNEUX M.E., TAYLOR T., WIRIMAJ., HOMMEL M.Plasmodium falciparum : diversity of isolates from Malawi in their cytoadherenceto melanoma cells and monocytes in vitro.Br. J. Haematol., 1992,81,413-418.

GORDEUK V., THUMA P., BRITTENHAM G., MacLAREN C, PARRY O., BACKENSTONEA., BIEMBA G., MSISKA R., HOLMES L., MacKINLEY E., VARGAS L., GILKESON R.,POLTERA A.A.Effect of iron chelation therapy on recovery from deep coma in children lvithcerebral malaria.New Eng/. J. Med., 1992,327, 1473-1477.

GOUNDIS O., REID KB.M.Properdin, the terminal complement components, thrombospondin and thecircumsporozoite protein of malaria parasites contain similar sequence motifs.Nature, 1988,335,82-85.

GRANINGER W., THALHAMMER F., HOLLENSTEIN U., ZOTTER G.M., KREMSNER P.G.Serum protein concentrations in Plasmodiumfaiciparum malaria.Acta Trop., 1992,52, 121-128.

IX

GRANINGER W., THALHAMMER F., LOCKER G.Pentoxifylline in cerebral malaria./. Infect. Dis., 1991, 164, 829.

GRAU G.E., BIELER G., POINTAIRE P., DE KOSSODO S., TACCHINI-COTlER F.,VASSALI P., PIGUET P.F., LAMBERT P.H.Significance of cytokine production and adhesion molecules in malarialimmunopathology.lmmunol. Letters, 1990a, 25, 189-194.

GRAU G.E., FAJARDO L.F., PIGUET P.F., ALLET B., LAMBERT P.H., VASSALLI P.Tumor necrosis factor (cachectin) as an essential mediator in murine cerebralmalaria.Science, 1987a,237, 1210-1212.

GRAU G.E., FREI K., PIGUET P.F., FONTANA A., HEREMANS R, BILLIAU A., VASSAL LIP., LAMBERT P.H.Interleukin 6 production in experimental cerebral malaria: modulation byanticytokine antibodies and possible role in hypergammaglobulinemia.J. Exp. Med., 1990b, 172, 1505-1508.

GRAU G.E., GRETENER D., LAMBERT P.RPrevention of murine cerebral malaria by low-dose cyc1osporin A.lmmunologu, 1987b, 61, 521-525.

GRAU G.E., HEREMANS R, PIGUET P.F., POINTAIRE P., LAMBERT P.H., BILLIAU A.,VASSALLI P.

Monoclonal antibody against interferon y can prevent experimental cerebralmalaria and its associated overproduction of tumor necrosis factor.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989a, 86,5572-5574.

GRAU G.E., KINDLER V., PIGUET P.F., LAMBERT P.H., VASSALLI P.Prevention of experimental cerebral malaria by anticytokine antibodies.Interleukin 3 and granulocyte macrophage colony-stimulating factor areintermediates in increased tumor necrosis factor production and macrophageaccumulation.J. Exp. Med., 1988, 168, 1499-1504.

GRAU G.E., PIGUET P.F., ENGERS RD., LOUIS J.A., VASSALLI P., LAMBERT P.H.L3T4+ T lymphocytes play a major role in the pathogenesis of murine cerebral malaria.J. lmmunol., 1986, 150,353-360.

GRAU G.E., PIGUET P.F., VASSALLI P., LAMBERT P.RTumor-necrosis factor and other cytokines in cerebral malaria: experimentaland c1inical data.lmmunol. Rev., 1989b, 1128, 49-70.

GRAU G.E., POINTAIRE P., PIGUET P.F., V~SIN c., ROSEN H, STAMENKOVIC 1.,TAKEI F., VASSALLI P.Late administration of monoclonal antibody to leukocyte function-antigen 1abrogates incipient murine cerebral malaria.Eur. J. lmmunol., 1991,21, 2265-2267.

x

GRAU G.E., TAYLOR T.E., MOLYNEUX M.E., WIRIMA J.J., VASSALLI P., HOMMEL M.,LAMBERT P.H.Tumor necrosis factor and disease severity in children with falciparum malaria.New Engi. J. Med., 1989c,320, 1586-1591.

GREENWALT D.E., LIPSKY R.H., OCKENHOUSE CF., IKEDA H., TANDON N.N.,JAMIESON G.A.Membrane glycoprotein CD36 : a review of its role in adherence, signaltransduction, and tranfusion medicine.Blood, 1992, 80, 1105-1115.

GREENWOOD B.M., MARSH K, SNOW R.Why do sorne African children develop severe malaria?Parasitol. TodJ1y, 1991,7,277-281.

GYSIN J., AlKAWA M., TOURNEUR N., TEGOSHI T.Experimental Plasmodium falciparum cerebral malaria in the squirrel monkeySaimiri sciureus.Exp. Parasitoi., 1992,75,390-398.

HANDUNNElTI S.M., DAVID P.H., PERERA KL.R.L., MENDIS KN.Uninfected erythrocytes form "rosettes" around Plasmodium falciparum infectederythrocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989,40, 115-118.

HANDUNNETfI S.M., GILLADOGA A.D., VAN SCHRAVENDIJK M.R., NAKAMURAKI., AIKA WA M., HOWARD R.J.Purification and in vitro selection of rosette-positive (R+) and rosette-negative(R-) phenotypes of knob-positive Plasmodium faiciparum parasites.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992a, 46, 371-381.

HANDUNNETfI S.M., HAStER T.R, HOWARD R.J.Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes do not adhere well to C32 melanomacells or CD36 unless rosettes with uninfected erythrocytes are first disrupted.Infect. lmmun., 1992b, 60, 928-932.

HANDUNNETTI S.M., VAN SCHRAVENDIJK M.R., HASLER T., BARNWELL J.W.,GREENWALT D.E., HOWARD R.J.Involvement of CD36 on erythrocytes as a rosetting receptor for Plasmodiumfalciparwn-infected erythrocytes.Blood, 1992c, 80, 2097-2104.

HARPAZ R., EDELMAN R., WASSERMAN S.S., LEVINE M.M., DAVIS J.R., SZTEIN M.B.Serum cytokine profiles in experimental human malaria. Relationship toprotection and disease course after challenge.J. Clin. Invest., 1992,90, 515-523.

HASLER T., ALBRECHT G.R., VAN SCHRAVENDIJK M.R., AGUIAR J.C, MOREHEADKE., PASLOSKE B.L., MA C, BARNWELL J.W., GREENWOOD B.M., HOWARD R.J.An irnproved microassay for Plasmodium falciparum cytoadherence using stabletransformants of Chinese hamster ovary cells expressing CD36 or intercellularadhesion molecule-l.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993, 48, 332-347.

Xl

HASLER T., HANDUNNETTI S.M., AGUIAR J.C, VAN SCHRAVENDIJK M.R.,GREENWOOD B.M., LALLINGER G., CEGIELSKI P., HOWARD R.J.In vitro rosetting, cytoadherence, and microagglutination properties ofPlasmodium falciparum-infected erythrocytes from Gambian and Tanzanianpatients.Blood, 1990, 76, 1845-1852.

HELMBV H., CAVELIER L., PEITERSSON U., WAHLGREN M.Rosetting Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes express unique strain­specifie antigens on their surface.Infect. lmmun., 1993, 61, 284-288.

HEMMER cr, KERN P., HOLST F.G.E., RADTKE KP., EGBRING R., BIERHAUS A.,NAWROTH P.P., DIETRICH M.Activation of the host response in human Plasmodium falciparum malaria:relation of parasitemia to tumor necrosis factor / cachectin, thrombin­antithrombin ID, and protein C levels.Am. J. Med., 1991, 91, 37-44.

HENDERSON D.C., SHELDON J., RICHES P., HOBBS J.R.Cytokine induction of neopterin production.Clin. Exp. Immunol., 1991,83,479-482.

HILLA.V.S.Malaria resistance genes : a natural selection.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1992,86,225-226.

HILL A.V.S., ALLSOPP C.E.M., KWIATKOWSKI D., ANSTEV N.M., TWUMASI P., ROWEP.A., BENNET S., BREWSTER D., MacMICHAEL A.J., GREENWOOD B.M.Common West African HLA antigens are associated with protection fromsevere malaria.Nature, 1991,352,595-600.

HIROMATSU V., SATO M., VAMADA K, NONAKA KInhibitory effects of nicotinamide on recombinant human interferon-garnma­induced intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and HLA-DR antigenexpression on cultured human endothelial cells.lmmunol. Leiiers, 1991,31,35-40.

HO M., DAVIS T.M.E., SILAMUT K, BUNNAG D., WHITE N.J.Rosette formation of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from patients withacute malaria.Infect. lmmun., 1991a, 59, 2135-2139.

HO M., SINGH B., LOOAREESUWAN S., DAVIS T.M.E., BUNNAG D., WHITE N.J.Clinical correlates of in vitro Plasmodium falciparum cytoadherence.Infect. Imtnun., 1991b, 59, 873-878.

Xll

HO M., WEBSTER HK., GREEN B., LOOAREESUWAN S., KONGCHAREON S.,WHITEN.J.Defective production of and response to IL-2 in acute human falciparummalaria.1. lmmunol., 1988, 141,2755-2759.

HOFFMAN S.L., RUSTAMA D., PUNJABI N.H, SURAMPAET B., SANJAYA B.,DIMPUDUS A.J., MacKEE K.T., PALEOLOGO F.P., CAMPBELL J.R., MARWOTO H,LAUGHLINL.High-dose dexamethasone in quinine-treated patients with cerebral malaria: adouble-blind, placebo-controiled trial.1. Infect. Dis., 1988, 158,325-331.

HOMMELM.Amplification of cytoadherence in cerebral malaria: towards a more rationalexplanation of disease pathophysiology.Ann. Trop. Med. Parasiiol., 1993, sous presse.

HOMMEL M.,Cytoadherence of malaria-infected erythrocytes.Blood Cells, 1990, 16,605-619.

HOMMEL M., SEMOFF S.Expression and function of erythrocyte-associated surface antigens in malaria.Biol. Cell, 1988,64, 183-203.

HOWARD M., O'GARRA A.Biological properties of interleukin 10.Immunol. Today, 1992, 13, 198-200.

HOWARDR.J.Malarial proteins at the membrane of Plasmodium falciparum-infectederythrocytes and their involvement in cytoadherence to endothelial ceils.Prog. Allergy, 1988,41,98-147.

HOWARD R.J., GILLADOGA A.D.Molecular studies related to the pathogenesis of cerebral malaria.Blood, 1989,74,2603-2618.

HVIID L., JAKOBSEN P.H., ABU-ZEID Y.A., THEANDER T.HT-ceil responses in malaria.APMIS, 1992, 100,95-106.

HVIID L., THEANDER T.G., ELHASSAN I.M., JENSEN J.B.Increased plasma levels of soluble ICAM-1 and ELAM-1 (E-selectin) duringacute Plasmodium falciparum malaria.lmmunol. Letters, 1993,36,51-58.

IGARASHI 1., 00 M.M., STANLEY H, REESE R., AlKAWA M.Knob antigen deposition in cerebral malaria.Am. f. Trop. Med. Hy~., 1987,37,511-515.

Xl1I

IQBAL J., PERLMANN P., BERZINS KPlasmodium falciparum : analysis of the cytoadherence inhibition of the humanmonoclonal antibody 33G2 and of antibodies reactive with antigen Pf332.Exp. Parasitol., 1993, 77, 79-87.

ISOBE M., YAGITA H., OKUMURA K, IHARA A.Specific acceptance of cardic allograft after treatment with antibodies to ICAM­1 and LFA-l.Science, 1992,255, 1125-1127.

ISRAELI A., SHAPIRO M., EPHROS M.A.Plasmodium jalciparum malaria in an asplenic man.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1987,81,233-234.

JACOB C.O., FRONEK Z., LEWIS G.D., KOO M., HANSEN J.A., MacDEVITI H.O.Heritable major histocompatibility complex c1ass II-associ.ated differences inproduction of turnor necrosis factor a: relevance to genetic predisposition tosystemic lupus erythematosus.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990,87, 1233-1237.

JAFFE E.A., ARMELLINO D., LAM G., CORDON-CARDO c, MURRAY H.W., EVANS R.L.

IFN-y and IFN-a induce the expression and synthesis of Leu 13 antigen bycultured human endothelial cells./. lmmunol., 1989, 143,3961-3966.

JAFFE E.A., NACHMAN R.L., BECKER C.G., MINICK c.n,Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identificationby morphologie and immunologie criteria./. Clin. Invest., 1973, 52, 2745-2756.

JAMESS.L.The effector function of nitrogen oxides in host defense against parasites.Exp. Parasitol., 1991, 73, 223-226.

]ANOTA 1., DOSHI B.Cerebral malaria in the United Kingdom.J. Clin. Pathol., 1979,32, 769-772.

JOHNSON J.K, SWERLICK R.A., GRADY K.K, MILLET P., WICK T.M.Cytoadherence of Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes to microvascularendothelium is regulatable by cytokines and phorbol ester.J. Infect. Dis., 1993, 167,698-703.

JOSIMOVIC-ALASEVIC O., FELDMEIER H., ZWINGENBERGER K, HARMS G., HAHNH., SHRISUPHANUNT M., DIAMANTSTEIN T.Interleukin 2 receptor in patients with localised and systemic parasitic diseases.Clin. Exp. lmmunol., 1988, 72, 249-254.

KARUNAWEERA N.D., GRAU G.E., GAMAGE P., CARTER R., MENDIS KN.Dynamics of fever and serum levels of tumor necrosis factor are closelyassociated during clinical paroxysms in Plasmodium vivax malaria.Proc. NatI. Acad. Sei. USA., 1992,89, 3200-3203.

XIV

KAUL D.K., ROTH E.F., NAGEL R.L., HOWARD R.J., HANDUNNETTI S.M.Rosetting of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with uninfected redblood cells enhances microvascular obstruction under flow conditions.Blood, 1991, 78, 812-819.

KAWAI S., AIKAWA M., KANO S., SUZUKI M.A primate model for severe human malaria with cerebral involvement:Plasmodium coatneyi-infected Macaca fuscata.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993, 48, 630-636.

KERN P., HEMMER CJ.,GALLATI R, NEIFER S., KREMSNER P., DIETRICH M.,PORZSOLTF.Soluble tumor necrosis factor receptors correlate with parasitemia and diseaseseverity in human malaria./. Infect. Dis., 1992, 166,930-934.

KERN P., HEMMER CJ.,VAN DAMME J., GRUSS H.J., DIETRICH M.Elevated tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 serum levels as markersfor complicated Plasmodium falciparum malaria.Am. J. Med., 1989,87, 139-143.

KLEIN-SOYER C, HEMMENDINGER S., CAZENAVE J.P.Culture of human vascular endothelial cells on a positively charged polystyrenesurface, Primaria : comparaison with fibronectin-coated tissue culture gradepolystyrene.Biomaierials, 1989, 10, 85-90.

KNOWLES II D.M., TOLIDJIAN B., MARBOE C, D'AGATI V., GRIMES M., CHESS L.Monoclonal anti-human monocyte antibodies OKM1 and OKM5 possessdistinctive tissue distributions including differential reactivity with vascularendothelium.J. lmmunol., 1984, 132,2170-2173.

KREMSNER P.G., BIENZLE U.Soluble CD8 antigen in Plasmodium falcipatum malaria.J. Infect. Dis., 1989, 160,357-358.

KREMSNER P.G., FELDMEIER R, ZOTTER G.M., JANSEN-ROSSECK R., GRANINGERW., ROCHA R.M., BIENZLE U.Irnmunological alterations in uncomplicated Plasmodium falciparum malaria.Relationship between parasitaemia and indicators of macrophage activation.Acta Trop., 1989, 46, 351-359.

KREMSNER P.G., GRUNDMANN R, NEIFER S., SLIWA K., SAHLMÜLLER G.,HEGENSCHEID B., BIENZLE U.Pentoxifylline prevents murine cerebral malaria.J. Infect. Dis., 1991, 164,605-608.

KREMSNER P.C., NEIFER S., CHAVES M.F., RUDOLPH R., BIENZLE U.

Interferon-y induced lethality in the late phase of Plasmodium tnnckei malariadespite effective parasite clearance by chloroquine.Eut, J. lmmunol., 1992, 22, 2873-2878.

xv

KREMSNER P.G., NÜSSLER A., NEIFER S., CHAVES M.F., BIENZLE U., SENALDI G.,GRAUG.E.Malaria antigen and cytokine-induced production of reactive nitrogenintennediates by murine macrophages: no relevance to the development ofexperimental cerebral malaria.ImmunoLogy, 1993, 78, 286-290.

KREMSNER P.G., ZOTfER G.M., FELDMEIER H, GRANINGER w., ROCHA R.M.,JANSEN-ROSSECK R., BiENZLE U.Immune response in patients during and after Plasmodium falciparum infection.J. Infect. Dis., 1990, 161, 1025-1028.

KWIATKOWSKI D., CANNON J.G., MANOGUE K-R., CERAMI A., DINARELLO C.A.,GREENWOOD B.M.Tumour necrosis factor production in falciparum malaria and its associationwith schizont rupture.CLin. Exp. ImmunoL., 1989, 77, 361-366.

KWIATKOWSKI D., IDLL A.V.S., SAMBOU 1.,TWUMASI P., CASTRACANE J.,MANOGUE K-R., CERAMI A., BREWSTER D.R., GREENWOOD B.M.TNF concentration in fatal cerebral, non-fatal cerebral, and uncomplicatedPLasmodium falciparum malaria.Lancet, 1990, ii, 1201-1204.

KWIATKOWSKI D., MOLYNEUX M.E., STEPHENS S., CURTIS N., KLEIN N., POINTAIREP., SMIT M., ALLAN R., BREWSTER D.R., GRAU G.E., GREENWOOD B.M.Anti-TNF therapy inhibits fever in cerebral malaria.Quart. J. Med, 1993, 86, 91-98.

LANDAU Z., ATfALI M.Use of pentoxifylline in the treatment of cerebral malaria.CLin. Infect. Dis., 1993, 17, 137.

LE BRAS J., ANDRIEU B., HATIN 1.,SAVEL J., COULAUD J.P.Plasmodium falciparum : interprétation du semi-microtest de chimiosensibilité invitro par incorporation de 3H-hypoxanthine.Path. BioL., 1984, 32, 463-466.

LE BRAS J., DELORON P.In vitro study of drug sensitivity to Plasmodium falciparum : an evaluation of anew semi-microtest.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1983, 32, 447-451.

LEJ., VILCEKJ.Tumor necrosis factor and interleukin 1: cytokines with multiple overlappingbiological activities.Lab. Invest., 1987,56,234-248.

LEECHJ.PLasmodium faLciparum cytoadherence.Res. lmmunol., 1991, 142, 681-685.

XVI

LEECH J.H., BARNWELL J.W., MILLER L.H., HOWARD R.J.Identification of a strain-specific malarial antigen exposed on the surface ofPlasmodium falciparum-uxiecseà erythrocytes.J. Exp. Med., 1984, 159, 1567-1575.

LEEUWENBERG J.F.M., SMEETS E.F., NEEFJES J.J., SHAFFER M.A., CINEK T.,JEUNHOMME T.M.A.A., AHERN T.]., BUURMAN W.A.E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 are released by activatedhuman endothelial cells in vitro.lmmunology, 1992,77,543-549.

LESZCZYNSKI D., HAYRY P.Effect of granulocyte-macrophage colony stimulating factor on endothelialantigenicity.Hum. Immunol., 1990,28, 175-178.

LOOAREESUWAN S., SUNTHARASAMAI P., WEBSTER RK., HO M.Malaria in splenectomized patients: report of four cases and review.Clin. Infect. Dis., 1993, 16,361-366.

MacGREGOR I.A., CARRINGTON S.P., COHEN S.

Treatment of East African P. falciparum malaria with West african human y­globulineTrans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1963,57,170-175.

MacPHERSON G.G., WARRELL M.]., WHITE N.J., LOOAREESUWAN S., WARRELL D.A.Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitizederythrocyte sequestration.Am. J. Pathol., 1985, 119,385-401.

MAEGRAITH B.G., FLETCHER A.The pathogenesis of mammalian malaria.Adv. Parasiiol., 1972,10,49-75.

MAGOWAN c, WOLLISH W., ANDERSON L., LEECH J.Cytoadherence by Plasmodium falciparum-uiieaeâ erythrocytes is correlatedwith the expression of a family of variable proteins on infected erythrocytes.J. Exp. Med., 1988, 168, 1307-1320.

MANTOVANI A., BUSSOLINO r, DEJANA E.Cytokine regulation of endothelial cell function.FASEB J., 1992,6,2591-2599.

MARSHK.Malaria - a neglected disease.Parasiiologu, 1992, 104,553-569.

MARSH K., HOWARD R.J.Antigens induced on erythrocytes by Plasmodium falciparum : expression ofdiverse and conserved determinants.Science, 1986,231,150-153.

XVll

MARSH K., MARSH V.M., BROWN J., WHIlTLE H.C., GREENWOOD B.M.Plasmodium falciparum : the behaviour of dinical isolates in an in vitro model ofinfected red blood cell sequestration.Exp. Parasitol., 1988,65,202-208.

MENDISKN.Contrasting clinical disease in Plasmodium vivax and Plasmodium jalciparummalaria, and the association of both with cytokines.Bull. lnst. Pasteur, 1992,90,3-9.

MOLYNEUX M.E., TAYLOR T.E., WIRIMA J.J., GRAU G.E.Tumour necrosis factor, interleukin-6, and malaria.Lancei, 1991, i, 1098.

MOORE KW., O'GARRA A., DE WAAL MALEFYT R., VIEIRA P., MOSMANN T.R.Interleukin-10.Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 165-190.

MSHANA R.N., BOULANDI J., MSHANA N.M., MAYOMBO J., MENDOME G.

Cytokines in the pathogenesis of malaria: levels of IL-1~, IL-4, IL-6, TNF-a andIFN-yin plasma of healthy individuals and malaria patients in a holoendemicarea.J. Clin. Lab. lmmunol., 1991,34, 131-139.

MUNKER R., GASSON J., OGAWA M., KOEFFLER H.P.Recombinant human TNF induces production of granulocyte-monocyte colony­stimulating factor.Nature, 1986,163,79-82.

NAGATAKE T., THUC H.V., TEGOSHI T., RABBEGE J., ANN T.K., AIKAWA M.Pathology of falciparum malaria in Vietnam.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992, 47, 259-264.

NAIK P., VOLLER A.Serum C-reactive protein levels and falciparum malaria.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1984, 78,812-813.

NAKAMURA K.I., HASLER T., MOREHEAD K., HOWARD R.J., AlKAWA M.Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes receptor(s) for CD36 andthrombospondin are restricted to knobs on the erythrocytes surface.J. Hisiochem. Cytochem., 1992,40, 1419-1422.

NASH G.B., COOKE B.M., CARLSON J., WAHLGREN M.Rheological properties of rosettes formed by red blood cells parasitized byPlasmodium falciparum.Br. J. Haemaiol., 1992,82,757-763.

NAVA E., PALMER R.M.J., MONCADA S.Inhibition of nitric oxide synthesis in septic shock: how much is beneficial.Lancet, 1991, ii, 1555-1557.

XVll1

NAWROTH P.P., BANK 1., HANDLEY D., CASSIMERIS J., CHESS L., STERN D.Tumor necrosis factor / cachectin interacts with endothelial cell receptors toinduce release of interleukin l.f. Exp. Med., 1986, 163, 1363-1375.

NAWROTH P.P., STERN D.M.Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor.J. Exp. Med., 1986, 163,740-745.

NEIFER S., KREMSNER P.G., BIENZLE U.Application of anti-TNF to Plasmodium vinckei-infected mice is followed by anincrease of parasitaemia.Acta Trop., 1989, 46, 273-275.

NEIL A.L., HUNT N.H.Pathology of fatal and resolving Plasmodium berghei cerebral malaria in mice.Parasitologu. 1992,105, 165-175.

NEWTON CR.J.C, KIRKHAM F.J., WINSTANLEY P.A., PASVOL G., PESHU N.,WARRELL D.A., MARSH K.Intracranial pressure in African children with cerebral malaria.Lancet, 1991, i, 573-576.

NGUYEN-DINH P., GREENBERG A.E.Increased levels of released interleukin-2 receptors in Plasmodium falciparummalaria.J. Infect. Dis., 1988,158,1403-1404.

NÜSSLER A., DRAPIERJ.C, RENIA L., PIED S., MILTEN F., GENTILINI M., MAZIER D.L-arginine dependent destruction of intrahepatic malaria parasites in responseto tumor necrosis factor and/ or interleukin 6 stimulation.Eur. f. lmmunol., 1991,21,227-230.

OCKENHOUSE CF., BETAGERI R., SPRINGER T.A., STAUNTON D.E.Plasmodium falciparum-infected erythrocytes bind ICAM-1 at a site distinct fromLFA-1, Mac-l, and human rhinovirus.Cell, 1992a, 68, 63-69.

OCKENHOUSE CF., CHULAY J.D.Plasmodium [alciparum sequestration: OKM5 antigen (CD36) mediatescytoadherence of parasitized erythrocytes to a myelomonocytic cellline.J. Infect. Dis., 1988, 157, 584-588.

OCKENHOUSE CF., KLOTZ F.W., TANDON N.N.,JAMIESON G.A.Sequestrin, a CD36 recognition protein on Plasmodium falciparum malaria­infected erythrocytes identified by anti-idiotype antibodies.Proc. Nat!. Acad. Sei. USA, 1991,88,3175-3179.

OCKENHOUSE CF., MAGOWAN C, CHULAY J.D.Activation of monocytes and platelets by monoclonal antibodies or malaria­infected erythrocytes binding to the CD36 surface receptor in vitro.f. Clin. lnvest., 1989a, 84, 468-475.

XIX

OCKENHOUSE CF., TANDON N.N., MAGOWAN C, JAMIESON G.A., CHULAY J.D.Identification of a platelet membrane glycoprotein as a falciparum malariasequestration receptor.Science, 1989b, 243,1469-1471.

OCKENHOUSE CF., TEGOSHI T., MAENO Y., BENJAMIN c, HO M., KAN K.E, THWAYY.,WIN K., AIKAWA M., LOBB R.R.Human vascular endothelial cell adhesion receptors for Plasmodium falciparum­infected erythrocytes : roles for endothelialleukocyte adhesion molecule 1 andvascular cell adhesion molecule 1.r Exp. Med, 1992b, 176, 1183-1189.

00 M.M., AIKAWA M., THAN T., AYE T.M., MYINT P.T., IGARASHI 1., SCHOENE W.CHuman cerebral malaria: a pathological study.t. Neuropathol. Exp. Neurol., 1987,46,223-231.

00 M.M., THAN T.Pathogenesis of ring-haemorrhage in cerebral malaria.Ann. Trop. Med. Parasitol., 1989,83, 555-557.

OQUENDO P., HUNDT E, LAWLERJ., SEED B.CD36 directly mediates cytoadherence of Plasmodium falciparum parasitizederythrocytes.Cell, 1989, 58, 95-101.

PANTON LJ., LEECHJ.H., MILLER L.H., HOWARD R.J.Cytoadherence of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to humanmelanoma ceIllines correlates with surface OKM5 antigen.Infect. lmmun., 1987,55,2754-2758.

PETERSEN c., NELSON R., MAGOWAN c, WOLLISH W., JENSEN J., LEECHJ.The mature erythrocyte surface antigen of Plasmodium falciparum is not requiredfor knobs or cytoadherence.Mol. Biochem. Parasitol., 1989,36,61-66.

PETROS A., BENNETI D., VALLAN CE P.Effect of nitric oxide synthase inhibitors on hypotension in patients withseptic shock.Lancet, 1991, ii, 1557-1558.

PEYRON F., VUILLEZ J.P., BARBE G., BOUDIN C, PICOT S., AMBROISE THOMAS P.Plasma levels of tumor necrosis factor during a longitudinal survey in anendemie area of malaria.Acta Trop., 1990,47,47-51.

PEYRON F., VUILLEZ J.P., RINGWALD P., TOUZE J.E, CHUMPITAZI B., LEPERS J.,STAHL J.P., PICOT S., AMBROISE THOMAS P.Plasma levels of tumor necrosis factor (TNF) and neopterin during an attack ofmalaria.Ann. Soc. Belge Med. Trop., 1991, 71, 63-66.

xx

PICOT S., PEYRON F., VUILLEZ J.P., BARBE G., DELOIOr\ P., JACOB M.C,CHUMPITAZI B., BOUDIN C, SHEIK-ZAKKIUDIl\ L .üIBROISE-THOMAS P.Neopterin levels in plasma during a longitudira, srudy in an area endemie formalaria.Clin. lmmunol. lmmunopathol., 1993,67, 273-2ï6

PICOT S., PEYRON F., VUILLEZ J.P., BARBE G., M.AF~ K.,AMBROISE-THOMAS P.Tumor necrosis factor production by human mazophages stimulated in vitroby Plasmodium falciparum.Infect. Immun., 1990,58,214-216.

PICOT S., PEYRON F., VUILLEZ J.P., POLACK B., A.\{fdOlSE-THOMAS P.Chloroquine inhibits tumor necrosis factor proczction by human macrophagesin vitro.J. Infect. Dis., 1991, 164,830-831.

PIED S., NOSSLER A., PONTET M., MILTGEN F.,M'!"-::-::I..E H., LAMBERT P.H.,MAZIER D.C-reactïve protein protects against preerythrocrrc stages of malaria.Infect. lmmun., 1989, 57, 278-282.

PIGOrr R., DILLON L.P., HEMINGWAY I.H., GE.AJli.'G A.J.H.Soluble fOnTIS of E-selectin, ICAM-1 and VC~\~~ are present in thesupernatants of cytokines activated cultured er!':,:·dlelial cells.Biochem. Biophys. Res. Com., 1992, 187, 584-589.

POBERJ.S.Cytokines-mediated activation of vascular enà'::-'::èlium. Physiology andpathology.Am. J. PathoL., 1988, 133, 426-433.

POBER J.S., BEVILACQUA M.P., MENDRICK D.L., U·-:IERRE L.A., FIERS W.,GIMBRONEJr. M.A.Two distinct monokines, interleukin 1 and turner necrosis factor, eachindependently induce biosynthesis and transierr expression of the sameantigen on the surface of cultured human vascuar endothelial cells.J. lmmunol., 1986a, 136, 1680-1687.

POBER J.S., GRIMBRONE Jr. M.A., LAPIERRE LA., V:=-'-TIRlCK D.L., FIERS W.,ROTHLEIN R., SPRINGER T.A.Overlapping patterns of activation of human e:-l:.xhelial cells by interleukin 1,tumor necrosis factor, and immune interferonJ. lmmunol., 1986b, 137, 1893-1896.

POBER J.S., LAPIERRE L.A., STOLPEN A.H., BROCJ,: -=- A. SPRINGER T.A., FIERS W.,BEVILACQUA M.P., MENDRICK D.L., GRIMBRO~::: ~_ \LA.Activation of cultured human endothelial cells ::,",- recombinant lymphotoxin :comparison with tumor necrosis factor and in::;':-.--='·kin 1 species.J. lmmunol., 1987, 138,3319-3324.

XXI

POCIOT F., BRIANT L., JONGENEEL CV., MOLVIG J., WORSAAE H., ABBAL M.,THOMSEN M., NERVP J., CAMBON-THOMSEN A.Association of tumor necrosis factor (TNF) and class II major histocompatibilitycomplex link to insulin-dependent diabetes mellitus.Eur. J. lmmunol., 1993,23,224-231.

POLDER T.W., ELING W.M.C, CVRFSJ.H.A.J.,JERVSALEM CR., WIjER5-ROUW M.Ultrastructural changes in the blood-brain barrier of mice infected withPlasmodium berghei.Acta Leidensia, 1992, 60,31-46.

PONGPONRATN E., RIGANTI M., HARINASUTA T., BVNNAG o.Electron microscopy of the human brain in cerebral malaria.Southeast Asian J. Trop. Med. Pub Hlth., 1985, 16,219-226.

PONGPONRATN E., RIGANTI M., PVNPOOWONG B., AIKAWA M.Microvascular sequestration of parasitized erythrocytes in human falciparummalaria: a pathological study.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1991,44,168-175.

PRAOA J., PRAGER C, NEIFER S., BIENZLE V., KREMSNER P.G.Production of interleukin-6 by human and murine mononuclear leukocytesstimulated with Plasmodium antigens is enhanced by pentoxifylline, and tumornecrosis factor secretion is reduced.Infect. lmmun., 1993, 61, 2737-2740.

RAVENT05-SVAREZ C, KAVL O.K., MACALVSO F., NAGEL R.L.Membrane knobs are required for the microcirculatory obstruction induced byPLasmodium jaLciparum-infected erythrocytes.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 3829-3833.

REIBNEGGER G., FUCHS O., HAVSEN A., SCHMUTZHARO E.,WERNER E.R.,WACHTERH.The dependance of cell-mediated immune activation in malaria on age andendemicity.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1987, 81, 729-733.

RIGANTI M., PONGPONRATN E., TEGOSHI T., LOOAREESUWAN S., PVNPOOWONGB., AIKAWA M.Human cerebral malaria in Thailand: a clinico-pathological correlation.Immunol. Letters, 1990,25, 199-206.

RILEY E.M., ROWE P., ALLEN S.J., GREENWOOO B.M.Soluble plasma IL-2 receptors and malaria.CLin. Exp. lmmunol., 1993,91,495-499.

ROBERTS 0.0., SHERWOOO J.A., SPITALNIK S.L., PANTON L.J., HOWARD R.J.,OIXITV.M., FRAZIER W.A., MILLER L.H., GINSBVRG V.Thrombospondin binds falciparum malaria parasitized erythrocytes and maymediate cytoadherence.Nature, 1985,318,64-66.

XXll

ROBERTS D.J., CRAIG A.G., BERENDT A.R., PINCHES R., NASH G., MARSH K.,NEW80LD CI.Rapid switching to multiple antigenic and adhesive phenotypes in malaria.Nature, 1992,357, 689-692.

R08S0N K.J.H., HALL J.R.S., JENNINGS M.W., HARRIS T.J.R., MARSH K., NEW80LDCI., TATE V.E., WEATHERALL D.J.A highly conserved amino-acid sequence in thrombospondin, properdin and inproteins from sporozoites and blood stages of a human malaria parasite.Nature, 1988,335,79-82.

ROCK E.P., ROTH E.F., ROJA5-CORONA R.R., SHERWOOD J.A., NAGEL R.L., HOWARDR.J., KAUL D.K.Thrombospondin mediates the cytoadherence of Plasmodium jalciparum-infectedred cells to vascular endothelium in shear flow conditions.Blood, 1988a, 71, 71-75.

ROCK E.P., SAUL A.J., TAYLOR D.W., LEECHJ.R, SHERWOOD J.A., HOWARD R.J.Expression of the histidine-rich protein PfHRP1 by knob-positive Plasmodiumjalciparum is not suffici.ent for cytoadherence of infected erythrocytes.Infect. lmmun., 1988b, 56, 3301-3304.

ROCKEIT K.A., AWOURN M.M., AGGARWAL 8.B., COWDEN W.8., CLARK I.A.In vivo induction of nitrite and nitrate by tumor necrosis factor, lymphotoxin,and interleukin-1 : possible roles in malaria.Inject. Immun., 1992, 60, 3725-3730.

ROMANG.CCerebral malaria: the unsolved riddle.J. Neurol. Sei., 1991, 101, 1-6.

RUANGJIRACHUPORN W., AFZELIUS B.A., HELMBY R, HILL A.V.S., GREENWOOD8.M., CARLSON J., 8ERZINSK., PERLMANN P., WAHLGREN M.Ultrastuctural analysis of fresh Plasmodium jalciparwn-infected erythrocytes andtheir cytoadherence to human leukocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992,46,511-519.

RUANGJIRACHUPORN W., AFZELIUS 8.A., PAULIE S., WAHLGREN M., 8ERZINS K.,PERLMANNP.Cytoadherence of knobby and knobless Plasmodium fulciparum-iniecxeàerythrocytes.Parasitology, 1991, 102, 325-334.

SA8CHAREON A., 8URNOUF T., OUATTARA D., ATTANATH P., BOUHAROUN­TAYOUN H., CHANTAVANICH P., FOUCAULT C, CHONSUPHAJAISIDDHI T.,DRUILHEP.Parasitological and clinical human response to immunoglobulin administrationin falciparum malaria.Am. J. Trop. A1ed. Hy~., 1991,45,297-308.

XXl1l

SCHMIDT J.A., UDEINYA I.J., LEECHJ.H., HAY R.J.,AIKAWA M., BARNWELLJ., GREEN1., MILLER L.H.An amelanotic melanoma cellline bears receptors for the knob ligand oninfected erythrocytes.J. Clin. Invest., 1982, 70, 379-386.

SCHMIDT L.H.Plasmodium jalciparum and Plasmodium vivax infections in the owl monkey(Aotus trivigatus). 1. The course of untreated infections.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1978, 27, 671-732.

SCUDERI P., STERLING K. E., LAM K. S., FINLEY P.R., RYAN K.J., RAY c,c, PETERSENE., SLYMEN D.J., SALMON S.E.Raised serum levels of tumour necrosis factor in parasitic infections.Lancet, 1986, ii, 1364-1365.

SEIN K.K., MAENO Y., THUC H.V., ANH T.K., AIKAWA M.Differential sequestration of parasitized erythrocytes in the cerebrum andcerebellum in human cerebral malaria.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993,48,504-511.

SENALDI G., KREMSNER P.G., GRAU G.E.Nitric oxide and cerebral malaria.Lancet, 1992, ii, 1554.

SHAFFER N., GRAU G.E., HEDBERG K., DAVACHI F., LYAMBA B.,HIGHTOWER A.W.,BREMAN J.G., NGUYEN-DINH P.Tumor necrosis factor and severe malaria.J. Infect. Dis., 1991, 163, 96-101.

SHARMAY.D.Knobs, knob proteins and cytoadherence in falciparum malaria.Int. J. Biochem., 1991,23,775-789.

SHERMAN LW., CRANDALL 1., SMITH H.Membrane proteins involved in the adherence of Plasmodium falciparum­infected erythrocytes to the endothelium.Biol. CeIl, 1992,74, 161-178.

SHERMAN I.W., VALDEZ E.In vitro cytoadherence of Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes tomelanoma cells : factors affecting adhesion.Parasitology, 1989,98,359-369.

SHERWOOD J.A., ROBERTS D.D., MARSH K., HARVEY E.B., SPITALNIK S.L., MILLERL.H., HOWARD R.J.Thrombospondin binding by parasitized erythrocyte isolates in falciparurnmalaria. -Am. J. Trop. Med. Hyg., 1987, 36, 228-233.

XXIV

SHERWOOD J.A., ROBERTS 0.0., SPITALNIK S.L., LAWLERJ.W., MILLER L.H.,HOWARDR.J.Falciparum malaria parasitized erythrocytes bind to a carboxy-terminalthrombospondin fragment and not the amino-terminal heparin-binding region.Mol. Biochem. Parasitol., 1990,40, 173-182.

SHERWOOD J.A., ROBERTS 0.0., SPITALNIK S.L., MARSH K, HARVEY E.B., MILLERL.H., HOWARD R.J.Studies of the receptors on melanoma cells for Plasmodium faiciparum infectederythrocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989,40, 119-127.

SILVERSTElN R.L, BAIRD M., LO S.K, YESNER LM.Sense and antisense cDNA transfection of CD36 (glycoprotein IV) in melanomacells. Role of CD36 as a thrombospondin receptor.J. Biol. Chem., 1992,267, 16607-16612.

SINGH B., HO M., LOOAREESUWAN S., MATHA! E., WARRELL D.A., HOMMEL M.Plasmodium falciparum : inhibition/reversal of cytoadherence of Thai isolates tomelanoma cells by local immune sera.Clin. Exp. lmmunol., 1988, 72, 145-150.

SINGH B., MONSIGNY M., HOMMEL M.Amino-sugar inhibit the in vitro cytoadherence of Plasmodium falciparum­infected erythrocytes to melanoma cells.Mol. Biochem. Parasiiol., 1987,23,47-53.

SLIWA K, GRUNDMANN H.J., NEIFER S., FERREIRA CHAVES M., SAHLMÜLLER G.,BLITSTEIN-WILLINGER E., BIENZLE u., KREMSNER P.G.Prevention of murine cerebral malaria by a stable prostacyclin analog.Inject. Immun., 1991,59,3846-3848.

SMITH H., NELSON J.A., GAHMBERG c.c, CRANDALL 1., SHERMAN LW.Plasmodium falciparum : cytoadherence of malaria-infected erythrocytes tohumain brain capillary and umbilical vein endothelial cells - a comparativestudy of adhesive ligands.Exp. Parasitol., 1992, 75, 269-280.

SOBEL R.A., MITCHELL M.E., FONDREN G.Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in cellular immune reactions in thehuman central nervous system.Am. J. Pathol., 1990, 136, 1309-1316.

SOUTHWELL B.R., BROWN G.V., FORSYTH KP., SMITH T., PHILIP G., ANDERS R.Field applications of agglutination and cytoadherence assays with Plasmodiumfalciparum from Papua New Guinea.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1989,83,464-469.

STAUNTON D.E., OCKENHOUSE C.F., SPRINGER T.A.Soluble intercellular adhesion molecule l-immunoglobulin G1 immunoadhesinmediates phagocytosis of malaria-infected erythrocytes.J. Exp. Med., 1992, 176, 1471-1476.

xxv

STOLPEN A.H., GUIAN E.C, FIERS W., POBER S.Recombinant tumor necrosis factor and immune interferon act singly and incombination to reorganize human vascular endothelial ceil monolayers.Am. J. Pathol., 1986, 123, 16-24.

SWERLICK R.A., LEEKH., LI L.J.,SEPP N.T., CAUGHMAN S.W., LAWLEY T.J.Regulation of vascular cell endothelial molecule 1 on human dermalmicrovascular endothelial cells.J. lmmunol., 1992a, 149,698-705.

SWERLICK R.A, LEEKR, WICKT.M., LAWLEYT.].Human dennal microvascular endothelial but not human umbilical veinendothelial cells express CD36 in vivo and in vitro.J. lmmunol., 1992b, 148,78-83.

TABONE M.D., MUANZA K., LYAGOUBI M., JARDEL c., PIED S., AMEDEE-MANESMEO., GRAU G.E., MAZIER D.The role of interleukin-6 in vitamin A deficiency during malaria and possibleconsequences for vitamin A supplementation.lmmunologu, 1992, 75, 553-554.

TAPCHAISRI P., ASAVANICH A., LIMSUWAN S., THARAVANlJ S., HARINASUTA KT.Antibodies against malaria sporozoites in patients with acute uncomplicatedmalaria and patients with cerebral malaria.Am. ,. Trop. Med. Hyg., 1985,34,831-836.

TAVERNEJ., BATE CAW., KWIATKOWSKI D.,JAKOBSEN P.R, PLAYFAIRJ.H.L.Two soluble antigens of Plasmodium Jalciparum induce tumor necrosis factorrelease from macrophages.Infect. lmmun., 1990a, 58, 2923-2928.

TAVERNE]., BATE CA.W., SARKAR D.A., MEAGER A., ROOK G.A.W., PLAYFAIRJ.H.L.Human and murine macrophage produce TNF in response to soluble antigensof Plasmodium falciparum.Parasite lmmunol., 1990b, 12, 33-43.

TAYLOR T.E., MOLYNEUX M.E., WIRIMAJ.J., BORGSTEIN A., GOLDRING J.D.Intravenous immunoglobulin in the treatment of paediatric cerebral malaria.Clin. Exp. Immunol., 1992, 90,357-362.

THAMMAPALERD N., THARAVANIJ S., PATARAPOTIKULJ., LOOAREESUWAN S.Immunoprecipitating antibodies against blood stage antigens of Plasmodiumfalciparum in cerebral and non-cerebral malaria patients.Souiheasi Asian t. Trop. Med. Pub. Hlth, 1987, 18, 171-178.

THARAVANIJ S., TAPCHAISRI P., MAHAKUNKIJCHAROEN Y., LOOAREESUWAN S.Antibody against a ring-infected erythrocyte surface antigen in cerebral andnon-cerebral malaria patients.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1988, 82, 385-388.

XXVI

THARAVANIJ S., WARRELL M.J., TANTIVANICH S., TAPCHAISRI P.,CHONGSA­NGUAN M., PRASERTSIRIROJ V., PATARAPOTIKULJ.~actors contributing to the development of cerebral malaria. 1HumoralImmune responses.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1984,33, 1-11.

THORNHILL M.H., HASKARD D.O.

IL-4 regulates endothelial ceIl activation by IL-l, tumor necrosis factor, or IFN-y.J. lmmunol., 1990, 145,865-872.

THORNTON S.C, MUELLER S.N., LEVINE E.M.Human endothelial cells : use of heparin in doning and long-term serialcultivation.Science, 1983, 222, 623-625.

THUMWOOD C.M., HUNT N.H., CLARK I.A., COWDEN W.B.Breakdown of the blood-brain barrier in murine cerebral malaria.Parasitologg, 1988, 96, 579-589.

TORO G., ROMAN G.Cerebral malaria. A disseminated vasculomyelinopathy.Arch. NeuroL., 1978,35,271-275.

TOURNEUR N., SCHERF A., WAHLGREN M., GYSIN J.The squirrel monkey as an experimental model for Plasmodium falciparumerythrocyte rosette formation.Am. J. Trop. Med. Ryg., 1992,47,633-642.

TRAGER W., JENSEN J.B.Human malaria parasites in continuous culture.Science, 1976, 193,673-675.

TREUTIGER cr, HEDLUND 1.,HELMBY H., CARLSON J., JEPSON A., TWUMASI P.,KWIATKOWSKI D., GREENWOOD B.M., WAHLGREN M.Rosette formation in Plasmodiumfaiciparum isolates and anti-rosette activity ofsera from Gambians with cerebral or uncomplicated malaria.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1992,46,503-510.

UDEINYA I.J.Endothelial proliferation and adhesivity.ln Vitro CelL. Dev. Biol., 1993,29,89-90.

UDEINYA I.J., AKOGYERAM c.o,Induction of adhesiveness in human endothelial cells by Plasmodium falciparum­infected ery throcy tes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993,48,488-495.

UDEINYA I.J., GRAVES P.M., CARTER R., AIKAWA M., MILLER L.H.Plasmodium faciparum : effect of time in continuous culture on binding to humanendothelial cells and amelanotic melanoma cells.Exp. Parasitol., 1983a, 56, 207-214.

XXVll

UDEINYA I.J., LEECH J., AIKAWA M., MILLER L.H.An in vitro assay for sequestration: binding of Plasmodium falciparum-infectederythrocytes to formalin-fixed endothelial cells and amelanotic melanoma cells.J. Protozool., 1985,32, 88-90.

UDEINYA I.J., MAGOWAN C, CHULAY J.D.Long-term cultured human vascular endothelium cells (EC-FP5) bindPlasmodium falciparum infected erythrocytes.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989,41,400-405.

UDEINYA I.J., MILLER L.H., MacGREGOR I.A., JENSEN J.B.Plasmodium falciparum strain-specific antibody blocks binding of infectederythrocytes to amelanotic melanoma cells.Nature, 1983b, 303, 429-431.

UDEINYA I.J., SCHMIDT J.A., AIKAWA M., MILLER L.H., GREEN 1.Falciparum malaria-infected erythrocytes specifically bind to cultured humanendothelial cells.Science, 1981,213,555-557.

UDOMSANGPETCH R, AlKAWA M., BERZINS K., WAHLGREN M., PERLMANN P.Cytoadherence of knobless Plasmodium jalciparum-infected. erythrocytes and itsinhibition by a human monoclonal antibody.Nature, 1989a, 338, 763-765.

UDOMSANGPETCH R., TODD J., CARLSON J., GREENWOOD B.M.The effects of haemoglobin genotype and ABD blood group on the formation of.rosettes by Plasmodium jalciparum-infected. red blood cells.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993,48, 149-153.

UDOMSANGPETCH R, WAHLIN B., CARLSON J., BERZINS K., TORII M., AIKAWA M.,PERLMANN P., WAHLGREN M.Plasmodium fa1ciparum-infected erythrocytes form spontaneous erythrocyterosettes.J. Exp. Med., 1989b, 169, 1835-1840.

UDOMSANGPETCH R., WEBSTER H.K., PAlTANAPANYASAT K., PITCHAYANGKULS., THAITHONG S.Cytoadherence characteristics of rosette-forming Plasmodium falciparum.Infect. lmmun., 1992,60,4483-4490.

VAN SCHRAVENDIJK M.R., HANDUNNEITI S.M., BARNWELL J.W., HOWARD RJ.Normal human erythrocytes express CD36, an adhesion molecule ofmonocytes, platelets, and endothelial cells.Blood, 1992,80,2105-2114.

WAHLGREN M., CARLSON J., RUANGJIRACHUPORN W., CONWAy D., HELMBY H.,MARTINEZ A., PATARROYO M.E., RILEY E.Geographical distribution of Plasmodium falciparum erythrocyte rosetting andfrequency of rosetting antibodies in human sera.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1990,43,333-338.

XXVlll

WAHLGREN M., CARLSON J.,UDOMSANGPETCH R., PERLMANN P.Why do Plasmodiumjalciparum-infected erythrocytes form spontaneouserythrocyte rosettes?Parasitai. Today, 1989, 5, 183-185.

WALKER O., SALAKO L.A., SOWUNMI A., THOMAS J.O., SODEINE O., BONDI F.S.Prognostic risk factors and post mortem findings in cerebral malaria inchildren.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1992, 86, 491-493.

WALLER D., CRAWLEY J., NOSTEN F., CHAPMAN D., KRISHNA S., CRADDOCK C,BREWSTER D., WHITE N.J.Intracranial pressure in childhood cerebral malaria.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1991,85,362-364.

WARREL D.A.Pathophysiology of severe falciparum malaria in man.Parasitolology, 1987, 94, 557-576.

WARRELL D.A., LOOAREESUWAN S., PHILLIPS R.E., WHITE N.J., WARRELL M.J.,CHAPEL HM., AREEKUL S., THARAVANIJ S.Function of the blood-cerebrospinal fluid barrier in human cerebral malaria:rejection of the permeability hypothesis.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1986, 35, 882-889.

WARRELL D.A., LOOAREESUWAN S., WARRELL M.J., KASEMSARN P.,INTARAPRASERT R., BUNNAG D., HARINASUTA T.Dexamethasone proves deleterious in cerebral malaria. A double-blind trial in100 comatous patients.Ne-c» Engl. J. Med., 1982,306,313-319.

WARRELL D.A., WHITE N.J., VEALL N., LOOAREESUWAN S., CHANTHAVANICH P.,PHILLIPS R.E., KARBWANG J., KRISHNA S., PONGPAEW P.Cerebral anaerobie glycolysis and reduced cerebral oxygen transport in humancerebral malaria.Lancet, 1988, ii, 534-538.

WEISS L.Mechanisms of splenic control of murine malaria: cellular reactions of thespleen in lethal (strain 17XL) Plasmodiumyoelii malaria in BALB/ c mice, and theconsequences of pre-infective splenectomy.Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989,41, 144-160.

WESTON M.J.,JACKMAN N., RUDGE C, BOWLESJ., BRADY C, BIELAWSKA C,O'GRADYJ.Prostacyclin in falciparum malaria.Lancei, 1922, ii, 609.

.,

WHITE N.J., WARRELL D.A., LOOAREESUWAN S., CHANTHAVANICH P., PHILLIPSR.E., PONGPAEW P.Pathophysiological and prognostic significance of cerebrospinal-fluid lactate incerebral malaria.Lancet, 1985, i, 776-778.

XXiX

WICK T.M., LOUIS V.Cytoadherence Plasmodium jalciparum-infected erythrocytes to human umbilicalvein and human dermal microvascular endothelial cells under shear conditions.Am. 1. Trop. Med. Hyg., 1991,45,587-586.

WICK T.M., LOUIS V.Plasmodium fragile: cytoadherence of parasited Rhesus monkey erythrocytes tohuman endothelial cells under shear flow conditions.Exp. Parasiiol., 1992,74,228-231.

WINOGRAD E., SHERMAN I.W.Characterization of a modified red ceIl membrane protein expressed onerythrocytes infected with the human malaria parasite Plasmodium falciparum :possible role as a cytoadherent mediating protein.1. Cell Biol., 1989, 108, 23-30.

WORLD HEALTH ORGANIZATION.Severe and complicated malaria.Trans. R. Soc. Trop. Hyg., 1990, 84 suppl. 2, 1-65.

WRIGHT P.S., CROSS-DOERSEN D., MacCANN P.P., BITONTI A.J.Plasmodium falciparum : a rapid assay for cytoadherence of PH] hypoxanthine­labeled infected erythrocytes to human melanoma ceIls.Exp. Parasitol., 1990, 71, 346-349.

WRIGHT P.S., CROSS-DOERSEN D.E., SCHRODER K.K., BOWLIN T.L., MacCANN P.P.,BITONDI A.J.Disruption of Plasmodium jalciparum-infected erythrocyte cytoadherence tohuman melanoma cells with inhibitors of glycoprotein processing.Biochem. Pharmacol., 1991,41, 1855-1861.

YONG K., COHEN H., KHWAJA A., JONES H.M., UNCH D.C.Lack of effect of granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulatingfactors on cultured human endothelial cells.Blood, 1991,77, 1675-1680.

xxx