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Nephrologie & Therapeutique 8 (2012) 141–145
Revue generale
Polymorphismes genetiques : comment interpreter les etudes ?
Genetic polymorphisms: How to interpret studies?
Cecile Courivaud a,*,b, Philippe Saas a, Didier Ducloux a,b
a Inserm UMR 645, etablissement francais du sang Bourgogne Franche-Comte, universite de Franche-Comte, 1, boulevard Alexander-Fleming, BP 1937, 25020 Besancon, Franceb Service de nephrologie, dialyse et transplantation renale, hopital Saint-Jacques, CHU de Besancon, 25030 Besancon, France
Depuis quelques annees, le nombre de publications concernantd’eventuelles relations entre un variant genetique et un phenotypeclinique a connu une croissance exponentielle (Fig. 1). Les resultatssouvent contradictoires de ces etudes ont contribue a une mefiance
� des variations de nucleotides uniques (SNP pour single nucleotide
polymorphism) ou polymorphismes touchant un seul nucleotide,qui correspondent a la substitution d’un nucleotide par un autre ;� des insertions ou des deletions de bases, qui peuvent impliquer
I N F O A R T I C L E
Historique de l’article :
Recu le 12 avril 2011
Accepte le 17 juillet 2011
Mot cle :
Polymorphismes genetiques
Keyword:
Single nucleotide polymorphism
R E S U M E
Le nombre de publications concernant d’eventuelles relations entre un variant genetique et un
phenotype clinique a connu une croissance exponentielle. Les resultats souvent contradictoires de ces
etudes ont contribue a une mefiance legitime vis-a-vis des conclusions et des consequences pratiques de
ces travaux. Cette mise au point rappelle les caracteristiques des variants genetiques et les exigences
methodologiques des etudes de polymorphismes.
� 2011 Association Societe de nephrologie. Publie par Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.
A B S T R A C T
During the last years, publications upon potential association between genetic polymorphisms and
clinical outcomes have exponentially increased. Conflicting results between similar studies have
contributed to seriously distrust the validity of this approach. This review emphasizes on intrinsic
properties of SNP and methodological prerequisites for such studies.
� 2011 Association Societe de nephrologie. Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
legitime vis-a-vis des conclusions et des consequences pratiquesde ces travaux. Dans cette revue, nous fournissons un certainnombre de clefs pour mieux apprehender ces etudes et « separer lebon grain de l’ivraie ».
1. Definitions
Par convention, une variation rare (affectant par definition moinsde 1 % des chromosomes d’un individu) est appelee une mutation etune variation frequente (a partir de 1 %), un polymorphisme ouvariant genetique. Sur les trois milliards de bases du genomehumain, plus de 99 % sont identiques d’un individu a l’autre. Lesautres representent les variants genetiques ou polymorphismes. Cepourcentage peut paraıtre negligeable, mais represente pourtantenviron trois millions de nucleotides qui sont a la base desdifferences entre les individus. Ces polymorphismes resultent detrois types de modifications de la sequence d’ADN :
* Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (C. Courivaud).
1769-7255/$ – see front matter � 2011 Association Societe de nephrologie. Publie par
doi:10.1016/j.nephro.2011.07.411
une seule base ou des centaines de milliers de nucleotides ;� des deletions d’ADN repetitifs (tandem repeats, microsatellites).
Certains polymorphismes n’ont aucun effet phenotypique (leurpresence n’implique aucune difference), tandis que d’autres vontaffecter l’expression et/ou la fonction de la proteine codee par legene, avec pour consequences d’eventuelles variations, patholo-giques ou non.
Le polymorphisme le plus frequent est le SNP. Il s’agit d’unevariation simple et unique dans la sequence nucleotidique d’ungene, retrouvee chez plusieurs individus d’une meme espece et quise transmet de facon mendelienne. Ces SNP representent 90 % del’ensemble des variants genetiques. De fait, il a ete identifie a cejour plus de neuf millions de SNP [1,2]. La plupart sont bi-alleliqueset se caracterisent par la frequence d’un allele minoritaire ouvariant. On classe ces SNP en fonction de la modificationnucleotidique. On distingue ainsi :
� les SNP non codants qui se situent dans les regions 5’ ou 3’ nontranscrites, dans les regions 5’ ou 3’ non traduites, dans lesintrons ou dans les regions inter-geniques ;
Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.
Fig. 1. Evolution du nombre de publications recensees avec les mots cles « genetic
polymorphisms » « human » entre 2000 et 2010.
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� les SNP codants qui peuvent etre des polymorphismes desubstitution (qui aboutissent a une modification de l’acide aminecode), ou des polymorphismes synonymes (ou malgre lechangement de codon, l’acide amine ne change pas).
2. Caracteristiques des polymorphismes
Tous les SNP proviennent d’une mutation initiale puisque lasubstitution d’un nucleotide par un autre est par definition unemutation. Mais lorsque l’on observe un variant genetique dans unepopulation, l’evenement qui lui a donne naissance est generale-ment ancien et le SNP observe ne constitue pas une nouvellemutation. Il s’agit de fait d’un polymorphisme transmis degeneration en generation. On parle pourtant souvent de« mutation » pour decrire un allele different du type majoritaire,surtout lorsqu’on pense que l’allele anormal est implique dans uncaractere pathologique. La plupart des loci des populationsnaturelles presente plusieurs haplotypes, de sorte que le typesauvage est en fait un ensemble de differents haplotypes. Memedans le cas ou un ou plusieurs haplotypes sont associes a un traitphenotypique, il n’est pas facile de distinguer entre les typessauvages et mutants. Il se peut meme que la forme la plus rare soitla forme ancestrale et il est donc plus pertinent de parler depolymorphisme ou variant genetique que de mutations.
3. Applications
Les deux applications principales des etudes de polymor-phismes sont la genetique des populations correspondant a l’etudede la repartition des variants genetiques dans les differentesethnies et la genetique quantitative correspondant a l’etude desrelations entre SNP et variations phenotypiques. Il est admis que laplupart des SNP se maintiennent dans les populations naturellesgrace a l’equilibre entre mutations et derive genetique. Cela signifieque le taux de survenue de nouvelles mutations est en equilibreavec le taux de disparition de polymorphisme. La plupart desmutations sont ainsi perdues apres quelques generations, maiscertaines d’entre elles peuvent devenir frequentes et se fixerdefinitivement dans une population. A ce titre, les mouvements depopulation constituent une source potentielle de diversite. Ainsi,l’isolement affecte la vitesse de perte de ces variations par derivegenetique et une croissance rapide de la population change larepartition des haplotypes. Ces elements structurants des variantsgenetiques peuvent en theorie compliquer l’analyse des etudes depolymorphismes et leur generalisation dans l’espace (d’unepopulation a une autre) et dans le temps (pour une meme
population). Cela est plus particulierement le cas dans des societesouvertes, multiethniques et ou il existe des echanges entre lesdifferentes ethnies.
4. Concepts importants pour comprendre les ecueils des etudesde polymorphismes
Quelques concepts sont importants a comprendre pour mieuxapprehender la genetique quantitative.
4.1. La repartition de la frequence des alleles
La grande majorite des SNP sont rares concernant le plussouvent moins de 5 % des individus [1]. Une faible proportion depatients porteurs du variant genetique rend difficile la mise enrelation de ce variant avec un phenotype clinique. Cela a desconsequences sur la qualite des etudes. En effet, si le genotypeetudie est rare, il sera necessaire d’inclure un nombre important depatients.
4.2. Le desequilibre de liaison (DL)
Le DL designe la situation ou des alleles situes a deux loci nesont pas transmis de facon independante. Si deux SNP sont associespar hasard, la proportion attendue pour chacun des 4 genotypespossibles peut etre calculee en multipliant les frequencesrespectives des SNP pour chaque allele. Si la proportion d’unecombinaison depasse celle predite, il y a alors un DL entre les SNP.Ce DL peut empecher de conclure correctement quant a l’existenced’une association reelle entre un genotype et le phenotypecorrespondant.
4.3. La stratification de la population
Ce terme designe la repartition de la variation genetique entreles populations d’une meme espece. L’espece humaine presenteune variabilite geographique assez reduite. La plupart des SNPhumains se retrouve dans les principaux groupes raciaux. Stephenset al. ont montre que seuls 8 % de tous les haplotypes (combinaisond’alleles sur un meme chromosome) etaient specifiques de l’un des4 groupes ethniques etudies, et que 71 % etaient communs a tousles groupes, meme en se basant sur un aussi faible echantillon [3].Neanmoins, la frequence des SNP peut varier de facon importanted’un groupe ethnique a un autre. Le melange dans une memepopulation d’etude de deux populations ayant a la fois unefrequence differente de l’allele considere et du phenotyperecherche peut conduire a conclure a tort a un lien causal entrele variant et la maladie (Fig. 2). Cette relation peut etre expliqueepar des differences culturelles ou environnementales dans les deuxpopulations. Il est donc important de considerer dans chaque etudeune population ethniquement homogene.
D’autres concepts sont necessaires a l’interpretation correctedes etudes de polymorphismes.
4.4. L’heritabilite de la maladie
Dans le cas pathologie d’origine multifactorielle, la contributiongenetique a la maladie est parfois trop faible pour qu’aucunechantillon etudie n’ait une taille suffisante. Ainsi, plus laphysiopathologie de la maladie est complexe et fait intervenirde determinants differents, plus il sera difficile d’identifier le roled’un facteur genetique. La non prise en compte de cet aspect,souvent couplee a un echantillon de population etudie insuffisant,peut faire conclure a tort a l’absence d’effet du variant genetiquesur le phenotype observe.
Fig. 2. Exemple d’effet lie a un desequilibre de liaison. Dans cet exemple ou deux populations sont analysees, la frequence de l’allele G est plus elevee dans la population A tout
comme l’est l’incidence du rejet aigu. De ce fait, si les deux populations sont etudiees ensemble, il apparaıtra necessairement une frequence plus elevee du rejet chez les
porteurs de l’allele G. En effet 69 % des alleles G (0,9/(0,9 + 0,4) = 0,69) sont dans la population A ou le rejet est plus frequent. La relation n’est pas necessairement causale et
peut etre due a des facteurs culturels ou environnementaux.
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4.5. Le nombre de genes affectant la maladie
Plus le nombre de genes est grand, plus la contributionmoyenne de chacun est faible, et plus leur detection est difficile.Par ailleurs, les variants de chaque gene peuvent interagir entreeux et avec les autres genes impliques.
4.6. La penetrance et l’expressivite
Dans le cas de maladie humaine, la penetrance peut dependrepar exemple de l’age et conduire a des conclusions erronees. C’estle cas de la plupart des maladies renales qui surviennenttardivement ce qui peut conduire a des erreurs de classificationsdes phenotypes. L’expressivite peut egalement etre modulee parl’environnement, pouvant alors entraıner de faux diagnostics ouune fausse classification du degre de gravite.
5. Quelles consequences pour les etudes cliniques depolymorphisme ?
Les etudes concernant la recherche de correlation entre unvariant genetique et un caractere pathologique, sont tresnombreuses. Leur realisation necessite cependant, pour etreadaptee, des conditions de realisations adequates (Tableau 1).
5.1. Qualite de l’hypothese initiale
Il est necessaire dans les etudes d’association que le genecandidat etudie soit pertinent du point de vue physiopathologique.L’hypothese doit donc se baser sur le fait que la mutation affecte une
Tableau 1Principales conditions d’interpretation des etudes de polymorphismes.
Qualite de l’hypothese Le gene etudie do
Stratification de la population La repartition gen
la frequence de l’a
Consequences biologiques de la mutation Un test pertinent
Taille de l’effectif Doit etre adapte a
Replication L’hypothese doit e
Ajustement pour les comparaisons multiples L’hypothese initia
Selection des participants Si des patients son
patients doivent e
Erreurs de genotypage L’enonce methodo
proteine dont l’alteration d’une ou des fonctions est raisonnable-ment susceptible d’avoir les consequences recherchees.
5.2. Stratification de la population
L’effet de la stratification est probablement faible. L’associationd’un genotype et d’une maladie semble en effet relativementconstante d’une population a une autre [4]. Neanmoins, comme laplupart des etudes d’association comporte de faibles effectifs, unbiais modere peut avoir des consequences statistiques importantes[5]. Il est donc important de preciser si l’etude inclut unepopulation genetiquement homogene ou dans la cas contraire, sila stratification de la population a ete prise en compte.
5.3. Fonction biologique de la mutation
Une validation fonctionnelle confirmant que la variation desequence nucleotidique a une consequence sur l’activite de laproteine est egalement indispensable. Cette etape est loin d’etresimple car l’effet des polymorphismes au niveau biologique estparfois difficile a etablir. Les validations fonctionnelles peuvent etreetablies par dosage serique dans le cadre, par exemple, d’etude depolymorphisme de cytokines dont le taux serique est correle a laproduction.C’est lecas,parexempledel’interleukine-6.Notre groupea ainsi montre que le taux serique d’IL-6 variait avec le poly-morphisme dupromoteurdugenedel’IL-6en position �174 [6]. Delameme maniere, l’etude de polymorphisme concernant un systemeenzymatique peut etre validee grace a la mesure de son activitebiologique (par exemple, mesure de la production de PGE2 lors de lavalidation fonctionnelle du polymorphisme de la COX-2 [7]).
it avoir un role potentiel dans la pathologie recherchee
etique de la population doit etre indiquee. Si la population n’est pas homogene,
llele et de la pathologie doit etre indiquees pour chaque population
doit montrer que la variant a un effet sur la proteine codee
la frequence de l’allele, a l’incidence de la pathologie et a sa complexite
tre testee dans 2 populations independantes
le doit etre clairement enoncee evitant ainsi les comparaisons multiples
t exclus, les raisons doivent etre precisees et les caracteristiques de ces
tre analysees
logique doit etre precis
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Cela peut etre plus complexe pour l’etude de certainspolymorphismes, par exemple, lorsque la mutation affectel’affinite d’un recepteur pour son ligand. Une autre difficulte estrencontree lorsque le dosage direct dans un liquide est impossibleou non pertinent et que la capacite de production doit etre mesureein vitro apres stimulation plus ou moins specifique. Dans ce cas, lapertinence du test est difficile a apprecier et l’interpretation de telsresultats est sujette a caution.
5.4. La taille de l’effectif
La plupart des tests statistiques utilises dans le cadre de cesetudes requierent en general des tailles d’echantillons depassant500 individus pour avoir une chance de plus de 80 % de detecter unlocus responsable d’au moins 5 % de susceptibilite a la maladie. Peud’etudes a ce jour font etat d’echantillons de cette taille et deserreurs de second type (non detection de l’association alors qu’elleexiste) sont donc probablement frequentes. Determiner de faconadequate la taille de l’echantillon depend de plusieurs parametresdont la frequence de l’allele mineur, la difference attendue entrecas–temoins, la complexite de la pathologie. . . Une etude recentesur les etudes de polymorphismes presentees a l‘EDTA et a l’ASNillustre tout particulierement cette insuffisance d’echantillonnagedes etudes genetiques [8]. Le nombre moyen de patients par etudeetait en effet de 276 � 116 et 42 % avaient inclus moins de100 patients.
Une taille inadaptee de l’echantillon peut conduire a un autretype de biais. Lorsque des etudes incluant un faible nombre depatients sont realisees, leur probabilite de publication augmente sile resultat est positif, c’est-a-dire lorsqu’une association estretrouvee entre le variant genetique et le phenotype. Cela induitun biais de publication.
5.5. La cohorte de replication
La replication des etudes est indispensable. Cependant, comptetenu des differences de frequence alleliques pouvant exister entrepopulations differentes, l’association n’est pas necessairementretrouvee, sans pour autant exclure l’implication du gene. Il estdonc necessaire de disposer d’une population genetiquementcomparable.
5.6. Ajustement pour les comparaisons multiples
Lorsque l’on etudie plusieurs evenements potentiellementassocies a un meme variant ou que l’on teste differentescombinaisons alleliques, le resultat est soumis a un biais d’inflationdu risque alpha. La correction habituelle de Bonferroni dans le casde comparaison multiple consiste a diviser le seuil nominal designification par le nombre de comparaison effectuee pour obtenirun taux de faux-positifs acceptable dans le cadre de l’experienceeffectuee. Ces corrections s’accompagnent evidemment d’uneaugmentation du nombre de patients necessaire pour mettre enevidence une difference significative. Au mieux et pour eviter lescomparaisons aleatoires entre groupes, il est plus logique decomparer les genotypes en fonction de leur effet sur la quantite oula qualite de la proteine codee.
5.7. Genotypage
Differents types d’erreurs peuvent survenir au cours de l’etapede genotypage (faible quantite ou qualite d’ADN, equipementsimprecis, erreur humaine. . .) [9]. Ces erreurs de genotypagepeuvent atteindre 30 % des echantillons [9,10]. Les erreurs degenotypage vont plutot favoriser l’hypothese nulle. Le biais le plusimportant intervient lorsque la sensibilite du genotypage est faible
et la prevalence du genotype elevee ou lorsque la specificite estfaible et la prevalence basse.
6. Approche genes-candidats versus approche genome-wide
6.1. Approche genes-candidats
Les approches genes-candidats consistent a selectionner unensemble de genes dont les fonctions pourraient intervenir dansl’etiologie de la maladie etudiee, et a les tester directement parassociation. Le choix des genes peut etre guide par des a prioribiologiques tels que la fonction ou l’appartenance a une voiemetabolique associee a une maladie, ou encore sur la base de lalocalisation dans une region chromosomique d’interet, suggereepar une precedente etude de liaison ou d’association. Memelorsque les connaissances a priori sont larges et que la physio-pathologie de la maladie est relativement bien comprise,l’approche genes-candidats n’identifiera qu’une fraction desdeterminants genetiques. Dans le cas contraire, elle est alorsinadaptee pour apprehender de facon exhaustive les causesgenetiques des maladies.
6.2. Approche genome-wide
Une etude d’association genome-wide (ou systematique)s’interesse a une grande partie du genome sans aucun a priorisur l’identite des locus impliques. Cette approche represente unestrategie impartiale, non dirigee et assez complete pouvant etremise en place en l’absence d’indices sur la fonction ou la positiondes locus de susceptibilite. Elle a d’abord ete utilisee pour desetudes de liaison utilisant des microsatellites et a permis demettre en evidence la plupart des genes responsables desmaladies monogeniques connues. Ces etudes sont soumises ades contraintes bioinformatiques et statistiques particulieres.Dans une analyse prenant potentiellement en compte un millionde SNP ou le signal pathologique vrai n’est pas necessairementtres superieur au bruit de fond ou a l’effet d’un facteur confondant,les defis statistiques sont differents de ceux d’une analyse gene-candidat. Le calcul du nombre de patients, l’approche methodo-logique (cas–temoins, etudes de familles, analyse de liaison dansune population « melangee » [MALD]), la definition du seuil alpha(souvent compris entre 10�4 et 10�7), la couverture plus ou moinscomplete du genome, le controle qualite des donnees sontcertains des points majeurs a analyser dans l’interpretation de cesetudes.
Du choix de l’approche va donc dependre la selection desmarqueurs.
7. Conclusions
Les etudes de polymorphismes peuvent apporter desrenseignements precieux pour mieux comprendre la physio-pathologie de maladies complexes, selectionner des groupes depatients a risque et definir des strategies therapeutiques. Pouretre interpretables, elles necessitent de repondre a des criteresmethodologiques rigoureux. Ces exigences doivent etre cellesdes chercheurs qui generent les etudes, des lecteurs qui ont ajuger de leur pertinence et des comites editoriaux des journauxmedicaux qui contribuent a leur diffusion. La rehabilitation etl’exploitation raisonnable de ces etudes ne peuvent s’envisagerque si chacun joue son role pour exiger l’excellence en matierede recherche clinique dans ce type d’etudes. Des recommanda-tions existent depuis plusieurs annees et devraient enfin etreadoptees et suivies par l’ensemble de la communaute medicale[11,12].
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Declaration d’interets
Les auteurs declarent ne pas avoir de conflits d’interets enrelation avec cet article.
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