Calibration de la méthode

Quantification en mélanges ternaires

Distinction isomérique et quantification de

monosaccharides par la méthode cinétique

Distinction isomérique et quantification de

monosaccharides par la méthode cinétique

lliln (R ) = + . ln (R ) 1 -( ( ln (R ).

mesuré ii j

L'expression de la correction entre phase liquide et phase gazeuse en mélange ternaire est immédiatement dérivée de la correction en mélange binaire, en considérant des constantes d'équilibres propres à un sucre i, j ou k dans un mélange ternaire i/j/k pour un système M / Réf.

gi =

Ki

i, j, k

kKi, j, k

il.

.K

i

i, j, k

kKi, j, k +i

l 1-( (gi

gj -

Kj

i, j, k

kKi, j, k

jl. +

gi =

Ki

i, k

kKi, k

il.

+il.

Ki

i, k

kKi, k 1-( (

gi

gj -

Kj

j, k

kKj, k

jl. +

Conclusion

L'utilisation de métaux de transition et d'acides aminés natifs dans le cadre de la méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique permet d'obtenir des systèmes discriminants pour trois monosaccharides (D-glucose, D-galactose et D-fructose). Leur quantification en mélanges binaires et ternaires est possible en considérant une correction par une constante d'équilibre entre fractions en phase liquide et en phase gazeuse, liée en partie à l'impact de la composition isomérique du mélange sur la formation/ionisation du cluster trimérique associé à un isomère. Cette constante est toutefois susceptible de décrire d'autres phénomènes impliquant une réponse non linéaire, en particulier des phénomènes entropiques. La procédure de correction trois points fournit une méthode performante pour la quantification de monosaccharides en mélange, tant en terme de justesse que de répétabilité, l'écart-type mesuré étant de l'ordre du pourcent.Cette méthode peut être étendue à N isomères en mélange, sous réserve d'obtenir au préalable N-1 systèmes M / Réf discriminants pour les N analytes, et d'effectuer les 2 parmi N calibrations trois points des mélanges binaires pour déterminer les constantes d'équilibres (soit les coefficients correcteurs) associées. La moyenne des N valeurs obtenues pour chaque fraction molaire doit alors constituer une bonne approximation de la fraction réelle en phase liquide.

RemerciementsCette étude a pu être réalisée grâce aux moyens techniques du Spectropôle, service commun d'analyse des Universités d'Aix-Marseille, qui nous a donné un accès privilégié au parc instrumental acquis grâce à des fonds européens (FEDER OBJ2142-3341).

Références[1] Smith, G. ; Leary, J. A. ; Journal of the American Chemical Society 1998, 120, 13046 - 13056

[2] Salpin, J.-Y. ; Tortajada, J. J. Mass Spectrom. 2002, 37, 379-388

[3] Augusti, D. V. ; Carazza, F. ; Augusti, R. ; Tao, W. A. ; Cooks, R. G., Analytical Chemistry 2002, 74, (14), 3458 - 3462

[4] Fouquet, T. ; Charles, L. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, soumis pour publication

[5] Wu, L. ; Meurer E. C. ; Cooks, R. G. Analytical Chemistry 2004, 76 (3), 663 - 671

[6] Wu, L. M. ; Lemr, K. ; Aggerholm, T. ; Cooks, R. G., Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2003, 14, (2), 152 - 160

[7] Zhang, M. Y. ; Kerns, E. ; McConnell, O. 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Quebec, 2003 ; Montreal, Quebec, 2003

[8] Lemr, K. ; Ranc, V. ; Frycak, P. ; Bednar, P. ; Sevcik, J., Journal of Mass Spectrometry 2006, 41, (4), 499 - 506

Thierry Fouquet et Laurence CharlesUniversités Aix-Marseille I, II & III - CNRS, UMR 6264 : Laboratoire Chimie Provence, Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale, 13397 Marseille cedex 20

La détermination numérique de ces constantes d'équilibre nécessiterait un étalonnage supplémentaire par la mesure de ratio R en mélange ternaire connu. Toutefois, nous proposons ici d'utiliser les coefficients correcteurs obtenus avec les mélanges

binaires pour la quantification des mélanges ternaires, en supposant que l'impact d'un isomère j sur un isomère i , imagé par la constante d'équilibre, n'est pas influencé par la présence d'un isomère k.

Cette hypothèse implique alors l'obtention de trois jeux de résultats pour les fractions molaires en phase liquide, selon l'identification du composé k (dans l'expression ci-jointe) au fructose, au galactose ou au glucose.

La méthode retenue consiste en une moyenne arithmétique des trois valeurs obtenues pour chaque fraction molaire en phase liquide. Cette opération revient à considérer qu'un mélange ternaire i/j/k peut être modélisé par la somme des trois mélanges binaires dérivés i/j, i/k et j/k en terme de compétition pour la formation des clusters.

34,3 (0,5) 15,8 (1,1) 49,9 (1,2)

35,0 15,0 50,0

33,2 (0,5) 34,0 (1,0) 32,8 (0,9)

33,3 33,3 33,3

49,4 (0,6) 35,9 (0,9) 14,7 (1,1)

50,0 35,0 15,0

gal fruglc

mesuréil

il réel

gal fruglc gal fruglc

Introduction

Si les sucres dans leur ensemble interviennent dans une grande variété de processus biologiques, du stockage de l'énergie à la reconnaissance cellulaire, leur quantification en mélange prend toute son importance lorsqu'ils sont utilisés comme base pour l'élaboration de principes actifs ou de vecteurs, ou pour la production de biocarburants à partir de la biomasse.

Diverses techniques analytiques peuvent évidemment être mises en oeuvre pour l'étude de sucres. La résonance magnétique nucléaire est capable de caractériser des isomères de mono et polysaccharides, ou de distinguer les différentes formes cycliques et anomériques mais se heurte à la complexification rapide des signaux en mélanges binaire et ternaire. Les méthodes chromatographiques peuvent quant à elle devenir longues à mettre en oeuvre.En revanche la spectrométrie de masse peut avec succès identifier et/ou quantifier des sucres en mélange, par l'étude du profil de fragmentation d'adduits métalliques par exemple, ou par l'application des variantes de la méthode cinétique. Développée à l'origine pour la détermination de propriétés thermochimiques comme l'affinité protonique, elle fut mise en oeuvre pour la distinction et la quantification d'un vaste panel de composés chiraux (acides aminés, acides alpha-hydroxylés, peptides, ...).Les travaux présentés concernent l'application de la méthode cinétique pour la quantification de monosaccharides isomères, illustrés par le glucose, le galactose et le fructose, en mélanges binaires et ternaires.

[1, 2]

[3]

[4]

Les fractions molaires moyennes en phase liquide pour les différents mélanges ternaires proposés ci-dessus sont en très bon accord avec les fractions réelles en mélange. A cette justesse s'ajoute une très bonne répétabilité des mesures, l'écart-type obtenu étant au maximum de l'ordre d'un pour cent.

ggiln (R ) = + . ln (R ) 1 -( ( ln (R ).

mesuré ii j

il

Le logarithme du ratio n'est alors plus linéaire en fonction de la fraction molaire en phase liquide , mais en fonction de la fraction molaire en phase gaz , selon une relation analogue.

Une calibration trois points, réalisée en corrélant l'expression de ln(R) ci-dessus aux points expérimentaux (sucres i et j purs, et mélange équimolaire) permet d'obtenir avec précision la constante d'équilibre pour un système M / Réf et un mélange i/j donné. Cet unique coefficient correcteur obtenu, la mesure du ratio R apporte les fractions molaires en phase liquide des sucres en mélange binaire sans biais.Il faut noter que la constante d'équilibre ou le coefficient correcteur ne peuvent être associés qu'à un système et un mélange binaire donné, et non à un sucre de manière universelle.

i

g

gi =

Ki

i, j

jKi, j

il.

il. + 1 - i

l( (K

i

i, j

jKi, j

sucre i [M(réf*) (sucre i)-H]2+

Ki

i, j

sucre j [M(réf*) (sucre j)-H]+

2

Kj

i, j

En considérant une constante d'équilibre entre le sucre i en solution et le cluster associé en phase gaz dans un mélange i/j, susceptible de décrire tous les phénomènes entre la formation du cluster en phase liquide et sa fragmentation, en particulier l'impact des autres isomères en solution sur la formation/ionisation du cluster trimérique, on obtient une expression de la fraction molaire en phase gaz du sucre i.

D'après Cooks et al, le logarithme népérien du ratio mesuré en mélange de N composés peut être relié linéairement à la fraction molaire en phase liquide de chacun, connaissant les ratios des analytes pris séparement. Pour des mélanges binaires ou ternaires, respectivement une ou deux fractions molaires sont inconnues, et la quantification nécessite la mesure du ratio pour un ou deux systèmes discriminants.

li.ln (R ) = + mesuré ln (R )i

lj. ln (R )j 1-( (.

li ln (R )k

lj-+

M , réf* M , réf* M , réf*M , réf*

mélange ternaire

mélange binaire

lliln (R ) = + . ln (R ) 1 -( ( ln (R ).

mesuré ii j

mesuréln (R )

i

Kgal

fru, gal

fruKfru, gal

Cu - L-Ser

( ( = 2,51

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

gi

il

fraction molaire en phase liquide

fraction molaire en phase gaz, calculée par la constante d'équilibre

Les phénomènes entropiques, négligés dans le cadre de la méthode cinétique standard (sous réserve de similitude structurale entre analyte et référence) et l'impact de la présence d'un sucre j sur la formation/ionisation du cluster d'un sucre i sont des origines parmi d'autres possibles de cette non-linéarité.

Le logarithme népérien du ratio mésuré en mélange binaire des monosaccharides considérés n'est pas, contrairement aux attentes, lié linéairement à la fraction molaire en phase liquide d'un sucre donné comme observé sur ces courbes de réponse.

il

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0 ln (R)

li

fru / g

al

glc / gal

glc / fru

1,00,80,60,40,20

système Cu-Ser

Pour illustrer cette dernière hypothèse, la mesure de l'abondance du cluster trimérique associé au fructose est réalisée en ESI/MS pour différentes concentration en fructose, en présence de concentrations définies et croissantes de glucose marqué 13-C. Si l'abondance du cluster est bien une fonction linéaire de la concentration en fructose, la pente de cette droite varie avec la concentration en glucose marqué, démontrant ainsi l'impact de la présence d'un isomère j sur la formation/ionisation du cluster d'un isomère i.

1

2

3

fructose (mM)

glucose (mM)

0,20,150,10,050

Abo

ndan

ce (

x e6

)

0 mM0,1 mM

0,15 mM

0,3 mM

Déviation à la linéarité

Correction en mélange binaire

Résumé

Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be achieved for most tested systems amongst which serine/Cu and aspartic acid/Mn were selected for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained for each analyte in binary and ternary mixtures using three-point corrected calibration curves, which account for the competition effects evidenced to occur between sugars for the formation of the trimeric complexes.

L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D-glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de nombreux systèmes, dont les couples serine/Cu et acide aspartique/Mn , qui ont été sélectionnés pour l'analyse quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des complexes ont été mis en évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure la justesse et la répétabilité de la quantification en mélange binaire et ternaire.

Abstract

2+2+

2+2+

i / j / k ~ i / j + i / k + j / k

Conditions expérimentalesLes analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse hybride QTrap 3200 (Applied Biosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation electrospray. Les solutions analysées sont composées d'un sel métallique (1 M), d'un acide aminé (2 M) et d'un sucre (2 M) dans MeOH / H O à 50/502

[6]

[7]

[8]

Distinction isomérique

Parmi ces systèmes dont quelques exemples sont présentés ci-dessus, ceux offrant la plus grande distinction isomérique (c'est-à-dire la plus grande différence entre les trois ratios) et qui seront utilisés pour la quantification en mélange sont les combinaisons Cu/Ser et Mn/Asp. Les autres raisons susceptibles de faire écarter un système M / Réf sont la faible répétabilité des mesures (liée à la faible abondance du cluster trimérique) et le manque de discrimination entre certains isomères, ces deux motifs impactant sur l'éventuelle précision des mesures en mélange.

réf* MIIréf*

CID

k1

k2

IIsucreréf* M

M , réf*II

ESI

IIsucre

Mréf*réf*

sucre

R = k1

k2 [M(réf*) -H]2

+[M(réf*)(sucre)-H]

+

=

R = [M(Réf)(A)-H] /[M(Réf) -H]2

+ +

M Réf

MnAsp

Thr

Cu Ser

Zn Phe

gal

2,62

24

0,420

4,17

glc

0,45

1,96

0,161

0,392

1,11

3,23

0,043

0,42

fru

R = 0,04fructose

galactoseR = 0,42

glucoseR = 0,16

100 200 300 400 500

0

20

40

60

80

100

100 200 300 400 500

0

20

40

60

80

100

100 200 300 400 500

0

20

40

60

80

100

[Cu(L-Ser)2(D-fru)-H]+

[Cu(L-Ser)2(D-glc)-H]+

- D-fru

- D-gal

- L-Ser

- D-glc

- L-Ser

- L-Ser

[Cu(L-Ser)2(D-gal)-H]+

m/z

Ab

on

dan

ce r

ela

tive

Ab

on

dan

ce r

ela

tive

Ab

on

dan

ce r

ela

tive

L'utilisation de métaux de transitions (Mn, Fe, Co, Cu, Zn) pour le cation central et d'acides aminés pour références permet dans le cas des trois monosaccharides étudiés (glucose, galactose et fructose) d'obtenir une série de systèmes potentiellement discriminants, après avoir éliminé les combinaisons ne permettant pas la formation du cluster trimérique ou entraînant une fragmentation secondaire forte, non compatible avec la méthode cinétique (qui considère les deux voies de dissociation précitées comme les seules fragmentations du cluster trimérique).

La méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique est basée sur la mesure des cinétiques de dissociations compétitives d'un cluster trimérique simplement chargé formé d'un cation divalent central M, de deux molécules de référence Réf et de l'analyte A, noté [M(Réf) (A)-H] .Deux complexes dimériques sont formés après dissociation, résultant de la perte d'une référence ou de l'analyte, et sont notés [M(Réf)(A)-H] et [M(Réf) -H] respectivement.Les différences structurales des analytes isomères entraînent des stabilités différentes du complexe [M(Réf)(A)-H] , donc de l'abondance associée en MS/MS et qui, mesurée relativement à l'abondance du complexe [M(Réf) -H], définit un ratio R propre à chaque analyte, image des cinétiques de fragmentation. Si le système M / Réf est disciriminant, les ratios de chaque isomère étudié seront différents. Cette discrimination isomérique peut se quantifier par le rapport des ratios de deux isomères, et sera d'autant plus efficace que le rapport diffère de 1.

2+ [5]

2

2

++

+

+

.10 - 4 .10 - 4 .10 - 4

1

2

3