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Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4: recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Présenté par Olivier DELORME. Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL. - PowerPoint PPT Presentation
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Présenté par Olivier DELORME
Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2
Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL
Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4:
recherche des kinases responsables de la phosphorylation de
la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae
Le cycle de régulation des protéines Rho3 et Rho4
Rho3/4
Rho3/4
GDP
GTP
Rgd1 GEF
Forme active
Forme inactive
Pi GDP
GTP
La protéine Rgd1 (Related GAP Domain 1)
FCH RhoGAP
Fes-CIP4 Homology
Coiled-coil
Rho GTPase Activating Protein
D’après Roumanie et al., 2000
La protéine Rgd1 est phosphorylée
H. Fernandes.2005
Où se trouvent les sites de phosphorylation ?
S336
? ?
La phosphorylation régule l’activité de Rgd1p
H. Fernandes. 2005
L’activité RhoGAP augmente lorsque Rgd1 est sous forme non phosphorylée
Rgd1
Rho3
Rho4
Kinases?
Phosphatases?
Quels sont les mécanismes qui régulent Rgd1p ?
Objectifs
Participation à l’étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4
Etude de la régulation de Rgd1p
Recherche des kinases
Recherche des kinases de Rgd1p
– Approche ciblée : • Analyse des souches mutées pour les gènes codant
pour les kinases potentielles de Rgd1p
– Approche globale:• Analyse des souches mutées pour les gènes codant
pour les kinases• Approche par la protéomique : le Proto-Array
Approche ciblée : les kinases potentielles
Mkk2p et Bck1pRgd1pMkk2pBck1p
Complexe protéique
PKA (Tpk1, Tpk2, Tpk3)
Ipl1p
Ipl1 Aurora B
?
GAPRgd1p GAP MgcRacGAPp
Activité AMPc dépendante, la quantité d’AMPc varie au cours de la croissance
Stratégie d’analyse
Extraction Protéines totales
Western Blot
Prélèvement des cellules
Détection et Quantification par caméra CCD
Détection des bandes présentes sur la membrane
Acquisition d’une image
Acquisition des valeurs d’intensité des bandes
Calculs des rapports P/nP pour chaque extrait et détermination du seuil
Méthode de calculWT rgd1Δ1Δ 2Δ 3Δ 4Δ 5Δ 6Δ
P
nP
P/nP P/nP P/nP P/nPP/nP P/nP P/nP P/nPP/nP P/nP P/nP
Moyenne P/nPEcart-type
Seuil=(moyenne)-(écart-type)
P/nP<Seuil => la souche est sélectionnée
Approche Ciblée
Seuil
tpk1Δ, tpk2Δ, tpk3Δ
Valeur P/nP
2,11,9
2,2
bck1
Δ
mkk2Δ
1,8
2,9
1,7
1,2
WT
2,4
3,3
3
WT WT
ipl1-
322
ipl1-
322
2,5
WT WT
Extraits protéiques1
Approche globale
Extraits protéiques
ymr2
91wΔ
1
Valeur P/nP
2
3
2,5
1,5
6,5
WT2
WT4
WT1
WT3
WT5
ypl2
36cΔ
ypk2
Δyn
r047
wΔya
k1Δ
ypk1
Δyd
l025
cΔ
ssk1
Δ
ygr0
52cΔ
yck2
Δ
ste7Δ
yil04
2cΔ
rgd1
Δ
Seuil
ssk1
Δ
Approche globale
Quelles sont les kinases retenues?
Dig1p, Tpk3p
Yck1p, Yck2p
Bub1p, Fus3p, Pho85p
Bud32p
Ssn8p
Endocytose, cytocinèse
Mécanismes du cycle cellulaire
Sélection du site de bourgeonnement
Mck1p, Dun1p
Croissance invasive
Régulation de l’ARN polymérase II
Régulation des mécanismes de réparation de l’ADN
L’analyse des souches mutées par Western Blot est elle suffisante ?
• Le crible permet de sélectionner les kinases candidates
• Il est impossible de déterminer les kinases qui interagissent physiquement avec Rgd1p
Recherche des kinases en utilisant le proto-array
Protéine de fusion purifiée
Puce Invitrogen™ contenant 4088 protéines de S. cerevisiæ
(70% des protéines totales)
Localisation des protéines qui
interagissent avec Rgd1p
Utilisation Anticorps Anti-V5
fluorescent
Rgd1 V5 6xHis
Incubation des protéines de fusion sur la puce
Comment obtenir la protéine de fusion ?
Amplification de la séquence codante de RGD1
Clonage du produit de PCR dans un vecteur navette
Transformation de bactérie avec le vecteur contenant la séquence codante
Production du vecteur dans la bactérie, puis transformation des levures avec le vecteur
Purification de la protéine de fusion
Le vecteur utilisé pour effectuer la construction
Invitrogen
Conclusions générales
• Le crible des kinases ciblées a permis de sélectionner Ipl1
• A partir des 140 protéines testées, 11 kinases ont été retenues. Parmi ces 11 kinases Yck1, Yck2, Bud1 et Fus3 sont les meilleures candidates
• La construction plasmidique contenant la séquence codante fusionnée aux étiquettes V5 et 6xHis a été effectuée
Perspectives
• A court terme :– Terminer l’approche par le proto-array– Effectuer des tests d’activité sur les 11 kinases retenues
• A long terme :– Étudier les kinases et leur implication dans la régulation
des protéines Rho3 et Rho4– Effectuer les cribles pour rechercher les phosphatases
de la protéine Rgd1
Merci de votre attention
Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2