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Principauxة outils de la biologie moleacuteculaire

1- Principaux outils de la biologie moleacuteculaire

La biologie moleacuteculaire consiste agrave eacutetudier la structure des gegravenes leur expression et lecontrocircle de leur expression Elle conduit donc agrave travailler essentiellement avec desmoleacutecules drsquoADN et drsquoARNm

1-1- Quelques deacutefinitions

1-1-1- LrsquoADN recombinant (ou recombineacute)

On appelle laquo ADN recombinant raquo un ADN hybride obtenu in vitro parcombinaison de deux moleacutecules drsquoADN appartenant agrave deux espegravecesdiffeacuterentes Par exemple un fragment drsquoADN humain agrave eacutetudier dit ADNdrsquointeacuterecirct est greffeacute sur un ADN viralOn appelle laquo vecteur raquolrsquoADN dans lequel on insegravere lrsquoADN agrave eacutetudier et quisert en fait de support LrsquoADN inseacutereacute est appeleacute laquo insert raquo ou laquo ADNexogegravene raquo ou laquo ADN eacutetranger raquoLrsquoADN recombinant est preacutepareacute dans le but drsquoeffectuer laquo un clonage raquo ceclonage peut ecirctre ou non accompagneacute drsquoune expression de proteacuteines

1-1-2- Clonage de lrsquoADN recombinant

Un laquo clone raquo est par deacutefinition un grand nombre de cellules ou demoleacutecules identiques provenant drsquoun seul ancecirctre que cet ancecirctre soit unecellule ou une moleacuteculeLrsquoADN recombinant a le grand avantage de pouvoir se reacutepliquer dans unebacteacuterie comme lrsquoaurait fait le bacteacuteriophage Crsquoest donc un moyencommode de produire une amplification du fragment drsquoADN agrave eacutetudierUne amplification drsquoADN peut aussi ecirctre obtenue par voie enzymatique invitro avec la technique de polymerase chain reaction ou PCR

1-1-3- Expression drsquoADN recombinant

Lrsquoexpression de la seacutequence drsquoADN insert neacutecessite la preacutesence de signauxde transcription en amont de cette seacutequence placeacutes donc en geacuteneacuteral dans levecteur Ces signaux peuvent ecirctre speacutecifiques des machineriestranscriptionnelles de bacteacuteries levures ou encore de cellules demammifegraveres selon la cellule hocircte choisie pour cette expression

1-1-4- Les banques drsquoADNc et geacutenomiques

Banques drsquoADNc

Rappelons tout drsquoabord qursquoun ADNc est une copie drsquoADN double brindrsquoun ARNm et ne possegravede donc pas drsquointrons Une banque drsquoADNc est

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une collection drsquoADNc recombinants Ainsi si on srsquointeacuteresse agrave une proteacuteineX exprimeacutee dans un tissu donneacute on purifiera lrsquoARNm de ce tissu et onfabriquera les ADNc correspondant agrave ces ARNm que lrsquoon clonera dans unvecteur Cette banque DrsquoADNc ainsi constitueacutee repreacutesentera des seacutequencescodant pour les proteacuteines de ce tissu Cette information geacuteneacutetique selimitera donc aux gegravenes exprimeacutes dans le tissu et aux seacutequences codant lesproteacuteines (pas drsquointrons)

Banques geacutenomiques

Une banque geacutenomique srsquooppose agrave une banquest drsquoutiliser une banquegeacutenomiquee drsquoADNc par le fait qursquoelle repreacutesente la totaliteacute du geacutenomeUne telle banque est en effet obtenue par fragmentation drsquoADNgeacutenomique Elle est constitueacutee de toute une collection drsquoADNrecombinants correspondant aussi bien agrave des seacutequences codants qursquoagrave desseacutequences non codantes Chaque partie du geacutenome y est theacuteoriquementrepreacutesenteacutee au moins une fois Pour connaitre la structure drsquoun gegravene il fauteacutevidemment utiliser une banque geacutenomique et non une banque drsquoADNc Ilen est de mecircme lorsqursquoon srsquointeacuteresse agrave des reacutegions drsquoADN non transcritesDrsquoautre part quand on ne sait pas dans qursquoelle cellules est syntheacutetiseacutee laproteacuteine eacutetudieacutee un moyen infaillible de trouver son gegravene est drsquoutiliser unebanque geacutenomique Mais il est plus difficile de travailler avec une banquegeacutenomique dont la taille est bien plus eacuteleveacutee que celle drsquoune banquedrsquoADNc Elle contient en effet environ cent fois plus drsquoinformation deseacutequences drsquoADN qursquoune banque drsquoADNc

1-2- Les principaux outils de la biologie moleacuteculaire

1-2-1- Les enzymes

Les enzymes qui coupent lrsquoADNLes enzymes de restriction sont des enzymes qui vont modifier lrsquoADNau niveau de seacutequences speacutecifiques donc ils sont capables de couper desmoleacutecules drsquoADN double brin en des sites tregraves speacutecifiques de chaqueenzyme et reconnus par luiCes enzymes sont classeacutes en fonction de leur site de reconnaissance etleur lieu de coupureLes seacutequences de nucleacuteotides habituellement reconnues par les enzymesde restriction sont nommeacutees laquo palindrome raquoLes enzymes de restriction sont isoleacutes de micro-organismes bacteacuteries leplus souvent On donne agrave ces enzymes des noms agrave trois ou quatre lettresqui rappellent lrsquoorigine du micro-organisme drsquoougrave ils ont eacuteteacute isoleacutes Parexemple et agrave titre indicatif EcoR1 est isoleacute de Ecoli HpaI deHaemophilus parainfluenzae (R signifie une endonucleacutease le chiffreromain est utiliseacute lorsque plusieurs enzymes ont eacuteteacute isoleacutes agrave partir drsquounemecircme souche)On observe deux types de coupures par les enzymes de restriction -coupure donnant des laquo extreacutemiteacutes franches raquo la coupure drsquounemoleacutecule drsquoADN peut se faire au milieu du palindrome

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-coupure donnant des laquo extreacutemiteacutes adheacutesives raquo (ou laquo bouts collants raquo) drsquoautres types drsquoenzymes agissent en coupant de part et drsquoautre ducentre de symeacutetrie

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Un enzyme de restriction est donc capable de repeacuterer sur toute la longueurdrsquoun ADN certaines seacutequences caracteacuteristiques Si cette seacutequence se trouvecinq fois dans une moleacutecule drsquoADN lrsquoenzyme coupera cet ADN en cescinq endroits ce qui donnera cinq fragments drsquoADN Donc selon lrsquoenzymeutiliseacute un mecircme ADN sera coupeacute diffeacuteremment

La DNaseLa DNase utiliseacutee au laboratoire est geacuteneacuteralement drsquoorigine bovine(pancreacuteas) Crsquoest une endonucleacutease qui possegravede la prooprieacuteteacute decouper une moleacutecule drsquoADN double brin au hasard engendrantainsi des fragments drsquoADN double brin

La nucleacutease S1La nucleacutease S1 (isoleacutee drsquoun champignon Aspergillus oryzae)nrsquoattaque que lrsquoADN simple brin Sont donc eacutepargneacutes (agrave conditionsde ne pas utiliser de grandes quantiteacutes drsquoenzyme) lrsquoADN doublebrin et les hybrides ADNARN

Les exonucleacuteasesLes exonucleacuteases grignotent les extreacutemiteacutes libres des moleacuteculesdrsquoADN en libeacuterant des nucleacuteotides Par exemple lrsquoexonucleacutease IIIhydrolyse seacutequentiellement les extreacutemiteacutes 3rsquo libres des moleacuteculesdrsquoADN dans le sens 3rsquo vers 5rsquo

Les enzymes qui ligaturent les ligasesPour lier souder deux fragments drsquo ADN on utilise une ligase enpreacutesence Il est plus facile de liguer deux fragments agrave extreacutemiteacutescoheacutesives que deux fragments agrave coupure franche La ligase choisie esten geacuteneacuteral la ligase du virus T4 (extraite de bacteacuteries infecteacutees par levirus T4)Lorsqursquoil existe une coupure (nick) drsquoun des deux brins drsquoune moleacuteculedrsquoADN double brin la ligase est eacutegalement capable drsquoeffectuer uneligation entre les deux nucleacuteotides adjacents seacutepareacutes par une bregraveche

Les enzymes qui deacutephosphorylent les phosphatasesLes phosphatases catalysent lrsquoeacutelimination drsquoun groupement phosphateen 5rsquo drsquoune chaine drsquoADNIl est courant de deacutephosphoryler un vecteur que lrsquoon vient drsquoouvrir parun enzyme de restriction afin drsquoeacuteviter une refermeture de ce vecteur(auto-ligation) qui empecirccherait alors drsquoinseacuterer le fragment drsquoADN agraveeacutetudier

Les enzymes qui phosphorylent les kinasesLes kinases permettent le transfert drsquoun groupement phosphate agrave partirdrsquoune moleacutecule drsquoATP Il srsquoagit du phosphate en position gamma (le

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plus externe des trois groupements fixeacutes sur lrsquoAdeacutenosine) Il seratransfeacutereacute agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo drsquoun ADN deacutephosphoryleacute

Les enzymes qui laquo recopient raquo un acide nucleacuteiqueLa copie drsquoune chaine drsquoacides nucleacuteiques qursquoil srsquoagisse de syntheacutetiserune chaine drsquoADN ou drsquoARN srsquoeffectue de maniegravere compleacutementaire etantiparallegravele (lrsquoaddition des nouveaux nucleacuteotides se faisant dans lesens 5rsquophosphate vers 3rsquo OH)

ADN-ADNLes ADN polymeacuterases syntheacutetisent une chaine drsquoADN agrave partirdrsquoun modegravele En effet une ADN polymeacuterase nrsquoest pas capablede commencer une chaine drsquoacides nucleacuteiques Il est neacutecessairedrsquoapporter dans le milieu reacuteactionnel une amorce drsquoacidenucleacuteique

- ADN polymeacuterase I et enzyme de Klenow

LrsquoADN polymeacuterase habituellement utiliseacutee est lrsquoADN polymeacuterase drsquoE coli Elle estconstitueacutee drsquoune seule chaine peptidique et possegravede trois activiteacutes enzymatiques

-une activiteacute de synthegravese ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo-une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 3rsquo-5rsquo expliquant ses proprieacuteteacutesdrsquoenzyme laquo agrave fonction drsquoeacutedition raquo -une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 5rsquo-3rsquo

Lrsquoenzyme de Klenow est un enzyme tregraves souvent utiliseacute au laboratoire il est obtenu agravepartir de lrsquoADN polymeacuterase I drsquoougrave lrsquoon a eacutelimineacute clivage avec une proteacutease le petitfragment responsable de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 5rsquo-3rsquo Il ne reste donc plus que lesactiviteacutes polymeacuterase 5rsquo-3rsquo et exonucleacutease 3rsquo-5rsquo (fonction drsquoeacutedition)La suppression de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo permet drsquoaugmenter la processiviteacute dela polymeacuterase ce qui permet de syntheacutetiser des fragments de grande longueur

- Les ADN polymeacuterases thermoreacutesistantesLa Taq polymeacuterase a eacuteteacute la premiegravere agrave ecirctre identifieacutee Crsquoest une ADN polymeacuteraseisoleacutee des bacteacuteries vivant dans les sources drsquoeau chaude Elle agit agrave une tempeacuteraturevoisine de 65degc Cette proprieacuteteacute trouvera son utiliteacute dans les reacuteactions ougrave il faut utiliserune ADN polymeacuterase thermostable comme dans la polymerase chain restriction PCR(reacuteaction drsquoamplification drsquoADN)Elle peut aussi ecirctre utiliseacutee dans les techniques de seacutequenccedilages de lrsquoADN car ellepermet de travailler agrave tempeacuterature eacuteleveacutee donc drsquoabolir les structures secondaires

ARN-ADN

- La reacutetrotranscriptase laquo RT raquo (ou transcriptase reverse)La RT est un enzyme isoleacute de reacutetrovirus (mais existant eacutegalement ailleurs que dans lesreacutetrovirus) qui permet de fabriquer un ADNc agrave partir drsquoun ARNmLa RT est une ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo ayant les caracteacuterisiques suivantes

-elle est ARN deacutependante

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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une collection drsquoADNc recombinants Ainsi si on srsquointeacuteresse agrave une proteacuteineX exprimeacutee dans un tissu donneacute on purifiera lrsquoARNm de ce tissu et onfabriquera les ADNc correspondant agrave ces ARNm que lrsquoon clonera dans unvecteur Cette banque DrsquoADNc ainsi constitueacutee repreacutesentera des seacutequencescodant pour les proteacuteines de ce tissu Cette information geacuteneacutetique selimitera donc aux gegravenes exprimeacutes dans le tissu et aux seacutequences codant lesproteacuteines (pas drsquointrons)

Banques geacutenomiques

Une banque geacutenomique srsquooppose agrave une banquest drsquoutiliser une banquegeacutenomiquee drsquoADNc par le fait qursquoelle repreacutesente la totaliteacute du geacutenomeUne telle banque est en effet obtenue par fragmentation drsquoADNgeacutenomique Elle est constitueacutee de toute une collection drsquoADNrecombinants correspondant aussi bien agrave des seacutequences codants qursquoagrave desseacutequences non codantes Chaque partie du geacutenome y est theacuteoriquementrepreacutesenteacutee au moins une fois Pour connaitre la structure drsquoun gegravene il fauteacutevidemment utiliser une banque geacutenomique et non une banque drsquoADNc Ilen est de mecircme lorsqursquoon srsquointeacuteresse agrave des reacutegions drsquoADN non transcritesDrsquoautre part quand on ne sait pas dans qursquoelle cellules est syntheacutetiseacutee laproteacuteine eacutetudieacutee un moyen infaillible de trouver son gegravene est drsquoutiliser unebanque geacutenomique Mais il est plus difficile de travailler avec une banquegeacutenomique dont la taille est bien plus eacuteleveacutee que celle drsquoune banquedrsquoADNc Elle contient en effet environ cent fois plus drsquoinformation deseacutequences drsquoADN qursquoune banque drsquoADNc

1-2- Les principaux outils de la biologie moleacuteculaire

1-2-1- Les enzymes

Les enzymes qui coupent lrsquoADNLes enzymes de restriction sont des enzymes qui vont modifier lrsquoADNau niveau de seacutequences speacutecifiques donc ils sont capables de couper desmoleacutecules drsquoADN double brin en des sites tregraves speacutecifiques de chaqueenzyme et reconnus par luiCes enzymes sont classeacutes en fonction de leur site de reconnaissance etleur lieu de coupureLes seacutequences de nucleacuteotides habituellement reconnues par les enzymesde restriction sont nommeacutees laquo palindrome raquoLes enzymes de restriction sont isoleacutes de micro-organismes bacteacuteries leplus souvent On donne agrave ces enzymes des noms agrave trois ou quatre lettresqui rappellent lrsquoorigine du micro-organisme drsquoougrave ils ont eacuteteacute isoleacutes Parexemple et agrave titre indicatif EcoR1 est isoleacute de Ecoli HpaI deHaemophilus parainfluenzae (R signifie une endonucleacutease le chiffreromain est utiliseacute lorsque plusieurs enzymes ont eacuteteacute isoleacutes agrave partir drsquounemecircme souche)On observe deux types de coupures par les enzymes de restriction -coupure donnant des laquo extreacutemiteacutes franches raquo la coupure drsquounemoleacutecule drsquoADN peut se faire au milieu du palindrome

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-coupure donnant des laquo extreacutemiteacutes adheacutesives raquo (ou laquo bouts collants raquo) drsquoautres types drsquoenzymes agissent en coupant de part et drsquoautre ducentre de symeacutetrie

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Un enzyme de restriction est donc capable de repeacuterer sur toute la longueurdrsquoun ADN certaines seacutequences caracteacuteristiques Si cette seacutequence se trouvecinq fois dans une moleacutecule drsquoADN lrsquoenzyme coupera cet ADN en cescinq endroits ce qui donnera cinq fragments drsquoADN Donc selon lrsquoenzymeutiliseacute un mecircme ADN sera coupeacute diffeacuteremment

La DNaseLa DNase utiliseacutee au laboratoire est geacuteneacuteralement drsquoorigine bovine(pancreacuteas) Crsquoest une endonucleacutease qui possegravede la prooprieacuteteacute decouper une moleacutecule drsquoADN double brin au hasard engendrantainsi des fragments drsquoADN double brin

La nucleacutease S1La nucleacutease S1 (isoleacutee drsquoun champignon Aspergillus oryzae)nrsquoattaque que lrsquoADN simple brin Sont donc eacutepargneacutes (agrave conditionsde ne pas utiliser de grandes quantiteacutes drsquoenzyme) lrsquoADN doublebrin et les hybrides ADNARN

Les exonucleacuteasesLes exonucleacuteases grignotent les extreacutemiteacutes libres des moleacuteculesdrsquoADN en libeacuterant des nucleacuteotides Par exemple lrsquoexonucleacutease IIIhydrolyse seacutequentiellement les extreacutemiteacutes 3rsquo libres des moleacuteculesdrsquoADN dans le sens 3rsquo vers 5rsquo

Les enzymes qui ligaturent les ligasesPour lier souder deux fragments drsquo ADN on utilise une ligase enpreacutesence Il est plus facile de liguer deux fragments agrave extreacutemiteacutescoheacutesives que deux fragments agrave coupure franche La ligase choisie esten geacuteneacuteral la ligase du virus T4 (extraite de bacteacuteries infecteacutees par levirus T4)Lorsqursquoil existe une coupure (nick) drsquoun des deux brins drsquoune moleacuteculedrsquoADN double brin la ligase est eacutegalement capable drsquoeffectuer uneligation entre les deux nucleacuteotides adjacents seacutepareacutes par une bregraveche

Les enzymes qui deacutephosphorylent les phosphatasesLes phosphatases catalysent lrsquoeacutelimination drsquoun groupement phosphateen 5rsquo drsquoune chaine drsquoADNIl est courant de deacutephosphoryler un vecteur que lrsquoon vient drsquoouvrir parun enzyme de restriction afin drsquoeacuteviter une refermeture de ce vecteur(auto-ligation) qui empecirccherait alors drsquoinseacuterer le fragment drsquoADN agraveeacutetudier

Les enzymes qui phosphorylent les kinasesLes kinases permettent le transfert drsquoun groupement phosphate agrave partirdrsquoune moleacutecule drsquoATP Il srsquoagit du phosphate en position gamma (le

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plus externe des trois groupements fixeacutes sur lrsquoAdeacutenosine) Il seratransfeacutereacute agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo drsquoun ADN deacutephosphoryleacute

Les enzymes qui laquo recopient raquo un acide nucleacuteiqueLa copie drsquoune chaine drsquoacides nucleacuteiques qursquoil srsquoagisse de syntheacutetiserune chaine drsquoADN ou drsquoARN srsquoeffectue de maniegravere compleacutementaire etantiparallegravele (lrsquoaddition des nouveaux nucleacuteotides se faisant dans lesens 5rsquophosphate vers 3rsquo OH)

ADN-ADNLes ADN polymeacuterases syntheacutetisent une chaine drsquoADN agrave partirdrsquoun modegravele En effet une ADN polymeacuterase nrsquoest pas capablede commencer une chaine drsquoacides nucleacuteiques Il est neacutecessairedrsquoapporter dans le milieu reacuteactionnel une amorce drsquoacidenucleacuteique

- ADN polymeacuterase I et enzyme de Klenow

LrsquoADN polymeacuterase habituellement utiliseacutee est lrsquoADN polymeacuterase drsquoE coli Elle estconstitueacutee drsquoune seule chaine peptidique et possegravede trois activiteacutes enzymatiques

-une activiteacute de synthegravese ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo-une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 3rsquo-5rsquo expliquant ses proprieacuteteacutesdrsquoenzyme laquo agrave fonction drsquoeacutedition raquo -une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 5rsquo-3rsquo

Lrsquoenzyme de Klenow est un enzyme tregraves souvent utiliseacute au laboratoire il est obtenu agravepartir de lrsquoADN polymeacuterase I drsquoougrave lrsquoon a eacutelimineacute clivage avec une proteacutease le petitfragment responsable de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 5rsquo-3rsquo Il ne reste donc plus que lesactiviteacutes polymeacuterase 5rsquo-3rsquo et exonucleacutease 3rsquo-5rsquo (fonction drsquoeacutedition)La suppression de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo permet drsquoaugmenter la processiviteacute dela polymeacuterase ce qui permet de syntheacutetiser des fragments de grande longueur

- Les ADN polymeacuterases thermoreacutesistantesLa Taq polymeacuterase a eacuteteacute la premiegravere agrave ecirctre identifieacutee Crsquoest une ADN polymeacuteraseisoleacutee des bacteacuteries vivant dans les sources drsquoeau chaude Elle agit agrave une tempeacuteraturevoisine de 65degc Cette proprieacuteteacute trouvera son utiliteacute dans les reacuteactions ougrave il faut utiliserune ADN polymeacuterase thermostable comme dans la polymerase chain restriction PCR(reacuteaction drsquoamplification drsquoADN)Elle peut aussi ecirctre utiliseacutee dans les techniques de seacutequenccedilages de lrsquoADN car ellepermet de travailler agrave tempeacuterature eacuteleveacutee donc drsquoabolir les structures secondaires

ARN-ADN

- La reacutetrotranscriptase laquo RT raquo (ou transcriptase reverse)La RT est un enzyme isoleacute de reacutetrovirus (mais existant eacutegalement ailleurs que dans lesreacutetrovirus) qui permet de fabriquer un ADNc agrave partir drsquoun ARNmLa RT est une ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo ayant les caracteacuterisiques suivantes

-elle est ARN deacutependante

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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-coupure donnant des laquo extreacutemiteacutes adheacutesives raquo (ou laquo bouts collants raquo) drsquoautres types drsquoenzymes agissent en coupant de part et drsquoautre ducentre de symeacutetrie

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Un enzyme de restriction est donc capable de repeacuterer sur toute la longueurdrsquoun ADN certaines seacutequences caracteacuteristiques Si cette seacutequence se trouvecinq fois dans une moleacutecule drsquoADN lrsquoenzyme coupera cet ADN en cescinq endroits ce qui donnera cinq fragments drsquoADN Donc selon lrsquoenzymeutiliseacute un mecircme ADN sera coupeacute diffeacuteremment

La DNaseLa DNase utiliseacutee au laboratoire est geacuteneacuteralement drsquoorigine bovine(pancreacuteas) Crsquoest une endonucleacutease qui possegravede la prooprieacuteteacute decouper une moleacutecule drsquoADN double brin au hasard engendrantainsi des fragments drsquoADN double brin

La nucleacutease S1La nucleacutease S1 (isoleacutee drsquoun champignon Aspergillus oryzae)nrsquoattaque que lrsquoADN simple brin Sont donc eacutepargneacutes (agrave conditionsde ne pas utiliser de grandes quantiteacutes drsquoenzyme) lrsquoADN doublebrin et les hybrides ADNARN

Les exonucleacuteasesLes exonucleacuteases grignotent les extreacutemiteacutes libres des moleacuteculesdrsquoADN en libeacuterant des nucleacuteotides Par exemple lrsquoexonucleacutease IIIhydrolyse seacutequentiellement les extreacutemiteacutes 3rsquo libres des moleacuteculesdrsquoADN dans le sens 3rsquo vers 5rsquo

Les enzymes qui ligaturent les ligasesPour lier souder deux fragments drsquo ADN on utilise une ligase enpreacutesence Il est plus facile de liguer deux fragments agrave extreacutemiteacutescoheacutesives que deux fragments agrave coupure franche La ligase choisie esten geacuteneacuteral la ligase du virus T4 (extraite de bacteacuteries infecteacutees par levirus T4)Lorsqursquoil existe une coupure (nick) drsquoun des deux brins drsquoune moleacuteculedrsquoADN double brin la ligase est eacutegalement capable drsquoeffectuer uneligation entre les deux nucleacuteotides adjacents seacutepareacutes par une bregraveche

Les enzymes qui deacutephosphorylent les phosphatasesLes phosphatases catalysent lrsquoeacutelimination drsquoun groupement phosphateen 5rsquo drsquoune chaine drsquoADNIl est courant de deacutephosphoryler un vecteur que lrsquoon vient drsquoouvrir parun enzyme de restriction afin drsquoeacuteviter une refermeture de ce vecteur(auto-ligation) qui empecirccherait alors drsquoinseacuterer le fragment drsquoADN agraveeacutetudier

Les enzymes qui phosphorylent les kinasesLes kinases permettent le transfert drsquoun groupement phosphate agrave partirdrsquoune moleacutecule drsquoATP Il srsquoagit du phosphate en position gamma (le

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plus externe des trois groupements fixeacutes sur lrsquoAdeacutenosine) Il seratransfeacutereacute agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo drsquoun ADN deacutephosphoryleacute

Les enzymes qui laquo recopient raquo un acide nucleacuteiqueLa copie drsquoune chaine drsquoacides nucleacuteiques qursquoil srsquoagisse de syntheacutetiserune chaine drsquoADN ou drsquoARN srsquoeffectue de maniegravere compleacutementaire etantiparallegravele (lrsquoaddition des nouveaux nucleacuteotides se faisant dans lesens 5rsquophosphate vers 3rsquo OH)

ADN-ADNLes ADN polymeacuterases syntheacutetisent une chaine drsquoADN agrave partirdrsquoun modegravele En effet une ADN polymeacuterase nrsquoest pas capablede commencer une chaine drsquoacides nucleacuteiques Il est neacutecessairedrsquoapporter dans le milieu reacuteactionnel une amorce drsquoacidenucleacuteique

- ADN polymeacuterase I et enzyme de Klenow

LrsquoADN polymeacuterase habituellement utiliseacutee est lrsquoADN polymeacuterase drsquoE coli Elle estconstitueacutee drsquoune seule chaine peptidique et possegravede trois activiteacutes enzymatiques

-une activiteacute de synthegravese ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo-une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 3rsquo-5rsquo expliquant ses proprieacuteteacutesdrsquoenzyme laquo agrave fonction drsquoeacutedition raquo -une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 5rsquo-3rsquo

Lrsquoenzyme de Klenow est un enzyme tregraves souvent utiliseacute au laboratoire il est obtenu agravepartir de lrsquoADN polymeacuterase I drsquoougrave lrsquoon a eacutelimineacute clivage avec une proteacutease le petitfragment responsable de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 5rsquo-3rsquo Il ne reste donc plus que lesactiviteacutes polymeacuterase 5rsquo-3rsquo et exonucleacutease 3rsquo-5rsquo (fonction drsquoeacutedition)La suppression de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo permet drsquoaugmenter la processiviteacute dela polymeacuterase ce qui permet de syntheacutetiser des fragments de grande longueur

- Les ADN polymeacuterases thermoreacutesistantesLa Taq polymeacuterase a eacuteteacute la premiegravere agrave ecirctre identifieacutee Crsquoest une ADN polymeacuteraseisoleacutee des bacteacuteries vivant dans les sources drsquoeau chaude Elle agit agrave une tempeacuteraturevoisine de 65degc Cette proprieacuteteacute trouvera son utiliteacute dans les reacuteactions ougrave il faut utiliserune ADN polymeacuterase thermostable comme dans la polymerase chain restriction PCR(reacuteaction drsquoamplification drsquoADN)Elle peut aussi ecirctre utiliseacutee dans les techniques de seacutequenccedilages de lrsquoADN car ellepermet de travailler agrave tempeacuterature eacuteleveacutee donc drsquoabolir les structures secondaires

ARN-ADN

- La reacutetrotranscriptase laquo RT raquo (ou transcriptase reverse)La RT est un enzyme isoleacute de reacutetrovirus (mais existant eacutegalement ailleurs que dans lesreacutetrovirus) qui permet de fabriquer un ADNc agrave partir drsquoun ARNmLa RT est une ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo ayant les caracteacuterisiques suivantes

-elle est ARN deacutependante

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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Un enzyme de restriction est donc capable de repeacuterer sur toute la longueurdrsquoun ADN certaines seacutequences caracteacuteristiques Si cette seacutequence se trouvecinq fois dans une moleacutecule drsquoADN lrsquoenzyme coupera cet ADN en cescinq endroits ce qui donnera cinq fragments drsquoADN Donc selon lrsquoenzymeutiliseacute un mecircme ADN sera coupeacute diffeacuteremment

La DNaseLa DNase utiliseacutee au laboratoire est geacuteneacuteralement drsquoorigine bovine(pancreacuteas) Crsquoest une endonucleacutease qui possegravede la prooprieacuteteacute decouper une moleacutecule drsquoADN double brin au hasard engendrantainsi des fragments drsquoADN double brin

La nucleacutease S1La nucleacutease S1 (isoleacutee drsquoun champignon Aspergillus oryzae)nrsquoattaque que lrsquoADN simple brin Sont donc eacutepargneacutes (agrave conditionsde ne pas utiliser de grandes quantiteacutes drsquoenzyme) lrsquoADN doublebrin et les hybrides ADNARN

Les exonucleacuteasesLes exonucleacuteases grignotent les extreacutemiteacutes libres des moleacuteculesdrsquoADN en libeacuterant des nucleacuteotides Par exemple lrsquoexonucleacutease IIIhydrolyse seacutequentiellement les extreacutemiteacutes 3rsquo libres des moleacuteculesdrsquoADN dans le sens 3rsquo vers 5rsquo

Les enzymes qui ligaturent les ligasesPour lier souder deux fragments drsquo ADN on utilise une ligase enpreacutesence Il est plus facile de liguer deux fragments agrave extreacutemiteacutescoheacutesives que deux fragments agrave coupure franche La ligase choisie esten geacuteneacuteral la ligase du virus T4 (extraite de bacteacuteries infecteacutees par levirus T4)Lorsqursquoil existe une coupure (nick) drsquoun des deux brins drsquoune moleacuteculedrsquoADN double brin la ligase est eacutegalement capable drsquoeffectuer uneligation entre les deux nucleacuteotides adjacents seacutepareacutes par une bregraveche

Les enzymes qui deacutephosphorylent les phosphatasesLes phosphatases catalysent lrsquoeacutelimination drsquoun groupement phosphateen 5rsquo drsquoune chaine drsquoADNIl est courant de deacutephosphoryler un vecteur que lrsquoon vient drsquoouvrir parun enzyme de restriction afin drsquoeacuteviter une refermeture de ce vecteur(auto-ligation) qui empecirccherait alors drsquoinseacuterer le fragment drsquoADN agraveeacutetudier

Les enzymes qui phosphorylent les kinasesLes kinases permettent le transfert drsquoun groupement phosphate agrave partirdrsquoune moleacutecule drsquoATP Il srsquoagit du phosphate en position gamma (le

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plus externe des trois groupements fixeacutes sur lrsquoAdeacutenosine) Il seratransfeacutereacute agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo drsquoun ADN deacutephosphoryleacute

Les enzymes qui laquo recopient raquo un acide nucleacuteiqueLa copie drsquoune chaine drsquoacides nucleacuteiques qursquoil srsquoagisse de syntheacutetiserune chaine drsquoADN ou drsquoARN srsquoeffectue de maniegravere compleacutementaire etantiparallegravele (lrsquoaddition des nouveaux nucleacuteotides se faisant dans lesens 5rsquophosphate vers 3rsquo OH)

ADN-ADNLes ADN polymeacuterases syntheacutetisent une chaine drsquoADN agrave partirdrsquoun modegravele En effet une ADN polymeacuterase nrsquoest pas capablede commencer une chaine drsquoacides nucleacuteiques Il est neacutecessairedrsquoapporter dans le milieu reacuteactionnel une amorce drsquoacidenucleacuteique

- ADN polymeacuterase I et enzyme de Klenow

LrsquoADN polymeacuterase habituellement utiliseacutee est lrsquoADN polymeacuterase drsquoE coli Elle estconstitueacutee drsquoune seule chaine peptidique et possegravede trois activiteacutes enzymatiques

-une activiteacute de synthegravese ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo-une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 3rsquo-5rsquo expliquant ses proprieacuteteacutesdrsquoenzyme laquo agrave fonction drsquoeacutedition raquo -une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 5rsquo-3rsquo

Lrsquoenzyme de Klenow est un enzyme tregraves souvent utiliseacute au laboratoire il est obtenu agravepartir de lrsquoADN polymeacuterase I drsquoougrave lrsquoon a eacutelimineacute clivage avec une proteacutease le petitfragment responsable de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 5rsquo-3rsquo Il ne reste donc plus que lesactiviteacutes polymeacuterase 5rsquo-3rsquo et exonucleacutease 3rsquo-5rsquo (fonction drsquoeacutedition)La suppression de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo permet drsquoaugmenter la processiviteacute dela polymeacuterase ce qui permet de syntheacutetiser des fragments de grande longueur

- Les ADN polymeacuterases thermoreacutesistantesLa Taq polymeacuterase a eacuteteacute la premiegravere agrave ecirctre identifieacutee Crsquoest une ADN polymeacuteraseisoleacutee des bacteacuteries vivant dans les sources drsquoeau chaude Elle agit agrave une tempeacuteraturevoisine de 65degc Cette proprieacuteteacute trouvera son utiliteacute dans les reacuteactions ougrave il faut utiliserune ADN polymeacuterase thermostable comme dans la polymerase chain restriction PCR(reacuteaction drsquoamplification drsquoADN)Elle peut aussi ecirctre utiliseacutee dans les techniques de seacutequenccedilages de lrsquoADN car ellepermet de travailler agrave tempeacuterature eacuteleveacutee donc drsquoabolir les structures secondaires

ARN-ADN

- La reacutetrotranscriptase laquo RT raquo (ou transcriptase reverse)La RT est un enzyme isoleacute de reacutetrovirus (mais existant eacutegalement ailleurs que dans lesreacutetrovirus) qui permet de fabriquer un ADNc agrave partir drsquoun ARNmLa RT est une ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo ayant les caracteacuterisiques suivantes

-elle est ARN deacutependante

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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plus externe des trois groupements fixeacutes sur lrsquoAdeacutenosine) Il seratransfeacutereacute agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo drsquoun ADN deacutephosphoryleacute

Les enzymes qui laquo recopient raquo un acide nucleacuteiqueLa copie drsquoune chaine drsquoacides nucleacuteiques qursquoil srsquoagisse de syntheacutetiserune chaine drsquoADN ou drsquoARN srsquoeffectue de maniegravere compleacutementaire etantiparallegravele (lrsquoaddition des nouveaux nucleacuteotides se faisant dans lesens 5rsquophosphate vers 3rsquo OH)

ADN-ADNLes ADN polymeacuterases syntheacutetisent une chaine drsquoADN agrave partirdrsquoun modegravele En effet une ADN polymeacuterase nrsquoest pas capablede commencer une chaine drsquoacides nucleacuteiques Il est neacutecessairedrsquoapporter dans le milieu reacuteactionnel une amorce drsquoacidenucleacuteique

- ADN polymeacuterase I et enzyme de Klenow

LrsquoADN polymeacuterase habituellement utiliseacutee est lrsquoADN polymeacuterase drsquoE coli Elle estconstitueacutee drsquoune seule chaine peptidique et possegravede trois activiteacutes enzymatiques

-une activiteacute de synthegravese ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo-une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 3rsquo-5rsquo expliquant ses proprieacuteteacutesdrsquoenzyme laquo agrave fonction drsquoeacutedition raquo -une activiteacute de deacutegradation exonucleacutease 5rsquo-3rsquo

Lrsquoenzyme de Klenow est un enzyme tregraves souvent utiliseacute au laboratoire il est obtenu agravepartir de lrsquoADN polymeacuterase I drsquoougrave lrsquoon a eacutelimineacute clivage avec une proteacutease le petitfragment responsable de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 5rsquo-3rsquo Il ne reste donc plus que lesactiviteacutes polymeacuterase 5rsquo-3rsquo et exonucleacutease 3rsquo-5rsquo (fonction drsquoeacutedition)La suppression de lrsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo permet drsquoaugmenter la processiviteacute dela polymeacuterase ce qui permet de syntheacutetiser des fragments de grande longueur

- Les ADN polymeacuterases thermoreacutesistantesLa Taq polymeacuterase a eacuteteacute la premiegravere agrave ecirctre identifieacutee Crsquoest une ADN polymeacuteraseisoleacutee des bacteacuteries vivant dans les sources drsquoeau chaude Elle agit agrave une tempeacuteraturevoisine de 65degc Cette proprieacuteteacute trouvera son utiliteacute dans les reacuteactions ougrave il faut utiliserune ADN polymeacuterase thermostable comme dans la polymerase chain restriction PCR(reacuteaction drsquoamplification drsquoADN)Elle peut aussi ecirctre utiliseacutee dans les techniques de seacutequenccedilages de lrsquoADN car ellepermet de travailler agrave tempeacuterature eacuteleveacutee donc drsquoabolir les structures secondaires

ARN-ADN

- La reacutetrotranscriptase laquo RT raquo (ou transcriptase reverse)La RT est un enzyme isoleacute de reacutetrovirus (mais existant eacutegalement ailleurs que dans lesreacutetrovirus) qui permet de fabriquer un ADNc agrave partir drsquoun ARNmLa RT est une ADN polymeacuterase 5rsquo-3rsquo ayant les caracteacuterisiques suivantes

-elle est ARN deacutependante

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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-elle est deacutepourvue drsquoactiviteacute exonucleacutease 3rsquo-5rsquo et est donc deacutenueacutee de fonctiondrsquoeacutedition elle est ainsi encline aux erreurs -elle possegravede une activiteacute RNase

Elle permet de syntheacutetiser le premier brin de lrsquoADNc (ADN double brin) agrave partir drsquounARNm Une amorce oligo (dT) qui srsquohybrideront au poly (A) de lrsquoARNm et permettradrsquoinitier lrsquoaction de la RT qui syntheacutetisera une copie compleacutementaire de lrsquoARNmjusqursquoagrave son extreacutemiteacuteUne reacuteaction tregraves utile se produit agrave la fin de la copie de lrsquoARNm La RT provoque leretournement de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du transcrit sur lui-mecircme Elle laquo tourne le coin raquo et estprecircte agrave recopier son propre travail ce qui creacutee une eacutepingle agrave cheveu de 10 agrave 20 bpSeules quelques bases agrave la toute extreacutemiteacute de la boucle ne sont pas apparieacutees

ADN-ARN

- LrsquoARN polymeacuteraseLrsquoARN polymeacuterase est utiliseacute pour effectuer des transcriptions in vitro Il est capable

de commencer une chaine

1-2-2- Les vecteurs

Les vecteurs sont des petites moleacutecules drsquoADN dans lesquels on insegravere lefragment drsquoADN agrave eacutetudier Ces petits ADN sont geacuteneacuteralement des virusbacteacuteriens (bacteacuteriophages) ou des plasmides Ils possegravedent dans leurgeacutenome les signaux neacutecessaires pour leur reacuteplication mais ils ne saventpas se multiplier seuls Ils doivent ecirctre introduits dans des cellules hocirctes(bacteacuteries par exemple)

Les bacteacuteriophages

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

13

seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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Deux phages ont eacuteteacute tregraves utiliseacutes comme vecteurs dans les premierstemps de la biologie moleacuteculaire Ce sont les phages λ (lambda) et lephage M13 ou plus exactement des deacuteriveacutes de ces deux phages quidoivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir ecirctreutiliseacutes comme vecteurs de clonage Le premier garde certainesapplications en particulier dans la construction des banquesgeacutenomiques et le second nrsquoest plus guegravere utiliseacute

- Le phage λ (lambda)

Plusieurs vecteurs sont deacuteriveacutes du phage λ et peuvent ecirctre utiliseacutes dans desconstructions geacuteneacutetiques essentiellement pour la constitution de banquesdrsquoADNc ougeacutenomiquesOn distingue deux parties dans le phage λ

-la tecircte du phage qui renferme lrsquoADN -la queue du phage qui permettra au virus de se fixer sur la cellule hocircte

bacteacuterienneLe phage λ est un phage agrave ADN double brin lineacuteaire drsquoune longueur de 485 Kb Ilcomprend plusieurs dizaines de gegravenes et se multiplie dans les bacteacuteries selon deuxmodes possibles appeleacutes lytique et lysogeacuteniqueLrsquoADN du phage λ naturel non modifieacute dit laquosauvage raquo contient plusieurs sites derestriction identiques il nrsquoest donc pas envisageable drsquoy inseacuterer un fragment drsquoADNqui risque drsquoecirctre couper avec drsquoautres fragments Donc les vecteurs λ modifieacutescontiennent des sites de restriction muteacutes

- Le phage M13

M13 est un bacteacuteriophage speacutecifique drsquoEcoli dont le geacutenome apregraves avoir eacuteteacutemodifieacute a eacuteteacute tregraves utiliseacute pour sous-cloner de petits fragments drsquoADNM13 est constitueacute drsquoun simple brin drsquoADN circulaire drsquoune longueur drsquoenviron 64Kb appeleacute (+) par convention Cet ADN comprend dix gegravenesLrsquoinfection drsquoune bacteacuterie Ecoli par M13 srsquoeffectue via le pilus sexuel codeacute par unplasmide F (F pour facteur de fertiliteacute) que lrsquoon trouve seulement chez les bacteacuteriesmacircles

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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A la diffeacuterence du phage λ lrsquoADN du phage nrsquoa pas de longueur limiteacutee et lesparticules phagiques sont produites sans lyse de la bacteacuterieDivers modifications ont eacuteteacute apporteacutes au phage M13 sauvage afin drsquoen faire unvecteur de clonage efficace introduction drsquoun polylinkerQursquoes qursquoun polylinker Crsquoest un petit fragment nucleacuteotidique double brinsyntheacutetiseacute chimiquement introduit dans un vecteur (phage ou plasmide) afin drsquooffrirtout un choix de sites de restriction uniques cest-agrave-dire tous diffeacuterents les uns desautres et nrsquoexistant pas par ailleurs dans ce vecteur Grace au polylinker introduit dansla forme reacuteplicative du phage M13 un fragment drsquoADN eacutetranger preacutepareacute avec unenzyme de restriction reconnaissant un site du polylinker pourra donc ecirctre inseacutereacute ausite voulu

Les plasmidesLes plasmides repreacutesentent un autre type de vecteurs que les phages etsont eacutegalement utiliseacutes Ce sont de petits fragments drsquoADN circulairedouble brin que lrsquoon trouve dans certaines bacteacuteries en dehors duchromosome Ils se reacutepliquent gracircce agrave des enzymes dans la bacteacuterieSelon les types de plasmide le nombre de plasmides par bacteacuterie varieCertains plasmides ne sont preacutesents que sous forme drsquoune seule copie(car ils se reacutepliquent une seule fois agrave chaque division cellulaire)Drsquoautres sont au contraire en plus grand nombre 15 agrave 20 (car ils sereacutepliquent plusieurs fois par cycle cellulaire)On utilise au laboratoire des plasmides artificiels creacuteeacutes agrave partir deplasmides naturels auxquels certaines seacutequences ont eacuteteacute ajouteacutees Laplupart des plasmides actuels est issue des plasmides pBR322 et de laseacuterie pUC

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

11

Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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- pBR322pBR322 est un plasmide qui possegravede deux gegravenes de reacutesistance lrsquoun agrave lrsquoampicillinelrsquoautre agrave la teacutetracycline Lrsquoinsertion drsquoun ADN eacutetranger pouvait se faire dans lrsquoun oulrsquoautre de ces deux sites Seule persistait la reacutesistance agrave lrsquoantibiotique due agrave celui desdeux gegravenes nrsquoayant pas reccedilu lrsquoinsert ce qui permettait ainsi une seacutelection desplasmides recombinants

- pUCpUC (plasmid of University of California) est un plasmide de 269 Kb dont lescaracteacuteristiques sont comparables agrave celles de M13 mp18

- BluescriptBluescript nrsquoest pas agrave proprement dit un plasmide mais un phagmide Crsquoest un vecteurartificiel hybride phage filamenteux-plasmide qui combine lrsquoavantage des phagesM13 (reacutecupeacuteration possible drsquoADN sous forme simple brin) et celui des plasmides(possibiliteacute drsquoobtenir un insert double brin plus long et plus stable) Ses proprieacuteteacutes dephage filamenteux ont eacuteteacute oublieacutees avec le temps et la disparition de lrsquoutilisation delrsquoADN simple brin Seules les proprieacuteteacutes de plasmide en font aujourdrsquohui le vecteur declonage le plus utiliseacute

Les cosmidesLes cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides plasmide-phage λLrsquoavantage des cosmides est qursquoil est possible de cloner de plus grandsfragments drsquoADN eacutetranger (35 agrave 45 Kb) qursquoavec les vecteurs deacuteriveacutes duphage λ (23 Kb maximum) Ils servent agrave fabriquer des banquesgeacutenomiques et sont utiliseacutes plus speacutecialement lorsque le gegravene eacutetudieacutesrsquoeacutetend par exemple sur une longueur de 30 agrave 40 KbAinsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 Kb peutrecevoir un ADN eacutetranger de 33 agrave 47 Kb Donc un cosmide

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

12

-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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-entre dans Ecoli comme un phage λ -srsquoy multiplie comme un plasmide

Les cosmides sont des plasmides posseacutedant des sites de restriction ougravelrsquoon peut inseacuterer lrsquoADN eacutetranger Ils renferment eacutegalement un gegravene dereacutesistance agrave lrsquoampicilline

Les banques YAC et BAC (yeast or bacterial artificial chromosome)Il est maintenant possible de cloner de grands fragments drsquoADN longsde 200 agrave 500 Kb voire plus sous forme de chromosomes artificielsdans la levure ou dans la bacteacuterieLe principe de cette technique consiste agrave doter les grands fragmentsdrsquoADN agrave cloner des eacuteleacutements neacutecessaires pour que la levure ou labacteacuterie les reacuteplique comme srsquoil srsquoagissait de ses propres chromosomes

1-2-3- Les cellules-hocirctes

La cellule-hocircte destineacutee agrave recevoir le vecteur phage ou plasmide (oucosmide) doit reacutepondre agrave certaines conditions

Choix de la soucheUne des premiegraveres conditions est que la souche drsquoE coli choisie ne soitpas pathogegravene pour lrsquohomme Crsquoest le cas par exemple des souches Ecoli K12 Ces souches ont la particulariteacute de ne pas coloniser lrsquoappareildigestif humain Mais elles syntheacutetisent lrsquoenzyme de restriction EcoK(enzyme de type I qui reconnait le site AAC et GTGC) Il faut utiliserdes souches deacuteriveacutees ne syntheacutetisant pas lrsquoenzyme de restriction EcoK(ou qui modifient les sites EcoK) sinon tout ADN agrave eacutetudier posseacutedantun site EcoK serait cliveacute

Croissance en milieu liquide

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Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

11

Apregraves une phase initiale de latence la croissance drsquoE coli estexponentielle le nombre de bacteacuterie double toutes les 20 minutesLorsque le substrat et lrsquooxygegravene ne sont plus en conditions optimales lacroissance ralentit Puis la culture entre en phase stationnaire lesbacteacuteries meurent aussi vite qursquoelles se divisent Finalement crsquoest lamort cellulaire

Distinction entre infection transformation et transfection

- InfectionDans lrsquoinfection la bacteacuterie est mise en contact avec le virusLrsquoinfection par le phage λ en phase lytique se traduit par lrsquoapparition de plages delyse Lrsquoinfection par le phage M13 (ou par le virus λ en phase lysogeacutenique) aboutira agravedes colonies bacteacuteriennes contenant ces virus

- TransformationLa transformation consiste agrave mettre en contact un ADN double brin (plasmide) et lesbacteacuteries preacutetraiteacutees (on dit compeacutetentes) Dans ces conditions lrsquoADN peacuteneacutetrera dansles bacteacuteries et pourra srsquoy reacutepliquer

- TransfectionLa transfection enfin concerne essentiellement les cellules de mammifegraveres et serapproche de la transformation des bacteacuteries Elle consiste agrave faire entrer dans lescellules un ADN double brin soit en fragilisant la membrane plasmique(eacutelectroporation agents chimiques) soit en incluant lrsquoADN dans des goutteletteslipidiques (liposomes) qui seront internaliseacutees par les cellules (lipofection) soit encoreen formant avec lrsquoADN un preacutecipiteacute de phosphate de calcium qui entrera dans lescellules

1-2-4- Les sondes nucleacuteiques

Caracteacuteristiques des sondes

Les sondes nucleacuteiques sont des segments drsquoacides nucleacuteiques que lrsquoonutilise pour repeacuterer de maniegravere speacutecifique dans une reacuteactiondite laquo drsquohybridation moleacuteculaire raquo le fragment drsquoacide nucleacuteique auquelon srsquointeacuteresseUne sonde possegravede les caracteacuteristiques suivantes -crsquoest un segment drsquoacide nucleacuteique (ADN ou ARN) nrsquoayantobligatoirement qursquoun brin elle peut ecirctre plus ou moins longue selon lescas et peut ne posseacuteder qursquoune vingtaine de nucleacuteotides (sondeoligonucleacuteotidique) ou plusieurs centaines de nucleacuteotides -elle est compleacutementaire et antiparallegravele du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaitre cette reconnaissance pouvant se faire entre ADN-ADN (ouADN-ARN ou ARN-ARN) bien eacutevidemment dans cette reacuteactiondrsquohybridation moleacuteculaire il faut que les acides nucleacuteiques agrave reconnaicirctresoient eacutegalement sous forme monobrin

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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-la sonde peut couvrir tout ou une partie du segment drsquoacide nucleacuteique agravereconnaicirctre elle est capable de deacutetecter sa copie compleacutementaire parmides milliers de fragments drsquoADN ou drsquoARN diffeacuterents-une sonde doit ecirctre repeacuterable des sondes radioactives sont le plussouvent utiliseacutees il est ainsi facile de repeacuterer lrsquoemplacement de cettesonde et par conseacutequent le clone agrave identifier qui se sera hybrideacute avec cettesonde

Hybridation moleacuteculaire Stringence

Lrsquoutilisation de sondes drsquoacides nucleacuteiques repose bien entendu sur lacompleacutementariteacute des deux brins drsquoADN qui peuvent ecirctre dans certainescirconstances dissocieacutes puis reacuteassocieacutes avec la sonde repeacuterableSi lrsquoon chauffe de lrsquoADN il se produit agrave une certainetempeacuterature laquo tempeacuterature de fusion raquo une rupture des liaisons hydrogegraveneentre les bases La double heacutelice se deacutefait les deux brins se seacuteparent ondit que lrsquoADN est deacutenatureacute Plus il y a de bases C G dans un ADN plusla tempeacuterature de fusion sera eacuteleveacutee Ceci se comprend aiseacutement eacutetantdonneacute que les bases C G sont relieacutees par trois liaisons hydrogegravene alorsque les bases A T ne sont relieacutees que par deux liaisons hydrogegraveneLa deacutenaturation de lrsquoADN est reacuteversible quand la tempeacuterature estabaisseacutee progressivement les deux brins drsquoADN peuvent srsquohybrider agravenouveau cest-agrave-dire se rapprocher selon les regravegles de compleacutementariteacute debases (renaturation) Drsquoougrave la neacutecessiteacute de refroidir brusquement pourmaintenir une deacutenaturation souhaiteacutee Cette hybridation est mise agrave profitpour identifier la seacutequence drsquointeacuterecirct lrsquointroduction de moleacutecules drsquoADNmarqueacute (sonde) dans la mixture de seacutequences drsquoADN deacutenatureacuteespermettra lrsquohybridation de la sonde avec la seacutequence rechercheacutee

Obtention drsquoune sonde

Toute la difficulteacute consiste bien eacutevidemment agrave obtenir une sondespeacutecifique de lrsquoADN agrave eacutetudier Plusieurs possibiliteacutes existent Peuvent ecirctreutiliseacutees comme sonde les moleacutecules ci-dessous

ADNcLrsquoADNc constitue une excellente sonde En pratique on utilise le plussouvent un fragment de restriction cloneacute couvrant la plus grande partiepossible de lrsquoADNc Encore faut-il avoir pu construire lrsquoADNccorrespondant ce qui nrsquoest pas toujours le cas surtout lorsque lrsquoondeacutebute lrsquoeacutetude drsquoun gegravene

ARNmLrsquoARNm peut eacutegalement servir de sonde mais cette fois encore on nedispose pas toujours de lrsquoARNm speacutecifique

Oligonucleacuteotides de synthegravese- Si la seacutequence de lrsquoADN nrsquoest pas connue il faut purifier une petite

quantiteacute de la proteacuteine correspondant au gegravene eacutetudieacute deacuteterminer la

13

seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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seacutequence des acides amineacutes drsquoun court segment de cette proteacuteine ondeacuteduire drsquoapregraves le code geacuteneacutetique la seacutequence de segment drsquoADNcorrespondant et syntheacutetiser alors de court sondes drsquoADN On peutimaginer les difficulteacutes rencontreacutees lorsque le segment proteacuteique seacutequenceacutecontient des acides amineacutes tels que Leu Ser ouArg codeacutes par six codonsdiffeacuterents Il faut alors syntheacutetiser tout un ensemble de ces courtes sondesdrsquoADN afin de couvrir toutes les possibiliteacutes

- Si la seacutequence drsquoune partie drsquoADN agrave repeacuterer est connue il devient alorsbeaucoup plus facile de syntheacutetiser une sonde drsquoune vingtaine denucleacuteotides Il existe des appareils automatiques (laquo syntheacutetiseursdrsquooligonucleacuteotides raquo) qui permettent drsquoassembler jusqursquoagrave une centaine denucleacuteotides dans lrsquoordre souhaiteacute

2- Quelques techniques geacuteneacuterales de biologie moleacuteculaire

2-1- PCR

Lamplification en chaicircne par polymeacuterase ou reacuteaction en chaicircne par polymeacuterase (PCR estlabreacuteviation anglaise de polymerase chain reaction lacronyme franccedilais ACP pour

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Amplification en Chaicircne par Polymeacuterisation est tregraves rarement employeacute) est une meacutethode debiologie moleacuteculaire damplification geacutenique in vitro qui permet de copier en grand nombre(avec un facteur de multiplication de lordre du milliard) une seacutequence dADN ou dARNconnue agrave partir dune faible quantiteacute (de lordre de quelques picogrammes) dacide nucleacuteique(seacutequence speacutecifique drsquoADN (lrsquoAmplicon) ou amorces speacutecifiques constitueacuteesdoligonucleacuteotides de synthegravese de 20 agrave 25 nucleacuteotides) Cette technique permet entre autres dedeacutetecter la preacutesence du virus VIH ou de mesurer la charge virale (concentration du virus dansle plasma) des OGM (organismes geacuteneacutetiquement modifieacutes) des virus des heacutepatites B C et DDe plus en plus utiliseacutee en criminalistique cette technique est baseacutee sur la combinaison dedeux facteurs

Les proprieacuteteacutes de synthegravese enzymatique et drsquoinitiation speacutecifique agrave lADN double brinsspeacutecifique des ADN polymeacuterases deacutependantes agrave lADN thermostables

Les proprieacuteteacutes drsquohybridation et de deshybridation des brins compleacutementaires drsquoADNen fonction de la tempeacuterature

2-2- Southern blot

Un transfert dADN est une meacutethode de biologie moleacuteculaire permettant lanalyse delADN Elle a eacuteteacute inventeacutee par Edwin Southern un professeur britannique de biologiemoleacuteculaire Cest ce nom qui a par jeu de mot inspireacute lappellation de deux autrestechniques Western blot et Northern blot

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Nous partons des fragments dADN obtenus par les enzymes de restriction On vaappliquer la technique du transfert de Southern pour fixer les sondes aux fragments leurcorrespondant une sonde eacutetant un fragment dADN auquel on a marqueacute une base gracircce agrave descomposeacutes radioactifs fluorescents ou un anticorps qui sert agrave localiser une seacutequence de lADNqui nous inteacuteresse Le transfert de Southern sert donc agrave repeacuterer des fragments dADN Dunefaccedilon plus geacuteneacuterale ces fragments obtenus vont preacutesenter des polymorphismes de restrictionUn polymorphisme de restriction est une variation individuelle de la seacutequence des bases dugeacutenome des eucaryotes modifiant un ou plusieurs sites de restriction Donc cespolymorphismes de restriction (mutations) vont dans les faits ecirctre inteacuteressants pourdeacuteterminer des variations geacuteniques des tests de paterniteacute par exemple

2-3- Northern blot

Elle deacuterive du Southern blot sauf quau lieu deacutetudier de lADN on eacutetudie de lARN LARNva ecirctre analyseacute par eacutelectrophoregravese et deacutetecteacute par une sonde Une diffeacuterence du proceacutedeacute parrapport au transfert de Southern est lutilisation de formaldeacutehyde dans le gel deacutelectrophoregravese

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comme deacutenaturant parce que le traitement dhydroxyde de sodium utiliseacute en transfert desouthern deacutegraderait lARN Comme dans le transfert de Southern la sonde dhybridation peutecirctre faite agrave partir dADN ou dARN

2-4- RFLP

En biologie moleacuteculaire le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (ouRFLP de langlais restriction fragment length polymorphism) est utiliseacute dans deux sens

comme une caracteacuteristique des moleacutecules dADN permettant de les distinguer les unesdes autres

comme la technique de laboratoire qui utilise cette caracteacuteristique pour diffeacuterencier oucomparer des moleacutecules dADN Cette technique est utiliseacutee pour la reacutealisationdempreintes geacuteneacutetiques et dans les tests de paterniteacute

LADN dun individu ou dune cellule est dabord extrait et purifieacute LADN purifieacute peutecirctre amplifieacute par PCR LADN est ensuite coupeacute en fragments de restriction par une enzymede restriction cette derniegravere coupant lADN au niveau dune seacutequence qui lui est speacutecifique(site de restriction) Les fragments dADN ainsi obtenus nommeacutes fragments de restrictionsont ensuite seacutepareacutes selon leur longueur par eacutelectrophoregravese sur gel dagarose Le gel obtenuest ensuite analyseacute par Southern Blotting et reacuteveacuteleacute avec une ou plusieurs sondes

La distance entre deux sites de coupure de lenzyme de restriction (site de restriction)varie selon les individus (du fait du polymorphisme des individus) de ce fait la longueur desfragments de restriction varie Les positions de certaines bandes dADN (sur le geldeacutelectrophoregravese) seront donc diffeacuterentes dun individu agrave lautre Le polymorphisme existantentre individus dune mecircme espegravece peut ecirctre ainsi visualiseacute gracircce au polymorphisme de leurADN Cette technique permet de mettre en eacutevidence les particulariteacutes dun individu Ellepermet eacutegalement de montrer les relations geacuteneacutetiques qui peuvent exister entre individus dufait de la transmission des caractegraveres geacuteneacutetiques de parents agrave enfant La technique esteacutegalement utiliseacutee pour eacutetudier les relations entre diffeacuterentes espegraveces