Print Tesina Nadia Jocelyn Talamantes Morales

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y

TECNOLOGÍA AVANZADA UNIDAD QUERÉTARO ESTABLECIMIENTO DE UNA COLECCIÓN DE LEVADURAS CON ELEVADA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE LA FERMENTACIÓN DE MAÍZ MALTEADO

TESINA

Para obtener el grado de Especialidad en Tecnología Avanzada

PRESENTA

Nadia Jocelyn Talamantes Morales

Director de tesina

Dra. Regina Hernández Gama

Querétaro, Querétaro; Diciembre 2018.


5

ÍNDICE Página

Índice I

Índice de cuadros II

Índice de figuras III

Resumen IV

Summary V

1. INTRODUCCIÓN 10

2. MARCO TEÓRICO 11

3. OBJETIVO GENERAL 12

Objetivos específicos

4. HIPÓTESIS 12

5. METODOLOGÍA 12

6. RESULTADOS 18

7. DISCUSIÓN 41

8. CONCLUSIONES 44

9. REFERENCIAS 46

10. PRODUCTOS 49


6

ÍNDICE DE FIGURAS Número Figura

Página

1 Morfología microscópica de las levaduras obtenidas después del

aislamiento en medio YPD. 24

2 Resultados de la cinética de fermentación para Saccharomyces

cerevisiae Whisky. 25

3 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 1. 26










13 Resultados de la producción de etanol de cada cultivo, durante las

cinéticas de fermentación. 36

14 Cultivos con mayor producción de etanol comparado con la cepa

comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky. 37

15 Cultivos con menor producción de etanol comparado con la cepa

comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky. 38

16 Electroforesis en gel de agarosa de la extracción de ADN. 39

17 Muestras de ADN aplificado a partir de una PCR. 40


7

ÍNDICE DE TABLAS

Número Tabla Página

1 Lista de ingredientes utilizados durante el proceso de elaboración

de bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz. 13

2 Lista de catalizadores utilizados durante el proceso de elaboración

de bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz. 13

3 Lista de frutos utilizados durante el proceso de elaboración de

bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz. 13

4 Lista de bebidas utilizados durante el proceso de elaboración de

bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz. 14

5 Oligonucleótidos. 18

6 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de ingredientes. 19

7 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de catalizadores. 19

8 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de bebidas

artesanales. 20

9 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de la

fermentación de maíz malteado. 21

10 Colección de levaduras. 22

11 Resultados identificación taxonómica. 41


8

RESUMEN En este proyecto se llevó a cabo una búsqueda de levaduras entre 33 muestras

seleccionadas por su aportación durante procesos de elaboración de bebidas

artesanales fermentadas a base de maíz. También se usaron muestras del producto

de la fermentación de 3 variedades de maíz VC-152, FAC-M40 y VC-42 para la

obtención de microorganismos. Cada muestra se inoculó en caldo extracto de maíz (2

g/L de extracto de maíz, 30 µl de amoxicilina, pH a 4.5). Una vez obtenido el

crecimiento microbiano, se realizó tinción Gram para determinar los grupos

microbianos presentes y se sembraron en YPD con varias resiembras hasta obtener

un cultivo puro. Se obtuvo una colección de 10 cultivos de levaduras a las cuales se

comparó su capacidad para producir etanol a través de cinéticas de fermentación de

maíz. El maíz empleado en la fermentación se malteó lavando y germinando el maíz

durante 4 días con hoja de plátano para conservar la humedad. Posteriormente se

realizó una molienda y tratamiento térmico a ebullición constante por 3 h. Al extracto

frío se añadieron enzimas alfa amilasa y beta glucosidasa. La cinética de fermentación

se realizó durante 120 h y se tomaron muestras desde el tiempo 0 h y cada 24 h. Las

muestras se separaron por HPLC para cuantificar el etanol, glucosa, maltosa y

fructosa. Cada cultivo se identificó por técnicas moleculares para lo cual se realizó la

extracción de ADN y se realizó una PCR con oligos ITS1 e ITS4. Se obtuvieron 10

cultivos de levaduras provenientes de maíz blanco 1VC-152, maíz blanco 2VC-152,

maíz morado VC-42, tepache, tejuino 1, tejuino 2, masa, guayaba y piña. Los

productos se secuenciaron por el método de Sanger, seguido de un análisis en BLAST

con la finalidad de establecer su identidad taxonómica.

Al comparar los resultados respecto a una cepa comercial Sacchacomyces cerevisiae

whisky, con 1.4 % de etanol a las 24 h. Se obtuvieron 6 de los 10 cultivos de la

colección de levaduras que produjeron mayor cantidad de etanol que la cepa comercial

de referencia, destacando entre ellas, consorcio 2 obtenida a partir de masa, con 2.7

% de etanol a las 24 h, Meyerozima caribbica 2 obtenida a partir de guayaba, con 4.7

% de etanol a las 72 h y Zygotorulaspora florentina obtenida a partir de tejuino 1, con

3.1 % de etanol a las 72 h.


9

SUMMARY In this project, a yeast search was presented among 33 samples for its contribution

during the process of making traditional fermented beverages based on corn and

samples of the fermentation product of 3 varieties of corn VC-152, FAC-M40 and VC-

42 are also presented for obtaining microorganisms.

Each sample was inoculated into corn extract broth (2 g / L of corn extract, 30 μl of

amoxicillin, pH to 4.5). Once the microbial growth was obtained, Gram stain was

performed to determine the microbial groups present and planted in YPD with several

reseeds until obtaining a pure culture. A collection of 10 yeast cultures was obtained to

which their capacity to produce ethanol was compared through corn fermentation

kinetics. The corn used in the fermentation was malted by washing and germinating the

corn for 4 days with a banana leaf to conserve moisture. Subsequently, grinding and

thermal treatment at constant boiling for 3 h. The enzymes alpha amylase and

glucosidase were added to the cold extract. The fermentation kinetics was carried out

for 120 h and samples were taken from time 0 h and every 24 h. The samples were

separated by HPLC to quantify ethanol, glucose, maltose and fructose. Each culture

was identified by molecular techniques for which DNA extraction was performed and a

PCR was performed with oligos ITS1 and ITS4. We obtained 10 yeast cultures from

white corn 1VC-152, white corn 2VC-152, purple corn VC-42, tepache, tejuino 1, tejuino

2, corn dough, guava and pineapple. The products were sequenced by the Sanger

method, followed by a BLAST analysis in order to establish their taxonomic identity.

When comparing the results with respect to a commercial strain Saccharomyces

cerevisiae whiskey, with 1.4% ethanol at 24 h. Six of the 10 cultures of the yeast

collection were obtained, producing more ethanol than the reference commercial strain,

highlighting among them, consortium 2 obtained from the corn dough, with 2.7%

ethanol at 24 h, Meyerozima caribbica 2 obtained from guava, with 4.7% ethanol at 72

h and Zygotorulaspora florentine obtained from tejuino 1, with 3.1% ethanol at 72 h.


10

INTRODUCCIÓN La fermentación es un proceso bioquímico, que degrada una molécula orgánica para

transformarla en otra más simple. Los procesos más importantes en la industria de

alimentos y bebidas son la fermentación del ácido láctico y del alcohol (Mbajiuka et al.

2015). La fermentación alcohólica se lleva a cabo por hongos levaduriformes

Sacaromycetos y en algunas ocasiones por no Sacaromycetos, siendo el principal

producto de la fermentación el etanol, además algunos otros productos como

aldehídos, ácidos y gases se acumulan generando características deseables o

indeseables para el producto final. La fermentación alcohólica genera una cantidad

mínima de energía, debido a que la mayor parte de la energía permanece en el

producto final (Sossa Urrego et al. 2009).

La levadura Saccharomyces cerevisiae se utiliza comúnmente para la producción de

etanol y dióxido de carbono que se genera durante el proceso, tanto para las bebidas

alcohólicas como para la industria alimentaria (Estela-Escalante et al. 2014; Mbajiuka

et al. 2015). Por otra parte, las levaduras no Saccharomyces, es decir, levaduras de

géneros taxonómicos distintos, son consideradas microorganismos de

descomposición; sin embargo, se ha reportado que algunas especies de no

Saccharomyces pueden colaborar a la calidad del vino. Por ello se ha practicado la

fermentación mixta, la cual, como su nombre lo dice, consiste en mezclar en este caso

Saccharomyces y no Saccharomyces, obteniendo una mejora en las características

de la producción del vino (Berradre et al. 2012; Ciani et al. 2010).

Hoy en día, existe una creciente instalación de empresas para la producción de

bebidas alcohólicas artesanales principalmente cervezas y mezcal. En muchos

procesos artesanales se emplean los mismos microorganismos asociados a las

materias primas, lo que puede generar bajo rendimiento e incluso la generación de

subproductos fermentativos indeseables. Las levaduras comerciales, actualmente no

están adaptadas al maíz que es la materia prima que se desea fermentar en este

proyecto; muchas de estas cepas se han seleccionado para la producción de vinos de

mesa y cervezas hechas con malta de cebada. Algunas empresas productoras de

etanol buscan obtener el mejor rendimiento en el proceso de fermentación y/o


11

destilación, y al mismo tiempo tienen interés por establecer productos con

características únicas.

Por esta razón se propone el uso a futuro de dicha colección de levaduras

fermentables, para el desarrollo u optimización de productos e incluso su

comercialización.

La fermentación alcohólica es un proceso que nace aproximadamente en los años

3000 a.C., en las civilizaciones de Egipto, China, India y Grecia, con la elaboración de

bebidas alcohólicas como vino y cerveza a partir de frutos y cereales (Steinkraus

1995). Siendo ésta una forma de pago para los trabajadores, una bebida que

consideraban más estéril que tomar agua por su proceso de tratamiento térmico para

eliminar microorganismos. En México, años antes de la época prehispánica se

acostumbraba tomar bebidas como el atole, chocolate, pozol, tascalate, entre otros

que procedían del maíz o del cacao, bebidas que generalmente no contenían alcohol.

Después con la llegada de los españoles se comenzó a producir bebidas fermentadas,

basadas principalmente en maíz y otros compuestos como piña, caña de azúcar, entre

otros. Algunas de las bebidas fabricadas en base a la fermentación del maíz son:

tejuino, originario de Colima y Sonora; tesquino, originario de Jalisco; tequino,

originario de Aguascalientes; zende, originario del Estado de México; chicha, originario

de Chiapas; y guarapo, originario de Veracruz y Tabasco (Mendoza et al. 2017; Piló et

al. 2018; Silva et al. 2017). Éstas dos últimas bebidas, la chicha y el guarapo, junto con

el masato, también son bebidas que se toman actualmente en Colombia; comúnmente

son apreciadas por lo refrescante (Bautista 2006; Vallejo et al. 2013).

La fermentación del maíz en México comienza en la época prehispánica con los

tarahumaras con la producción de tesgüino, siendo el maíz la base de la dieta de

nuestros antepasados, actualmente México se encuentra en el 7º lugar como productor

a nivel mundial; sin embargo, el 99 % del maíz que importamos proviene de Estados

Unidos. Siendo ésto un tema de interés para mi proyecto, el utilizar el maíz mexicano

como sustrato para la fermentación de bebidas alcohólicas. México tiene una gran

variedad de maíces y es el principal productor de maíz blanco el cuál representa el 35

% de siembra agrícola, por otra parte también se tiene maíz amarillo que representa


12

el 5 % de la producción nacional en México, maíz morado, entre muchos otros. Cada

variedad de maíz tiene usos determinados, en México la mayor producción es para el

maíz blanco con el 86,9 % el cuál está destinado la mayor parte para consumo humano

nacional, por su alto contenido nutricional; seguido del maíz amarillo del cual la mayor

parte es grano importado y se utiliza en la industria y para alimento animal; por otra

parte, tenemos el maíz azul o morado que es utilizado para el consumo humano

nacional y recientemente se ha aportado evidencia de su contribución a la nutrición

por el aporte de antioxidantes (Sagarpa 2017).

Es importante destacar que al interior del grupo de investigación se ha realizado la

fermentación para la producción de whisky a partir de maltas con base maíz y se han

encontrado áreas de oportunidad en el malteado y fermentación debido a la naturaleza

del almidón de maíz (Espinoza 2018). De este modo se espera que la optimización del

malteado y la exploración de nuevas cepas fermentativas puedan generar como

resultado, mayor producción de etanol en la fermentación de maíz malteado. En este

proyecto se buscaron principalmente microorganismos con alta producción de alcohol

con base en maíz malteado.


13

OBJETIVO GENERAL Obtener una colección de levaduras fermentadoras para la elaboración de bebidas

alcohólicas, basadas en maíz malteado.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

o Establecer cultivos de levaduras a partir de muestras de bebidas fermentadas,

ingredientes y catalizadores empleados en la fermentación de maíz.

o Aislar levaduras.

o Evaluar la producción de etanol de cada cultivo puro a partir de mostos de maíz

malteado.

o Identificar levaduras por técnicas moleculares.

HIPÓTESIS

A partir de procesos de elaboración artesanal de bebidas alcohólicas con base maíz,

es posible obtener microorganismos con elevada producción de etanol durante la

fermentación de maíz malteado.


14

METODOLOGÍA Se realizó una búsqueda bibliográfica para conocer el proceso fermentativo de maíz

en la producción de bebidas artesanales. A partir de dicha revisión se establecieron

cinco niveles de muestreo, ingredientes, catalizadores, frutos, bebidas artesanales y

mosto de tres variedades de maíz.

Se consideraron como ingredientes a los componentes principales de la formulación

de bebidas a base de maíz. Los catalizadores además de agilizar en parte, el proceso

de fermentación, también se caracterizan de ser los que aportan notas de aroma y

sabor. Los frutos y bebidas en ocasiones son añadidos como agentes fermentadores

o como inóculos en el proceso de fermentación.

Tabla 1. Lista de ingredientes utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas

alcohólicas artesanales a base de maíz.

Tabla 2. Lista de catalizadores utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas

alcohólicas artesanales base maíz.

Ingrediente Uso Referencia

Piloncillo Preparación de chicha y tesgüino (Vallejo et al. 2013; Wacher et

al., 2000)

Arroz Preparación de masato (Becerra 2014; Karimi, Emtiazi,

and Taherzadeh 2006)

Miel de abeja Contiene levaduras (Coll Cárdenas, Villat, Laporte,

Noia 2008)

Masa de maíz Elaboración de bebidas (Betancourt Botero, Bolívar

Escobar, and Toro 2013)

Catalizador Uso Referencia

Clavo Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

Canela Preparación de chicha (Vallejo et al. 2013)

Flor de manzanilla Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

Caña de azúcar Preparación de chicha, producción de alcohol (Rabelo et al. 2011)

Frijolillo Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

Flor de durazno Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)


15

Tabla 3. Lista de frutos utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas


Tabla 4. Lista de bebidas utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas


Todo el material con el que se procesaron las muestras se esterilizó por calor húmedo

en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Cada muestra fue tomada en un tubo cónico

de 50 ml estéril o en una bolsa de polipapel nueva para su transporte al laboratorio.

Para la selección de las muestras se tomaron varios aspectos en cuenta; la muestra

debía estar madura, en buen estado, fresca y en contacto con más muestras de la

misma especie.

Una vez colectadas, las muestras sólidas se lavaron con agua destilada, se trituraron

en un mortero y se tomó 1g por triplicado, con el cual se inocularon matraces de 50 ml

con 30 ml/L de caldo extracto de maíz (2g/L de extracto de maíz, 30 µl de amoxicilina,

pH a 4.5) y se dejaron en incubación a 30°C hasta la aparición de crecimiento, durante

Hoja de madroño Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

Fruta Uso Referencia

Piña Utilizado para chicha (Vallejo et al. 2013)

Ciruela morada Fermentable (Dulf, Vodnar, and Socaciu 2016)

Ciruela pasa Fermentable (Dulf, Vodnar, and Socaciu 2016)

Fresa Fermentable (Hornedo-Ortega et al. 2016)

Durazno néctar Fermentable (Hidayet Argun 2016)

Guayaba Utilizado para chicha (Vallejo et al. 2013)

Bebida Uso Referencia

Pozol Fermentable (Juvonen et al. 2015)

Tascalate Fermentable Proyecto

Tepache Fermentable (Nalini and Parthasarathi 2018)

Tejuino Fermentable (Nava-Arenas 2009)


16

24 h a 72 h. En el caso de las muestras líquidas se tomó 1 ml de muestra y se inoculó

según lo antes descrito.

Una vez obtenido el crecimiento en medio líquido se realizó una tinción de Gram de

cada cultivo y se observó la morfología microscópica de cada cultivo. Cuando el cultivo

tuvo presencia de levaduras se sembró por estría cruzada en agar dextrosa Sabouraud

y las cajas de cultivo se incubaron durante 24 horas a 30°C, y nuevamente se realizó

tinción de Gram para confirmar la morfología microscópica.

Para los cultivos enriquecidos a partir de la fermentación de maíz, se pesaron 200g de

granos de maíz, se realizaron tres lavados con agua potable y se dejaron en remojo

durante 24 h a temperatura ambiente. Pasadas las 24 h se escurrieron los granos y se

tomó la muestra de los granos sin germinación, el resto de los granos se colocaron en

un recipiente plástico cubriéndolos con hoja de plátano por 4 días a temperatura

ambiente, hasta conseguir la germinación de los granos. Al finalizar el tiempo se tomó

la muestra del maíz germinado.

Posterior a la germinación, el maíz se trituró finamente en un molino, se tamizó para

eliminar cáscaras o residuos grandes y se pesaron 150 g de harina de maíz a los que

se les añadieron 1500 ml de agua destilada. En este punto se dividieron en dos grupos

los granos sin tratamiento térmico que se sometieron a fermentación durante tres días

y los granos con tratamiento térmico. El tratamiento térmico consistió en llevar la

mezcla de los granos en agua a ebullición durante 3 h. Al terminar se dejó enfriar y se

fermentó a temperatura ambiente por 3 días.

Se procesaron muestras de maíz blanco VC-152, morado VC-42 y amarillo FAC-M-40.

Cada variedad de maíz se inoculó con los siguientes tratamientos: maíz germinado sin

tratamiento térmico, maíz sin germinar sin tratamiento térmico, maíz germinado con

tratamiento térmico y maíz germinado sin tratamiento térmico. De cada variable se

tomó 1 g de muestra o 1 ml de suspensión fermentada a la cual se le realizó el mismo

método de aislamiento de la forma antes descrita para las muestras de ingredientes,

catalizadores y bebidas, haciendo seguimiento de los resultados por morfología

microscópica con tinción de Gram.


17

Una vez seleccionados los cultivos aislados de levaduras se procedió a realizar las

cinéticas de fermentación. Para esto se llevó a cabo el proceso de malteado de maíz

morado VC-42. El cual consistió en seleccionar los granos de maíz, se pesaron 200 g,

se realizaron tres lavados con agua potable y se dejaron en remojo durante 24 h a

temperatura ambiente. Pasadas las 24 h se escurrieron los granos y se colocaron en

un recipiente plástico cubriéndolos con hoja de plátano por 4 días a temperatura

ambiente, hasta conseguir la germinación de los granos. Al finalizar el tiempo, el maíz

se trituró finamente en un molino, se tamizó para eliminar cáscaras o residuos grandes,

se pesaron 150 g de harina de maíz a los que se les añadieron 1500 ml de agua

destilada y se realizó un tratamiento térmico que consistió en llevar la mezcla de los

granos en agua a ebullición durante 3 h. Al terminar se dejó enfriar y se fermentó a

temperatura ambiente por 3 días en alícuotas de 50 ml en frascos serológicos sellados

con tapones de acrilonitrilo y arillos de aluminio con agujas a las que se colocaron

filtros de membrana de nylon de 0.22 µm de diámetro para permitir la liberación de

dióxido de carbono, sin que se presentara contaminación.

Para preparar los inóculos, se sembró cada cultivo en 150 ml de medio YPD y se

incubaron a temperatura ambiente por 24 h, para posteriormente se añadidos en cada

frasco. Al termino del tratamiento térmico del mosto de maíz y antes de la fermentación,

se filtró el mosto y se añadieron 0.4g de a-amilasa pro Kg de maíz y 0.1g de

glucosidasa por Kg de maíz, se homogenizó la mezcla del mosto con las enzimas y se

colocaron 50mL en frascos de 125mL cada uno y se inocularon con 5mL del medio

YPD con los diferentes cultivos. Se realizó cada ensayo por triplicado y se tomaron

muestras cada 24 h hasta el tiempo final 120 h. Cada una de las muestras fueron

filtradas y analizadas por HPLC para cuantificar la producción de etanol y el consumo

de azúcares: maltosa, fructosa y glucosa. Los resultados del etanol y azúcares se

cuantificaron con respecto a curvas de calibración con estándares de glucosa,

fructosa, maltosa y etanol a 3, 2, 1, 0.5 y 0.25 %. Se utilizó una fase móvil con H2SO4

al 5 mM, el flujo utilizado durante la corrida fue de 0.35 ml/min con una presión máxima

de 60 bares.


18

Finalmente, las levaduras se identificaron por métodos moleculares para proporcionar

mayor información sobre ellas. Para esto se realizó extracción de ADN a cada uno de

los cultivos resultantes con el siguiente protocolo:

1. Se centrifugaron cultivos de 24 h de crecimiento en medio YPD a 10000 rpm

durante 5 min, se decantó el sobrenadante y se suspendió la pastilla 0.2 ml de

agua destilada.

2. Se añadieron 50 mg de la suspensión anterior en el tubo ZR Bashing Bead Lysis

y se añadieron 0.750 ml de Bashing Bead Buffer al tubo.

3. Se centrifugó a 10000 xg por 1 min.

4. Se transfirieron 0.4 ml del sobrenadante a un Zymo – Spin IIIF Filter en un tubo

de colección y se centrifugó a 8000 xg por 1 min.

5. Se añadieron 1.2 ml del Genomic Lysis Buffer al filtrado del tubo de colección

del paso 3.

6. Se transfirieron 0.8 ml de la mezcla del paso 4 a un Zymo - Spin IIC Columns

en un tubo de colección y se centrifugó a 10000 xg por 1 min.

7. Se decantó el sobrenadante del tubo y se repitió el paso 5.

8. Se añadieron 0.2 ml de DNA Pre – Wash Buffer al Zymo – Spin IIC Column y

se centrifugó a 10000 xg por 1 min.

9. Se transfirió el Zymo – Spin IIC Column a un tubo eppendorf de 1.5ml,

previamente esterilizado. Se añadieron 0.04 ml de DNA Elution Buffer. Se

centrifugó a 10000xg por 1 min para eluir el DNA.

Posteriormente se verificó la presencia del DNA extraído, mediante una electroforesis

en gel de agarosa al 1%. Se usó un marcador de peso molecular de 1 kb Plus DNA

(Invitrogen). El ADN en el gel se sometió a separación a 80 V. El gel se tiñó por

inmersión en una solución con SYBR Safe DNA Gel Stain 10 000X diluido

apropiadamente en TAE 1X y se reveló con luz UV en un transiluminador UVP.

Una vez realizada la extracción de ADN de los cultivos, se realizó la amplificación por

PCR de la región intergénica ribosomal con los oligos universales ITS1 e ITS4. En la

Tabla 5 se muestran los oligonucleótidos que se utilizaron para la PCR.


19

Tabla 5. Oligonucleótidos.

Se llevó a cabo una optimización de la temperatura para la amplificación con los oligos

ITS1 e ITS4, por lo que se hizo una PCR de gradiente, partiendo de una temperatura

de 55 ºC hasta 65 ºC. Al revelar los resultados por medio de una electroforesis se

determinó la temperatura óptima de alineamiento de los oligos.

Para la PCR se utilizaron 2 µl de ADN molde, 2U de ADN polimerasa, 2.5 µl de buffer

con magnesio 10x, 2 µl de DNTP’s 10 mM, 2 µl de cada uno de los oligos 10 pM y se

complementó con de agua estéril. En total fueron 11 muestras, de las cuales fueron 10

cepas y agua como control negativo. Se realizó una centrifugación corta para eliminar

burbujas. Las condiciones para el termociclador fueron, calentamiento a 95°C durante

5 minutos, 30 ciclos de, 95ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min, 72ºC durante 1min

y al finalizar los ciclos, una extensión final de 5 min en la misma temperatura de 72ºC.

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa para determinar la amplificación de

cada cepa. El producto de la PCR se secuenció por el método capilar mediante

servicio externo con Macrogen Korea. Finalmente las secuencias obtenidas, se

sometieron a una búsqueda con la herramienta BLAST (NCBI 2018), para encontrar

los organismos de referencia con mayor identidad en sus secuencias.

Región Oligonucleótidos Referencia

ITS1 5’TCCGTAGGTAACCTGCGG3’ (Morrissey et al. 2004)

ITS4 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’

(Uruburu F 1999)


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RESULTADOS Para este trabajo, se buscó aislar levaduras y reducir al máximo el crecimiento

bacteriano, mediante el uso de un medio de cultivo de enriquecimiento que contenía 2

g/L de extracto de maíz y con pH de 4.5. Este medio favoreció el crecimiento de

levaduras, además de la adición de amoxicilina, la cual inhibe la formación de la pared

celular de las bacterias por lo que evita el crecimiento bacteriano. En la Tabla 6 se

muestran los resultados obtenidos a partir de una tinción Gram en 9 muestras de

ingredientes. Cabe destacar que, fue necesario realizar varias siembras de los cultivos,

debido a la presencia de bacterias en todas las muestras.

Tabla 6. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de ingredientes. Ingrediente Morfología microscópica

Piña Levaduras y cocos Gram +

Guayaba Levaduras y cocos Gram +

Papaya Cocos y bacilos Gram +

Ciruela morada Cocos Gram +

Ciruela pasa Cocos y bacilos Gram +

Fresa Cocos Gram + y bacilos

Gram -

Durazno (variedad

néctar) Bacilos Gram +

Masa de maíz Levaduras y cocos Gram +

Arroz Cocos Gram +


21

En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos a partir de una tinción Gram en 8

muestras de catalizadores, de las cuales únicamente se tuvo presencia de bacterias

sin crecimiento de levaduras.

Tabla 7. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de catalizadores.

Nombre Resultados

Clavo Cocos Gram +

Canela Cocos Gram +

Flor de manzanilla Cocos y bacilos

Gram +

Caña de azúcar Cocos Gram -

Frijolillo Cocos Gram +

Flor de durazno Bacilos Gram + y

cocos Gram -

Hoja de madroño Cocos gram -

Miel de abeja Bacilos y cocos

Gram +

En la Tabla 8 se muestras los resultados de morfología miscroscópica de 5 bebidas

fermentadas de las cuales se tuvieron 2 bebidas con presencia de levaduras y 3

bebidas con bacterias; sin embargo, la presencia de bacterias también se observó en

las bebidas de tejuino y tepache, como parte de un consorcio con las levaduras y que

contribuyen a la fermentación proporcionando un toque ácido en algunas ocasiones a

las bebidas.


22

Tabla 8. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de bebidas artesanales.

Nombre Resultados

Pozol Cocos Gram +

Tascalate Cocos Gram +

Atole de maíz Cocos Gram -

Tejuino

Levaduras,

bacilos y cocos

Gram +

Tepache Levaduras y

cocos Gram +

También se realizaron fermentaciones con 3 variedades de maíz, VC.152, FAC-M40 y

VC-42 o bien, blanco, amarillo y morado. Para éste apartado se realizaron 4

tratamientos para cada tipo de maíz las cuales consistieron en germinar o no el maíz

y aplicar un tratamiento térmico o no con una posterior fermentación. En la Tabla 9 se

muestran los resultados de la tinción Gram realizada a 12 muestras, en donde se

detectó la presencia de levaduras en el maíz germinado, las cuales se perdieron en

las muestras con tratamiento térmico. Únicamente la fermentación con maíz

germinado permitió el aislamiento de las levaduras.

Tabla 9. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de la fermentación de maíz

malteado.

Maíz Germinado Tratado

térmicamente Resultado

Maíz blanco VC-152

Cocos Gram -

X X Cocos Gram -

X Cocos Gram +

X Levaduras y cocos Gram +

Maíz amarillo FAC-M-40 Cocos Gram -

X X Cocos Gram +


23

X Cocos Gram +


Maíz morado VC-42

Cocos Gram +

X X Cocos Gram -

X Cocos Gram +


Finalmente, de un total de 33 muestras tomadas a partir de ingredientes, catalizadores,

bebidas artesanales y fermentaciones base maíz, conseguimos una colección inicial

de 12 levaduras, las cuales se muestran en la Tabla 10. Para llegar a este resultado

se realizaron resiembras para aislar las levaduras, logrando aislar a partir de 8

muestras diferentes como el maíz blanco, amarillo y morado, tejuino, tepache, masa,

guayaba y piña. En la tabla 10 se muestran dos cultivo para maíz blanco, tejuino, masa

y guayaba, los cuales se numeran diferente sí hay diferencia en la morfología colonial

y microscópica o con un subíndice si presentaron la misma morfología durante las

resiembras en Agar Dextrosa Saboreaud.

Tabla 10. Colección de levaduras.

Cultivo Muestra de origen

1 Maíz blanco 1 VC-152 germinado

2 Maíz blanco 2 VC-152 germinado

3 Maíz amarillo FAC-M-40 germinado

4 Maíz morado VC-42 germinado

5 Tepache

6 Tejuino 1

7 Tejuino 2

8 Masa 1

8a Masa 2 9 Guayaba 1

9a Guayaba 2

10 Piña


24

A continuación, en la Figura 1 se muestran 10 imágenes de microscopía de tinción

simple con safranina de diferentes levaduras. De la colección anterior, se observó una

misma morfología en los cultivos obtenidos de las mismas muestras de masa y

guayaba por lo que únicamente seleccionamos 10 levaduras para las siguientes

investigaciones. En la Figura 1a se observa una morfología típica de levadura, ancha

y alargada con algunas se observan levaduras en gemación, ésta levadura se aisló de

la fermentación de maíz blanco germinado de la muestra 1. En la Figura 1b se observa

una morfología circular, la cual corresponde a la muestra 2 de la fermentación de maíz

blanco germinado. Continuando con la Figura 1c tiene una morfología ancha y ovalada

la cual corresponde a la muestra obtenida de fermentación de maíz morado

germinado, en la Figura 1d tenemos las levaduras provenientes de la fermentación de

maíz amarillo germinado. La Figura 1e muestra el cultivo de levadura obtenido de piña;

la Figura 1f, g, i, corresponde a las muestra de masa, guayaba y tejuino muestra 1,

repectivamente, las cuales tienden a una morfología circular. En la Figura 1h se

observan levaduras grandes y ovaladas, las cuales pertenecen a la muestra de

tepache y finalmente en la Figura 1j se muestra una morfología tanto circular como

alargada de levaduras, procedentes de tejuino muestra 2.

Figura 1. Morfología microscópica de las levaduras obtenidas después del aislamiento en medio YPD. a) fermentación

de maíz blanco muestra 1, b) fermentación de maíz blanco muestra 2, c) fermentación de maíz morado, d) fermentación

de maíz amarillo, e) piña, f) masa, g) guayaba, h) tepache, i) tejuino muestra 1, j) tejuino muestra 2.

a) b) c) d) e)

f) g) h) i) j)

Posteriormente se realizaron las cinéticas de fermentación. Para ello se tomaron

muestras por triplicado desde tiempo inicial (0 h) cada 24 h hasta completar 120 h. En

la Figura 2 se muestran los resultados de la cinética de fermentación para el cultivo

Saccharomyces cerevisiae whisky que funcionó para este estudio como un control

positivo de fermentación y como una referencia para seleccionar cepas que produjeran

mayor concentración de alcohol. Podemos observar que la levadura consume los

azúcares y a su vez tiene una producción de etanol de 1.4%, lo que nos indica que es

una levadura que actua desde las primeras 48 h de su fermentación, seguido de una

liberación de glucosa a las 72 h.

Figura 2. Resultados de la cinética de fermentación para Saccharomyces cerevisiae

Whisky.

0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Saccharomyces cerevisiae Whisky

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


27

El cultivo 1 se obtuvo de la fermentación de maíz blanco VC-152 germinado. En la

Figura 3 se muestra la cinética de este cultivo, donde se puede observar que la

producción de etanol es elevada oscilando entre 2.55 % y 1.4 %, por otra parte la

maltosa y la fructosa fueron consumidas por la levadura y la glucosa se liberó durante

toda la cinética. Cabe mencionar que el tiempo 0 h en realidad pasaron hasta 90 min

para su toma de muestra debido al proceso de homogenización, filtrado, adición de

enzimas, el vaciado de alícuotas en cada frasco, la filtración y finalmente se procesó

el tiempo cero para cada ensayo.

Figura 3. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 1.

-1

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 1

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


28

El cultivo 2 se obtuvo, al igual que el cultivo 1, de la fermentación de maíz blanco VC-

152 germinado con una morfología distinta. En la Figura 4 se muestra la cinética de

este cultivo, el cual muestra una producción de etanol elevada desde las primeras

horas de la fermentación llegando a un punto máximo de 2.5 %, por otro lado la

levadura mantuvo una liberación constante de glucosa al 2.0 % aproximadamente y la

fructosa junto con la maltosa parecen ser consumidas por la levadura para la

producción de etanol.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 2

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


29

El cultivo 3 se obtuvo de la fermentación de maíz amarillo FAC-M-40 germinado. En la

Figura 5 se observa que la levadura tiene una producción de etanol máxima de 0.34

% de las 24 h a las 48 h y un consumo total de maltosa y fructosa durante su producción

de etanol. La levadura a partir de las 48 h comienza a liberar fructosa hasta llegar a un

punto máximo a las 120 h de 6.6 % y en el caso de la glucosa se mantuvo una

liberación constante, durante la cinética de fermentación al 2.0 % aproximadamente


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 3

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


30

El cultivo 4 se obtuvo de la fermentación de maiz morado VC-42 germinado. La

levadura del cultivo 4 no logró producir etanol como se muestra en la Figura 6, por otra

parte la maltosa se mantuvo en trazas durante todo el proceso sin ser liberada como

la fructosa a partir de las 96 h hasta llegar a un punto máximo a las 120 h de 4.6 %.

La glucosa se mantuvo en concentraciones cercanas al 2.0% durante las 120 h al igual

que el cultivo 3 y el cultivo 2. Cada microorganismo es totalmente distinto, no todos

utilizan una misma ruta metabólica, podemos suponer que ésta levadura produjo ácido

láctico en lugar de etanol o metabolizó los azúcares hasta CO2.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 4

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


31

El cultivo 5 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tepache. en la Figura 7 se

muestra la cinética de fermentación de esta levadura, la cual tuvo una producción de

etanol durante las primeras 24 h con un máximo de 0.96 %, a mismo tiempo que fue

consumida la maltosa, por otra parte tenemos liberación de fructosa durante la cinética

hasta un punto máximo a las 120 h de 3.0 % y una liberación constante de glucosa

oscilando entre 0.59 % y 1.9 %.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 5

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


32

El cultivo 6 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tejuino y en este caso de la

muestra 1 debido a la diferente morfología presentada entre las dos muestras de

tejuino, se conservaron ambos cultivos (Figura 1). En la Figura 8 se muestra la cinética

de fermentación de la levadura del cultivo 6. La levadura de este cultivo tuvo una buena

producción de etanol un tanto tardía con respecto a la cepa S. Cerevisiae, debido a

que obtuvo una producción del 3.1 % a las 72 h la producción de etanol, corresponde

con el consumo de maltosa durante toda la cinética se mantuvo en trazas, comparado

con la fructosa, la cual fue liberada desde el tiempo 0 hasta las 72 h donde se mantuvo

constante al 7.0 %. Finalmente tenemos el comportamiento constante de la glucosa

durante la cinética entre el 2.0 %


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 6

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


33

El cultivo 7 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tejuino y en este caso es

muestra 2 debido a la diferente morfología presentada en las imagenes de la Figura 1.

En la Figura 9 se muestra la cinética de esta levadura, no tuvo producción de etanol,

no liberó maltosa durante la cinética y se destaca su liberación de fructosa hasta llegar

a un pico máximo de 10.3 % alas 72 h y después de a las 72 h a las 120 h se mantuvo

en un 7.0%. Por último tenemos la glucosa que se mantuvo a liberación constante al

2.0% durante las 120 h.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 7

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


34

El cultivo 8 se obtuvo de la una muestra de masa. En la Figura 10 se observa que la

levadura tuvo una producción de etanol del 2.7 % a las 24 h, cayendo a las 72 h y

llegando a un punto máximo a las 120 h con 3.0%, es necesario mencionar que el

comportamiento de la producción de etanol corresponde con la liberación de maltosa

a las 72 h donde la levadura lo ocupa como fuente para su producción final. Por otra

parte la levadura liberó fructosa a las 48 h con 2.5 % y se observa nuevamente una

liberación constante de glucosa al 2.0 % durante toda la cinética.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 8

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


35

El cultivo 9 se obtuvo de una muestra de guayaba. En la Figura 11 se observa que

esta levadura tiene un buen comportamiento en la producción de etanol alcanzando

un 4.7% a las 72 h de fermentación, correspondiendo al consumo de maltosa y por

otra parte, la cinética sugiere que ese etanol se produce después del consumo de la

fructosa acumulada durante las primeras 48 h de fermentación, nuevamente tenemos

un comportamiento constante en la liberación de glucosa.


0

1

2

3

4

5

6

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 9

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


36

El cultivo 10 se obtuvo de una muestra de piña. En la Figura 12 se observa que la

producción de etanol comienza desde las 0 h con un 3.0 % y se mantiene de las 24 h

a las 120 h constante entre 0.3 % y 0.9 %, la maltosa permanece en trazas al ser

consumida por la levadura. Lo que se destaca de la levadura es su acumulación de

fructosa durante las primeras 72 h y por otra parte tenemos nuevamente la liberación

constante de glucosa oscilando al 2.0 % durante la cinética.


0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120

Eta

nol (

%)

Azú

ca

res

(%)

Tiempo (h)

Cultivo 10

Glucosa

Maltosa

Fructosa

Etanol


37

En la Figura 13 se observan únicamente los resultados de etanol de las cinéticas de

fermentación de los 10 cultivos comparados con la cepa comercial de referencia

Saccharomyces cerevisiae Whisky, en color amarillo, la cual tuvo una producción de

etanol de 1.4 % a las 24 h.

Figura 13. Resultados de la producción de etanol de cada cultivo, durante las

cinéticas de fermentación.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

0 24 48 72 96 120

Eta

nol

(%)

Tiempo (h)

Cinética de fermentación S. CerevisiaeWhiskyCultivo 1

Cultivo 2

Cultivo 3

Cultivo 4

Cultivo 5

Cultivo 6

Cultivo 7

Cultivo 8

Cultivo 9

Cultivo 10


38

En la Figura 14 se muestran los resultados de los 6 cultivos que tuvieron en algún

punto de la cinética de fermentación una producción mayor a la cepa de referencia,

Saccharomyces cerevisiae Whisky. Empezando por el cultivo 8 obtenido a partir de

masa de maíz, con 2.7 % de etanol a las 24 h, cultivo 9 obtenido a partir de guayaba,

con 4.7 % de etanol a las 72 h y cultivo 6 obtenido a partir de tejuino 1, con 3.1 % de

etanol a las 72 h. El cultivo 1 obtenido a partir de maíz blanco 2VC-152, con 2.3 % de

etanol a las 24 h, el cultivo 10 obtenida a partir de piña, con 3.0 % de etanol a las 0 h

y el cultivo 2 obtenido a partir de maíz blanco 2VC-152, con 2.5 % de etanol a las 0 h.

Figura 14. Cultivos con mayor producción de etanol comparado con la cepa

comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

0 24 48 72 96 120

Eta

nol

(%)

Tiempo (h)

Cinética de fermentaciónS. CerevisiaeWhisky

Cultivo 1

Cultivo 2

Cultivo 6

Cultivo 8

Cultivo 9

Cultivo 10


39

En la Figura 15 se muestran los resultados de los 4 cultivos que tuvieron una

producción menor a la cepa de referencia, Saccharomyces cerevisiae Whisky, durante

la cinética de fermentación. Los cuales fueron, cultivo 3 proveniente de maíz amarillo

FAC-M-40, cultivo 4 obtenido del maíz morado VC-42, cultivo 5 obtenido del tepache

1 y cultivo 7 obtenido del tejuino 2.

Figura 15. Cultivos con menor producción de etanol comparado con la cepa

comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky.

Para realizar la identificación de los diferentes cultivos se eligieron técnicas

moleculares. Para ello se realizó la extracción de ADN y se verificó su presencia y

calidad mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%. Destacando entre ellos

el carril 11 que corresponde a la muestra de guayaba y el carril 12 que corresponde a

piña.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0 24 48 72 96 120

Eta

nol

(%)

Tiempo (h)

Cinética de fermentación

S. CerevisiaeWhisky

Cultivo 3

Cultivo 4

Cultivo 5

Cultivo 7


40

Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa de la extracción de ADN. 1) Marcador de peso molecular

1Kb plus (Invitrogen), 2) cultivo 1, 3) cultivo 2, 4) cultivo 3, 5) cultivo 4, 6) cultivo 5, 7) cultivo 6, 8)

cultivo 7, 9) cultivo 8, 10) cultivo 9, 11) cultivo 9a, 12) cultivo 10.

Una vez realizada la extracción de DNA de los 10 cultivos, se continuó con la

amplificación por PCR con los oligos universales ITS1e ITS4 específicos para las

levaduras. En el carril 1 tenemos el marcador de peso molecular, en el carril 2 tenemos

el control negativo y del carril 3 al 13 los productos de amplificación a partir del ADN

de los cultivos. Se puede apreciar en el carril 11 y 12 una similitud debido a que es la

misma muestra del cultivo obtenido a partir de guayaba.

2 3 6 9


41

Figura 15. Muestras de ADN aplificado a partir de una PCR. 1) marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen), 2) control negativo , 3) cultivo 1, 4) cultivo 2, 5) cultivo 3, 6) cultivo 4, 7) cultivo 5, 8)

cultivo 6, 9) cultivo 7, 10) cultivo 8, 11) cultivo 9, 12) cultivo 9a, 13) cultivo 10.

Posterior a la amplificación por PCR, el producto se envió a secuenciación y se

obtuvieron en total 8 secuencias con calidad apropiada, es decir, que pudieron ser

secuenciadas para su posterior análisis taxonómico. Éstas secuencias se utilizaron

para la comparación mediante el algoritmo BLAST (NCBI 2018) en las bases de datos

NCBI. 2 secuencias correspondientes a los cultivos 3 y 8 no tuvieron suficiente calidad

incluso después de resecuenciarlas, por lo que fueron nombradas como consorcio 1 y

consorcio 2 al no ser cultivos puros. La mayoría de los cultivos pudieron identificarse

a nivel de especie excepto el cultivo 10 que tiene una identidad muy baja con a

secuencia más parecida.


42

Tabla 11. Resultados Identificación taxonómica.

En la Tabla 11 se enumeran del 1-10 los cultivos finales que formaron parte de nuestra

colección de levaduras, seguido de la muestra de donde se obtuvieron, la posición

taxonómica, la identidad con respecto a la secuencia más cercana y los valores de e-

value del BLAST, en el caso del cultivo 3 y 8 no aplica debido a que no se tenían los

datos por parte de la secuenciación y no se pudieron correr en el programa.

Cultivo Muestra de origen Cepa Identidad EValue

1 Maíz blanco

1 VC-152 germinado

y fermentado

Candida intermedia 100% 5e-143

2 Maíz blanco

2 VC-152 germinado y fermentado

Meyerozima caribbica 1 99% 0.0

3 Cultivo 4 / Maíz

amarillo FAC-M-40

germinado y

fermentado

Consorcio 1 NA NA

4 Maíz morado

VC-42 germinado y

fermentado

Kluyveromyces

marxianus

99% 0.0

5 Tepache Candida boidinii 99% 0.0

6 Tejuino 1 Zygotorulaspora

florentina

100% 0.0

7 Tejuino 2 Hanseniaspora uvarum 99% 0.0

8 Masa Consorcio 2 NA NA

9 Guayaba Meyerozima caribbica 2 100% 0.0

10 Piña Hanseniaspora sp. 90% 0.0


43

DISCUSIÓN

Una vez obtenida la identidad taxonómica de acuerdo a los resultados obtenidos en

BLAST de cada cultivo, se realizó una búsqueda bibliográfica para tener conocimiento

del potencial de cada cepa e indagar sobre su uso actual.

Comenzando con la cepa Candida intermedia obtenida de maíz blanco 1 VC-152,

anteriormente ya se tenía el registro de Candida intermedia como levadura

espontánea, encontrada durante la elaboración artesanal de vino de palma (Ríos.

2018). En otros estudios realizados en Portugal y Japón, se investigó el efecto por

parte de Candida intermedia y Saccharomyces cerevisiae, ambas levaduras

fermentadoras de xilosa y glucosa. Los autores evaluaron su rendimiento, usando

como sustrato paja de trigo y se observó que en ocasiones la xilosa tomaba otra ruta

metabólica y en lugar de producir etanol producía glicerol y xilitol (Fonseca et al. 2011;

Tanino et al. 2012). En este estudio, Candida intermedia tuvo un comportamiento

constante en la producción de etanol desde las 0 h como se muestra en la Figura 3;

es probable que bajo nuestras condiciones de proceso se pueda aumentar el

porcentaje alcohólico al realizar una fermentación en conjunto con Sacharomyces

cerevisiae y Candida intermedia.

Meyerozima caribbica es una levadura que fue obtenida en dos muestras, maíz blanco

2 VC-152 y guayaba, además ha sido reportada como una cepa aislada de

ecosistemas oleicos, de piña y mora. Produce enzimas β-glucosidadasa, peroxidasa y

β-glucanasa (Luz Adriana Mambuscay M. et al. 2013); sin embargo, en este estudio la

levadura fue aislada a partir de la fermentación de maíz blanco 1 germinado y guayaba.

Por otra parte, M. caribbica es considerada una levadura fermentadora, que cataboliza

L-arabinosa, D-glucosa y D-xilosa, el rendimiento de etanol que se obtuvo tomando

como fuente de carbono la D-glucosa fue de 21.7g/L (Sukpipat et al. 2017). Es probable

que, si nosotros aumentamos la producción de glucosa, la levadura lograría tener un

incremento y una mayor estabilidad en la producción de etanol. En el caso específico

del cultivo 2 se observó una producción de etanol al inicio y al final de la cinética como


44

se muestra en la Figura 4 y en el cultivo 9 se logró un 4.5% a las 72 h como se muestra

en la Figura 11. En otros estudios se utilizó M. caribbica como biocontrol en un mango

ataulfo y esta levadura funcionó al igual que un fungicida, compitiendo por nutrientes

como sacarosa y fructosa, controlando el crecimiento del patógeno Colletotrichum

gloeosporioides, presente durante el proceso de putrefacción del mango (Bautista-

Rosales et al. 2013).

En la India se utilizó Kluyveromyces marxianus para la producción de alcohol a partir

del suero de queso, obteniendo que a las 72 h se consumía la lactosa, logrando un

rendimiento alcohólico de 6.02 g/L, (BipashaDas et al. 2016). En otros estudios se

utilizó K. marxianus para fermentación de etanol utilizando como biomasa la xilosa y

obteniendo un rendimiento total de 6.02 g/L de etanol con bagazo de caña (Bourdichon

et al. 2012; Dasgupta et al. 2017). En la Figura 6 podemos observar que K. marxianus,

no logró producir etanol durante las 120 h.

Zygotorulaspora florentina fue evaluada en fermentaciones de cultivo mixto junto con

Saccharomyces cerevisiae. La finalidad de ese estudio era analizar los resultados de

aroma y sabor en vino (Lencioni et al. 2016). En otras investigaciones se han utilizado

diferentes cepas de levaduras fermentadoras no convencionales, entre ellas

Zygotorulaspora florentina, en conjunto con Saccharomyces cerevisiae, logrando

mejoras en sabor de cerveza (Holt et al. 2018). En este trabajo, para Z. florentina se

obtuvo un 3.0% de etanol a las 72 h, como se muestra en la Figura 8; sin embargo, de

acuerdo a los resultados obtenidos por Lencioni et al. (2016) la aportación de esta

levadura para mejorar el sabor de vinos, es importante, por lo que un cultivo mixto de

Saccharomyces cerevisiae con Zygotorulaspora florentina, podría mejorar el aroma y

sabor de la bebida de interés.

En China se analizó que la concentración de compuestos aromáticos podría

incrementarse por medio de Hanseniaspora uvarum, mediante la actividad de enzimas

como β-glucosidasa y la presencia de ácidos grasos; sin embargo, si se aumentaba la

cantidad de levaduras se tenía un resultado contraproducente al elevar las


45

concentraciones de ésteres, provocando un olor a esmalte de uñas en los vinos

utilizados en ese proyecto (De Arruda Moura Pietrowski et al. 2012; Bourdichon et al.

2012; Chunxiao Wang and AlbertMasBraulio 2015; Kai Hu et al. 2018). H. uvarum

puede aportar más al aroma y sabor. Se puede apreciar en la Figura 9 que H. uvarum

no produce etanol, pero si alguna levadura de interés tiene por biomasa la fructosa,

esta levadura le ayudaría como un cultivo mixto, debido a que la liberacion que

tenemos por parte de nuestra cepa es alto y en algunos estudios hemos encontrado

que realizan investigaciones con cultivos mixtos, para beneficiar la producción final del

objetivo, en nuestro caso, etanol.

En estudios realizados en Brasil, se utilizó Candida boidinii en sustrato de xilosa

obtenida a partir de una palma brasileña para la producción de biodiesel alcanzando

5g/L de etanol (Gonçalves et al. 2013). Los estudios encontrados para esta levadura,

no consisten directamente en fermentación para uso alimentario, sino para la

producción de bioetanol. La cepa identificada en este estudio fue aislada de una bebida

tradicional, el tepache y como se muestra en la Figura 7, Candida boidinii, no logró

producir etanol.

No se tiene certeza del contenido en el consorcio obtenido de la fermentación de maíz

amarillo (Consorcio 1). Como se muestra en la Figura 5, el consorcio 1, no logró una

producción de etanol durante las 120 h.

El consorcio 2 obtenido de una muestra de masa, podría colaborar con la parte de

fermentación si se busca una generación de etanol en poco tiempo. En la Figura 10

podemos observar que el consorcio 2 a las 24 h y 120 h tiene una producción de etanol

considerable; sin embargo, al ser un consorcio, probablemente puede tener diferentes

tipos de levaduras, por lo que no se podría asegurar aroma y sabor aceptable.

CONCLUSIONES


46

• A partir de 33 muestras, se obtuvo una colección de diez cultivos de levaduras,

provenientes de la fermentación de maíz, bebidas artesanales y algunos

ingredientes.

• Los cultivos seleccionados pertenecen a los siguientes géneros, Candida,

Meyerozima, Kluyveromyces, Zygotorulaspora y Hanseniaspora.

• Las cepas Candida intermedia, Meyerozima caribbica 1, Zygotorulaspora

florentina, consorcio 2, Meyerozima caribbica 2 y Hanseniaspora sp., fueron las

que alcanzaron una producción de etanol mayor a la cepa de referencia,

Sacchacomyces cerevisiae whisky.


47

REFERENCIAS De Arruda Moura Pietrowski, Giovana et al. 2012. “Influence of Fermentation with Hanseniaspora Sp.

Yeast on the Volatile Profile of Fermented Apple.” Journal of Agricultural and Food Chemistry

60(39): 9815–21.

Bautista-Rosales, Pedro Ulises et al. 2013. “Action Mechanisms of the Yeast Meyerozyma Caribbica for

the Control of the Phytopathogen Colletotrichum Gloeosporioides in Mangoes.” Biological Control 65(3): 293–301. http://dx.doi.org/10.1016/j.biocontrol.2013.03.010.

Bautista, José Luis Sedano. 2006. “Selección de Cepas Nativas de Lactobacillus Con Actividad

Inhibitoria y Tolerantes Al Etanol Aisladas Del Masato.” Universidad nacional mayor de San

Marcos.

Becerra, Mónica. 2014. “Bebidas Fermentadas a Partir De Maíz Y Arroz: Elaboración, Control Y

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PRODUCTOS Póster presentado en el 2nd Biotechnology World Symposium. San José del Cabo,

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