BIOCHIMIE, 1976, 58, 12r99-1302. M6moires originaux

Purification d' -amylases par chromatographie d'affinitd

sur amidon rdticuld.

Michble WEBER, Marie-Jos6 FOGLIETTI et F ranco is PERCHERON ~.

Laboratoire de Chimie Biologique, E.R.A. n" 99 du C.N.R.S., Facultd des Sciences Pharmaceut iques el Biologiques, Universitd Ren~ Descartes,

4, Avenue de l 'Observatoire, 75006 Paris. (11-10-1976).

Summary. - - Affinity chromatography on cross-linked starch affords a simple and rapid procedure for or-amylases (EC 3.2.1.1.) purification. "When starch is cross-linked in alkaline medium by epiehlorhydrin in the conditions described, the insoluble polysaceharide obtained is able to retain speeifically the ct-amylase which is then eluted with 2M maltose solution, ct-alnylase can be obtained in a pure form with a 60 per cent yield.

The exoenzyme [~-amylase (EC 3.2.1.2) is not retained by the support and is eluted with other contanfinant proteins. Therefore, this procedure allows the separation of the endo- and exoamylase activities.

INTRODUCTION.

Actuel lement , les techniques sp6cifiques de ch romatograph ie d'affinit6 sont encore peu uti- lis~es pour la pur i f icat ion des polysacchar idases .

Dans un pr6c6dent t ravai l [11, nous avons pu isoier l ' endopolyga lac turonase du suc d'Hel ix po- maria par ch romatograph ie d'affinit6 sur acide po lyga lac turon ique r6ticul6, suppor t in t rodui t par Rexovh pour la pur i f icat ion de l ' endopolygalac tu- ronase d'Aspergil lus niger [21.

En effet, par t ra i tement d 'un po lysacchar ide avec l ' 6p ich lo rhydr ine en mil ieu alcalin, il se forme entre les chaines, des ponts conduisant h une macromol6cule r6ticul~e, insoluble. Si la r6ti- culat ion n'est pas trop impor tante , la polysaecha- r idase cor respondante peut reconna i t re son sub- strat el s 'y fixer sans le modifier.

Nous d6cr ivons ici l ' appl ica t ion de cette tech- nique d'affinit6 h la pur i f ica t ion d'(t-alnylases (E,C 3.2.1.1.) sur amidon r6ticul6. Ce m~me sup- port est aussi uti l isable pour l 'obtent ion de (~-amy- lase (EC 3.2.1.2.) d6pourvue d 'act ivi t6 a-amyla- sique.

Pendant la r6dact ion de cet art icle, nous avons pris connaissance d 'un t ravai l publi6 ici-m~me [3] concernan t l ' emploi d 'amylose r6ticul6 pour 6ta- blir si une pr6para t ion amyloly t ique cont ient de l'¢L-amylase ou de la ,~-amylase. Nous discuterons

<> A qui toute correspondance dolt ~tre adressde.

plus loin cette t echn ique d ont la finalit6 et les possibili t6s sont diff6rentes de la n6tre.

MATERIEL ET METHODES.

E n z y m e s : ~-amylase bact~rienne (Calbiochem 17153).

or-amylase de malt, type V-A (Sigma A-6755).

B-amylase (Calbiochem 17157). Diastase de malt ( Industr ie Biologi-

clue Francaise) .

Substrat : Amidon soluble Merck.

D~terminat ion de l 'activitd enzgmatique.

Une solution d 'amidon h 0,5 p. cent en t ampon phosphate mono-, d isodique 0,02 M, pH 7 conte- nant HC1 0,0'06 N, est ul i l ise comme substrat. L 'act ivi l6 enzynlat ique est d6termin6e, apr6s incu- bation h -4- 25°C, par dosage des sucres r6ducteurs lib6r6s (exprim6s en maltose) au moyen de la technique de Nelson-Somogyi [4, 51.

L 'act ivi td enzymat ique est expr im6e en Unit6s co r respondan t h la quantit6 d 'enzyme l ib~rant 1 umole de (mal tose . mn-D.

L 'act ivi t6 ct-amylasique est rep6r6e fi la sortie des colonnes par ta rOaction 5 l ' iode [6!.

Suppor t chromatographique.

L'amidon r6ticul6 par act ion de l '6pichlorhy- dr ine en inilieu alcalin est pr6par6 d 'apr6s une technique d6cri te par Kuniak et Marchessault [73.

89

1300 M. W e b e r , M. -J . Fog l i e t t i el F. P e r c h e r o n .

L'amidon de bl~ est trait~ par une quanti t6 6quimol6culaire (calcul6e d 'apr6s la concent ra t ion en anhydroglucose) de soude en solution aqueuse

7;5 p. cent et par de l ' 6p ich lo rhydr ine ( rappor t mola i re @ i e h l o r h y d r i n e / a m i d o n = 1,5).

Le m61ange est main tenu sous agitat ion conti- nue, 1,5 h "~ la temp6rature du laboratoire , puis 2 h h -4- 35°C.

Le gel obtenu est lay6 h l 'eau jusqu'h neutrali t6, s6ch6 par l 'ac6tone et pulv6ris6 en fines part i - cules.

I so lement de l 'a-amylase.

Une eolonne (1 era . 25 era) eonsti tu6e par un m61ange homog6ne de 2 g d ' amidon r6tieul6 et 2 g de Sephadex G 10 destin6 h faci l i ter l '6eoulement , est 6quilibrSe avee un tampon malSate 0,01 M de pH 6,5, contenant de l 'ae6tate de calc ium 0,01 M.

1 ml de solution tamponn6e eontenant 60 Unit6s d 'a-amylase et 10 mg de s6rum-albumine bovine destin6e h s imuler des prot6ines contaminantes , est adsorb6 sur la eolonne.

L'61ution des prot6ines non enzymat iques est r6alis6e par le tampon d '6qui l ibrage jusqu'h ce que l'61uat ne prbsente plus d 'absorp t ion h 280 nm.

L 'aet ivi t6 a-amylas ique est 61u6e par une solu- tion de maltose 2 M dans le tampon d 'bquil ibrage. L,e maltose est ensuite 61imin6 par passage de l'61uat sur une eolonne de Sephadex G 25.

Le m f m e protocole est utilis6 pour la s fpa ra t ion des aetivit6s .a- et ~- amylasiques. Le d6p6t est alors constitu6, soit par une solution d 'a-amylase de malt contenant 60 Unit6s d 'a-amylase et 2,0 Unit6s de ~-amylase, soit par un nx61ange d'(t- et ~-amylases (60 Unit6s d 'a-amylase et 30 Unit6s de 6:amylase). Dans les deux cas, les solutions sont surcharg~es par 10 mg de s6rum-albumine bovine.

RESULTATS.

Par t ra i tement de l 'a lnidon de b16 par l '6pichlo- r hyd r ine en mi l ieu alealin, il est possible d 'obte- n i t une forme r6tieul6e, insoluble du polysaccha- ride. Le degr6 de r6t iculat ion est influenc6 par diff6rents f a e t e u r s : concent ra t ions en polysac- char ide, soude et 6p ieh lorhydr ine . Par un choix jud ic ieux de ces diff6rents param6tres , il est possible d 'ob ten i r un po lysacchar ide suffisam- ment r~ticul6 pour ne pas 6tre modifi6 par les a-amylases mais possbdant encore des s6quences de r6sidus g lucopyranosyl non substitu6es suscep- tibles d '6tre reconnues par l ' enzyme qui se fixera sp6eif iquement sur ce suppor t insoluble.

Un po lysaechar ide trop rfiticulfi ne re t i endra pas l 'a-amylase qui est incapable de reeonna i t r e une s6quence assez longue de son substrat. Par contre, si la r6t ieulat ion est trop faible, l '~-amy- lase, non seulement reconna i t son snbstrat, mais l 'a t taque. C'est ce qui a 6t~ d6crit par Mateescu et coll. [3].

D . O

28O ..

21 :;l B

O

Fie,. 1. - - Chromatographie d'une a-amylase sur ami- don rdticuld.

Colonne de 1 X 25 em - - Elution par : A) Tampon maldate 0,01 M; pH 6,5, additionnd d'ae~tate de cal- cium 0,0'1 M, B) Solution de maltose. - - 2M D.O. h 280 nm. - - , - - & - - A e t i v i t f i et-alnylasique (R6aetion h l ' iode:

voir texte).

! I

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I ' , ; ; ",

L

I-5 2 0 F r a c t i o n n"

La fixation des a-amylases est max imale h pH 6,5, pH voisin du pH op t imum de ces enzymes.

La puri f icat ion d 'une .a-amylase bact6r ienne par eh romatograph ie d'affinite sur amidon retieul6 est seh6matis6e dans la figure 1.

Les prot6ines eontaminantes et les enzymes autres que l 'a-amylase ne sont pas retenues par le suppor t et sont 61u6es d i rec tement par le tampon d '~qui t ibrage de la eolonne.

Diff6rents essais d'61ution de l ' enzyme par aug- menta t ion de la force ionique de l'61uant ( tampon addi t ionn6 de KC1 2: M) et par modif icat ion du pH (pH 4 h pH 8) se sont r6v616s inefficaees.

Par eontre, il est possible d'filuer l ' enzyme, soit pa r une solution de son propre substrat, l ' amidon, soit par une solution de maltose 2 M; Fun ou l 'aut re 6tant dissous dans le tampon d '6qui l ibrage de la eolonne.

L'61ution sp6eifique par le substrat de l ' enzyme est une p reuve de sa fixation par affinit6 sur l ' amidon r6tieul6. Cependant , l 'blution par le mal- tose est pr6f6rable ear apr6s 61ution par l ' amidon, l '61iminalion de l 'exe6s de substrat s 'av6re diffi- t i le .

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

Chromatographie d'affinitd de /'u-amylase. 1301

Le maltose est faci lement s6par6 de Pa-amylase par passage de l%luat sur une colonne de Sepha- dex G 25.

Diff6rentes concent ra t ions de maltose ont 6te essay6es pour 61uer l 'enzyme. Avec des concentra- t ions inf6rieures h 2 M, l'61ution est possible mats l 'enzyme n'est pas 61u6e en un pie aussi 6troit qu 'avec les solutions 2 M, ce qui condui t h une di- minu t ion du rendement de la purif icat ion.

Avec le protocole retenu, l '(t-amylase obtenue se r6v61e homogbne "h l '61ectrophorbse en gel de poly- acrylamide-agarose et le r endement de purifica- t ion est d ' env i ron 60 p. cent.

Pour une colonne contenant 2 g d ' amidon r6ti- cul6, la capacit6 de saturat ion est de l 'ordre de 60 Unit6s a-amylasiques.

L ' amidon r6tieul6 consti tue un support sp6ci- fique pour la fixation des c~-amylases : lorsque, sur une colonne, est chromatographi6 un m61ange con tenan t les activit6s a- et ,~-amylasiques asso- ci6es, seule l'c~-amylase est retenue. L'activit6 B-amylasique est 61u6e dans le premier pic en m6me temps (lue les prot6ines contaminantes (fig. 2). Ceci peut 6tre v6rifi6 par chromatographie des mil ieux d ' incuba t ion d 'une solution d ' amidon en pr6sence de chacun des pics d'61ution, l~e pre- mier pic, 61u6 par le tampon d '6quil ibrage de la colonne condui t h la seule l ib6rat ion de maltose, d6gradation caract6rist ique de celle r6alis6e par une exoamylase (B-amylase). Le deuxi6me pic, 61@ par la solution de maltose 2 M, condui t h la l ib6rat ion d 'une s6rie d 'ol igosaccharides de degr6 de polym6risa l ion vari6s, d6gradat ion caract6- r ist ique de celle r6alis6e par une endoamylase (a-amylase).

D.O 2 B O n u

0 5 I 0

A

! I A •

I t

! |

15 2 0 F rac t i on n"

Fro. 2. - - C h r o m a t o g r a p h i c d 'un md lange d'a- et de B-amy lases sur a m i d o n rdliculd. Conditions identiques h celles d6erites pour la figure 1. - - D . O . h 280 nm. - -A--J , - -Act iv i t6 c~-amylasique (R6aetion h l ' iode:

voir textel. - -Q--®--Aet iv i t6 ~-amylasique (Dosage des groupes

r~ddueteurs ]ib6rds : voir texte).

Ce proc6d6 consti tue done un moyen siml)le pour s6parer les deux activit6s endo- et exopoly- sacchar idasiques associ6es. Ceci peut 8lre int6res- sant lors de la pr6para t ion de maltose h par t i r de l ' amidon, pr6para t ion n6cessitant des 8-ainylases exemptes de toute activit6 ~-amylasique.

DISCUSSION.

A notre connaissance, deux techniques de pur i - fication &a-amylase par chromatographic d'affi- nit6 ont 6t6 raises au point r6ceminenl par Tkachuk [8] et par Buonocuore [91. Mats elles n6cessitent des supports dont la pr6para t ion est plus complexe que celle de l ' amidon r6ticul6 : glycog~ne- CHSepharose 4B et a lbumine de grain de b16 coupl6e au Sepharose 2B. Cette derni6re technique ut i l i sant comme l igand un inh ib i t eur n'est applicable qu 'aux u-amylases inhib6es par cette prot6ine.

Mateescu et coll. [31 font 6galement ment ion d'essai de s6paral ion des activit6s a- et /3-amyla- siques par chromatographic d'affinit6 [10] sur le support pr6c6demment cit6. La ~-amylase n 'est pas re tenue par ce support, l / a -amylase n 'est que retard6e car elle attaque le support avec lib6ra- t ion d 'ol igosaccharides qui en t ra inen t une 61ution de l 'enzyme au fur et h mesure de leur l ib6ration. En effet, le volume de la colonne d iminue eonsid6- rab lement lots de la chronmtographie .

Dans ce cas, l 'amylose rdticul6 consti tue non un support d'affinit6, mats un substrat sp6cifique de l 'u-amylase qui permet de dis t inguer entre une solution d'ct-amylase et une solution de ~-amylase, mais qui ne permet pas de mettre en 6vidence une activit6 :~-amylasique en pr6sence d 'une acti- vit6 a-amylasique.

Dans notre cas, une s6paration nette des deux enzymes est possible car les condi t ions de r6ticu- lat ion sont choisies de telle sorte que l 'a-amylase n 'a t taque pas le support. Elle est a insi fix6e sp6ei- f iquement alors que toutes les autres prot6ines contaminantes ne sont pas retenues.

La technique de chromatogral)hie d'affinit6 des a-amylases ut i l i sant l ' amidon r6ticul6 const i tue un moyen simple et rapide de pur i f icat ion d'a-alny- lases de diverses origines (bact6rienne, v6g6tale). Elle peut aussi 8tre mise "& profit pour la s6para- t ion d'activit6s endo- et exopolysaccharidasiques associ6es.

R e m e r c i e m e n t s .

Ce travail a b6n6fici6 d'une aide de la D.G.R.S.T. (n ~' 75.7 0538).

BIOCHIMIE, 1976, 58, n" 11-12.

1 3 0 2 M. W e b e r , M.-J. Fog l i e t t i el F. P e r c h e r o n .

N o u s a d r e s s o n s t o u s n o s r e u l e r e i e m e n t s h M o n s i e u r le P r o f e s s e u r J. E. Cour to i s p o u r l ' i n t6 r6 t qu ' i l a por t6 h e e t r a v a i l .

R~SUM~.

La c h r o m a t o g r a p h i e d ' a f f ln i td su r a m i d o n r6t ieuld e o n s t i t u e u n m o y e n s i m p l e et r a p i d e de p u r i f i c a t i o n d ' c t - a m y l a s e s (EC 3.2.1.1) de d i v e r s e s o r ig ines . La p ro - t~ ine r e s p o n s a b l e de l ' ae t iv i td c~-amylas ique es t r e t e n u e s p d e i f i q u e m e n t s n r le s u p p o r t e t e s t ~lude p a r u n e so lu - t i on de m a l t o s e 2M.

La [3-amylase (EG 3.2.1.2) n ' e s t p a s r e t e n u e p a r le s u p p o r t , done eet te t e c h n i q u e p e r m e t la s d p a r a t i o n des ac t iv i tds exo- et e n d o a m y l a s i q n e s .

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BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.