QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION

QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION L’inflammation est la réponse des tissus vivants à une agression ; elle constitue l’un des

mécanismes les plus importants des défenses de l’organisme. Bien que bénéfique, car elle permet

d’éliminer l’agent pathogène, l’inflammation peut devenir néfaste notamment en causant de

nombreux dommages tissulaires suite à une activité très importante des cellules inflammatoires,

une libération accrue d’espèces réactives oxygénées ou à une trop grande agressivité de l’agent

pathogène (Russo-Marie et coll., 1998). De nos jours, l’athérosclérose, l’asthme et le cancer

peuvent être associés à une inflammation chronique (Parke et Parke, 1997 ; Macarthur et coll.,

2004). Le traitement de telles maladies, long, coûteux et inaccessible à la plupart des populations

pauvres, nécessite l’utilisation des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et stéroïdiens

(AIS). Les anti-inflammatoires (AINS et AIS) agissent sur les effets initiateurs ou amplificateurs

de l’inflammation (migration des cellules inflammatoires, libération de prostaglandines et

leucotriènes, ERO…). Toutefois, l’utilisation des molécules anti-inflammatoires, essentiellement

d’origine synthétique, n’est pas sans effets nocifs pour l’organisme ; notamment, l’usage prolongé

des AINS peut entraîner des troubles au niveau du tractus gastro-intestinal, des toxicités au niveau

du rein et de la peau (Ng, 1992). Dès lors, la recherche de molécules actives dotées de faibles

effets secondaires s’avère nécessaire. De telles molécules sont présentes dans les plantes qui

constituent, parfois, la seule source de traitement pour les populations pauvres (OMS, 2002 ;

Kumaraswamy et coll., 2010). Généralement, les composés impliqués dans l’activité anti-

inflammatoire des plantes comprennent les dérivés polyphénoliques, les stérols et les triterpènes

(Adedapo et coll., 2008).

Sur la base des résultats antérieurs (Traoré, 2000 ; Ouédraogo et coll., 2005a ; Ouédraogo et

coll., 2005b ; Boly, 2007), nous avons entrepris d’extraire et d’identifier les composés

polyphénoliques présents dans Agelanthus dodoneifolius, plante hémiparasite utilisée en

médecine traditionnelle burkinabè pour le traitement de plusieurs pathologies inflammatoires

chroniques telles que l’asthme ou les gastroentérites (Nacoulma/Ouédraogo, 1996). Les composés

polyphénoliques sont connus pour leurs effets antioxydant, antimicrobien, antiviral et

anticancéreux (Narayana et coll., 2001 ; Havsteen, 2002).

Bien qu’elles soient efficaces, il est nécessaire d’établir des bases scientifiques d’un

traitement traditionnel avec les plantes (Kumaraswamy et coll., 2010). C’est dans ce but que nous

nous sommes intéressés à étudier les propriétés anti-inflammatoire et anticancéreuse de

Agelanthus dodoneifolius.

La CCM et la chromatographie d’adsorption sur colonne (« chromatographie ouverte »)

sont des outils analytiques régulièrement réalisés dans les laboratoires de pharmacognosie

pour l’investigation phytochimique d’un extrait ; ces techniques donnent un aperçu rapide sur

la composition chimique d’un extrait donné. Nous avons comparé la composition chimique du

décocté aqueux, une des formes d’utilisation traditionnelle de la plante Agelanthus

dodoneifolius, avec celle des fractions organiques obtenues après un épuisement et un

fractionnement sur une colonne ouverte. La méthode d’extraction des flavonoïdes permet

d’obtenir des fractions pas très chargées comme l’indique la diminution du nombre de spots

de la fraction éther diéthylique à la fraction butanolique. La chromatographie liquide couplée

avec les méthodes de détection spectrophométrique (UV) et spectrométrique (MS) a permis

d’identifier et de quantifier plusieurs constituants polyphénoliques de Agelanthus

dodoneifolius. Les résultats rapportés indiquent que la composition du décocté aqueux diffère

de celle des fractions organiques ; ces dernières diffèrent aussi entre elles par la présence ou

l’absence d’un composé donné.

1 Au niveau des résultats obtenus dans le cadre de

l’inflammation Les résultats obtenus montrent que le décocté aqueux et les fractions organiques de la

plante Agelanthus dodoneifolius sont capables de moduler, in vitro, certaines activités

biologiques des neutrophiles telles que la production des espèces réactives de l’oxygène et la

libération de la myéloperoxydase.

1.1 Inhibition de la production des espèces réactives de

l’oxygène (ERO) par les neutrophiles stimulés avec le PMA Le site inflammatoire comprend de nombreuses cellules inflammatoires qui libèrent

beaucoup de médiateurs chimiques, susceptibles d’être pro- ou anti- inflammatoires. Les espèces

réactives de l’oxygène (ERO) libérés par les neutrophiles et les monocytes au cours du

métabolisme oxydant pour leur activité microbicide représentent l’un des médiateurs les plus

importants impliqués dans l’inflammation (Russo-Marie et coll., 1998). Lorsque la production des

ERO est contrôlée, l’agent infectieux est détruit et l’intégrité cellulaire est préservée. Toutefois,

lorsque cette production devient excessive, il s’en suit une exacerbation des réactions d’oxydation

qui peuvent devenir cytotoxiques pour les cellules productrices elles-mêmes et les cellules

voisines (Russo-Marie et coll., 1998). Les ERO sont à l’origine de plusieurs pathologies telles

que le vieillissement, les cancers et les maladies inflammatoires chroniques (Parke et Parke,

1995 ; Wright et coll., 2010).

L’anion superoxyde est la première espèce réactive oxygénée formée par la NADPH

oxydase dans les systèmes biologiques ; il est à l’origine de la formation des autres espèces

radicalaires et non radicalaires (Van Dyke et coll., 2003). L’organisme s’oppose à l’effet nocif

des ERO par des antioxydants (« contre les oxydants »). Un antioxydant est une substance,

qui, présente à de faibles concentrations par rapport à un substrat peut significativement

retarder ou inhiber l’oxydation de ce dernier (Halliwell et Gutteridge, 1995). Ainsi, de part

son potentiel antioxydant, une molécule pourrait être anti-inflammatoire puisqu’elle permet

de limiter la production et les effets des ERO. Le PMA a été utilisé pour activer le

neutrophile ; ce composé a été choisi sur la base des résultats d’études antérieures, portant sur

la production des ERO et la dégranulation aussi bien par les neutrophiles humain qu’équin

(Paula et coll., 2009; Franck et coll., 2009). Le PMA stimule la NADPH oxydase via une

activation de la PKC qui est un récepteur des esters de phorbol alors que d’autres stimuli tels

que le peptide bactérien N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) se fixent sur des

récepteurs membranaires déclenchant des réponses intracellulaires qui impliquent des

phospholipases et des kinases (Burg et Pilliger, 2001 ; Franck et coll., 2009 ; Paula et coll.,

2009).

La production des ERO a été suivie par la chimiluminescence en présence de la

lucigénine, composé connu pour interagir spécifiquement avec l’anion superoxyde (Van Dyke

et coll., 2003). Les résultats présentés sur la figure 35 et le tableau V montrent que le décocté

aqueux et les fractions organiques des parties aériennes de Agelanthus dodoneifolius inhibent

de manière dose-dépendante la production de l’anion superoxyde. A partir de ces résultats

préliminaires, les fractions à l’acétate d’éthyle et au butanol ont été fractionnées sur une

colonne ouverte. Les sous fractions obtenues, notamment les sous fractions acétate,

conservent un bon effet inhibiteur sur la production des espèces radicalaires. Le meilleur effet

inhibiteur des fractions organiques, notamment les fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate

d’éthyle, pourrait être corrélé avec leur forte teneur en composés polyphénoliques (Tableaux

III et IV). Parmi les composés polyphénoliques présents dans les fractions à l’éther

diéthylique et à l’acétate d’éthyle, on peut noter la présence prépondérante de l’acide gallique

et de la catéchine qui se retrouvent également dans les sous fractions, particulièrement dans la

sous fraction Ac1. Les composés polyphénoliques sont des composés ubiquitaires qui

comprennent des acides phénoliques (phénols simples), des stilbènes, des flavonoïdes, des

lignanes, des lignines et des tanins (Vacek et coll., 2009). Ils sont communément connus pour

leur effet antioxydant, lequel se caractérise notamment par (i) la réduction des ERO en

transférant un atome d’hydrogène pour former des intermédiaires radicalaires plus stables ou

par (ii) l’inhibition des enzymes impliquées dans la production radicalaire comme la NADPH

oxydase, la xanthine oxydase et la PKC (Rice-Evans et coll., 1996 ; Pietta, 2000 ; Narayana et

coll., 2001 ; Havsteen, 2002). Des études antérieures basées sur les relations structure-activité

ont démontré l’effet inhibiteur des composés polyphénoliques tels que les flavonoïdes sur la

PKC et la NADPH oxydase. Les auteurs ont montré que cet effet serait essentiellement lié à

leur structure (Tauber et coll., 1984 ; Ferriola et coll., 1989 ; Narayana et coll., 2001 ;

Havsteen, 2002). Aussi, l’effet antioxydant des fractions de Agelanthus dodoneifolius pourrait

être dû à une interaction directe avec les ERO libérés par les neutrophiles activés et/ou à

l’inhibition de la NADPH oxydase ou la PKC.

1.2 Inhibition de la libération de la myéloperoxydase par les

neutrophiles activés avec le PMA Le neutrophile, recruté sur le site inflammatoire, est un granulocyte caractérisé par la

présence de nombreux granules regroupés en quatre types selon leur contenu. Les granules

primaires, parmi les mieux caractérisés, contiennent spécifiquement des hydrolases acides, des

protéases neutres comme l’élastase, de la myéloperoxydase et des défensines (Russo-Marie et

coll., 1998 ; Abdel-Latif et coll., 2005). Ces granules libèrent leur contenu essentiellement dans le

phagolysosome pour détruire les particules phagocytées (Russo-Marie et coll., 1998 ; Abdel-Latif

et coll., 2005 ; Cowburn et coll., 2008). La libération importante de la MPO, hors du phagosome,

est le signe d’une activation excessive ou la mort du neutrophile. Les neutrophiles hyperactivés

sont impliqués dans le développement de plusieurs processus inflammatoires aigu et chronique

comme le syndrome de détresse respiratoire aigu, l’asthme, l’artériosclérose et la polyarthrite

rhumatoïde (Serteyn et coll., 2003 ; Selloum et coll., 2004 ; Abdel-Latif et coll., 2005 ; Cowburn

et coll., 2008). Aussi, est-il nécessaire de trouver des molécules capables de moduler la

dégranulation des neutrophiles. A cet effet, nous avons testé différentes fractions de Agelanthus

dodoneifolius sur la libération de la MPO en utilisant un test ELISA de type « sandwich ». Les

fractions testées ont un effet inhibiteur dose-dépendante et l’effet est plus prépondérant avec les

fractions au butanol et à l’acétate d’éthyle (Figure 36 et Tableau VI).

Le processus de dégranulation dépend de plusieurs facteurs comme le cytosquelette

d’actine, le taux de calcium intracellulaire et la voie de signalisation de la PKC (Abdel-Latif et

coll., 2005 ; Jog et coll., 2005). Des études antérieures ont montré qu’une désorganisation du

réseau d’actine peut activer ou inhiber la dégranulation (Jog et coll., 2005). Dans le cas des

granules azurophiles, il a été montré que le cytosquelette d’actine inhibe la dégranulation en

empêchant leur fusion avec la membrane plasmique aussi bien dans les conditions normales que

de stimulation afin de prévenir la libération des enzymes destructrices comme la MPO (Jog et

coll., 2005). L’élévation du taux de calcium intracellulaire régule le processus de dégranulation

dans lequel les granules azurophiles sont les derniers excrétés (Borregaard et Cowland, 1997). Le

calcium a de multiples sites d’action comme les protéines du réseau d’actine ou de la PKC

(Russo-Marie et coll., 1998).

L’effet inhibiteur de la fraction butanolique pourrait être lié à sa forte teneur en flavonoïdes,

notamment en rutine. Les flavonoïdes peuvent inhiber le processus de dégranulation en (i)

interagissant avec les récepteurs de la membrane cellulaire, en (ii) empêchant l’élévation de la

concentration du calcium intracellulaire par une inhibition de la phospholipase C ou en (iii)

inhibant directement la PKC (Middleton et coll., 2000 ; Narayana et coll., 2001 ; Kaneto et coll.,

2008). Si des composés polyphénoliques tels que l’acide gallique, la quercétine et la rutine ont

déjà démontré leur efficacité sur la dégranulation (Kroes et coll., 1992 ; Takemura et coll., 1997 ;

Havsteen, 2002 ; Selloum et coll., 2003), il faut toutefois noter que dans notre modèle, ni la

quercétine ni l’acide gallique n’ont montré un effet inhibiteur ; il se pourrait que ceci soit lié à

l’utilisation du PMA comme stimulus. Toutefois, il faudrait vérifier cette hypothèse en utilisant

d’autres stimuli comme le peptide fMLP ou le zymozan.

On note aussi que la sous fraction acétate Ac1 n’inhibe pas la libération de la MPO alors que la

sous fraction Ac2 présente un effet modéré ; ces résultats suggèrent que l’effet inhibiteur de la

fraction à l’acétate d’éthyle (fraction mère) serait la somme des effets de chacun des composés

présents dans cette fraction. Parmi les sous fractions butanolique, seule la sous fraction But1

démontre un effet inhibiteur marqué sur la dégranulation avec une IC50 de 4.1 ± 1.3 µg/ml ; elle

ne contient pas de rutine comme la fraction mère et nous n’avons pas pu identifier les composés

majoritaires présents dans cette fraction. Toutefois, sur la base des tests de caractérisation

chimique (Geissmann, 1962) et des mesures de masse par HPLC-UV-MS (masses très élevées)

(données non présentées), il se pourrait que la sous fraction But1 contienne des

proanthocyanidines ou tanins condensés, polymères de flavan-3-ols ou de catéchine (Gu et coll.,

2003). La présence des tanins condensés ou catéchiques dans la plante Agelanthus dodoneifolius

avait déjà été rapportée (Traoré, 2000).

1.3 Inhibition de l’activité de la myéloperoxydase La MPO mature est un homodimère formé de deux monomères à deux sous-unités

(lourde et légère) chacun et reliés par un pont disulfure. Sa structure héminique est dérivée de

celle de l’hème b ou porphyrine IX (Deby-Dupont et coll., 1999). La MPO est dotée d’une

activité peroxydasique et de chloration avec dans chaque activité le peroxyde d’hydrogène

comme substrat (Figure 4). Il existe aussi d’autres substrats potentiels de la MPO tels que les

anions chlorure, le monoxyde d’azote, des acides aminés aromatiques ou des dérivés

indoliques (Lau et Baldus, 2006). Compte tenu du rôle de la MPO, par elle-même et la

production d’espèces réactives oxygénées très oxydantes comme l’acide hypochloreux, dans

la pathogénie de diverses maladies inflammatoires, il est nécessaire de développer des

stratégies thérapeutiques visant à inhiber son activité (Lau et Baldus, 2006 ; Malle et coll.,

2007). Bien que les inhibiteurs spécifiques de l’activité enzymatique de la MPO soient rares,

des composés comme l’acide salicylhydroxamique (Salicylhydroxamic Acid ou SHA),

l’hydrazide de l’acide 4-amino-benzoïque et des anti-inflammatoires tel que l’acide

flufénamique se sont montrés actifs sur l’inhibition de l’activité de la MPO (Lau et Baldus,

2006 ; Malle et coll., 2007 ; Van Antwerpen et coll., 2007). Ces composés interagissent avec

la production de l’acide hypochloreux ou se fixent sur le site catalytique de l’enzyme

provoquant son inactivation. Toutefois, l’inhibition de la MPO dépend de plusieurs facteurs

comme la concentration en peroxyde d’hydrogène dans le cas d’une inhibition avec l’acide

salicylhydroxamique (Malle et coll., 2007).

Dans notre modèle de dégranulation des neutrophiles, nous avons utilisé le test ELISA

qui mesure la MPO totale libérée par les neutrophiles activés. La MPO totale comprend une

fraction active et une fraction inactive. Le test ELISA ne permet donc pas la mesure réelle de

l’activité enzymatique de la MPO. Franck et coll. (2006) ont donc mis au point une nouvelle

méthode d’analyse, le SIEFED, qui permet de mesurer l’activité spécifique de la MPO sans

interférences. Nous avons utilisé cette méthode pour évaluer, pour la première fois, l’effet du

décocté aqueux et des fractions organique des parties aériennes de Agelanthus dodoneifolius

sur l’activité de la MPO.

Les résultats montrent un effet inhibiteur dose-dépendante pour toutes les fractions testées

avec toutefois, une inhibition plus prononcée pour les fractions à l’acétate d’éthyle et à l’éther

diéthylique (Figure 37). Cette excellente activité pourrait s’expliquer par la forte teneur en

composés polyphénoliques. En effet, les dérivés polyphénoliques sont susceptibles d’interagir

soit avec le site catalytique de l’enzyme soit avec le substrat comme le peroxyde d’hydrogène.

Selon Malle et coll., (2007), les antioxydants comme la vitamine C et les composés

polyphénoliques comme l’acide chlorogénique pourraient représenter de potentiels inhibiteurs

de la MPO.

Des études antérieures ont montré que des composés polyphénoliques comme l’acide

gallique, la quercétine, le resvératrol, la myricitrine et la curcumine sont des substrats et des

inhibiteurs efficients de la MPO (Kato et coll., 2003 ; Kohnen et coll., 2007 ; Meotti et coll.,

2008 ; Shiba et coll., 2008). Par des techniques de modélisation informatique, Shiba et coll.

(2008) suggèrent que l’effet inhibiteur de la quercétine et sa forme glycosylée (quercétine 3-

O-glucuronide) serait dû à leur interaction avec le site actif de la MPO au niveau de la région

hydrophobe située à l’entrée de la cavité de l’hème distal. L’effet inhibiteur est d’autant plus

important que le flavonoïde possède une fonction catéchol sur le noyau B, une double liaison

entre les carbones 2 et 3, des groupements hydroxyles en position 3-, 4- et 5- (Figure 34)

(Meotti et coll., 2008 ; Shiba et coll., 2008).

2 Au niveau des résultats obtenus dans le cadre du cancer Les résultats obtenus sur l’activité anticancéreuse montrent que les fractions de

Agelanthus dodoneifolius inhibent modérément la prolifération des cellules cancéreuses.

Aucune des sous fractions, acétate et butanolique, testées ne présente une activité

antiproliférative (IC50 > 100 µg/ml). La présence de la quercétine dans les fractions à l’éther

diéthylique (3.1 g/kg) et à l’acétate d’éthyle (1.9 g/kg) pourrait expliquer, en partie, le

meilleur effet inhibiteur qu’elles affichent par rapport aux autres fractions.

2.1 Les propriétés anticancéreuses des composés

polyphénoliques en général Le cancer est un processus multi-étapes résultant d’une part de l’activation des

oncogènes et de l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs et d’autre part des

interactions complexes entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement stromal. Ces

interactions sont impliquées dans les processus d’invasion et de métastase (Wang et Sun,

2010 ; Hanahan et Weiberg, 2011).

La chimiothérapie est largement utilisée dans le traitement du cancer et les nombreux

médicaments disponibles en clinique sont d’origine synthétique ou naturelle. Selon Newman

et Cragg (2007), de 1940 à 2006, 47% des 155 anticancéreux approuvés cliniquement sont

d’origine naturelle ou dérivent directement des composés naturels.

Bien que le cancer soit souvent mal défini ou diagnostiqué dans les milieux traditionnels,

l’utilisation des plantes comme source d’agents anticancéreux est important et les vinca-

alcaloïdes sont les premiers agents anticancéreux d’origine végétale utilisés en clinique

(Cragg et coll., 2009). Depuis, de nombreux autres composés comme les polyphénols ont été

isolés à partir des plantes et utilisés efficacement contre le cancer. Les polyphénols sont des

métabolites secondaires caractérisés par au moins un noyau aromatique et entre un ou

plusieurs groupements hydroxyles. Ces composés ubiquitaires, communément regroupés en

acides phénoliques (phénols simples), flavonoïdes et en tanins, arborent plusieurs propriétés

biologiques : antimicrobiens, anti-inflammatoires, antioxydants, antiallergiques et

anticancéreux (Havsteen, 2000 ; Middleton et coll., 2000 ; Vacek et coll., 2009). Parmi les

composés polyphénoliques, les flavonoïdes sont les plus nombreux. En effet, ils représentent

plus de la moitié des 8000 composés phénoliques naturels (Balasundram et coll., 2006).

Selon les données de l’OMS (2009), 40% des cancers peuvent être prévenus par la diminution

de certains facteurs de risque tels que la consommation du tabac et de l’alcool ou la

diminution de l’exposition solaire. Des études épidémiologiques et expérimentales chez

l’animal ont démontré l’importance des facteurs alimentaires sur le développement des

cancers et une alimentation riche en vitamines et en polyphénols (fruits et légumes)

permettrait de réduire les risques de développer les maladies cardiovasculaires et certains

cancers tels que le cancer colorectal ainsi que celui de l’estomac, du poumon et de l’œsophage

(Rice-Evans et coll., 1996 ; Yao et coll., 2004 ; Gibellini et coll., 2010). L’objectif de la

chimioprévention du cancer est de supprimer ou d’inverser le processus de la cancérogénèse

par des composés chimiques (Shu et coll., 2010). Les composés phytochimiques utilisés dans

la chimioprévention interviennent dans le processus de la cancérogénèse par leurs effets anti-

inflammatoire et antioxydant d’une part et d’autre part par leur capacité à protéger le génome

(Shu et coll., 2010). L’utilisation des flavonoïdes, composés phytochimiques, dans la

chimioprévention est de plus en plus rapportée malgré des résultats contrastés (Gibellini et

coll., 2010). La capacité des flavonoïdes à prévenir le cancer serait lié à leurs talents de

piégeurs d’espèces réactives oxygénées ou à leurs effets modulateurs sur certaines enzymes

oxydantes comme la lipooxygénase, la cyclooxygénase et la NADPH oxydase (Yao et coll.,

2004 ; Gibellini et coll., 2010). Ainsi, l’effet protecteur du thé serait dû à la présence des

catéchines, comme l’épicatéchine gallate (ECG), l’épigallocatéchine (EGC) et

l’épigallocatéchine gallate (EGCG) qui agiraient en : (i) piégeant les espèces réactives

oxygénées, (ii) bloquant la division cellulaire, (iii) induisant l’apoptose et en (iiii) inhibant la

promotion de la cancérogénèse (Yao et coll., 2004 ; Gibellini et coll., 2010).

Toutefois, les composés polyphénoliques comme la curcumine et les flavonoïdes peuvent

aussi être utilisés pour le traitement des cancers (Pan et coll., 2010 ; Shu et coll., 2010). La

curcumine est capable de bloquer la prolifération de nombreuses cellules malignes en agissant

sur la régulation des voies de signalisation intracellulaire. Elle peut aussi interagir avec des

facteurs de transcription, les récepteurs des facteurs de croissance ou les protéines kinases

(Pan et coll., 2010). Selon les études réalisées in vitro et in vivo, les cancers susceptibles

d’être traités par les flavonoïdes comprennent notamment les leucémies, les cancers de la

peau, du sein, du poumon, du tractus gastro-intestinal et les cancers de l’appareil reproducteur

(prostate et utérus) (Havsteen, 2000 ; Ravindranath et coll., 2009). Ravindranath et coll.

(2009) ont montré que les composés polyphénoliques du thé inhibaient la prolifération des

cellules des cancers de l’ovaire, de la prostate et de mélanome ; dans le cas des cancers de

l’appareil reproducteur, ces auteurs ont montré que l’effet anticancéreux des catéchines du thé

varie avec le type et le stade de la malignité (Ravindranath et coll., 2009).

Les effets anticancéreux des composés polyphénols en général et des flavonoïdes en

particulier seraient dus à leur pouvoir antioxydant et à leur capacité à interférer avec les voies

de régulation cellulaire comme celles de la croissance cellulaire, du métabolisme énergétique,

de l’apoptose, de la division cellulaire, des réparations génétiques et de l’inflammation

(Havsteen, 2000 ; Lamoral-Theys et coll., 2010a). Les cellules cancéreuses peuvent acquérir

une grande capacité à proliférer lorsque l’activité des protéines kinases impliquées dans le

contrôle du cycle cellulaire est dérégulée (Lamoral-Theys et coll., 2010a). Ainsi, l’activité

anticancéreuse (inhibition de la prolifération et induction de la mort cellulaire dans les lignées

cellulaires du cancer de la vessie) de la baicaléine est liée d’une part à l’inhibition des

protéines kinases cycline-dépendantes 2 et à l’activation des MAP Kinases d’autre part.

L’activité antikinase des composés tels que les polyphénols serait liée à leur capacité à inhiber

la phosphorylation ou les interactions protéine-protéine (Lamoral-Theys et coll., 2010a).

C’est en raison de leurs nombreux effets, que la plupart des études consacrées aux plantes ont

notamment pour objectifs d’isoler à partir d’un extrait donné, le ou les composés (s) capables

d’expliquer l’effet anticancéreux de la plante ou à même d’être utilisé (s) comme agent (s)

thérapeutique (s). Toutefois, le ou les composé (s) pure (s) isolés peut ou peuvent se révéler

inefficace (s) par rapport à l’extrait total, suggérant ainsi des actions synergiques des

différents composés présents dans l’extrait (Liu, 2004). C’est dans cette optique que nous

nous sommes attelés à identifier les différents composés polyphénoliques présents dans les

fractions de Agelanthus dodoneifolius et à tester ces fractions sur trois lignées cancéreuses.

Les résultats montrent que les fractions dotées d’un effet inhibiteur de la croissance (Figure

38 et Tableau VII) contiennent la quercétine, l’un des flavonoïdes les plus importants de

notre alimentation (Yao et coll., 2004 ; Gibellini et coll., 2010). Cependant, il faut souligner

que l’effet antiprolifératif des fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle est dû à

l’ensemble des composés présents dans ces fractions et non à la quercétine seule. Pour la

suite, nous allons discuter particulièrement des effets anticancéreux de la quercétine.

2.2 Les propriétés anticancéreuses liées à la quercétine en

particulier La quercétine est un flavonoïde de la classe des flavonols caractérisés par la présence

d’un groupement hydroxyle en position 3 sur le cycle C (Figure 33). Les flavonols sont les

plus abondants dans l’alimentation avec la quercétine, le kaempférol et la myricétine les plus

communément rencontrés (Yao et coll., 2004). La quercétine est un composé très abondant

dans les oignons et les pommes ; elle est à une teneur généralement inférieure à 10 mg/kg

dans les parties comestibles des plantes (Yao et coll., 2004).

La consommation de la quercétine aurait un effet dans la chimioprévention ; ainsi, son

absorption serait inversement proportionnelle avec le risque de développer le cancer du

poumon (Liu, 2004). Le rôle de la quercétine dans la chimioprévention pourrait être dû à son

activité antioxydante et ses interactions avec différents récepteurs cellulaires et voies de

signalisation intracellulaire (Murakami et coll., 2008 ; Gibellini et coll., 2010). Notamment,

certaines études ont montré l’effet de la quercétine sur différentes étapes de la cancérogénèse

telles que la régulation du cycle cellulaire, l’apoptose et l’angiogenèse (Murakami et coll.,

2008) ; ainsi, il apparaît que cette molécule soit capable de bloquer les différentes étapes du

cycle cellulaire et d’induire l’apoptose suivant les voies intrinsèque et extrinsèque,

particulièrement en modulant les enzymes, telles que les kinases, impliquées dans ces

différents processus (Murakami et coll., 2008 ; Gibellini et coll., 2010).

Les résultats obtenus dans cette étude corroborent avec ceux des précédentes études en

ce qui concerne les propriétés anticancéreuses de la quercétine in vitro ; nous avons

effectivement montré que la quercétine a des effets inhibiteur de la croissance et cytostatique.

Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle ces différents effets pourraient être dus à une

interaction avec certaines kinases. L’hypothèse a été vérifiée : nous avons montré que la

quercétine aux concentrations de 2 et 30 µM présente une importante activité antikinase (Boly

et coll., 2011b). La quercétine inhibe à 95% plusieurs tyrosine kinases surexprimées dans

certains cancers comme la tyrosine kinase abl (formes sauvage et mutante) surexprimée dans

la leucémie myéloïde chronique (Bumbea et coll., 2010 ; Jabour et coll., 2010). A 2 µM,

concentration ni cytotoxique ni cytostatique, la quercétine inhibe les 3 classes de protéines

kinases Aurora qui sont impliquées dans la régulation de la mitose (Katayama et Sen, 2010).

Les protéines kinases Aurora A et B sont essentielles à l’assemblage correct des

chromosomes, la formation du fuseau mitotique et à la cytocinèse. La quercétine à la

concentration de 2 µM inhibe aussi d’autres protéines kinases activées de manière aberrante

dans des cancers telles les kinases CDC-Like Kinase (CLK 1 et 4), Fms-Like Tyrosine kinase

receptor 3 (FLT3, formes sauvage et mutante), Janus (Jak 2 et 3), MET (formes sauvage et

mutante), NEK (NEK 4 et 9), p21-Activated Kinase (PAK 1, 2, 3 et 6), PIM (PIM 1 et 3),

RET (formes sauvage et mutante), Fibroblast Growth Factor Receptor (FGF-R, formes

sauvage et mutante) et Platelet-Derived Growth Factor Receptor (PDGF-R α et β) (Boly et

coll., 2011b).

Dans les plantes, les flavonoïdes comme la quercétine se rencontrent généralement sous forme

de glycosides et les principaux sucres rencontrés sont le glucose, l’arabinose, le rhamnose, le

galactose et l’acide glucuronique (Pietta, 2000 ; Heim et coll., 2002 ; Cuyckens et Claeys,

2004 ; De Rijke et coll., 2006). Les différentes propriétés biologiques des composés

polyphénoliques en général dépendent de leur structure. En ce qui concerne les flavonoïdes, la

plupart des études tendent à montrer que le noyau catéchol (sur le cycle B) et l’absence de

glycosylation (sur le carbone 3 du cycle C) potentialisent leurs activités (Pietta, 2000 ;

Middleton et coll., 2000 ; Murakami et coll., 2008). La quercétine 3-O-galactose ou

hyperoside et la quercétine-3-O-glucuronide ou miquelianine n’exercent aucun effet inhibiteur

sur la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses utilisées (Figure 38) ; cela pourrait

s’expliquer par leur faible caractère lipophile, contrairement à l’aglycone, qui diminuerait leur

entrée dans la cellule.

Bien que les études in vitro aient démontré les effets préventifs de la quercétine sur le cancer,

des études in vivo montrent aussi qu’elle peut être efficace sur la prévention et le traitement

du cancer. Ainsi, la quercétine est capable de réduire de manière drastique l’incidence des

foyers de cryptes aberrantes et de lésions prénéoplasiques dans le côlon du rat avant une

exposition à l’azoxyméthane, un puissant agent cancérigène (Murakami et coll., 2008 ;

Gibellini et coll., 2010). Les principaux organes susceptibles d’être des sites d’action par la

quercétine sont le côlon, la langue, le sein, le poumon et la peau (Murakami et coll., 2008).

Les propriétés biologiques in vivo de la quercétine dépendent de sa biodisponibilité ; absorbée

sous forme de glycoside au niveau de la membrane apicale des entérocytes, la quercétine est

hydrolysée puis convertie dans ses formes conjuguées par l’action enzymatique de l’uridine

diphosphate glucuronosyltransférase (UGT) et/ou une phénol sulfotransférase (PST)

(Murakami et coll., 2008 ; Gibellini et coll., 2010). Parmi les principales formes conjuguées

de la quercétine présentes dans le plasma, on peut citer la quercétine 3’-O-β-D-glucuronide, la

quercétine 3-O-β-D-glucuronide et la quercétine 4’-O-β-D-glucuronide (Murakami et coll.,

2008 ; Chen et coll., 2010). Si la conjugaison tend à diminuer les activités biologiques de la

quercétine, des études suggèrent que l’activité in vivo de la quercétine puisse s’expliquer par

l’action d’une glucuronidase qui libère l’acide glucuronique pour permettre à l’aglycone

d’interagir avec une cible donnée (Murakami et coll., 2008).

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Conclusions

La médecine traditionnelle constitue parfois l’unique source de soins pour de

nombreuses populations à travers le monde (OMS, 2002). Selon les données de l’OMS,

environ 65% de la population mondiale a recours à la médecine traditionnelle pour assurer ses

besoins de santé (Cragg et coll., 2009).

Une des caractéristiques majeures de la médecine traditionnelle africaine est qu’elle a des

composantes spirituelle et non spirituelle; cette dernière fait habituellement référence à

l’utilisation de plantes médicinales (Nyika, 2009). L’usage généralisé des plantes est tel qu’il

est nécessaire d’établir les bases scientifiques de leur utilisation traditionnelle.

Faisant suite aux travaux antérieurs (Traoré, 2000 ; Ouédraogo et coll., 2005a ;

Ouédraogo et coll., 2005b), le présent travail a porté sur la caractérisation des propriétés anti-

inflammatoire et anticancéreuse de la plante Agelanthus dodoneifolius, utilisée en Afrique

pour le traitement de nombreuses maladies chroniques dont l’asthme, l’hypertension, les

gastroentérites et le cancer. Cette étude a tenté d’une part de comprendre les mécanismes mis

en jeu dans les processus inflammatoire et cancéreux et d’autre part elle a tenté d’identifier et

quantifier les composés responsables, du moins en partie, de ces différentes activités.

Sur le rôle anti-inflammatoire de Agelanthus dodoneifolius, nos résultats ont permis de

démontrer que son potentiel anti-inflammatoire pourrait être lié d’une part à sa capacité à

inhiber la production des espèces réactives oxygénées et d’autre part à moduler les activités

biologiques des neutrophiles. En effet, les différentes fractions de Agelanthus dodoneifolius,

en particulier les fractions organique, ont montré une forte capacité à inhiber la libération et

l’activité de la myéloperoxydase. Notamment, sur l’ensemble des activités recherchées, la

fraction à l’acétate d’éthyle était la plus active. Cette meilleure activité des fractions

organique pourrait être liée aux caractéristiques (polarité par exemple) des solvants utilisés et

à l’effet de la température qui permettent une meilleure extraction des composés

polyphénoliques (Dai et Mumper, 2010).

Les techniques de chromatographie et de spectrométrie de masse ont permis d’identifier les

composés polyphénoliques qui pourraient expliquer le potentiel antioxydant et anti-

inflammatoire de la plante ; les dosages spectrométrique et spectrophotométrique ont permis

de quantifier la teneur de ces composés dans les fractions de Agelanthus dodoneifolius. Ainsi,

les fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle ont une forte teneur en composés

polyphénoliques selon les résultats du dosage spectrophotométrique des polyphénols totaux

alors que les fractions les plus solubles dans l’eau comme le décocté aqueux et la fraction

butanolique se caractérisent par une forte teneur en flavonoïdes, en particulier les formes

glycosylées, selon les résultats du dosage avec le trichlorure d’aluminium. Les composés

polyphénoliques identifiés comprennent les acides phénoliques tels que l’acide gallique,

coumarique, férulique, ellagique, chlorogénique et les flavonoïdes comme la catéchine, la

quercétine, le kaempférol, la rutine, l’isoquercitrine et la miquelianine.

Sur le rôle anticancéreux de Agelanthus dodoneifolius, les résultats montrent que les fractions

à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle, caractérisées par la présence de la quercétine,

inhibent la prolifération de trois lignées cellulaires cancéreuses humaines en particulier les

cellules du cancer de côlon (LoVo). L’une des utilisations traditionnelles de la plante est le

traitement des gastroentérites caractérisées par une inflammation (d’origine infectieuse) du

tube digestif. Les effets antiprolifératifs des fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate

d’éthyle sur les cellules de cancer de côlon pourraient argumenter en faveur de l’utilisation de

la plante comme traitement anticancéreux vu qu’une inflammation (gastrite chronique) qui

dure peut conduire au cancer (Schottenfeld et Beebe-Dimmer, 2006).

Selon nos résultats, le potentiel anticancéreux de la quercétine est lié à ses effets

antiprolifératif, cytostatique et antikinase.

L’ensemble des résultats constitue des bases scientifiques qui pourraient justifier certaines

utilisations traditionnelles de Agelanthus dodoneifolius, communément appelé « gui

africain ».

Perspectives

L’étude bibliographique réalisée préalablement a montré que l’on disposait peu

d’informations sur Agelanthus dodoneifolius. A notre connaissance, aucune étude n’avait, au

préalable, démontré le potentiel antioxydant ni identifié les composés polyphénoliques de la

plante.

Bien que des techniques puissantes aient déjà été utilisées pour l’identification et la

quantification des composés polyphénoliques présents dans les fractions des parties aériennes

de Agelanthus dodoneifolius, elles n’ont pas permis d’identifier l’ensemble des composés ;

beaucoup de pics dans les chromatogrammes n’ont pas été identifiés soit par leur faible teneur

dans les fractions soit par l’absence de standards. Notamment, de part son effet intéressant sur

la dégranulation du neutrophile, il serait intéressant d’utiliser des outils plus spécifiques,

comme la masse couplée à la RMN, pour identifier et isoler les composés présents dans la

sous fraction butanolique But1.

Par ailleurs, les résultats ont montré une intéressante activité antikinase de la quercétine à 2

µM ; cette concentration, ni cytotoxique ni cytostatique, représentant environ 7% de l’IC50,

inhibe des kinases qui pourraient participer aussi bien dans les processus inflammatoire et

cancéreux. On pourrait envisager d’identifier l’ensemble de ces kinases et de rechercher

l’effet anticancéreux de la plante in vivo.

Une des limites de cette étude est l’absence de comparaison des activités de Agelanthus

dodoneifolius avec une autre loranthacée. Il serait intéressant de comparer l’ensemble de ces

résultats avec d’autres loranthacées parasitant d’autres hôtes ou des plantes utilisées en

traitement anti asthmatique et anticancéreux. Les principaux composés (10) identifiés et

quantifiés pourraient alors servir de traceurs.

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ANNEXES

ANNEXE 1 : PUBLICATIONS

ANNEXE 2 : Analyse chromatographique (HPLC-UV) et

spectrométrique de la sous fraction butanolique But1

Analyse chromatographique (HPLC-UV) de la sous fraction butanolique But1

(Discovery®2.1×150 mm, 5 µm, Supelco ; Acétonitrile/Eau/Acide formique (30/70/0.1%))

Analyse spectrométrique de la sous fraction But1

(Elution en mode gradient de 6.3% A à 93.7% B pendant 20 minutes. A : Méthanol/Eau, acide

formique 0.2% et B : Eau, acide formique 0.2%)

ANNEXE 3 : Droite d’étalonnage de la miquelianine

déterminé en HPLC

Courbe d'étalonnage miquel ianine

y = 6113,7 x + 231,42R2 = 0,9848

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Concentration miquel ianine (mg/ml)

Aire

(mAU

*s)

Droite d’étalonnage de la miquelianine déterminé en HPLC