Arcliives Internationales de Physiologie et de Biochimie. 1970, 78, 253-258 253

Rqu le 27 fdvrier 1970.

QUELQUES PROPRaTES DES ATPASES DE LA PEAU DE GRENOUILLE (l) (2)

PAR

M.-L. DARGENT-SALEE (7 (Laboratoire de Biochimie, Institut Lbon Fredericq, UniversitP de Liege)

(2 figures)

INTRODUCTION

Alors que la peau de grenouille est un matkriel qui a CtC particu- likrement CtudiC au point de vue de la permCabilitC aux ions, nous sommes trts ma1 renseignb sur les propriCtCs de ses ATPases (ATP phosphohydrolase, E.N. 3.6.1.3.). SKOU (1962) et BONTING et CARAVAGGIO( 1963) signalent cependant la prksence d’une ATPase stimulke par Na+ et K+ dans I’homogCnat de peau de grenouille. Ces rCsultats sont toutefois peu reproductibles. Par contre, ces auteurs ont pu mettre en Cvidence une activitk ATPasique stimulCe par les ions Mg++ et dont le r61e reste mystkrieux.

Nous avons mesurt une activitC ATPasique dCpendant du Me+ et du Ca++ dans l’organe Clectrique de la torpille (WINS et DARGENT- SALBE, 1970) et dans le cerveau de la souris (DARGENT-SAL~E, rksultats non publits); nos rCsultats permettent de penser que cette ATPase joue un r61e dans les phCnom6nes bioklectriques de la membrane. C’est pourquoi nous avons jug6 intdressant d’Ctudier les propriCtCs de ce systtme ATPasique, dans la peau de grenouille qui transporte activement le Na-‘.

(I) En hommage au Professeur Marcel FLORKIN, a I’occasion de son 70e anni-

(3 Travail rtklid grice a une subvention du Fonds de la Recherche fondamentale

(a) Chercheur du Fonds de la Recherche fondamentale collective.

versaire.

collective, accord& au Professeur M. FLORKIN, crddit no 786.

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MATBRIEL ET M ~ T H O D E

La peau de grenouille (Rana temporaria L.) est un materiel que I’on homogCnCise difficilement ttant donnt l’tpaisseur du tissu conjonctif.

Nous avons utilise deux mtthodes de prtparation des extraits. Dans le premier cas, la peau est disstqute et broyte a l’aide d’un homogtntiseur Ultra-Turrax dans dix fois son volume de saccharose 0.25 M tamponnt par du Tris-C1 20 mM, A pH 7’5 et contenant de I’EDTA (I) 3 mM. Le broyat est rthomogtntist (Potter Elvehjem) et centrifugt 20 minutes 21 12 OOO x g. Le surnageant est centrifugt 3 heures, a 11OOOO x g dans une centrifugeuse Spinco Model L, a 5OC. Le culot est remis en suspension dans une solution de saccharose 0.25 M avec du Tris-C1 40 mM, pH 8.5 : c’est ce que nous appelons la fraction P,.

Une deuxibme mtthode consiste a plonger les peaux de grenouille dans une solution de saccharose 0.25 M contenant 0.5 %,, de strum albumine de baeuf (Sigma) et amente pH 7.3 avec du Tris-C1; les peaux sont ensuite rincCes puis couptes en fins lambeaux, a l’aide de ciseaux. Elles sont alors homogtneisees (Potter- Elvehjem, piston en ttflon). L’homogtnat est centrifugt a 5 OOO x g pendant 20’; le culot est remis en suspension dans la mCme solution de saccharose. La suspension est filtrte sur de la gaze et utilisee comme extrait enzymatique : c’est la fraction P,. Pour diminuer la concentration en ions inorganiques de I’extrait, le premier culot de centrifugation est remis en suspension dans un grand volume de solution de saccharose (1 ml de culot dans 50 ml) et centrifuge 30 minutes a 1 1 500 x g). On reprend le culot dans la solution de saccharose 0.25 M et on le filtre sur gaze.

Le milieu d’incubation contient : ATP 4 mM; Tris-CI 25 mM, pH 7.3; 0.5 mg de prottines par ml lorsqu’on utilise la fraction P1 et 0.15 a 0.2 mg de protkines par ml pour la fraction P,.

Les ions inorganiques sont ajoutts suivant les besoins de l’ex- pkrience. Le volume total est ament i 2 ml avec de I’eau. L’in- cubation se fait a 37O, pendant 30 minutes et est stoppee par I’addition de 0.2 ml d’acide trichloracttique a 50 %. On dose le phosphate suivant la mtthode de FISKE et SUBBAROW (1925).

( I ) EDTA : tthylkne diarnine tbtraadtate.

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ATPASE DE LA PEAU DE Rana teniporaria 255

Ris ULTATS

Efets des ions.

En 1 ’absence d’ions alcalino-terreux, I’activitC ATPasique de I’homogCnat de peau de grenouille est trks faible. L’ion Mg+‘ exerce un effet activateur considkrable sur les deux fractions Ctudiees (fig. 1, b et c); I’optimum est atteint en prbence de 2 mM de Mg‘k environ. Le calcium active Cgalement 1’ATPase mais l’optimum se situe aux environ de 5 mM (fig. I , a et d). L’affinitC apparente est donc plus faible que pour le Mpk . Quant au stron- tium, il est un trks mauvais activateur (fig. 1, e).

Nous n’avons pu mettre en Cvidence de faGon reproductible un effet activateur des ions Na+ et K + en presence de magnCsium mCme aprks traitement de I’homogCnat par le dCsoxycholate (DOC) 0.06 %, i 3 7 O , pendant 30 minutes.

Efets de l’ouabaine.

Les rksultats prCsentCs dans le tableau I mettent en Cvidence un effet activateur de l’ouabai’ne sur I’ATPase dependant du

. . . 18‘ lo-’ 2x10-3 5x10.’ 6~10-~ M

FIG. 1. AcrivirP ATPasique exprimke en mpMoles de P inorp/mg prorkineslh en fonctiorr de la concentration en ions Mg++, Ca++ et Srf+ (voir texte).

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Enpdsencede I + ouabahe 0.2 mM

Mg++ 4mM EGTA 0.5mM 1 0.55 1 0.70

Mg++ 4mM EGTA 0.5mM Na+ 75mM K+ 20mM

0.39 0.51

Mg1-t de la fraction PI. Nous avons ajoutk de I’EGTA (l) dans le milieu d’incubation afin de complexer les ions Ca++ dont l’action sur la Mg-ATPase est assez compliqute et fera l’objet d’une publi- cation ultCrieure.

Cet effet activateur de l’ouabaine est obtenu aussi bien en prCsence qu’en l’absence des ions Na+ et K+.

Efets de quelques substances.

La figure 2 montre les effets de la promCthazine, de la chlor- promazine, de I’atCbrine et de l’amytal sur l’activitk ATPasique de la fraction P,. On peut voir que les agents considCrks comme des antagonistes des enzymes flavoprotdiques exercent un effet inhibi- teur en presence de M p . 11s ont la mCme action en prksence de Ca++.

Le 2,6-dichlorophdnolindophCnol (DCPIP) qui est un oxydant des flavoprotkines est Cgalement inhibiteur mais A un degrC moindre. Par contre, nous avons obtenu, A plusieurs reprises, une activation par l’hydrosulfite de Na qui est rkducteur.

DISCUSSION

Nous observons dans les deux fractions utilisdes une activitd ATPasique sensible aux ions bivalents Ca++ et Mg++. Un tel systkme a dkjia CtC trouvd par plusieurs auteurs dans des extraits

(I) EGTA : Cthylhneglycol-bis-(2-amin~thyl)-N,N,N,N’-t~traa~tate.

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ATPASE DE LA PEAU DE Rana teniporariu

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f b) L

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!! 2- lx- 5:

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C hlor promo z i no 8 Atkbrine

” 16’ 5 x 10.’ 16‘ M

FIG. 2. Activith ATPasique de la fraction P2 exprimhe en mpMoles de Plnoro/mg pro- thineslen fonction de la concentration des diflerentes substances indiqtrtes.

de cerveau (KADOTA et al., 1967; NAKAMARU et al., 1967; ROBINSON et LUST, 1968; WOLF et ADOLPH, 1969). Goz (1967) dtcrit Cgalement une ATPase activbe par Cat+, en l’absence de Mg+t, dans un extrait de medullaire surrknale.

En ce qui concerne la peau de grenouille, nous ne possedons pas encore beaucoup d’arguments pour decider s’il s’agit d’un seul enzyme ou de deux enzymes diffkrents. Cependant nous savons que les effets de deux ions ne sont pas additifs et que les phkno- thiazines sont inhibitrices aussi bien en presence de MgI-+ que de Cat’. Ces observations sont en faveur de la premikre hypothkse.

Les rksultats obtenus avec les antagonistes des flavoproteines diffirent de ceux obtenus sur la Mgkf-Ca++ATPase des globules rouges (WINS et SCHOFFENIELS, 1968; WINS, 1969). En effet, dans les globules rouges, ces substances n’ont pas d’effet inhibiteur sur 1’ATPase en prisence de Mgt I- mais inhibent I’activation par le Cat+- ou le Sr++, en presence de Mg++.

Nous n’avons pu obtenir un effet activateur des ions Naf et K+ mCme aprb avoir mis l’extrait en contact avec du DOC bien

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quec et agent dtmasque la Na+-K+-ATPase dans d’autres tissus (JARNEFELT, 1964). I1 semble paradoxal que la Nal- - K+ - ATPase soit si difficile h dkceler dans un tpithtlium qui transporte activement le sodium; notons cependant que cet enzyme n’a pu Ctre dtcelt dans d’autres tissus dont le r61e osmortgulateur est pourtant bien connu, par exemple la branchie d’Eriocheir (SCHOFFENIELS, 1962) ou la branchie de truite (WINS, non publit).

En ce qui concerne l’ouabaine, on sait qu’elle prtsente, a tres faible concentration ( 10-l0M), un effet activateur sur la Nat-KI- ATPase de cerveau de lapin et de rein de poulet (PALMER et al., 1966). Mais h notre connaissance, c’est la premitre fois que l’on observe une activation par d’aussi fortes concentrations (2. M). De plus, Palmer n’obtient un effet activateur qu’en prksence des ions Na+ et K+, alors que sur notre prkparation, l’activation est aussi importante en I’absence qu’en prksence de ces ions mono- valents.

En rtsumt, nous avons mesurt, dans un extrait de peau de grenouille, une activitk ATPasique stimulke par le Mg++ ou le Ca++. Cet enzyme est activk par l’ouabdine 2.10-4 M en prksence ou en I’absence des ions monovalents Na+ et K+.

Nous n’avons pu obtenir d’effet d’activateur par les ions Na+ et Kt .

REMERCIEMENTS

J’exprime ici mes remerciements ii Monsieur le Professeur E. SCHOF- FENIELS pour ses conseils et I’aide qu’il m’a apportke dans la rkali- sation de ce travail.

BIBLIOGRAPHIE

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