Quels examens de biologie moléculaire prescrire et obtenir en

2011?

I Rouquette

Elles ont pour vocation de réaliser les tests moléculaires innovants pour l’ensemble des patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou établissement privé.Elles ont pour vocation de réaliser les tests moléculaires innovants pour l’ensemble des patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou établissement privé.

Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancersPlateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers

Plateforme de génétique moléculaire des cancers

• Directeur de plateforme: E Delabesse• Trois sites: Rangueil I Rouquette: poumon

EGFR/ALK/BRAF/HER2ICR G Favre PI3K poumonPurpan J Selves Lamant: colon mélanome E Delabesse: BCR ABL/KIT

• A Rangueil

2005 projet ligue: séquençage de 100 patients acquisition d’une expertise formation technicien Tenon

2007 demande d’activité nouvelle: acquisition d’équipements et budget fonctionnement sur 2 ans pour commande réactifs

2009 : intégration plateforme biologie moléculaire des cancers du CHU (E Delabesse)

2009 ORPAMIP: Structuration de la biologie moléculaire.(Kras, EGFR, MSI, 1p19q).

2010: Subvention EGFR INCa: pas de facturation clinicien patient, remboursement déstockage

2011: subvention INCa biomarqueurs émergents

AUJOURD’HUI

• Une AMM première ligne: gefitinib

• Une ATU: Crizotinib

• Des essais cliniques plus ou moins avancés

Un seul examen aujourd’hui indispensable pour guider la conduite thérapeutique: recherche des mutations activatrices d’EGFR

Un seul examen aujourd’hui indispensable pour guider la conduite thérapeutique: recherche des mutations activatrices d’EGFR

GEFITINIB (IRESSA®) is indicated for the treatment of adult patients with locally advanced or metastatic non small cell lung cancer (NSCLC) with activating mutations of EGFR.

48%

3% 5% 3%

2142 adénocarcinomes exon 19 et L858R

Incidence of EGFR Exon 19 Deletions and L858R in Tumor Specimens From Men and Cigarette Smokers With Lung Adenocarcinomas

Incidence of EGFR Exon 19 Deletions and L858R in Tumor Specimens From Men and Cigarette Smokers With Lung Adenocarcinomas

Sandra P. D’Angelo et al J Clin Oncol 2011Sandra P. D’Angelo et al J Clin Oncol 2011

Indications

•Financement INCa: Tous les patients atteints d’un adénocarcinome du poumon devraient pouvoir avoir accès au test EGFR pour déterminer le statut mutationnel de leur tumeur.

•Non acceptés par la plateforme: épidermoïdes du fumeur, NEGC

•Acceptés après discussion: épidermoïdes du non fumeur, adéno-squameux, CNPC.

•Financement INCa: Tous les patients atteints d’un adénocarcinome du poumon devraient pouvoir avoir accès au test EGFR pour déterminer le statut mutationnel de leur tumeur.

•Non acceptés par la plateforme: épidermoïdes du fumeur, NEGC

•Acceptés après discussion: épidermoïdes du non fumeur, adéno-squameux, CNPC.

Pathologiste de la plateforme

Pathologiste détenteur du matérielCHG, CHU, Secteur Privé

Circuit des examens de biologie moléculaire

Contrôle morphologique

Extraction d’ADN

PCR

Criblage

Séquençage des variants

Contrôle morphologique

Extraction d’ADN

PCR

Criblage

Séquençage des variants

BILAN EGFR 2010Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4

Nb patients 464 88 115 115 147

Nb examens 522

89 149 127 157

% mutations 17,05 12,17 9,57 11,56Délai de rendu 15 jours 15 jours 11 jours 9 jours

% Prescriptions secteur privé

37,5 26,96 45,22 51,02

% Non interprétables

2,27 13,91 6,96 4,08

2009 2010 2011

PATIENTS TESTES 55 422 600 Trois premiers trimestres

% MUTES 23% 9,5 à 17% 7 à 11%

16

20-30%12-14%

5%

une altération moléculaire peut être identifiée chez environ 40 % des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules.une altération moléculaire peut être identifiée chez environ 40 % des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules.

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

-30 %

Progression

Stabilité

Réponse partielle confirmée

Réponse complète confirmée

Varia

tion

max

imal

e de

la ta

ille

tum

oral

e (%

)

Activité de l’inhibiteur oral de ALK, le PF-02341066, dans une population de CBNPC positifs pour ALK (n = 82)

81

Translocation EML4-ALK

Taux de réponse = 57%Contrôle à 8 semaines : 87 %SSP à 6 mois : 72 %

Kwak, NEJM 2010

20

Protéine de fusion EML4-ALK:

partie N-term. EML4 (echinoderm michrotubule associated protein

like 4) +

portion intracellulaire du récepteur tyrosine-kinase ALK (anaplastic lymphoma kinase)

inversion du bras court du chromosome 2 [Inv(2)(p21p23)] qui fait joindre exons 1–13 de EML4 aux exons 20–29 de ALK.

Split signal en FISHSplit signal en FISH

FISH: examen de biologie moléculaire:Problèmes:

FixateurEchantillonnageEosineEquipement spécifiqueAide à la lectureOn n’identifie que la cassure d’ALK

Clin Cancer Res 2010 D5F3 or D9E4 antibodiesClin Cancer Res 2010 D5F3 or D9E4 antibodies

Journal of Thoracic Oncology 2011 ALK1+ système de révélationJournal of Thoracic Oncology 2011 ALK1+ système de révélation

J Clin Pathol 2010 ALK 5A4J Clin Pathol 2010 ALK 5A4

Bilan ALK 2011Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4

(Octobre)

Nb patients 180 30 64 58 27

Nb examens 30 62 56 24

% Translocations

20% 6,4% 1,8% 4,2%

Délai de rendu 15 jours 12 jours 11 jours 11 jours

% Prescriptions secteur privé

20% 20,3% 24,1% 14,8%

% Non interprétables

0% 16,1% 1,8% 4,2%

Mutations de K-Ras

Mutations activatrices en position 12,13 or 61Mutuellement exclusives avec celles d’ EGFRAssociées au tabac (transv. G en T ou C)22% des ADC ( très rares ds malpighiens)Mais chez 15% des non fumeurs (transition G en A)

GGT GGC GCA CCA

Exon 1

Codon 12Glycin

Codon 13 Codon 59 Codon 61

TGT Cystin CGT ArginineGTT Valine AGT SerineGAT Aspartate GCT Alanine

Marchetti et al J Clin Oncol 2011

1,046 NSCLCs

BRAF mutations were present in 36 ADCs (4.9%) and one SCC (0.3%).

Twenty-one of the mutations (56.8%) were V600E, and 16 (43.2%) were non-V600E.

Marchetti et al J Clin Oncol 2011

1,046 NSCLCs

BRAF mutations were present in 36 ADCs (4.9%) and one SCC (0.3%).

Twenty-one of the mutations (56.8%) were V600E, and 16 (43.2%) were non-V600E.

Paik et al J Clin Oncol 2011

BRAF mutations occur in 3% of patients with lung adenocarcinoma and occur more commonly in current and former smokers

Paik et al J Clin Oncol 2011

BRAF mutations occur in 3% of patients with lung adenocarcinoma and occur more commonly in current and former smokers

BRAFBRAF

BRAF mutations occur in approximately 5% of pulmonary adenocarcinomas, often with a papillary architecture, but in the micropapillary subgroup, the incidence rises to approximately 20%, similar to that seen in thyroid and ovarian papillary adenocarcinoma.

BRAF mutations occur in approximately 5% of pulmonary adenocarcinomas, often with a papillary architecture, but in the micropapillary subgroup, the incidence rises to approximately 20%, similar to that seen in thyroid and ovarian papillary adenocarcinoma.

Yousem et al The histopathology of BRAF-V600E-mutated lung adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2008

Rosane De Oliveira et al Micropapillary Lung AdenocarcinomaEGFR, K-ras, and BRAF Mutational Profile Am J Clin Pathol 2009

Yousem et al The histopathology of BRAF-V600E-mutated lung adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2008

Rosane De Oliveira et al Micropapillary Lung AdenocarcinomaEGFR, K-ras, and BRAF Mutational Profile Am J Clin Pathol 2009

Shigematsu Cancer Res 2005; HER2 mutations were present in 1.6% (11 of 671) of NSCLC

Pao Lancet Oncol 2011 HER2 mutations are present in 2% of NSCLC

Shigematsu Cancer Res 2005; HER2 mutations were present in 1.6% (11 of 671) of NSCLC

Pao Lancet Oncol 2011 HER2 mutations are present in 2% of NSCLC

PIK3CAPIK3CA Mutations and Copy Number Gains in Human Lung CancerCancer Res 2008;68(17):6913–21] 1,6% de mutations. PIK3CA copy number gains

occur at much higher frequencies in lung cancers than do activating mutations and the gains target squamous cell carcinomas.

IGR Essai précoce: GDC-0941, inhibiteur de la protéine PI3 kinaseIGR Essai précoce: GDC-0941, inhibiteur de la protéine PI3 kinase

Autres biomarqueurs

TECHNIQUE NB TOTAL + % MUT 2010

NB TOTAL + % MUT 2011

KRAS HRM/SEQ 20120%

55822,9%

BRAF PCR-ASO --

3161,7%

HER2 HRM/SEQ --

681,5%

PI3K (ICR) SEQ --

90%

Améliorations Techniques

• EGFR: Passage techniques plus rapides et sensibles,

redesign des amorces, sensibilisation fixateur: moins de prélèvements non interprétables, délais raccourcis

• FISH ALK: criblage IHC systématiquecorrections éosine acidité, contrôle externalisé des

cas litigieux

EXON 19 EXON 21 EXON 18 EXON 20

Mutation recherchée

DELETIONS MUTATIONSPONCTUELLES

MUTATIONS PONCTUELLES

T790MINSERTIONS

Techniques utilisées

HRM/ ANALYSE DE FRAGMENT

PCR-ASO HRM/SEQUENCAGE

PCRASO/SEQUENCAGE

Améliorations gestion

Interface cliniciens/plateforme: Mélanie Boussard

Fiche modifiée téléchargeableDéveloppements informatiques pour recueil

de données et rendu résultats (fiches complémentaires)

PRESCRIPTION DE GENOTYPAGE EGFR exons 19 à 21

Service d'Anatomie Pathologique et Histologie-Cytologie du Pr M.B. Delisle

CHU Rangueil, Bt L2 - 1 avenue Jean Poulhès - TSA 50032 - 31059 Toulouse Cedex 9 Responsables : Dr Isabelle Rouquette, Camille Allera Moreau. Tél Accueil 05 61 32 28 42 --- Fax 05 61 32 21 27

Date de la demande de génotypage EGFR : / / 20….. Matériel tumoral à analyser : Tabagisme :

Biopsie bronchique Fumeur Biopsie pulmonaire sous scanner Non fumeur Pièce opératoire (lobectomie, pneumonectomie) Site métastatique, préciser : ……………………………………… Indication : …………………………

Date du prélèvement : / / 20….. Stade de la maladie : ……………. Remarques :

FICHE à compléter par le médecin prescripteur de l’examen et à envoyer au médecin pathologiste en possession du prélèvement tumoral du patient.

Cette fiche sera secondairement envoyée au laboratoire de génotypage par le pathologiste avec le

Identification MEDECIN PRESCRIPTEUR (Nom et coordonnées dont tel et fax)

Identification A. PATHOLOGISTE REFERENT détenteur du matériel tumoral (Nom et coordonnées dont tel et fax)

Identification PATIENT Nom : …………………………. Nom de jeune fille : ………………… Prénom : ……………………….. Date de naissance : ……./……./……. Adresse : …………………………………………………………………………………………….

Le résultat du génotypage sera renvoyé au médecin prescripteur et au médecin anatomo-pathologiste. Version 23/11/2011

A COMPLETER PAR LE MEDECIN PRESCRIPTEUR DE L’EXAMEN ET A ENVOYER AU PATHOLOGISTE

Identification du Patient Date de demande du test :

NOM : Type de test :

NOM DE JEUNE FILLE : EGFR KRAS BRAF ALK HER2 PI3K PRENOM : DATE DE NAISSANCE : Matériel Tumoral à analyser

Homme Femme Type de prélèvement

Biopsie Résection chirurgicale Autre : Identification MEDECIN PRESCRIPTEUR

Site de prélèvement : NOM : Bronche Poumon Autre : ADRESSE : Date de prélèvement :

Statut tabagique : Fumeur Non fumeur Ancien fumeur (stop en .....) Tel : Nombre paquets/année :

Fax : E-mail : Stade TNM : IIIB IV Autre :………... Indications (si autre) :

CADRE, A COMPLETER PAR LE PATHOLOGISTE, ACCOMPAGNEE :

1. Du prélèvement tumoral (1 fragment de tumeur fixée et incluse en paraffine ou congelée/ choisir un bloc riche en cellules tumorales). 2. Du compte-rendu anapath.

ET A ENVOYER AU LABORATOIRE REALISANT LES GENOTYPAGES, A l’ADRESSE SUIVANTE : Service d’Anatomie Pathologique et Histologie Cytologie du Pr Delisle CHU Rangueil 1 avenue Jean-Poulhès TSA 50032 31059 TOULOUSE Cedex 9

Responsables : Dr Isabelle Rouquette, Mélanie Boussard tel Secrétariat 05 61 32 28 61 fax 05 61 32 21 27

PAS DE FIXATION BOUIN, ni fixateur à base d’acide picrique. Eviter AFA.

Matériel tumoral transmis: Identification MEDECIN PRESCRIPTEUR Nombre de blocs: N° bloc: NOM : Tumeur primitive Métastases Cérébrales ADRESSE : Ganglionnaires

Autres : Histologie : Adénocarcinome Epidermoïde/malpighien Autre : Tissu congelé : oui non Tel : Tumorothèque ONCOMIP Rangueil Purpan Fax : Emplacement E-mail : Fixateur (indispensable): Formol Glyoxal RCL2 Autre

Date de réception au service d’Anatomie Pathologique de Rangueil : …….../…….../……….. Heure :……… Visa :………..

PRESCRIPTION DE GENOTYPAGE

Numéro INSC :

Numéro ONCOMIP :

Tumeurs pulmonaires

BILAN EGFR 2011Trimestre 1 Trimestre 2 Trimestre 3 Trimestre 4

(Octobre)

Nb patients 609 168 200 173 68

Nb examens 578

168 186 162 62

% mutations 5,9% 9,7% 13,6% 6,45%Délai de rendu 8 jours 5 jours 5 jours 5 jours

% Prescriptions secteur privé

44% 37,5% 35,3% 44,1%

% Non interprétables

4,2% 1,6% 2,5% 0%

TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4

TOTAL 102 113 154 174

FUMEUR 14 58 54 64

NON FUMEUR 14 36 37 45

ANCIEN FUMEUR 9 17 20 18

NON RENSEIGNE 65 2 43 47

HOMME 53 96 83 102

FEMME 50 76 63 75

NON RENSEIGNE 3 5 10 0

TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4

TOTAL 162 157 174FUMEUR 90 95 99NON FUMEUR 38 32 34ANCIEN FUMEUR 26 23 33NON RENSEIGNE 8 7 8HOMME 93 102 111FEMME 68 55 58NON RENSEIGNE 0 0 0

ANNEE 2010

ANNEE 2011

Evolution du tabagisme et du nombre de femme/homme (en %)

Aujourd’hui

• Un dossier enregistré le vendredi• Résultats exon 19/21/20 IHC ALK le mercredi• Résultats KRAS BRAF HER2 le vendredi• Si demande PI3K transfert ICR si matériel restant

DélaisDélai de rendu des résultats (en jours)

TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4

2010 15 15 11 9

2011 8 5 5 5

Délai d’acheminement de la demande entre le prescripteur et le laboratoire de biologie moléculaire (en jours)

TRIM 1 TRIM 2 TRIM 3 TRIM 4

2010 - 11 11 6

2011 5 6 7 6

Augmentation du nombre de dossiers pour les différentes analyses depuis le début de l’activité

Les non conformités les plus retrouvées

Fiches de prescription directement envoyée au laboratoire de biologie moléculaire sans prélèvement

Le stade TNM de la maladie n’est pas indiqué ou ne correspond pas aux indications précisées pour la prescription de l’analyse

Le statut tabagique n’est pas renseigné La date de prélèvement n’est pas renseignée Le fixateur n’est pas renseigné Le numéro du prélèvement inscrit sur la fiche de prescription est

absent ou ne correspond pas au numéro du bloc La congélation du prélèvement n’est pas indiquée

1 dossier de prescription sur 3 n’est pas conforme…

Ce qui entraine:-Un retard de traitement et donc un retard de rendu des résultats-Une perte de temps pour l’ingénieur qui doit rappeler les prescripteurs/anatomopathologiste-Un défaut dans les statistiques rendus à l’INCA

Reste à améliorer

• Délai d ’acheminement • Délai de réponse (protéinase K, DCC)• Évolution continue des techniques• Renseignements cliniques• Projet IFCT de recueil des données

Le futur sur la plateforme

• Prescrire via le DCC ONCOMIP (Suivi, rendu des résultats)

• Améliorer la détection des anomalies les plus utiles (plateforme aide lecture FISH, MAD pyroséquenceur)

• Participer aux études nationales et aux STIC• Développer l’IHC• Développer la détection de nouveaux biomarqueurs

(amplification c-met, FGFR…)• Exploitation des données recueillies projet IFCT

Le futur

• ALK: algorithme IHC/FISH• EGFR: place des anticorps?• Marqueurs prédictifs de réponse (TS..): IHC

Etudes multicentriques de validation, STICEtudes multicentriques de validation, STIC