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Radicaux libres, Stress oxydant : genèse et détoxification K Peoc’h

Radicaux libres, Stress oxydant : genèse et détoxification

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Radicaux libres, Stress oxydant : genèse et détoxification

K Peoc’h

Objectifs

• Citer les principaux acteurs du stress oxydant

• Definir un radical libre

• Décrire l’origine de ces marqueurs

• Citer les principales cibles des espèces réactives

• Citer différentes pathologies impliquant le stress oxydant

• Citer les principales méthodes d’exploration

Plan

1. Stress Oxydant : Origine et Définition

2. Espèces réactives de l’oxygène ou ROS1. Description

2. Principaux modes de production

3. Impact en physiopathologie

4. Mécanismes de protection

5. Exploration

Stress Oxydant :

Origine et Définition

Anoxie mortelle à court terme chez les aérobies

• Chute de l’ATP cellulaire ->Mort tissulaire

• Cerveau détruit en 3 minutes

• Foie, rein et myocarde en qq heures• Muscle, peau et phanères, bcp plus tard

Que se passe t-il au sein de nos

cellules ?

Cellules aérobies produisent des espèces

réactives de l’oxygène, neutralisées par les

antioxydants

Oxygène nécessaire au transfert d’e-

couplé aux phosphorylations oxydatives :

source principale d’énergie

Fuites au niveau mitochondrial

Balance

Stress oxydant

Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants

Dommages oxydatifs des biomolécules

Helmut Sies (1985)

PRO-

OXYDANTS

UV, rad. ionisantes

Xénobiotiques

Inflammation

ANTIOXYDAN

TS

GSH (paracétamol)

Vit E, Vit C

Se, Cu

LIPIDES ADN

PROTEINES

ERO

ERNOxydation Oxydation

ROS et défense contre les micro-organismes

• Globules blancs : utilisent l’O2 pour tuer les bactéries phagocytées (via NADPH oxydase, iNOS)

• Monocytes et polynucléaires neutrophiles : mécanisme spécifique pour créer des radicaux libres oxygénés

• Rôle de la NADPH oxydase

• Rôle de la Myeloperoxydase

NO et transduction du signal

• (.NO) : radical libre issu de l’oxydation enzymatique du noyau guanidinium de l’arginine en présence d’oxygène et de NADPH, par NO synthase

• Signal diffusible: diffusion inter-cellulaire

• NO synthases:• constitutive dépendante du Calcium (second

messager)• inductible

NOActive les guanylyl-cyclases cytoplasmiques ->Relachement des cellules musculaires lisses : vasodilatation, hypotension, ...

Prodrogue

NO°et modifications post-traductionnelles

• Nitrosylation et S-nitrosylation

Apoptose

Nécrose

Mort

cellulaire

Croissance

Différentiation

Prolifération

Adaptation

SO

SignalisationRedox

Oxydations

réversibles

Oxydations

irréversibles

Red

Ox

Effets cellulaires des ERO et ERN fonction de leur

concentration

Adaptation cellulaire au stress oxydant

Induction

de gènes

Répression

de gènes

Enzymes

anti-oxydantes

et de

réparation

Enzymes

productrices des

ERO

Stress

oxydantAdaptation

Toxicité:

ADN, ARN

Protéines

Lipides

Cellules + H2O2 100 nM

24h 24h

H2O2 1

mM

Cellules + H2O2 1 mMMort cellulaire

Survie cellulaire

Mise en évidence de l’adaptation

Hormésie : réponse biologique favorable en réponse à l’exposition à de

faibles doses de toxiques

24h

Rôle dans la signalisation cellulaire

-Modification réversible des groupementsthiols

des cystéines des protéines

-Rôle de messagers secondaires

H2O2 NO

D’après Y. M.W. Janssen-Heininger. et al (2008)

Modifications réversibles des

cystéines

réactives des protéines

S-glutathionylationAcide sulfénique Acide sulfinique

S nitrosylation

disulfure

H2O2

H2O2H2O2

NO

GSH

TRX

GRX

TRX

GRX SRX

-Thiolate

SO3H

Acide sulfonique

Protéines cibles des oxydations réversibles

des cystéines

Phosphatases : Inactivées

Kinases : activées ou inactivées

Caspases (Inhibition par H2O2 etNO)

Métalloprotéinases (activées par H2O2 etNO)

Protéases : activées ou inactivées

Régulation des facteurs de Transcription

NKB activé par H2O2, inactivé par NO

Mécanisme de l’adaptation par une élévation modérée des ERO et ERN

Signalisation

cellulaire

O2-.

Expression de gènes

Enzymes antioxydantes

(adaptation)

peroxydases

Oxydation réversibles des

cystéines

Modifications d’activité (kinases,

phosphatases, facteurs de

transcription)

H2O2 , NO

inducteurs •Radiations,

•Exercise physique

(entraînement)

•Préconditionnement

ischémique

Thiols

Réductases

(TrX, GrX)

Nécrose

mort

cellulaire

Croissance

Différentiation

Prolifération

Adaptation

ApoptoseSO

Signalisation red ox

oxydations

réversibles

oxydations

irréversibles

Red

Ox

Effets cellulaires des ERO et ERN

Méfaits des ERO et ERN

• Stimulés par les radiations ionisantes

• Entrainnent :• Mutations de l’ADN

• Peroxydation lipidiques

• Altération des protéines

• Anomalies de la transduction des signaux

• Modulent les gènes et les protéines de stress régulant prolifération, différenciation cellulaire et apoptose

Toxicité

ADN: génotoxicité ->Mutagenèse

ARN: oxydation et altération

Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés,

-> anomalie signalisation, athérosclérose ?

Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…)

Nitrosylation (NO), Carbonylation

dénaturation (protéines chaperones),

- > agrégation, maladies dégénératives ?

Glucides: glycation et dérivés

->Diabète

- Quelques exemples de dérivés d’oxydation des bases de l’ADN par les ROS.

Cibles Moléculaires ADN

Peuvent induire des mutations par mésappariement (8-OH hydroxy guanine – A) ou la mort cellulaire

Exemples

d’effets

des ROS

sur les lipides:formation de

l’isoprostane

Composé

Prostaglandine-

like

Cibles Moléculaires : LipidesAcide arachidonique

- Oxydation des lipides par les ROS

Cibles Moléculaires : Lipides

Aldéhydes dérivés

d’acides gras polyinsaturés

Dérivés du cholestérol: oxystérols

Dérivés d’acides aminés

Cibles Moléculaires : Protéines

Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles

Espèces réactives de l’oxygène ou ROS

Acteurs du Stress Oxydant:

Espèces Réactives de l’Oxygène (et de l’Azote)

ESPECES RADICALAIRES

ESPECES NON RADICALAIRES

Radicalhydr

.oxyle

OHAnion

superoxyde

O2

-. NO

d’az.oteLO

LOO

. Monoxyde

Radicaux

lipidique.s

ONO2-

peroxynitrite

HOCl

Acide

hypochloreux

O2

H2O2

Peroxyde

d’hydrogène

LO° alcoxyleLOO° peroxyle

"Radical libre" (RL) =espèce chimique

- électron non apparié

- Existence indépendante ('libre')

1/ R.

2/ électriquement neutres ou chargés : radicaux cationiques r.+ et

anioniques R.-

3/ réactivité particulière avec d’autres atomes ou molécules

4/ oxydant ou réducteur

Radicaux libres (RL)

Formes réactives de l'oxygène (ROS)

Formes radicalaires (RLO) Formes non radicalaires _______________________________________________________

Superoxyde O°- Peroxyde d'hydrogène H2O2

Hydroxyle OH° Acide hypochloreux HOCl

Peroxyle ROO° Ozone O3

Alkoxyle RO° Oxygène singulet 1Dg

Aydroperoxyle HOO° Peroxynitrite ONOO-

___________________________________________________

____

2 grandes voies de production

Transfert d’électrons

O2 + e- O2- .

Lié au métabolisme cellulaire

Origines

Réduction progressive de l’oxygène

O2

1e-O2

-.

(anion superoxyde)

1e - Dismutation O2-.

H2O2

4e- (peroxyde d’hydrogène)

FentonFe2+

1e -

OH˙(radical hydroxyle)

1e -

H2O

Formation des EOR

Cyclo-oxygénases

Lipo-oxygénases

Echappement

chaîne respiratoire

O2-

Métabolisme et localisation

Mitochondrie

(respiration cellulaire)

EROs sont des produits 2aires

du métabolisme

Essential of Cell Biology » - Alberts et al - Ed. Garland

Fuites d’électrons au cours de la respiration cellulaire

H+ H+ H+

H+ATPADP

+Pi

O2 2H2O

e-

membrane interne

Membrane externe

MATRICE

NADH FADH2

e-

UQ

O2

O2- 5%

O2-

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme

Mitochondrie

(respiration cellulaire)

Xanthine oxydase

(catabolisme des bases puriques)

Cyclooxygénase Lipoxygénases

(Synthèse des PGs et LOOH)

Cytochrome P450

(métabolisme des xénobiotiques)

EROs : produits 2aires

du métabolisme

NoxNADPH oxydases

EROs et ERNs : produits par

des enzymes spécifiques

NADPH Oxydase (Nox-2) des phagocytes

NADPH

NADP+

O2Nox-2

2O -.

H2O2

.OH

Explosion

respiratoire

Defense contre

les microorganismes

Rôle majeur dans l’inflammationet dans l’immunité innée

Principales Nox et physiopathologies

Types de Nox Distribution Fonctions

Nox-1

Nox-2Phagocytes

Cell endothéliales CardiomyocytesMuscle squelettique Fibroblastes Microglie, neurones

Nox-4Constitutive

Nox-5 Macrophages Lymphocytes

Duox-1 et 2

Produisent H2O2

Cell épithéliales (thyroïde, poumon)

Défense

Physiopathologies

Nox-3

Cell. Muscle lisseCell epithéliales

Oreille interne

Cell. Muscle lisseCell endothélialesFibroblastes

Défense Différentiation

Sénescence

Signalisation cellulaire Apoptose

Différentiation

Granulomatose

Maladies Cardio.Vasc.

Neurodégénérescence AngiogénèseCarcinome prostatique

Athérogénèse

Maladies Cardio-.Vasc.

Octoconies

Athérogénèse

Maladies Cardio- Vasc

NeurodégénerescenceAngiogénèse, Diabète

Infertilé masculine

Défense

Hormone

thyroïde

Hypothyroïdisme

O2-

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme

Xanthine oxydase

(catabolisme des bases puriques)

Mitochondrie

(respiration cellulaire)

Cyclooxygénase Lipoxygénases

(Synthèse des PGs et LOOH)

Cytochrome P450

(métabolisme des xénobiotiques)

EROs sont des produits 2aires

du métabolisme

NoxNADPH oxydases

EROs et ERNs sont produits

par des enzymes spécifiques

des types cellumaires

ONOO-

NO

NO synthases

Arginine

i NOSNADPH

O2

Citrulline

Nox-2

O2-.

H2O2

.OH

NO NO

O2-.

O2ONOO-

NO Synthase inductible des phagocytesRôle majeur dans l’inflammation

NADP+

Nox-2

O2-

Cyclooxygénase Lipoxygénases

(Synthèse des PGs et LOOH)

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme

Xanthine oxydase

(catabolisme des bases puriques)

Mitochondrie

(respiration cellulaire)

Cytochrome P450

(métabolisme des xénobiotiques)

H2O2

F

e

2+

Cu+

.OH

EROs sont des produits 2aires

du métabolisme

NoxNADPH oxydases

EROs et ERNs sont produits

par des enzymes spécifiques

ONOO-

NO

NO synthases

Myéloperoxydase

Cl-

HOCL

Arginine

i NOS

citrulline

NADPH

O2

O2-.

H2O2

.OH

NO NO

MPO

O2-.

O2

+ Cl- HOCL +OH-

ONOO-

Myéloperoxydase des neutrophiles:défense et inflammation

NADP+

Nox-2

Neutrophile

2 grandes voies de production

Transfert d’électrons

O2 + e- O2- .

Lié au métabolisme cellulaire

Scission homolytique des liaisons covalentes

Nécéssite de l’énergie

A.+ B.A. .B

Radiations ionisantes

.OH

Radiolyse de l’eau

irradiation

excitation.OH + H.

.OH + H+ + e-aq

ionisation

H2O

Lumière

Photolyse

H2O2UV

Photochimie

S

flavines

quinones

porphyrines

chlorophylles

S*3 O2

transfert d’e-

O2-.1 O2

h

transfert

d’énergie

.OH 1O2O2-.

UV

lumière

2.OH

Facteurs augmentant la production ERO et ERN

Radiations

Ionisantes, UV

Médicaments, Pesticides,

Solvants industrielsPolluants

atmosphérique

s

Facteurs environnementaux

Métaux lourds

Inflammation Ischémie/

reperfusion

Hyperglycémie

Hyperlipidémie

Facteurs endogènes

Surcharge

Fe, Cu

Infections

ERO, ERN

Impact en Physiopathologie

Etats pathologiques impliquant le stress

oxydant

Cause ou Conséquence?

Pathologies chroniques Pathologies aiguës

•Athérosclérose

•Cancer

•Diabète

•Cataracte, DMLA

•Maladie d’Alzheimer

•Vieillissement

•Lésions de reperfusion

post-ischémique (infarctus,

AVC, greffe d’organes)

•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)

•Choc septique

•Inflammation

Etats pathologiques impliquant le stress

oxydant

Cause ou Conséquence

Pathologies chroniques Pathologies aiguës

•Athérosclérose

•Cancer

•Diabète

•Cataracte, DMLA

•Maladie d’Alzheimer

•Vieillissement

•Lésions de reperfusion

post-ischémique (infarctus,

AVC, greffe d’organes)

•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)

•Choc septique

•Inflammation

Heinecke J W J Exp Med 2006;203:813-816

ERO

Oxydation des LDL dans l’initiation de l’athérosclérose

MCP1

ERO

mmLDL

Différentes formes de LDL oxydées

LOOH

LOOH

-NHX

-NHX

Native

Minimally oxidized

Extensively oxidized

Oxidatively modified

seeded

Facteurs de risques de la maladie coronarienne et concentration d’isoprostanes

Facteurs de risques

Fumeurs

Hypercholestérolémie

X 3 gros fumeurs

Isoprostanes(plasma, urine)

X 2 à 3

Diabète type 2 X 2 à 6

Obésité

Hypertension

X 3 à 4 - log isoP urinaire corrélé

au IMC

X 2 - log isoP urinaire corrélé

avec la pression systolique

Protéine C réactive X 1.5 (homocystéine élevée)

D’après Davies s.& Roberts , 2011

Etats pathologiques impliquant le stress

oxydant

Cause ou Conséquence

Pathologies chroniques Pathologies aiguës

•Athérosclérose

•Cancer

•Diabète

•Cataracte, DMLA

•Maladie d’Alzheimer

•Vieillissement

•Lésions d’ischémie/reperfusion

(infarctus,AVC, greffe

d’organes)

•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)

•Choc septique

•Inflammation

ME

FADH2

NADH

Deshydrogénase

Succinate

Deshydrogénase

Cytochrome C

RéductaseCytochrome C

Oxydase

MI

Chaine respiratoire

e-

I II III

e-

IV V ANT

Désynchronisation de la chaîne respiratoire durant l’ischémiereperfusion

Ischémie: découplage avec excès e- et anoxie

ATP->ADP->AMP ---- Adénosine->HypoxanthineInduction de Xantine oxydase ->Anion superoxyde à la reperfusion

I II III

O2º-

IV V ANT

Modifications de la chaîne respiratoire durant l’ischémiereperfusion (2)

O2

O2º-

Reperfusion: apport massif O2 sur les e- accumulés

MnSOD

H2O2

CE : cellules endothéliales ; ERO : espèces

réactives de l’oxygène ; IL-1 : interleukine-1 ;

PNN : polynucléaires neutrophiles ; TNF-α: Tu m o r N e c r o s i s Fa c t o r α

Mécanismes lésionnels et initiation

de la réponse inflammatoire au

cours des phases précoce et tardive

de la reperfusion (d’après Jaeschke,

2003

Reaction de mono-oxygenation:

A-H + O2 + NADPH,H+ A-OH + H2O + NADP+

RE riche en cytochromes P450 impliqués dans les processus de métabolisme

des Xénobiotiques

Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique

Rôle de l’exposition aux médicaments et toxiques

P450FeIII P450 –FeIII-SH

2e- NADPHCytP450

reductase

O2

P450-FeIII-SH

O22-

P450-FeIII-SH + O2- et/ou H2O2P450-FeIII

SOH

Génèse ERO via CYP450

Robin, 2005

Mécanismes de protection

Stress oxydant: adaptation et défense

1ère ligne

Molécules anti-oxydantes; GSH, Vit C, Vit E, biliverdine, Ac urique, Hème ….

2ème ligne

Induction ou répression des gènes

Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox…

Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases…

Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon)

Dernière ligne

Apoptose

Protections contre le stress oxydant

Confinement en organelles

Protections non spécifiques

Protections spécifiques

Mitochondries : principale source de production de radicaux libres

Exception pour le foie: microsomes

Mitochondries Microsome Peroxysome

Cytosol

45% 20% 30%

5%

Mitochondries Microsome Peroxysome

Cytosol

15% 45% 35%

5%

Origine subcellulaire

Confinement en organelles

• Mitochondrie

• COX, certaines oxydases

• Sensibilité de l’ADN mitochondrial

• Peroxysomes

• Contiennent de nombreuses oxydases

• Catalases et peroxydases

Rôles des peroxysomes

• Métabolisme des peroxydes, des ERO et ERN

• Synthèse des plasmalogènes

• b- et a-oxydation des acides gras

• Métabolisme du glyoxylate

• Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines)

inhibition

SOD

O-2

H2O2

CAT

H2O

GPx, GSH

LOH

2NO --

LOOH

ONOO

Enzymes de défense antioxydante

Enzymes clées(Housekeeping enzymes)

Superoxyde dismutases

Catalase

Glutathion peroxydases

H2O2

H2O + O2 H2O

O2.-

.OH

Superoxidedismutases

(Cu/Zn-Mn)

Catalase GSH-PeroxidaseGSH

GSSG

Fe2+Fe3

+

Première ligne de défense

Systèmes de Défense enzymatiques

Protéines non enzymatiques

-Sequestrants des minéraux

- Fe: Transferrine, ferritine, lactoferrine

- Cu: céruloplasmine, albumine

- Métallothionéines: Zn+, Cu+,Cd+, Hg2+

Protéines enzymatiques

-Thiols-disulfures oxydoréductases et transférases

- Système thiorédoxine (thiorédoxine/thiorédoxine

réductase/NADPH)

- Peroxirédoxines (thiorédoxine peroxydases)

- Système glutarédoxine (glutarédoxine/ glutarédoxine

réductase/GSH)

- Hème oxygénase

Autres protéines antioxydantes

Antioxydants de bas poids moléculaire

Endogènes- glutathion (synthèse via N-acétyl cystéine)- acide urique : 1O2, LOO°

- bilirubine : 1O2, LOO°

- acide lipoïque : .OH, LOO°, HOCL, ONOOH

- coenzyme Q10 :LOO°

Apportés par l’alimentation

- Vitamines E et C

- Caroténoïdes- Polyphénols, flavonoïdes

• Tripeptide (glycine, glutamate, cystéine)

• Dans toutes les cellules à des concentrations élevées

• Forme réduite: groupement –SH

• Forme oxydée: 2 tripeptides se lient de manière covalente

(S-S, pont disulfure)

• 2 atomes d ’H libérés: H2O2 --> 2H20

Glutathion

Forme Réduite (GSH)

La forme réduite (GSH)

maintient l’état réduit

normal de la cellule

Réparation des lipides oxydés

Excision des bases oxydées

Réparation des protéines oxydées

En aval : systèmes de réparation non spécifique

Vitamines antioxydantes

• Rôle biologique essentiel

• Vitamines hydrophiles

• Acide ascorbique (vitamine C)

• Vitamines liposolubles

• Vitamines A & E

Techniques d’exploration

Isoprostanes dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8-epi PGF2 alpha

Peroxydation de l’acide arachidonique , indépendante de l’action des enzymes cyclooxygénase

et lipooxygénase

Hydroperoxydes lipidiques

Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals comme le 4 HNE

(4hydroxynonenal)

Glutathion : Stress oxydant rapport glutathion réduit/glutathion oxydé

Dosage des défenses: acide ascorbique, a-tocophérol, b-carotène, ubiquinol, …

Total antioxydant status

mesure la capacité totale antioxydante du plasma

Marqueurs de la peroxydation des protéines

Protein adducts on protéines carbonylées.

Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques

8-0H-deoxyguanosine.

Marqueurs de l’activation des PN

Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de l’elastase.

Dosages d’enzymes anti oxydantes

la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la catalase.

Techniques d’exploration

Stress oxydant : nouvelle définition

Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants domages oxydatifs des

biomolécules Helmut Sies (1985)

ANTIOXYDANTS

PRO-OXYDANTS

LIPIDES ADN

ERO

ERNOxydation Nitrosylation

nitration

PROTEINES

Pr. J. Cillard, Pharmacie, Rennes

Perturbation de la signalisation et du contrôle de l’homéostasie redox (Dean Jones

2006)

Conclusion

-Homéostasie redox : équilibre entre production d’espèces

réactives et lutte contre ces espèces

-Impact positif dans la défense anti-microbienne

-Rôle du stress oxydant dans la signalisation et

l’adaptation cellulaire

-Impact en physiopathologie : cause ou conséquence?

Take home message

• Espèces radicalaires de l’oxygène et de l’azote :• Role physiologique

• Role pathologique

• Importance d’un équilibre redox, sinon induction d’un stress oxydant

• Important arsenal de protection : spécifique (Enzymatique+++) et aspécifique

• Peu exploré en pratique clinique quotidienne

Pour aller plus loin

• C Migdal et M Serres, Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant, 2011, Med. Sci.

• S. Benhabbouche et al, Base des phénomènes d’ischémie reperfusionet de la protection myocardique, Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 30 (2011)