Reacutecupeacuteration motrice post-AVC

Biotheacuterapie

Loubinoux Isabelle

1 Inserm Centre de NeuroImagerie de Toulouse Toulouse

2 Universiteacute UPS de Toulouse

3 CHU Toulouse Pocircle Neurosciences

Echelle neurologique globale

Echelle fonctionnelle

Echelle analytique motrice

NIH

Barthel

Fugl-Meyer (extreacutemiteacute supeacuterieure)

Fugl-Meyer (extreacutemiteacute infeacuterieure)

Reacutecupeacuteration rapide dans les 2 premiers mois plasticiteacute ceacutereacutebrale maximale

Reacutecupeacuteration des deacuteficits moteurs Deacutecours temporel

Introduction

Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes

bull Renforcement de connections (LTP)

bull Neuritogenegravese

bull Synaptogenegravese

bull Neurogenegravese

bull Premiegravere cause de handicap

bull Patients lourdement invalideacutes

bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)

limiteacutee

bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation

limiteacutee (modaliteacutes )

bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les

deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)

Introduction

lrsquoAVC

Reacuteeacuteducation

stimulation meacutedicament et cellules souches

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Echelle neurologique globale

Echelle fonctionnelle

Echelle analytique motrice

NIH

Barthel

Fugl-Meyer (extreacutemiteacute supeacuterieure)

Fugl-Meyer (extreacutemiteacute infeacuterieure)

Reacutecupeacuteration rapide dans les 2 premiers mois plasticiteacute ceacutereacutebrale maximale

Reacutecupeacuteration des deacuteficits moteurs Deacutecours temporel

Introduction

Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes

bull Renforcement de connections (LTP)

bull Neuritogenegravese

bull Synaptogenegravese

bull Neurogenegravese

bull Premiegravere cause de handicap

bull Patients lourdement invalideacutes

bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)

limiteacutee

bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation

limiteacutee (modaliteacutes )

bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les

deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)

Introduction

lrsquoAVC

Reacuteeacuteducation

stimulation meacutedicament et cellules souches

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Introduction

Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes

bull Renforcement de connections (LTP)

bull Neuritogenegravese

bull Synaptogenegravese

bull Neurogenegravese

bull Premiegravere cause de handicap

bull Patients lourdement invalideacutes

bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)

limiteacutee

bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation

limiteacutee (modaliteacutes )

bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les

deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)

Introduction

lrsquoAVC

Reacuteeacuteducation

stimulation meacutedicament et cellules souches

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

bull Premiegravere cause de handicap

bull Patients lourdement invalideacutes

bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)

limiteacutee

bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation

limiteacutee (modaliteacutes )

bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les

deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)

Introduction

lrsquoAVC

Reacuteeacuteducation

stimulation meacutedicament et cellules souches

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Reacuteeacuteducation

stimulation meacutedicament et cellules souches

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Laboratoire de TMS et tDCS

TMS Transcranial Magnetic Stimulation

and

tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau

Repetitive TMS +

Neuronavigation

tDCS TMS bistim Repetitive TMS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor

Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group

-

-

-

-

-

-

0

20

40

60

80

100

120

D1 D5 D15 D30

Dec

rease

in

tim

e to

per

form

JH

FT

b

ase

lin

e (s

ec)

Anodal tDCS + rPNS

Sham tDCS + rPNS

Neurorehabilitation and Neural Repair 2015

tDCS

Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre

N=10

N=10

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques

Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice

bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance

bull Patients lourdement deacuteficitaires

Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer

Lancet Neurol 2011

Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)

- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament

Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999

Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)

Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)

Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)

5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)

Mechanisms of action (1)

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Mechanisms of action (2)

1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)

2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression

bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)

3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)

bull 4-hydroxy-2 nonenal

bull delayed neuronal death (penumbra)

4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation

bull in the dentate gyrus

bull of GABAergic interneurones I in the cortex

5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)

bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003

Santarelli Science 03)

5-HT

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal

Observeacutee dans des modegraveles animaux

ABC leacutesion modegravele ischeacutemie

D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives

(Scleacuterose en plaque)

Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes

Quel beacuteneacutefice fonctionnel

Zone Sous-Ventriculaire

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration

Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee

Neurogenegravese en conditions pathologiques existante

Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent

Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes

Magavi et al Nature 2000

Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Amplifier la neurogenegravese existante

1 Stimulation

02

2 Greffe

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Stimulation de la neurogenegravese endogegravene

- Par des composeacutes

Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor

- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses

Strateacutegies les moins invasives

bull Isolation et amplification facile

bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus

adipeux placenta hellip

bull Greffe autologue bonne toleacuterance

bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du

complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)

bull Potentiel de multi-lineacuteage

bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers

la zone leacuteseacutee

Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale

Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Meacutecanismes drsquoaction

bull Facteurs de croissance

bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire

bull Guidage axonal

bull Proteacuteines matrice extracellulaire

(laminine fibronectine collagegravene IV)

Expriment des gegravenes de cellules neurales

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip

Nombre de patients faible (lt13)

Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses

Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules

- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale

- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)

- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute

Seacutecuriteacute Qualiteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales

1 Stimulation

2 Greffe

La plus invasive

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Cellules capables de se diffeacuterencier

uniquement en

bull Neurones

bull Astrocytes

bull Oligodendrocytes

Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale

Greffe de cellules souches neurales

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)

1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)

2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)

3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement

modifieacutees)

Sources de cellules souches neurales

1 Cultures primaires

bull Cellules embryonnaires fœtales

Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)

cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute

problegravemes eacutethiques

Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation

du deacuteficit

bull Cellules souches adultes

SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute

quantiteacute

faible pouvoir prolifeacuteratif

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

amygdalo-hippocampectomie

Zone retireacutee

pour acceacuteder

agrave lrsquohippocampe

(SVZ)

Lobe

temporal

Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la

corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et

cortex

Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie

pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-

hippocampectomie)

Patient Adultes de 18 agrave 65 ans

Autorisation du Ministegravere

DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012

Preacutelegravevement

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Biopsie

Dissociation

meacutecanique et enzymatique

Cellules non adheacuterentes

dissocieacutees

Amplification

Culture 3 semaines

en preacutesence de mitogegravenes

Neurosphegraveres

Clusters de

cellules souches

Neurosphere

Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules

souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de

biopsies de la SVZ et du lobe temporal

Nestin GFAP BrdU

SVZ

Temporal lobe

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Mise en culture et Amplification

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

GFAP GFAP

J7 J25

MAP2

GFAPtuj-1

Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en

Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)

J25

SMI312

MAP2 O4

O4GFAP

J25

Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012

100 microm GFAPtuj-1

Mise en culture et Diffeacuterenciation

Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Reacutecupeacuteration de la force

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules

neuronales

Reconstruction tissulaire

limiteacutee

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP

bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)

bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)

bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct

de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)

Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons

ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)

Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)

Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere

2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen

Pas de groupe controcircle sans chirurgie

Suivi 1 an

Pas drsquoeffets secondaires

NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores

PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03

European Stroke Conference 2014

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Greffe de cellules souches seules est peu efficace

- mort cellulaire massive (5 de survie)

- pas adapteacutee aux leacutesions massives

- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones

Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales

1 Stimuler la neurogenegravese

2 Remplacement neuronal

Faisabiliteacute deacutemontreacutee

mais beacuteneacutefice fonctionnel faible

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Tissue engineering

Mimer la matrice extracellulaire

Creacuteer un microenvironnement permissif

au niveau de la leacutesion

- Ameacuteliorer la survie cellulaire

- Aider agrave la diffeacuterentiation

- Aider agrave la vascularisation

- Diminuer lrsquoinflammation

- Permettre la recolonisation de la glie

par lrsquohocircte

Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable

Structure facilement implantable

La contribution drsquoun support aux cellules

C Montero-Menei Angers

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002

La contribution drsquoun support aux tissus

Supports en polymegraveres syntheacutetiques

poreux biodeacutegradables (PGA

Polyglycolic acid)

Cellules souches neurales

bull Remplissent la caviteacute

bull Milieu permissif pour la croissance

des neurites

bull Permettent drsquoeacutetablir des connections

avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere

controlateacuteral

bull Supportent la vascularisation

bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules

mononucleacuteaires et la cicatrice gliale

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Matrice extracellulaire support est neacutecessaire

- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible

- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes

Question

Nanobiotechnologies

Verrou

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal

Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute

Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance

2004

Marqueurs de

bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)

bull migration neuroblaste

bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)

20ndash30 nouveaux neurones mm3

5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois

Dont certains projettent sur la

moelle

2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

DTI Faisceau corticospinal

(rouge)

Reacutegeacuteneacuteration du FCS

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance

SMI 312

bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes

preacutediffeacuterentieacutees

bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la

leacutesion 4 mois apregraves

bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures

bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte

Neurones hocirctes + humains

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Isabelle LOUBINOUX

laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Introduction

MAG myelin-associated glycoprotein

Inhibiteur de croissance axonale

GSK249320 anti-MAG

2 iv 24h + 9 jours apregraves

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)

Dynamomegravetre

manuel

Force des

extenseurs du

poignet

Test des

frappes

reacutepeacuteteacutees

de lindex

Test Jebsen amp Taylor

Flexion du poignet

9 chevilles

Dexteacuterimegravetre

Stimulateur eacutelectrique

TENS

Systegraveme danalyse cineacutematique 3D

Ergonomegravetre isocineacutetique

en projet

EMG

compatible IRM Capteur du poignet

compatible IRM EEG

2 dynamomegravetres

Reacutealiteacute virtuelle

Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)

Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones

corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard

2007)

Projections longues distances rares

Suffisant pour avoir un reacuteel

beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur

2007

Contact synaptique Pousse axonale

Axone myeacuteliniseacute

Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV

Descending CS motor axons

Ascending sensory axons

La contribution drsquoun support aux cellules

Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle

Spinale ameacutelioreacutee par

lrsquoinjection de biomateacuteriaux

J Neurosci 2010

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme

SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants

Vaysse et al Biomaterials 2015

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

41 6 Novembre 2014

Isabelle LOUBINOUX

Verrous technologiques

1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal

MicroPET non invasif

Immunohistologie

bull Greffe marqueur

bull Neurones marqueur

Double marquage ex vivo

Marqueur humain neuronal humain+neuronal

AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches

2 Histologie des biomateacuteriaux

Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile

Coupes eacutepaisses (Axiozoom)

bull Neurones immatures

bull Astrocytes

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Histologie 1 Neuro-implants

B

ED1 GFAP A

GFAP C

Vaysse et al Biomaterials 2015

Pas de reacuteaction

astrocytaire et

inflammatoire

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Histologie 2

Neuro-

implants

A

B

hNu

Tuj-1 SMI312

Tuj-1 SMI312

Vaysse et al Biomaterials 2015

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Moulage du support en PDMS

(biocompatible)

PDMS avec rainures

de diffeacuterentes tailles

Adheacutesion cellulaire

Coating PolylysineLaminine

20 microm

Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC

1 Fabrication support silicone rainureacute

Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules

45cm

25

cm

Support PDMS adapteacute agrave la

culture cellulaire

20 mm

Image MEB

Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010

Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Microsillons

PDMS plat

Cellules humaines ligneacutee Luhmes

Neurofilaments

Actine

Noyaux

45

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Ctrl plat

10 microm

20 microm 60 microm

X microm

5 microm Tuj-1 Dapi

Ctrl plat 20 microm

2 Alignement des neurites

1 Diffeacuterentiation neuronale

3 Nombre de neuritesneurone

1 neurite

2 neurites

3 neurites

5 microm 10 microm 20 microm

60 microm Ctrl

ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells

differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012

60 microm

Pourcentage de cellules tuj-1

3

52

92 98 114

5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl

Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function

after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation

of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by

behavioral testing

Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

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Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Diminution de la taille de la leacutesion

Ameacutelioration de la survie cellulaire

Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules

Delcroix et al Biomaterials 2011

MSC sur microbilles avec

laminine+NT3

Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

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4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Suivi des cellules

qui prolifegraverent

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

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Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

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Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Arvidsson et al Nature Medecine 2002

Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire

vers les reacutegions leacuteseacutees

Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux

(Meis2 et DARPP32)

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

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4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Lee et al Stem Cells 2010

Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC

SVZ Sub-Ventricular Zone

A stimuler

Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese

Quantification hellip

Correacutelation avec le devenir fonctionnel

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Bleu noyaux

Le tissu ne se reforme pas

Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes

Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif

SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures

Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1

Maturation neuronale

U825

Equipe I Loubinoux

Leacutesion

4 mois post-leacutesion

Analyse histologique chez le rat

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Seacutecuritaires

Cellules sanguines

Cellules endotheacuteliales

6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes

Lee et al Stem Cells 2010)

Neurogenegravese

Transplantation allogeacutenique neurones

Transplantation allogeacutenique neurogenegravese

Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours

Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

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Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

A B

C

Human Marker

Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015

Effet de la greffe

de cellules seules

Plasticiteacute post-

leacutesionnelle

Cortex insulaire

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9

Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke

Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S

Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L

Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA

Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2

N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute

Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere

leacutesion Relier les cellules implanteacutees

au cortex et agrave la moelle

Reacutegeacuteneacuterer des neurones

Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante

Cellules souches Nanotechnologies

Diriger la croissance axonale

Dihneacute et al Stroke 2011

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

AVC et thrombolyse thrombectomie

5 des patients

TOulouse NeuroImaging Centre TONIC

UMR 1014

Centre de NeuroImagerie de Toulouse

cadre

steacutereacuteo-

taxique

Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau

CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012

Preuve de concept

Chez le rat

Ameacutelioration de la

force

(Vaysse et al

Biomaterials 2015)

Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance

AVC et thrombolyse thrombectomie

5 des patients

TOulouse NeuroImaging Centre TONIC

UMR 1014

Centre de NeuroImagerie de Toulouse

AVC et thrombolyse thrombectomie

5 des patients

TOulouse NeuroImaging Centre TONIC

UMR 1014

Centre de NeuroImagerie de Toulouse

TOulouse NeuroImaging Centre TONIC

UMR 1014

Centre de NeuroImagerie de Toulouse