Réduction du chrome (VI) par la souche - INSA Lyontheses.insa-lyon.fr/publication/2002ISAL0030/these.pdfN d’ordre : 02 ISAL 0030 Année 2002 Thèse Réduction du chrome (VI) par

N° d’ordre : 02 ISAL 0030

Année 2002

Thèse

Réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée à partir d’un sol pollué

Présentée devant

L’institut national des sciences appliquées de Lyon

Pour obtenir

Le grade de docteur

Formation doctorale

Sciences et Techniques du Déchet

École doctorale

École doctorale de Chimie de Lyon (Chimie, Procédés, Environnement)

Par

Valérie DESJARDIN (Maître ès-Sciences)

Soutenue le 28 Juin 2002 devant la Commission d’examen

Jury MM.

R. BAYARD

J. COVES Rapporteur

I. IGNATIADIS Rapporteur

P. LEBLOND Président

P. LEJEUNE Directeur de thèse

R GOURDON Directeur de thèse

INSA DE LYON DEPARTEMENT DES ETUDES DOCTORALES ET RELATIONS INTERNATIONALES SCIENTIFIQUES MARS 2002

Ecoles Doctorales et Diplômes d’Etudes Approfondies

habilités pour la période 1999-2003

ECOLES DOCTORALES

n° code national

RESPONSABLE

PRINCIPAL

CORRESPONDANT

INSA

DEA INSA

n° code national

RESPONSABLE

DEA INSA

CHIMIE DE LYON

(Chimie, Procédés, Environnement)

EDA206

M. D. SINOU UCBL1 04.72.44.62.63 Sec 04.72.44.62.64 Fax 04.72.44.81.60

M. R. GOURDON 87.53 Sec 84.30 Fax 87.17

Chimie Inorganique 910643

Sciences et Stratégies Analytiques

910634

Sciences et Techniques du Déchet 910675

M. R. GOURDON Tél 87.53 Fax 87.17

ECONOMIE, ESPACE ET

MODELISATION DES COMPORTEMENTS

(E2MC)

EDA417

M.A. BONNAFOUS LYON 2 04.72.72.64.38 Sec 04.72.72.64.03 Fax 04.72.72.64.48

Mme M. ZIMMERMANN 84.71 Fax 87.96

Villes et Sociétés 911218

Dimensions Cognitives et Modélisation

992678

Mme M. ZIMMERMANN Tél 84.71 Fax 87.96 M. L. FRECON Tél 82.39 Fax 85.18

ELECTRONIQUE,

ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

(E.E.A.)

EDA160

M. G. GIMENEZ INSA DE LYON 83.32 Fax 85.26

Automatique Industrielle 910676

Dispositifs de l’Electronique Intégrée

910696

Génie Electrique de Lyon 910065

Images et Systèmes

992254

M. M. BETEMPS Tél 85.59 Fax 85.35 M. D. BARBIER Tél 85.47 Fax 60.81 M. J.P. CHANTE Tél 87.26 Fax 85.30 Mme I. MAGNIN Tél 85.63 Fax 85.26

EVOLUTION, ECOSYSTEME,

MICROBIOLOGIE , MODELISATION

(E2M2)

EDA403

M. J.P FLANDROIS UCBL1 04.78.86.31.50 Sec 04.78.86.31.52 Fax 04.78.86.31.49

M. S. GRENIER 79.88 Fax 85.34

Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques 910509

M. S. GRENIER Tél 79.88 Fax 85.34

INFORMATIQUE ET INFORMATION

POUR LA SOCIETE

(EDIIS)

EDA 407

M. J.M. JOLION INSA DE LYON 87.59 Fax 80.97

Documents Multimédia, Images et Systèmes d’Information Communicants

992774 Extraction des Connaissances à partir des Données

992099

Informatique et Systèmes Coopératifs pour l’Entreprise 950131

M. A. FLORY Tél 84.66 Fax 85.97 M. J.F. BOULICAUT Tél 89.05 Fax 87.13 M. A. GUINET Tél 85.94 Fax 85.38

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-

SANTE

(EDISS)

EDA205

M. A.J. COZZONE UCBL1 04.72.72.26.72 Sec 04.72.72.26.75 Fax 04.72.72.26.01

M. M. LAGARDE 82.40 Fax 85.24

Biochimie 930032

M. M. LAGARDE Tél 82.40 Fax 85.24

MATERIAUX DE LYON

UNIVERSITE LYON 1

EDA 034

M. J. JOSEPH ECL 04.72.18.62.44 Sec 04.72.18.62.51 Fax 04.72.18.60.90

M. J.M. PELLETIER 83.18 Fax 84.29

Génie des Matériaux : Microstructure, Comportement Mécanique, Durabilité

910527

Matériaux Polymères et Composites 910607

Matière Condensée, Surfaces et Interfaces

910577

M. J.M.PELLETIER Tél 83.18 Fax 85.28 M. H. SAUTEREAU Tél 81.78 Fax 85.27 M. G. GUILLOT Tél 81.61 Fax 85.31

MATHEMATIQUES ET

INFORMATIQUE FONDAMENTALE

(Math IF)

EDA 409

M. NICOLAS UCBL1 04.72.44.83.11 Fax 04.72.43.00.35

M. J. POUSIN 88.36 Fax 85.29

Analyse Numérique, Equations aux dérivées partielles et Calcul Scientifique

910281

M. G. BAYADA Tél 83.12 Fax 85.29

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE

CIVIL, ACOUSTIQUE

(MEGA)

EDA162

M. J. BATAILLE ECL 04.72.18.61.56 Sec 04.72.18.61.60 Fax 04.78.64.71.45

M. G.DALMAZ 83.03 Fax 04.72.89.09.80

Acoustique 910016

Génie Civil

992610 Génie Mécanique

992111

Thermique et Energétique 910018

M. J.L. GUYADER Tél 80.80 Fax 87.12 M. J.J.ROUX Tél 84.60 Fax 85.22 M. G. DALMAZ Tél 83.03 Fax 04.78.89.09.80 M. J. F. SACADURA Tél 81.53 Fax 88.11

En grisé : Les Ecoles doctorales et DEA dont l’INSA est établissement principal

Liste des Professeurs de l’INSA de Lyon MARS 2002

INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK.A Professeurs : AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENT IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUREAU J.C. CEGELY* CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CETHIL – Energétique et Thermique DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DES FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE APPLIQUEE FAYET M. MECANIQUE DES SOLIDES FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. INFORMATIQUE GERARD J.F. MATERIAUX MACROMOLECULAIRES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. CEGELY*- Composants de puissance et applications GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE

Liste des Professeurs de l’INSA de Lyon HEIBIG A. LAB. MATHEMATIQUE APPLIQUEES LYON JACQUET RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DES FORMES ET VISION JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LEJEUNE P. GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MAZILLE H. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. MECANIQUE DES FLUIDES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** MOURA A. GEMPPM*** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE APPLIQUEE NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. MATERIAUX MACROMOLECULAIRES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. GRACIMP – Groupe de Recherche en Apprentissage, Coopération et Interfaces Multimodales pour la Productique PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION RUMELHART C. MECANIQUE DES SOLIDES SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. MATERIAUX MACROMOLECULAIRES SCAVARDA S. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UNTERREINER R. CREATIS** VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE

Liste des Professeurs de l’INSA de Lyon Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. MATERIAUX MACROMOLECULAIRES SEGUELA A. GEMPPM*** Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE APPLIQUEE GRENIER S. BIOLOGIE APPLIQUEE RAHBE Y. BIOLOGIE APPLIQUEE Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

Remerciements

Ces travaux de recherche ont été menés au Laboratoire d’Analyse Environnementale des Procédés et des

Systèmes Industriels (LAEPSI) et dans l’Unité de Microbiologie et de Génétique (UMG) de l’INSA de Lyon.

Je remercie Monsieur Pierre Moszkowicz (Directeur du LAEPSI) et Madame Nicole Cotte-Pattat

(Directrice de l’UMG) de m’avoir accueillie au sein de leurs laboratoires.

Je tiens à remercier Messieurs les Professeurs Rémy Gourdon et Philippe Lejeune, mes deux Directeurs

de thèse, pour la confiance qu’ils m’ont accordée et pour leur aide tout au long de ce travail.

Un merci tout particulier à Rémy Grand Chef pour ses chansons, sa bonne humeur et pour la bonne

ambiance qui régnait dans l’équipe Bio (et aussi pour les multiples relectures de manuscrits, de résumés, de

posters, d’articles…, merci pour ta patience).

Je remercie aussi le Professeur Pierre Leblond du Laboratoire de Génétique et de Microbiologie (Nancy)

qui m’a permis de réaliser une partie de cette étude dans son équipe. Merci pour l’accueil qui m’a été fait, pour

tous les conseils qui m’ont été donnés, et pour toutes ces histoires passionnantes sur l’instabilité génétique des

bras du chromosome de Streptomyces. Merci aussi de m’avoir fait l’honneur de participer au jury. Un merci tout

particulier à Thomas Wenner, pour son aide scientifique et technique mais surtout pour son amitié et les

soirées à Nancy.

Je remercie aussi Philippe Mazodier, Directeur du Groupe Streptomyces de l’Unité de Biochimie

Microbienne de l’Institut Pasteur à Paris pour ces précieux conseils concernant les manipulations avec

Streptomyces. Merci aussi pour l’accueil qui m’a été fait et merci à Julie Viala, son étudiante, pour son aide.

Je remercie aussi le Professeur Claude Roby du Laboratoire de Résonance Magnétique en Biologie

Moléculaire du CEA de Grenoble qui m’a permis de réaliser les spectres RMN. Merci à Sandra Cortes, son

étudiante, qui m’a aidée à réaliser les spectres et à les interpréter.

Je remercie Monsieur Jacques Covès du Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Redox

Biologiques du CEA de Grenoble pour son accueil dans son laboratoire, pour son aide et aussi pour m’avoir

fait l’honneur de juger ce travail.

Je remercie également Monsieur Ioannis Ignatiadis du BRGM d’Orléans, qui m’a fait l’honneur de juger

ce mémoire.

THÈSE V. DESJARDIN-2002 LAEPSI INSA DE LYON

Je remercie particulièrement Monsieur Rémy Bayard pour l’intérêt qu’il a porté à cette étude, pour ses

conseils et sa disponibilité. Merci pour l’agréable ambiance qui a régné dans le bureau pendant les 4 années

passées au LAEPSI.

Je remercie aussi l’ensemble du personnel de l’UMG, en particulier Nico, Agnès, Guy et Corinne pour

leur aide, leur soutien et leurs conseils. Merci aussi à Véronique, Valérie, Yvette et Jean Michel sans qui ce

travail aurait été beaucoup plus fastidieux.

Merci aussi à Sylvie Nazaret et Aline Efosse du laboratoire d’Écologie Microbienne du Sol de l’Université

Claude Bernard pour la lyophilisation des échantillons.

Merci à Piia, Clotilde, Tina et Sylvie qui ont fait leur stage avec moi. Merci pour leur sérieux, leur rigueur

mais aussi pour les bons moments passés ensemble.

Merci à l’ensemble du personnel du LAEPSI et en particulier aux thésards et étudiants en DEA

(Gwénaëlle (pour tous les moments que l’on a partagé et pour tous ceux à venir), Soso (qui a travaillé un an

sur ce sujet, merci aussi pour le fameux WE au ski (!!) et les bons moments passés en « vacances » à Chania),

Manu (pour sa bonne humeur et sa gentillesse, pour tous les problèmes d’ordinateur résolus et pour ses

pirouettes à Québec), Camille, Catherine, Zo, Fred, Khalil, Enrico, Vincent, Sonia, Aurélie, Céline, Fairouz,

Apichat, Bobo, Fabian…

Papa, Maman, un immense merci pour votre confiance et pour votre aide pendant ces longues années

d’études loin de vous. Merci aussi à mes deux sœurs, à Sylvie qui a réalisé un nombre impressionnant de

« patch », j’espère qu’elle gardera un bon souvenir de son stage et à Nathalie pour tous les bons moments

passés dans sa petite famille.

A Djé, tout mon amour, merci de ta confiance et de ton soutien.


Liste des Abréviations ADN : Acide desoxyribonucléique.

ARN : Acide ribonucléique.

ARNm : ARN messager.

ARNr : ARN ribosomial.

ARNt : ARN de transfert.

Cm : chloramphénicol

Cr(III) : chrome trivalent

Cr(VI) : chrome hexavalent

DMSO : Diméthylsulfoxide (CH3)2S.

EDTA : Ethylènediamine tétra-acétate.

ESR : Electron Spin Resonance

EXAFS : Extented X-ray Absorption Fine Structure.

FMN : flavine mononucléotide.

G : glucose.

Gm : gentamycine

LB : Luria Broth.

NAD+, NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide (oxydé, réduit).

NADP, NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide-phophate (oxydé, réduit).

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire.

RPE : Résonance Paramagnétique Electronique.

SDS : Sodium Dodécyl Sulfate.

TES : acide N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonique ; acide 2-[(2-hydroxy-1,1-bis[hydroxymethyl]ethyl)amino]ethanesulfonique.

Tsr : thiostrepton

VB : Vogel-Bonner.

Y : glycérol.

YEME : Yeast Extract-Malt Extract.


RÉSUMÉ

Le chrome est l’un des métaux les plus largement utilisés dans l’industrie. Aujourd’hui, suite à un non

respect ou à l’insuffisance des lois en vigueur ou à des accidents, un grand nombre de sites et d’anciens

sites industriels sont pollués par du chrome. Le chrome est présent dans l’environnement principalement

sous deux formes : le Cr(III) et le Cr(VI). La forme hexavalente, que l’on retrouve dans les rejets

industriels, est très toxique et très soluble dans l’eau. Cette solubilité lui confère une grande mobilité dans

les écosystèmes. La réduction du chrome (VI) en chrome (III) permet de limiter sa mobilité et sa toxicité

et ainsi de réduire les impacts écotoxicologiques potentiels. Le sol, pollué ou non, contient une microflore

abondante qui peut dans certains cas métaboliser les substances polluantes et ainsi réduire le caractère

toxique de certains composés. De plus en plus de travaux de recherche tentent d’exploiter ce phénomène

de « dépollution naturelle » afin de mettre au point des procédés de traitement biologique des rejets

pollués. Ces procédés pourraient être utilisés en complément des procédés physicochimiques, thermiques

et électrochimiques déjà existants.

A partir d’un sol, provenant d’un site de l’agglomération lyonnaise pollué par des ions chromate, une

nouvelle souche bactérienne, capable de réduire le Cr(VI) a été isolée. Cette souche a été identifiée comme

appartenant au genre Streptomyces et à l’espèce thermocarboxydus. Elle a été appelée NH50.

L’objectif de ce travail a été de caractériser cette souche bactérienne afin de déterminer d’une part si

les mécanismes de résistance Cr(VI) et de réduction du Cr(VI) étaient similaires à ceux décrits chez

d’autres bactéries présentant les mêmes phénotypes et d’autre part si l’on pouvait envisager de l’utiliser

dans un procédé de traitement biologique.

Les résultats obtenus ont montré que Streptomyces thermocarboxydus NH50 possède un niveau de

résistance aux ions chromate supérieur à celui d’autres Streptomyces étudiés. La présence d’un plasmide

linéaire, qui est absent chez les autres souches étudiées, suggère que le ou les gènes responsables de la

résistance au Cr(VI) soient localisés sur l’ADN extra-chromosomique. Les différentes expériences de

conjugaison et de mutagenèse n’ont cependant pas permis de démontrer ni d’exclure la participation du

plasmide, en tant que support génétique, dans le phénomène de résistance au chrome. L’étude de la

réduction du Cr(VI) en culture pure par la souche NH50 a montré que l’activité chromate réductase est

localisée dans les surnageants de culture. Il s’agit de molécules de faible masse moléculaire (< 1000

Daltons). D’après les spectres RMN du 13C, la (ou les) molécule(s) réductrices possède(nt) deux fonctions

carboxyliques et plusieurs fonctions hydroxyles.


L’application de surnageants lyophilisés et concentrés dix fois sur du sol pollué (ratio massique

Liquide /Solide = 1) a permis de réduire tout le chrome (VI) présent (pollution initiale d’environ 2000

mg.kg-1) en une quinzaine de jours.

En conclusion, cette étude permet d’envisager l’utilisation des surnageants de culture de la souche

Streptomyces thermocarboxydus NH50 dans un procédé de dépollution qui présenterait l’avantage de pouvoir

s’affranchir des problèmes de toxicité des polluants présents qui peuvent compromettre l’efficacité des

traitements biologiques basés sur l’utilisation de cellules vivantes.

MOTS-CLES : Bioréduction, Chrome, Streptomyces, Mobilité, Toxicité, Traitement, Sol pollué


Cette étude a fait l’objet de :

COMMUNICATIONS ORALES :

Colloque Franco-québécois (Québec, Canada). La pluridisciplinarité dans les problèmes de

l’environnement : les interactions Air Sol Eau. « Limitation de la mobilité du chrome par l’utilisation d’une

souche de Streptomyces capable de le réduire de manière non-enzymatique en présence de Cu2+ ».

MARS 2001

First European Bioremediation Conference (Chania, Crête). Utilisation of supernatants of pure

cultures of Streptomyces thermocarboxydus to reduce chromium toxicity and mobility in contaminated soils.

JUILLET 2001. (soumis pour publication dans Air, Soil and Pollution)

PUBLICATIONS :

Desjardin V., Bayard R., Huck N., Manceau A., Gourdon R (2002) Effect of microbial activity on the

mobility of chromium in soils. Waste Managment. 22, p 195-200.

Desjardin V., Bayard R., Lejeune P., Gourdon R. Utilisation of supernatants of pure cultures of

Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce chromium toxicity and mobility in contaminated soils. Water,

Air and Soil Pollution : Focus / Bioremediation I. (sous presse).


SOMMAIRE

SOMMAIRE

BIBLIOGRAPHIE

I. DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME ........................... 15

1. Introduction ............................................................................ 15

2. Répartition naturelle du chrome et sources de pollution .................. 15

2.1. Répartition naturelle 15

2.1.1. Répartition dans les roches et les sols ............................................. 15

2.1.2. Réserves et production minières ..................................................... 16

2.1.3. Répartition dans les eaux............................................................... 16

2.1.4. Répartition dans l’atmosphère ........................................................ 17

2.2. Sources industrielles 17

2.3. Les sites pollués 19

2.4. Exemple d’une pollution par le chrome : Le site de Joseph Forest

Products à Wallowa County, Oregon, Etats Unis 19

3. Réactivité chimique du chrome dans l’environnement ..................... 20

3.1. Etats d’oxydation 20

3.2. Spéciation 20

3.2.1. Le chrome hexavalent, Cr(VI)......................................................... 20

3.2.2. Le chrome trivalent, Cr(III)............................................................ 21

3.3. Réactions et comportement 22

3.3.1. Le chrome hexavalent ................................................................... 22

a Réduction par le fer ......................................................................... 22

b Réduction par les sulfures ................................................................. 23

c Réduction par la matière organique .................................................... 23

d Réduction photochimique .................................................................. 24

e Réduction biologique ........................................................................ 24

1.1.2. Le chrome trivalent....................................................................... 24

1.1.3. Mobilité....................................................................................... 25


1

SOMMAIRE

4. Toxicité du chrome................................................................... 26

4.1. Chez les animaux 26

4.2. Chez les végétaux 27

4.3. Chez les micro-organismes 28

II. LES SITES POLLUÉS............................................................................. 29

1. Introduction ............................................................................ 29

2. Inventaire des sites pollués en France (Nov 2000) ......................... 29

3. Réglementation en matière de sites pollués .................................. 30

4. Démarche méthodologique d’analyse environnementale.................. 32

4.1. Évaluation Simplifiée des Risques (ESR) 32

4.2. Evaluation Détaillée des Risques (EDR) 32

5. Traitements des sites pollués : aspects généraux .......................... 33

5.1. Méthodes mécaniques 35

5.1.1. Excavation .................................................................................. 35

5.1.2. Tri.............................................................................................. 35

5.1.3. Broyage ...................................................................................... 35

5.2. Méthodes géochimiques 35

5.2.1. Confinement ................................................................................ 35

5.2.2. Barrières actives .......................................................................... 36

5.2.3. Technique « Pump and Treat » ....................................................... 36

5.3. Méthodes chimiques et électrochimiques 36

5.3.1. Mobilisation et extraction............................................................... 36

5.3.2. Stabilisation / solidification ............................................................ 36

5.3.3. Electromigration........................................................................... 37

5.4. Méthodes thermiques 37

5.4.1. Désorption thermique.................................................................... 37

5.4.2. Incinération ................................................................................. 37

5.4.3. Vitrification.................................................................................. 38

5.5. Méthodes biologiques 38


2

SOMMAIRE

6. Traitement des sites pollués au chrome ....................................... 39

6.1. Inventaire 39

6.2. Techniques de traitement 41

6.2.1. Extraction du chrome .................................................................... 41

a Lavage du sol.................................................................................. 41

b Extraction thermique........................................................................ 41

c Electromigration .............................................................................. 41

6.2.2. Immobilisation du chrome.............................................................. 42

a Stabilisation.................................................................................... 42

b Atténuation naturelle........................................................................ 42

c Amendement en matières organiques.................................................. 42

d Techniques de Bio-remédiation .......................................................... 43

III. RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE

RÉDUCTION ............................................................................................... 45

1. Résistance au chrome : aspects généraux .................................... 45

1.1. Mutation du système de transport du sulfate 46

1.2. Système d’efflux : la protéine ChrA 48

2. Réduction du Cr(VI) par les bactéries .......................................... 52

2.1. Introduction 52

2.2. Cas particulier des bactéries sulfato-réductrices 53

2.2.1. Cycle du soufre ............................................................................ 53

2.2.2. Réduction indirecte du Cr(VI) chez les bactéries sulfato-réductrices (BSR)

............................................................................................................... 54

2.2.3. Réduction enzymatique du chrome (VI) par les BSR ........................... 54

2.3. Cas des autres bactéries 55

2.3.1. Mécanismes biochimiques .............................................................. 56

a En anaérobiose................................................................................ 56

b En aérobiose ................................................................................... 58

2.4. Influence de divers paramètres 63

2.4.1. Influence de la concentration en Cr(VI)............................................ 63

2.4.2. Influence du taux d’oxygène dissous sur la réduction du chrome (VI) ... 65

2.4.3. pH optimum et température optimum .............................................. 67

2.4.4. Effet d’autres métaux.................................................................... 67


3

SOMMAIRE

3. Application au traitement de solutions ou de sols pollués par du

chrome : quelques exemples ............................................................. 68

3.1. Traitements anaérobies 68

3.1.1. Culture mixte exogène/Cr(VI) en solution......................................... 68

3.1.2. Culture mixte + Escherichia coli ATCC33456/Cr(VI) en solution ........... 70

3.2. Procédés aérobies 70

3.2.1. Flore endogène/Cr(VI) dans le sol ................................................... 70

3.2.2. Pseudomonas fluorescens LB300/Cr(VI) en solution ........................... 71

3.2.3. Pseudomonas mendocina MCM B-180/Cr(VI) dans le sol ..................... 71


4

SOMMAIRE

MATÉRIELS ET MÉTHODES

1. Sol pollué et méthodes analytiques ............................................. 74

1.1. Origine 74

1.2. Prélèvement du sol et re-contamination en chrome (VI) 75

1.3. Extraction du chrome (VI) contenu dans le sol 76

1.3.1. Extraction par l’eau....................................................................... 76

1.3.2. Extraction par une solution alcaline ................................................. 76

1.4. Dosage du chrome et du cuivre Cu2+ 76

1.4.1. Dosage du chrome (VI) ................................................................. 76

1.1.2. Dosage du chrome total................................................................. 77

1.1.3. Dosage du Cuivre Cu2+ .................................................................. 77

1.2. Humidité résiduelle des échantillons de sol 78

2. Milieux de culture..................................................................... 78

2.1. Milieux liquides 78

2.1.1. Milieu M63................................................................................... 78

2.1.2. Milieu VB (Vogel-Bonner) ............................................................... 79

2.1.3. Milieu LB (Luria Broth) .................................................................. 79

2.1.4. Milieu PEG ................................................................................... 80

2.1.5. Milieu YEME (Yeast Extract Malt Extract) .......................................... 80

2.2. Milieux solides 80

2.2.1. M63 et LB.................................................................................... 80

2.2.2. R5.............................................................................................. 81

2.2.3. NE ............................................................................................. 82

2.2.4. Ajout des antibiotiques .................................................................. 82

3. Isolement de Streptomyces thermocarboxydus NH50 ..................... 82

3.1. Isolement de la souche réductrice (effectué par N. Huck en 1997) 82

3.2. Identification 83


5

SOMMAIRE

4. Bactéries et techniques microbiologiques et biochimiques ............... 83

4.1. Transformation d’Escherichia coli NM522 83

4.2. Streptomyces 84

4.2.1. Préparation du stock de spores ....................................................... 84

4.2.2. Cultures ...................................................................................... 84

4.2.3. Préparation de protoplastes de Streptomyces.................................... 84

4.2.4. Transformation des protoplastes ..................................................... 85

4.2.5. Conjugaisons ............................................................................... 85

4.3. Electrophorèse en champ pulsé 86

4.3.1. Préparation des « inserts » (« plugs ») ............................................ 86

4.3.2. Traitement des « inserts » ............................................................. 86

4.3.3. Electrophorèse ............................................................................. 86

5. Etude des molécules réductrices dans les surnageants de cultures.... 87

5.1. Récupération des surnageants 87

5.2. Lyophilisation des surnageants 87

5.3. Fractionnement des surnageants lyophilisés 88

5.4. Dosage des protéines contenues dans les surnageants par la méthode

de Bradford 88

5.5. Résonance Magnétique Nucléaire du carbone 89

6. Procédures expérimentales d’étude de la réduction du Cr(VI) en

présence de sol ............................................................................... 90

6.1. Milieu dispersé (« batch ») 90

6.2. Microcosmes 90

6.3. Lysimètres 91

6.4. Lit bactérien 91


6

SOMMAIRE

RÉSULTATS

I. CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE Streptomyces thermocarboxydus

NH50 ISOLÉE D’UN SOL POLLUÉ PAR DU Cr(VI) ET DE SA RÉSISTANCE AU

Cr(VI)......................................................................................................... 94

1. Historique............................................................................... 94

1.1. Introduction 94

1.2. Remise en culture de la souche 94

2. Principales caractéristiques physiologiques et biochimiques de la

souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 ..................................... 95

2.1. Aspect des cultures 95

2.1.1. En milieu liquide........................................................................... 95

2.1.2. Sur milieu solide .......................................................................... 96

2.2. Réduction du chrome (VI) 97

2.3. Sensibilité à différents antibiotiques 99

2.4. Recherche d’un éventuel plasmide 101

2.5. Conclusion 102

3. Résistance au chrome ..............................................................103

3.1. Étude préliminaire 103

3.1.1. Résistance comparé de différentes souches de Streptomyces............. 103

3.1.2. Détermination de la concentration létale 50 en chrome..................... 104

3.1.3. Résistance à d’autres métaux lourds.............................................. 105

3.2. Etude de la résistance au chrome 106

3.2.1. Transport du sulfate.................................................................... 106

3.2.2. Recherche du support génétique responsable de la résistance au chrome

............................................................................................................. 107

a Curage du plasmide ....................................................................... 107

b Conjugaison.................................................................................. 109

c Mutagenèse .................................................................................. 114

3.3. Conclusion 121


7

SOMMAIRE

II. RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES

PURES ......................................................................................................123

1. Introduction ...........................................................................123

2. Effet de différents paramètres ...................................................124

2.1. Effet de la taille de l’inoculum 124

2.2. Effet de la source de carbone 125

2.3. Effet d’autres métaux 127

3. Etude de la localisation de l’activité réductrice .............................129

3.1. Localisation de l’activité réductrice 129

3.2. Effet des ions Cu2+ sur la réduction du Cr(VI) par des surnageants de

culture 129

3.3. Effet de la présence de Cr(VI) au préalable dans les cultures 133

3.4. Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la réduction par des

surnageants de cultures 134

3.5. Effet de la température d’incubation 136

4. Etude de la nature de la (des) molécule(s) responsable(s) de la

réduction du Cr(VI) .........................................................................137

4.1. Recherche de molécules protéiques 137

4.1.1. Action de protéases .................................................................... 137

4.1.2. Effet du SDS.............................................................................. 140

4.1.3. Précipitation du surnageant à l’éthanol .......................................... 140

4.1.4. Lyophilisation ............................................................................ 144

4.2. Fractionnement des surnageants de culture lyophilisés 146

4.3. Etude par Résonance Magnétique Nucléaire du 13C 149

5. Conclusion .............................................................................156


8

SOMMAIRE

III. ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ.....

..........................................................................................................157

1. Caractéristiques du sol.............................................................157

2. Réduction du chrome (VI) dans un sol pollué : étude en milieu dispersé

(batch) .........................................................................................158

2.1. Conditions aérobies 158

2.2. Conditions anaérobies 160

2.3. Réduction du chrome (VI) par la flore endogène aérobie 162

2.3.1. Effet de la source de carbone ....................................................... 162

2.3.2. Effet d’une augmentation de la flore endogène................................ 163

2.3.3. Effet de la concentration initiale en glucose .................................... 164

2.3.4. Effet de la concentration initiale en chrome (VI) .............................. 167

a Essai avec la flore endogène sans enrichissement ............................... 167

b Essai avec la flore endogène enrichie ................................................ 168

2.4. Réduction du chrome (VI) par des flores exogènes aérobies 169

2.4.1. Pseudomonas fluorescens LB300................................................... 170

2.4.2. Streptomyces thermocarboxydus NH50 .......................................... 171

a Enrichissement sous forme de spores................................................ 171

b Ensemencement de S. thermocarboxydus NH50 sous la forme mycélienne

.......................................................................................................... 173

2.5. Conclusions 174

3. Expériences en microcosmes.....................................................175

3.1. Effet de l’apport d’un inoculum de NH50 (sous forme de spores) et de

la source de carbone pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de

100/8/0,5/1,25 175

3.2. Effet de l’apport d’un inoculum (NH50 ou LB300) pour un rapport

massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5 (milieu M63) 177

3.3. Etude en microcosmes de la réduction par des surnageants de culture

179

3.3.1. Effet de la dilution des surnageants ............................................... 179

3.3.2. Utilisation de surnageants lyophilisés et concentrés ......................... 181

3.3.3. Effet du cuivre ........................................................................... 183

3.4. Conclusions 185


9

SOMMAIRE

4. Etudes en lysimètres et lit bactérien...........................................187

4.1. Etude en lysimètres 187

4.1.1. Evaluation préliminaire de la bio-stimulation et de la bio-augmentation

............................................................................................................. 188

a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours ..................... 189

b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution ........................... 190

4.1.2. Comparaison des techniques de bio-stimulation et de bio-augmentation

............................................................................................................. 191

a Aspect du sol dans chacun des lysimètres .......................................... 192

b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution ........................... 193

4.1.3. Evaluation globale du traitement par bilan matière et caractérisation

écotoxicologiques ..................................................................................... 194

a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours ..................... 194

b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution en début de traitement

.......................................................................................................... 194

c Aspect de la solution contenue dans les réacteurs ............................... 194

d Devenir du chrome après 3 mois de traitement et bilan matière ............ 194

e Evaluation de l’écotoxicité du sol et de son percolat avant et après

traitement (étude réalisée par POLDEN) ................................................... 196

4.1.4. Conclusions ............................................................................... 198

4.2. Traitement des lixiviats en lit bactérien 198

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................. 202


10

SOMMAIRE

ANNEXES

1. Les Streptomyces ...................................................................209

1.1. Caractéristiques du genre Streptomyces 209

1.1.1. Généralités................................................................................ 209

1.1.2. Cycle de différentiation cellulaire .................................................. 210

1.2. Génétique des Streptomyces 211

1.2.1. Le génome ................................................................................ 211

1.2.2. Les plasmides ............................................................................ 212

2. Alignement multiple des 7 séquences des membres de la famille CHR

...................................................................................................213

3. Résonances (ppm) des atomes de carbone de différentes molécules.

Liste fournie par S. Cortes du laboratoire de Résonance Magnétique en

Biologie Moléculaire CEA Grenoble. ....................................................215

RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................... 218

LISTE DES FIGURES................................................................................. 228

LISTE DES TABLEAUX............................................................................... 233


11

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Le XXème siècle aura été le siècle pendant lequel l’industrie s’est le plus développée. Cette croissance

exponentielle a permis des progrès considérables pour l’Humanité mais a aussi engendré un nombre

important de conséquences néfastes pour l’environnement et pour l’Homme.

Le chrome est l’un des métaux les plus largement utilisés dans l’industrie car il possède un grand

nombre de qualités. Il est utilisé notamment dans l’industrie des aciers inoxydables, dans la tannerie, pour

le traitement du bois… Des quantités importantes de chrome ont été rejetées dans l’environnement suite à

un non respect ou à l’insuffisance des lois en vigueur, à de la négligence ou à des accidents. Aujourd’hui,

beaucoup de sites et d’anciens sites industriels sont pollués par du chrome.

C’est la forme dite hexavalente qui est la plus problématique car sous cette forme, le chrome est très

toxique mais aussi très soluble dans l’eau. Cette solubilité lui confère une grande mobilité dans les

écosystèmes si bien qu’une pollution au chrome (VI) d’abord très localisée peut concerner ensuite une

zone beaucoup plus vaste.

Les méthodes mises en œuvre aujourd’hui pour traiter les rejets pollués par du chrome (VI) visent

généralement à réduire le chrome (VI) en chrome (III) afin de diminuer les impacts écotoxicologiques et

l’étendue de ces impacts. En parallèle des méthodes physico-chimiques et électrochimiques existantes, de

plus en plus de travaux de recherche tentent d’exploiter la capacité de la nature à se régénérer elle-même.

Le sol est un milieu « vivant ». Une microflore très riche, qui a su s’adapter aux pollutions les plus diverses,

utilise parfois les substances polluantes pour se développer. Un nombre important de bactéries a été isolé

de sites pollués au chrome (VI) et une partie d’entre elles est capable de réduire le chrome (VI) en chrome

(III). Cette capacité à réduire le chrome (VI) et par conséquent sa toxicité et sa mobilité permet

d’envisager la mise au point de bio-procédés pour traiter les sols (et les effluents) pollués au chrome.

C’est dans ce contexte qu’a été isolée, à partir d’un sol pollué de la région lyonnaise, une souche

bactérienne de Streptomyces thermocarboxydus, que nous avons appelée NH50. Cette souche est capable de

croître dans un milieu contenant des ions chromate et de réduire ces ions sous forme trivalente.


12

INTRODUCTION

Nous avons dans un premier temps déterminer les principales caractéristiques physiologiques et

biochimiques de cette nouvelle souche. Nous avons notamment étudié la résistance au chrome (VI) afin

d’élucider les mécanismes de résistance au chrome propres à cette souche bactérienne. Cette souche est en

effet destinée à être utilisée dans un procédé de biorémédiation pour traiter un sol pollué au chrome (VI).

Nous avons, dans un deuxième temps, étudier la réduction du chrome (VI) en culture pure pour

définir les conditions optimales afin de réduire le chrome (VI) et déterminer le mécanisme de réduction du

chrome.

Enfin, dans une troisième partie, nous avons utilisé la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50

pour réduire le chrome (VI) contenu dans un sol (étude en milieu dispersé, microcosmes et lysimètres)

afin de mettre au point un procédé de traitement de sol pollué.


13

BIBLIOGRAPHIE

BIBLIOGRAPHIE


14

BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME

I. DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU

CHROME

1.Introduction

Le chrome a été découvert dans l’Oural à Beresovsk dans du minerai de plomb rouge (crocoïte) à la

fin du XVIIIème siècle par le chimiste français Nicolas Louis Vauquelin (1763-1829). Ce métal fut nommé

ainsi à cause des couleurs éclatantes qu’il donne à certains de ses composés (khrôma en grec signifie

couleur). Les couleurs du rubis et de l’émeraude par exemple sont dues à la présence de Cr(III).

Le chrome fut utilisé au début du XIXème siècle dans les procédés de pigmentation aux bichromates, mis

au point par Alphonse Louis Poitevin, pour la photographie. Le chrome a aujourd’hui trouvé un grand

nombre d’applications industrielles qui exploitent ses couleurs mais aussi un grand nombre de ses autres

qualités qui sont la solidité, la dureté et la résistance à la corrosion ainsi que les capacités oxydantes de

certaines de ses formes. Il n’est pas surprenant, compte tenu de toutes ces qualités, que de grandes

quantités de chrome soient utilisées de par le monde dans différents procédés industriels et qu’en

conséquence de grandes quantités de déchets chromés soient produites et éventuellement rejetées dans

l’environnement. Alors que le chrome en très faible quantité, « à l’état de trace », est essentiel pour la vie

humaine, l’exposition répétée et régulière aux composés chromés peut entraîner de graves dommages pour

la santé. Les quantités très importantes de chrome dispersées par certaines activités industrielles présentent

aussi un réel danger pour les écosystèmes.

2.Répartition naturelle du chrome et sources de pollution

2.1. Répartition naturelle

Le chrome se retrouve dans tous les compartiments de l’environnement, aussi bien dans l’eau que

dans l’air et le sol mais aussi par extension dans les organismes vivants.

2.1.1. Répartition dans les roches et les sols

La concentration moyenne en chrome de la croûte continentale est de 125 mg.kg-1 avec des valeurs

généralement comprises entre 80 et 200 mg.kg-1 (Losi et al., 1994). Il est largement présent dans les roches

ignées où le chrome trivalent peut se substituer à Fe3+ car leurs rayons ioniques sont très proches

(r Fe3+ = 0,067 nm et r Cr3+ = 0,064 nm). Il se substitue aussi à Fe3+ et à Al3+ dans d’autres minéraux


15


comme les tourmalines, les micas et les grenats. Les traces de chrome sont souvent responsables de la

couleur de ceux-ci comme le vert de l’émeraude et le rouge du rubis. La teneur en chrome des sols est

largement dépendante de leur nature. La concentration moyenne d’un sol est autour de 40 mg.kg-1 avec

des variations entre 10 et 150 mg.kg-1. Le Tableau I présente les concentrations en chrome rencontrées

dans différents échantillons de roches et minéraux :

Tableau I : Concentration moyennes en chrome dans différents minéraux (d’après Govindaraju, 1984)

Roches/Minéraux Péridots Basaltes Grabbros Argiles Micas Feldspaths Quartz

Cr en ppm ou mg.kg-1 2900/3200 300/400 450 150/200 50 5/25 5

2.1.2.Réserves et production minières

Les plus grands pays producteurs de chromite sont l’Afrique du Sud avec 1490 milliers de tonnes de

métal pour l’année 1995, le Kazakhstan avec 1200 .103 t.an-1 puis le Zimbabwe (550.103 t.an-1), l’Inde

(260.103 t.an-1), la Turquie et l’Albanie (250.103 t.an-1), la Finlande et le Brésil (175 et 160.103 t.an-1

respectivement). La France produisait environ 60.103 t.an-1 de minerai jusqu’en 1991 en Nouvelle-

Calédonie dans les mines de Tiebaghi et d’Alice-Louise, principalement exporté vers la Chine et le Japon.

Ces mines sont fermées depuis dix ans maintenant. Aujourd’hui la France importe annuellement près de

90 000 tonnes de chromite extraite en Albanie (41 %), en Turquie (22 %) et en Afrique du Sud (20 %).

Les réserves mondiales en chromite ont été estimées en 1990 à 1,4 milliard de tonnes dont 70 % sont

situées en Afrique du Sud, 10 % au Zimbabwe, 9 % au Kazakhstan, 4 % en Inde et 1 % en Finlande

(www.sfc.fr consulté le 10/09/01).

2.1.3. Répartition dans les eaux

L’altération et l’érosion des roches est une source importante de libération du chrome dans

l’environnement. Les processus d’érosion naturels libèrent le chrome qui peut être transporté vers les eaux

de surface et les eaux souterraines.

Dans les eaux douces, la concentration en chrome est en général comprise entre 0,1 et 6 µg.L-1 avec

une moyenne à 1 µg.L-1 alors que l’on trouve une moyenne de 0,3 µg.L-1 dans les eaux de mer avec des

variations plus importantes des valeurs (0,2 jusqu’à 50 µg.L-1) (Losi et al., 1994). La concentration en

chrome de certaines eaux peut atteindre des valeurs assez élevées, jusqu’à 800 µg.L-1 dans les eaux de

drainage dans San Joaquin Valley en Californie en raison de l’irrigation de zones agricoles contenant des

valeurs élevées en chrome (Deverel et Millard, 1988). La concentration dans les eaux est étroitement liée à

la concentration des sols adjacents.


16


2.1.4. Répartition dans l’atmosphère

Les teneurs en chrome de l’atmosphère varient aussi beaucoup selon la localisation. Des zones comme

l’Antarctique ou le Groenland présentent des valeurs de l’ordre de 10-6 à 10-3 µg.m-3. Ces valeurs sont

considérées comme des valeurs basales dues aux poussières constituées de particules de sol amenées par le

vent (50.103 tonnes par an) ou dispersées par l’activité volcanique (1.103 tonnes par an). En comparaison,

des analyses effectuées sur des échantillons collectés en zone urbaine présentent des concentrations

pouvant atteindre 0,03 µg.m-3, valeurs largement dépassées dans des zones d’industrie de l’acier (Losi et al.,

1994).

2.2. Sources industrielles

Les concentrations en chrome mesurées dans la pédosphère, l’hydrosphère, l’atmosphère et la

biosphère sont liées pour l’essentiel à des émissions d’origine industrielle.

Le chrome est extrait sous forme de minerai de chromite de formule chimique complexe

[(Fe, Mg)O(Cr, Al, Fe)2O3] ou plus simplement sous forme de FeCrO4. Cette chromite est principalement

utilisée en sidérurgie et en métallurgie (70 %), dans la production de réfractaire (15 %) et en chimie (15 %).

Selon les régions du monde, les minerais sont de qualité différente. Il existe une première catégorie, les

minerais dits riches, c’est-à-dire contenant entre 48 et 55 % (w/w) de Cr2O3 avec un rapport Cr/Fe

supérieur à 3. Ces minerais sont principalement extraits en Turquie, en Albanie et en Grèce. Ils sont

destinés à la fabrication des ferrochromes (voir ci-dessous). La deuxième catégorie est constituée des

minerais dits pauvres où la teneur en Cr2O3 est de l’ordre de 40 % et le rapport Cr/Fe est d’environ 1,6.

Ils sont extraits en Afrique du Sud. Ils servent à la fabrication de matériaux réfractaires mais aussi, depuis

l’introduction des procédés AOD (Arc-Oxygène-Dégazage, convertisseur d’acier carbone en acier

inoxydable), à l’élaboration des aciers inoxydables. Ils sont également employés pour élaborer des

ferrochromes appelés charge-chrome à basse teneur en Cr (50-55 % de Cr et 6-8 % de C).

Utilisation du chrome dans l’industrie

Les ferrochromes : les ferrochromes sont élaborés au four électrique à arc. Ils sont le plus souvent utilisés

pour la production des aciers, dont les aciers inoxydables, et aussi de la fonte. On en distingue 3 grands

types en fonction de leur composition chimique : le charge-chrome (50 à 55 % de Cr, 6 à 8 % de C et 2 à 5

% de Si), le ferrochrome carburé (60 à 65 % de Cr, 4 à 8 % de C) et le ferrochrome bas carbone raffiné et

suraffiné (67 à 75 % de Cr, 0,02 à 0,5 % de C).

Dans le monde en 1994, 3124 milliers de tonnes de ferrochromes (charge-chrome et carburé) ont été

produites dont près d’un tiers par l’Afrique du Sud. Ensuite, on trouve la Chine, l’Inde, la Finlande,

le Japon, le Kazakhstan, la Russie et le Zimbabwe qui produisent entre 150 et 250 milliers de tonnes


17


chacun. A partir de minerais importés, la France ne produit que 22 milliers de tonnes qu’elle exporte en

quasi totalité vers l’Allemagne et la Belgique. Elle en importe 10 fois plus en provenance d’Afrique du Sud

(61 %), de Finlande (9 %) et de Suède (8 %) (www.sfc.fr).

Le chrome métal :: Le chrome métal de couleur gris acier est très dur, cassant, brillant, résistant à la

corrosion et facilement polissable. Il est obtenu par aluminothermie à partir d’oxyde de chrome ou par

électrolyse à partir de ferrochrome. La réaction mise en jeu dans l’aluminothermie est la suivante :

Cr2O3 + 2 Al→2 Cr + Al2O3

équation 1

Dans le monde, 17 000 tonnes de chrome sont produites annuellement. La France en utilise 1 200

tonnes et en exporte plus de 2 300 tonnes. La société Delachaux est le premier producteur européen de

chrome par aluminothermie et occupe le 3ème rang mondial (www.sfc.fr). Le chrome métal est utilisé dans

les superalliages (en présence de nickel et de cobalt), dans la fabrication des pigments et de bandes

magnétiques ainsi que pour les soudures électriques et l’électronique. Pour le chromage des pièces

métalliques, le chrome a deux utilisations : le dépôt de chrome décor effectué par électrolyse qui a pour

but de recouvrir d’une faible épaisseur les pièces métalliques essentiellement nickelées. La couche finale,

n’ayant qu’un rôle esthétique, permet d’éviter le ternissement de la surface de nickel par sulfuration.

Lorsque la couche de chrome atteint une épaisseur de plusieurs dixièmes de mm, on parle de chrome dur

et dans ce cas le chrome sert directement à protéger la pièce métallique. Le chrome apporte une excellente

résistance à l’usure, aux frottements, à la corrosion, une grande dureté de surface et des propriétés anti-

adhérentes. On retrouve la technique du chromage dans l’industrie automobile, l’aéronautique, pour les

arbres de transmission des machines-outils, pour les appareils de mesure et les moules pour plastique.

Le chrome est aussi utilisé pour ses propriétés fongicides dans le traitement du bois. L’ancienne

technique pour protéger le bois consistait à carboniser le bois mais ce procédé rendait celui-ci

extrêmement cassant. L’utilisation du sulfate de cuivre et de chlorure de zinc posait un problème de

délavabilité. L’ajout de chrome améliore significativement la fixation des composants actifs comme le

cuivre et l’arsenic. Les mélanges les plus utilisés sont l’ACC (Arsenic Cuivre Chrome) et le BCC

(Bore Cuivre Chrome)

Le stockage inadapté et des structures défaillantes sont à l’origine de graves pollutions industrielles.

Le sol est le plus touché avec 900.103 tonnes de chrome rejeté par an. Viennent ensuite les eaux de surface

qui récupèrent environ 140.103 tonnes par an et l’atmosphère avec 30.103 tonnes par an.


18


2.3. Les sites pollués

La contamination des sols existait bien avant l’ère industrielle. Les catastrophes naturelles, comme les

éruptions volcaniques, les inondations, les incendies de forêt, de même que les phénomènes courants, tels

l’altération atmosphérique, la combustion et l’érosion, libèrent des contaminants qui peuvent se répandre

dans le sol. Depuis, ce sont principalement les diverses activités humaines, telles que l’agriculture,

la fabrication, l’exploitation minière et l’élimination des déchets, qui ont été et sont responsables de la

dispersion de grandes quantités de contaminants dans l’environnement. On trouve dans le sol des

contaminants d’origine naturelle, par exemple des métaux, tels que le plomb, le mercure et le cadmium,

des éléments radioactifs, tels que l’uranium et le radon. L’activité humaine est responsable de leur

dispersion et/ou de leur concentration en certains sites. D’autres contaminants du sol proviennent

exclusivement de l’activité humaine. Il s’agit notamment de composés organiques de synthèse, tels les

pesticides, ainsi que du pétrole et de ses sous-produits. A partir du sol, ces substances peuvent aller jusqu’à

contaminer les aliments, l’air ou l’eau. La majorité des sols de la planète a été contaminée par les activités

humaines, même si le degré de contamination varie d’un endroit à un autre. Bien que les sols aient une

capacité inhérente d’épuration, ce processus d’atténuation naturelle est très lent et parfois il ne s’agit que

d’un déplacement de la pollution d’un compartiment à l’autre de l’environnement.

Dans la majorité des cas, les anciens sites d’enfouissement de déchets dans de nombreux pays

industrialisés constituent des installations assez simples où l’on superpose des couches de détritus en ne

prenant guère de précautions pour empêcher les lixiviats de s’infiltrer dans le sol environnant. Au Canada,

le ministère de l’environnement a dénombré plus de 10 000 décharges publiques actives, désaffectées ou

abandonnées, sans compter les sites d’enfouissement privés.

Durant le dernier siècle, le développement de l’industrie a été exponentiel. Aujourd’hui, nous devons

assumer cet héritage technologique et ses conséquences environnementales préjudiciables pour l’Homme

et pour son patrimoine naturel. Il convient aujourd’hui d’évaluer les risques consécutifs à ce

développement technologique de la fin du millénaire et trouver des solutions afin de préserver notre

patrimoine naturel pour les générations futures.

2.4. Exemple d’une pollution par le chrome : Le site de Joseph

Forest Products à Wallowa County, Oregon, Etats Unis

Une industrie de traitement du bois, située sur un site de 75 hectares, a été détruit en 1974 par un

incendie. Des milliers de litres de produits pour traiter le bois se sont écoulés directement dans le sol. La

compagnie fit faillite en 1984 et ne put assumer l’assainissement du site demandé par le Département de la

qualité de l’environnement de l’état d’Oregon. Des analyses de l’EPA (Environmental Protection Agency)


19


en 1985 révélèrent de hautes concentrations en arsenic et en chrome dans les sols. De plus, cette

contamination avait atteint les nappes phréatiques de la région. Les premières investigations démontrèrent

que l’eau potable, fournie par une entreprise située près du site, était menacée par la contamination.

L’EPA décida d’excaver plus de mille tonnes de sol fortement contaminé et installa une barrière autour de

la zone de traitement, afin d’y interdire l’accès. Ces mesures assurèrent une qualité de l’eau pendant que

l’EPA dirigeait une analyse de risque et prévoyait un plan de traitement à long terme du site. Le site fut

placé sur la NPL (National Priorities List des États Unis) le 31 mars 1989. En septembre 1992, l’EPA

entreprend le traitement du site qui inclut l’excavation des terres polluées, la démolition des anciens

bâtiments, la mise en décharge du sol pollué et des débris, l’élimination des containers de stockage et le

suivi de la qualité de l’eau. Le traitement du site s’est achevé en mai 1993. Au total, plus de 6000 tonnes de

sol et de débris ont été envoyées en décharge. La qualité de l’eau a été suivie encore pendant trois ans. La

dernière investigation du site date de septembre 1998 et a confirmé que le site ne présentait plus de

risques. Le site a été rayé de la NPL le 4 novembre 1999 (www.epa.gov).

3.Réactivité chimique du chrome dans l’environnement

3.1. Etats d’oxydation

L’isotope le plus abondant est le 52Cr. Comme d’autres métaux de transition, le chrome peut exister

sous plusieurs formes de valence pouvant aller de –2 à +6. Les formes les plus couramment rencontrées

dans les valeurs de pH et de potentiel redox trouvées dans l’environnement sont les formes 3+ et 6+

(Cr(III) et Cr(VI)). La forme (III) est considérée comme la forme la plus stable.

3.2. Spéciation

3.2.1. Le chrome hexavalent, Cr(VI)

Le chrome hexavalent est un puissant oxydant. On le retrouve sous des formes d’oxyanions qui sont

très solubles dans l’eau et qui répondent aux équations suivantes selon le pH (Nieboer et Jusys, 1988):

H2CrO4 H+ + HCrO4- avec Ka1 = 10-0,6 équation 2

HCrO4- H+ + CrO42- avec Ka2 = 10-5,9

équation 3

Les deux équations ci-dessus montrent qu’à faibles pH, proche de 0, H2CrO4 est l’espèce dominante

alors qu’entre 0,6 et 6 environ, c’est HCrO4-. Pour des pH > 6, c’est l’ion chromate CrO42- qui prévaut.

Etant donné qu’on ne retrouve pas de pH proche de 0 dans les matrices environnementales, seuls


20


HCrO4- et CrO42- sont présents dans les systèmes naturels. Au-dessus d’une concentration de 10 mM

environ (520 mg.L-1), on observe la dimérisation du chromate CrO42- en dichromate Cr2O72- surtout à de

faibles valeurs de pH.

2 CrO42- + 2 H+ Cr2O72- + H2O équation 4

[Cr2O72-]/[CrO42-]2 [H+]2 = 1014,6 équation 5

Dans les conditions généralement rencontrées dans les eaux polluées au chrome, l’ion chromate est

prédominant. Ainsi pour une concentration en ions CrO4- de l’ordre de 5 mg.L-1 à pH 7, l’équation 5

donne un rapport [Cr2O72-]/[CrO4-] de 0,04. C’est pour cette raison que la chimie de l’environnement se

limite souvent à l’étude de l’ion chromate plutôt que l’ion dichromate.

La solubilité du Cr(VI) dans l’eau peut être très importante mais tout dépend du cation auquel il est

associé. K2CrO4 (carapataïte) présente une solubilité de 38,96 g.L-1 à 20°C alors que les complexes

PbCrO4, CaCrO4 et BaCrO4 présentent des solubilités beaucoup moins importantes de l’ordre de

0,005.10-3 g.L-1, 0,2 g.L-1 à 18°C et de 50.10-3 g.L-1 à 25°C respectivement. (Pascal, 1957)

3.2.2. Le chrome trivalent, Cr(III)

Le chrome trivalent est la forme la plus stable mais ayant des propriétés chimiques plus complexes

que le chrome hexavalent. Le chrome trivalent a peu d’affinité pour l’oxygène, c’est pour cette raison qu’il

a tendance à former nombre de complexes avec des ligands organiques ou non. Parmi les ligands suivants

OH-, SO42-, CO32-et NO3-, seul OH- se complexe de façon significative avec le Cr(III) aux concentrations

retrouvées dans l’environnement. Dans les conditions environnementales courantes, le Cr(III) se retrouve

en solution aqueuse sous forme de Cr3+, Cr(OH)2+, Cr(OH)30 et Cr(OH)4-. Les formes ioniques donnent

une coloration verte aux solutions. La solubilité de la forme solide Cr(OH)30 la plus fréquemment

rencontrée aux pH naturels est connue pour être très faible. Certains composés, notamment des composés

organiques, peuvent former des complexes avec le chrome trivalent, prévenant ainsi sa précipitation à de

faibles valeurs de pH.

La spéciation du chrome (VI) et (III) dépend de plusieurs paramètres comme le pH, leur

concentration et la disponibilité en ligand. Dans les milieux naturels, le chrome hexavalent est

principalement sous la forme de CrO42- et la majeure partie du chrome trivalent est incluse dans des

hydroxydes ou dans des complexes avec des ligands organiques. Le comportement du chrome (VI) et (III)

et l’inter-conversion entre les deux formes peut être mieux comprise si l’on considère les propriétés

environnementales du chrome.


21


3.3. Réactions et comportement

Le chrome est connu pour intervenir dans différentes réactions chimiques et biologiques qui peuvent

modifier sa spéciation et par conséquent son comportement dans l’environnement. Il peut y avoir

oxydation du chrome (III) ou réduction du chrome (VI).

3.3.1. Le chrome hexavalent

Le chrome hexavalent est un oxydant puissant et peut être facilement réduit en présence d’un

réducteur selon l’équation suivante :

HCrO42- + 7 H+ + 3 e- Cr3+ + 4 H2O ε0 = + 1,195 V (Handbook, 82nd Ed, 2001) équation 6

Le Cr (VI), sous forme de chromate, peut oxyder la forme réduite de tous les couples dont le potentiel

standard est inférieur à 1,195 V. Par conséquent, la réduction du Cr(VI) peut avoir lieu en condition

standard en présence de fer ferreux Fe(II) puisque le potentiel standard du couple Fe3+/Fe2+ est de 0,77 V

(Handbook, 82nd Ed, 2001). La présence de composés soufrés réducteurs ou de matière organique telles

que les acides fulviques et humiques augmente la réduction du chrome hexavalent surtout si le taux

d’oxygène est faible. La réduction peut être aussi photochimique ou biologique.

a Réduction par le fer

Le fer (II) semble être le plus important des réducteurs possibles du Cr(VI) dans l’environnement.

Il existe sous forme dissoute comme cations libres ou intégré dans le réseau cristallin de phases minérales

comme la magnétite (Fe2+ 2Fe3+ O4), la biotite (K(Mg,Fe2+)3 (Al,Fe3+) Si3 O10 (OH,F)2), la pyrite (FeS2),

chloritoïde (Fe2+, Mg, Mn)2 Al4 Si2 O10 (OH)4).

Les études menées sur la réduction du Cr(VI) par le Fe(II) en solution ont montré que, outre les

concentrations respectives des deux espèces, le pH et la température influençaient la vitesse de réaction.

Les pH pour lesquels on observe des cinétiques de réaction les plus rapides sont compris entre 6 et 8

(Buerge et Hug, 1997 ; Sedlak et Chan, 1997). L’élévation de la température permet d’augmenter la vitesse

de réaction (Sedlak et Chan, 1997 ; Pettine et al., 1998).

L’oxygène dissous quant à lui ne semble pas entrer en compétition avec le chrome pour l’oxydation du

fer. La cinétique de réaction entre le chrome (VI) et les ions ferreux est mille fois plus rapide à pH 8 que la

réaction entre l’O2 et les ions Fe2+ (Buerge et Hug, 1997).


22


Des études ont été menées sur le pouvoir réducteur de phases minérales porteuses de Fe(II),

en particulier la magnétite. Elles ont montré que les ions Fe(II) en superficie du minéral réduisent le

Cr(VI) en Cr(III) probablement sous forme de oxy-hydroxyde de chrome, qui forme alors un précipité à la

surface de la magnétite. Cette couche « passive » en surface empêche l’accessibilité aux autres ions ferreux

et limite ainsi la réduction. Pour une biotite contenant 11,7 % en poids de fer ferreux, les études ont

montré que ce minéral se dissout en relarguant Fe(II). La réduction du chrome hexavalent a donc lieu en

solution (Eary et Rai, 1989).

b Réduction par les sulfures

Les sulfures sont aussi des candidats potentiels pour la réduction du chrome(VI). Ils peuvent être

associés au fer (II) sous forme de sulfures de fer dans la pyrite et dans la mackinawite (Fe9S8), ou à d’autres

métaux dans les minéraux, ou être seuls sous forme d’H2S. Dans le cas de la mackinawite (Patterson et al.,

1997), le minéral se dissout en relarguant des ions Fe2+ surtout à pH acide.

Pettine et al. (1994 et 1998) ont montré que les sulfures peuvent réduire les ions chromate en présence

de concentration de l’ordre du micromolaire en H2S et en milieu anoxique. Ils ont aussi montré que la

formation de complexe métal-chrome, le métal pouvant être un cation divalent tel que Mg2+, Pb2+, Cu2+,

Cd2+, Ni2+ et Mn2+, augmentait de manière significative la vitesse de réduction du chrome (VI).

Cette association métal-chrome permettrait aux chromates de réagir plus rapidement avec les sulfures que

s’ils étaient libres en solution. La vitesse peut être encore plus rapide en présence de Fe3+. En effet ces

ions peuvent être réduits par les sulfures en Fe2+ qui peuvent à leur tour réduire le Cr(VI). Dans ce cas,

les deux réactions faisant intervenir les sulfures et les ions ferreux et ferriques sont beaucoup plus rapides

que la réaction entre les sulfures et le Cr(VI).

c Réduction par la matière organique

La matière organique naturelle (acides humiques (AH) ou fulviques (AF)) contenue dans les sols ou

dans les eaux est également susceptible de réduire le chrome (VI) (Bartlett et Kimble, 1976 ; James et

Bartlett, 1983 ; Alloway, 1995). Grâce à leur pouvoir chelatant et leur propriété d’oxydo-réduction,

les matières humiques constituent un système actif d’oxydo-réduction (AHox/AHred E0 = 0,7 mV).

Les acides fulviques sont de meilleurs réducteurs que les acides humiques parce qu’ils sont moins sensibles

à l’inhibition par le Cr(III) et que leur potentiel standard (0,5 V) est plus faible que celui des acides

humiques (Palmer et Wittbrodt, 1991). Il semble que la vitesse de réduction du Cr(VI) par les acides

fulviques et humiques soit modifiée par la présence de Fe(III). En fait, en présence de Fe(III), deux

phénomènes pourraient se produire : le premier serait la réduction plus rapide du Fe(III) en Fe(II) par les

acides humiques. C’est le Fe(II) formé qui réduirait le Cr(VI). Le deuxième serait la formation de

complexes FeCrO4+ qui iraient en surface des substances humiques où la réaction de réduction aurait lieu

(Palmer et Wittbrodt, 1991).


23


d Réduction photochimique

Des études récentes (Kleber et Helz, 1992 ; Hug et al., 1997) sur la photo-réduction du Cr(VI) dans

les milieux naturels ont montré que le mécanisme était indirect. Le couple Fe(II)/Fe(III) transfère les

électrons des ligands organiques vers le Cr(VI). Les complexes Fe(III)-ligands organiques absorbent

la lumière ce qui produit du Fe(II). Le Fe(II) réduit le Cr(VI) en Cr(V) puis en Cr(IV) et finalement en

Cr(III). A chaque étape, le Fe(II) est réoxydé en Fe(III) qui peut de nouveau aller se complexer avec des

ligands organiques et reprendre ainsi le cycle.

e Réduction biologique

La réduction microbienne du chrome (VI) peut être directe ou indirecte. Des souches bactériennes

anaérobies isolées à partir de sols ou de boues fortement chargés en chrome sont capables de le réduire.

Il est évident que ce type de bactéries préfère réduire le chrome dans des conditions réductrices.

L’existence de bactéries capables de réduire le chrome en présence d’oxygène permet d’envisager la bio-

réduction comme un mécanisme de résistance au chrome. La réduction directe mettrait en jeu une enzyme

dont le gène serait porté par un plasmide et la vitesse de cette réaction serait en relation avec la

disponibilité en source de carbone. Cet aspect sera développé au chapitre III de la partie bibliographique.

3.3.2. Le chrome trivalent

Si la réduction du chrome hexavalent est possible dans l’environnement dans des conditions

réductrices rencontrées dans de nombreux milieux peu oxygénés, l’oxydation du chrome (III) est moins

courante car elle exige la présence d’un couple de potentiel redox plus élevé que celui du couple

Cr(VI)/Cr(III). Il est généralement admis que l’oxydation du chrome (III) ne se produit pas dans les sols.

Toutefois il apparaît qu’une fraction du chrome (III) présent dans un sol puisse être oxydée en présence

d’oxyde de manganèse (Losi et al., 1994).

Cependant, les concentrations en Cr3+ en solution sont quasiment nulles dans les conditions

environnementales courantes car le chrome trivalent précipite presque complètement sous forme de

Cr(OH)3 ou de CrOOH, souvent conjointement avec le fer à des pH compris entre 5,5 et 12. Le chrome

trivalent ainsi immobilisé physiquement sur la matrice du sol ou bien sédimenté dans les milieux liquides

est alors protégé de l’oxydation. A des pH inférieurs à 5, Cr(III) est présent sous sa forme cationique et

peut s’adsorber sur des sites échangeurs de cations.


24


3.3.3. Mobilité

La mobilité du chrome dans les sols dépend du pH et du potentiel d’oxydoréduction qui détermine la

spéciation du métal et la capacité d’échange cationique (pour le Cr(III)) ou anionique (pour le Cr(VI)),

ainsi que de la présence d’agents chelatants organiques ou minéraux. Compte tenu de la quasi insolubilité

de son hydroxyde Cr(OH)3 et de son oxy-hydroxyde CrOOH et de la forte capacité de sorption cationique

des sols et sédiments, le chrome trivalent est quasiment immobile dans la plupart des milieux naturels,

spécialement si ceux-ci contiennent de quantités importantes d’argiles. Cependant, dans des milieux

oxydants pauvres en matières organiques et où les oxydes de manganèse sont présents en grande quantité,

la forme hexavalente du chrome peut-être la plus stable, laquelle est soluble sur une large gamme de pH.

Ce sont alors les phénomènes de sorption qui sont prépondérants. La sorption regroupe tous les

phénomènes de rétention de soluté à la surface des solides impliquant par exemple des mécanismes

d’échanges d’ions, de complexation de surface et de précipitation de surface. Le phénomène de sorption

du chrome sans modification de sa valence existe mais est généralement bien moins important que les

phénomènes d’oxydo-réduction.

Les chromates sont peu adsorbés par les groupements oxy-hydroxydes (de Fe, Al ou Mn) et les

surfaces silicatées. L’adsorption des chromates augmente avec la diminution du pH parce que les

groupements OH notamment deviennent protonnés. La migration des chromates dans les sols est donc

favorisée à des pH neutres ou alcalins. Certains ions dans le sol peuvent en outre rentrer en compétition

avec les chromates pour les sites d’adsorption. C’est le cas des sulfates et des carbonates. On peut donc

diminuer la sorption du chrome en ajoutant des carbonates (CaCO3) ou bien des sulfates ou des

phosphates. Dans ces conditions c’est un phénomène de compétition qui s’opère entre les anions apportés

et les ions chromate. C’est sur ce principe qu’est fondé l’extraction du chrome (VI) échangeable dans les

sols pollués.

En dépit de quelques exceptions, on peut généraliser le comportement du chrome et ses réactions :

- Le phénomène de réduction est beaucoup plus fréquent que le phénomène d’adsorption du chrome.

- La réduction du Cr(VI) en Cr(III) est beaucoup plus fréquente que l’oxydation du Cr(III) en Cr(VI), ce

qui fait de la forme trivalente la forme la plus stable dans les écosystèmes.

- Le Cr(III) est beaucoup moins mobile que la forme hexavalente dans la plupart des sols et systèmes

aquatiques compte tenu de la relative insolubilité du Cr(III) à des pH > 5.

Ces caractéristiques sont d’une grande importance si l’on considère les risques potentiels

environnementaux et les stratégies éventuelles de bio-remédiation pour des écosystèmes chargés en

chrome d’origine naturelle ou le plus souvent d’origine anthropique.


25


4.Toxicité du chrome

Le chrome hexavalent, de par sa solubilité et sa mobilité, s’est retrouvé en interaction avec beaucoup

d’organismes aquatiques et terrestres sans oublier l’Homme.

4.1. Chez les animaux

À l’état de trace, le chrome est un oligo-élément essentiel pour l’Homme et les animaux. Il est associé

au métabolisme du glucose par son action sur l’insuline et serait aussi impliqué dans le métabolisme des

graisses. Le chrome métal Cr est biologiquement inerte. (Mertz, 1993 ; Losi et al., 1994 ; Stoecker, 1996 ;

Anderson et al., 1997 ; Davis et Vincent, 1997). Il est admis que c’est la forme trivalente qui est la forme

nutritionnelle. Les organes où la concentration en chrome est la plus élevée sont le foie, les reins, la rate,

les ovaires, les testicules et aussi les os. Le chrome (III) semble exercer un rôle important dans le

métabolisme des lipoprotéines plasmatiques et des phospholipides. Il diminue le taux de cholestérol total

et le cholestérol LDL (Low Density Lipoprotéine) et augmente le taux de HDL (High Density

Lipoprotéine), « le bon cholestérol ». La déficience en chrome se traduit par une augmentation de

l’insuline circulante, du cholestérol du sérum, des triglycérides et de l’apolipoprotéine B et par une

diminution de la tolérance au glucose. Les recommandations journalières sont de 25 µg par jour pour les

femmes et de 33 µg par jour pour les hommes. Pour les enfants, l’apport journalier doit être compris entre

10 et 40 µg par jour. Les sources alimentaires sont les fruits, les légumes, la levure de bière, le foie, les

champignons et les céréales. La viande rouge, la volaille, le poisson et les laitages en contiennent peu

(www.nutrition.org/nutinfo).

La forme hexavalente n’est pas la source nutritionnelle car elle est très toxique et mutagène.

En principe, l’Homme et l’animal absorbent peu de chrome par inhalation, mais pour l’essentiel au travers

des aliments et de l’eau potable. Les composés chromiques absorbés avec les aliments sont relativement

inoffensifs, mais les chromates sont fortement toxiques. La résorption dans le tube intestinal dépend

beaucoup de la structure chimique du chrome. Les composés organiques sont absorbés à raison de 20-25

% et le chrome inorganique à raison de 0,5 % environ. La toxicité du chrome (VI) vient de sa grande

facilité à traverser les membranes biologiques et de ses propriétés de puissant oxydant. Une fois à

l’intérieur de la cellule, le chrome (VI) se lie au glutathion et grâce au soufre présent dans cette molécule, il

est réduit en chrome V puis en IV. Le chrome est alors piégé à l’intérieur de la cellule. Le chrome réduit

peut alors aller se lier à l’ADN du noyau et entraîne le pontage entre deux guanines de 2 brins d’ADN. Ce

pontage empêche le déroulement normal de la réplication. La cellule est bloquée en phase « S » du cycle de

la mitose. Le pouvoir carcinogène des composés hexavalents du chrome a été démontré par des

expériences sur l’animal mais aussi par des études épidémiologiques sur des groupes de population


26


exposés en milieu professionnel.

Les humains peuvent absorber des composés chromés par inhalation, par contact avec la peau et par

ingestion. Ces expositions très fréquemment professionnelles, ont pour conséquence de graves ulcérations

et perforations du septum nasal mais peuvent aussi entraîner des cancers de l’appareil respiratoire et des

allergies cutanées. L’ingestion peut provoquer des troubles au niveau des organes stockeurs, surtout les

reins, causant des dommages à l’ADN qui conduisent à des mutations et à une éventuelle cancérisation.

Des concentrations de l’ordre de 100 mg.kg-1 de masse corporelle sont létales pour l’homme. La DL50 ou

Dose létale pour laquelle 50% des individus meurent est de 32 mg.kg-1 pour la souris en injection intra-

péritonéale et de 11 mg.kg-1 pour le lapin en intra-musculaire.

Tableau II : Doses létales du chrome (VI) pour différentes espèces animales. (DL) chez l’Homme,

DL50 chez le rat et concentrations létales CL50 chez les organismes aquatiques)

Organismes DL (dose létale) ou

CL (concentration létale)

DL : 0,5-1 g, voie orale (chromate de K) Homme

DL : 6-8 g, voie orale (bichromate de Na)

DL50 : 1,8 g.kg-1, voie orale (chlorure chromique) Rat

DL50 :3,25 g.kg-1, voie orale (nitrate chromique)

Poisson d’eau douce CL50 : 250-400 mg.L-1 (Cr(VI))

Poisson d’eau de mer CL50 : 170-400 mg.L-1 (Cr(VI))

Daphnie CL50 : 0,05 mg.L-1 (Cr(VI))

Truite commune et « arc-en-ciel » CL50 : 0,2-0,3 mg.L-1 (Cr(VI))

Poissons (toutes espèces confondues) CL50 : 60-728 mg.L-1 (bichromate de Na)

Source : http://media.payson.tulane.edu:8083/html/env/envfr/Vol343.htm#Chrome

4.2. Chez les végétaux

Le chrome ne semble pas être essentiel à la vie des plantes. Sa toxicité vis-à-vis du règne végétal est

rare dans les systèmes naturels. Certaines plantes poussent sur des sites hautement contaminés en chrome.

Certains auteurs s’accordent à dire qu’il n’y a pas d’absorption du chrome par les végétaux ou seulement

une absorption racinaire sans passage vers les autres parties de la plante (Losi et al., 1994). Mais une étude

récente a montré que la jacinthe d’eau cultivée en milieu riche en chrome hexavalent était capable de le

réduire au niveau de ses racines. Le Cr(III) est alors stocké au niveau de celles-ci mais aussi dans d’autres

tissus comme les feuilles et le pétiole sous forme libre ou compléxée avec des oxalates (Lytle et al., 1998).


27


La capacité détoxifiante de cette plante permet d’envisager son utilisation pour la phytoremédiation de

rivières, marécages ou lagunes pollués au chrome (VI).

4.3. Chez les micro-organismes

Le chrome n’est pas un métal essentiel pour la croissance des micro-organismes même si certains

auteurs ont affirmé le contraire (Horitsu et al., 1987). A notre connaissance, aucune souche bactérienne

sauvage ou mutante n’a été décrite comme ayant besoin de chrome pour croître. La présence du métal

peut être éventuellement tolérée par les micro-organismes. Dans certains cas, l’élément peut-être utilisé

comme accepteur final d’électron(s) s’il s’agit de Cr(VI). A de fortes concentrations, le Cr(VI) a des effets

toxiques et mutagènes. 10 à 12 mg de Cr(VI) par litre peuvent inhiber le développement de bactéries du

sol alors que les mêmes concentrations en chrome (III) n’ont aucun effet (Ross et al., 1981). Le chrome a

un effet toxique sur les bactéries saprophytes et nitrifiantes, sur les champignons filamenteux, les algues et

sur le phytoplancton. Le chrome (VI) altère le matériel cellulaire, le métabolisme et les réactions

physiologiques.


28

BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS

II. LES SITES POLLUÉS

1.Introduction

Dans ce chapitre, nous aborderons dans un premier temps le problème des sites pollués dans son

ensemble (inventaire, législation et traitement), puis dans un second temps nous présenterons les sites

pollués au chrome et les traitements qui peuvent leur être appliqués.

2.Inventaire des sites pollués en France (Nov 2000)

En France, le Ministère de l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement a répertorié 3058 sites

industriels pollués (recensés en novembre 2000) (Tableau III). Quatre ans auparavant, le Ministère avait

recensé 3 fois moins de sites. Cette augmentation notamment est due au fait qu’avant 1996, seuls les sites

dont l’activité avait cessé étaient répertoriés. Aujourd’hui, même les sites en exploitation sont

comptabilisés. Les polluants les plus fréquemment rencontrés (seuls ou en mélange) sont présentés dans le

Tableau IV.

Tableau III : Répartition géographique des sites pollués recensés en France en novembre 2000.

Régions Nombre de sites Régions Nombre de sites

Alsace 135 Languedoc-Roussillon 51

Aquitaine 192 Limousin 19

Auvergne 45 Lorraine 246

Basse Normandie 65 Midi Pyrénées 169

Bourgogne 63 Nord-Pas de Calais 390

Bretagne 49 Pays de Loire 85

Champagne Ardennes 136 Picardie 123

Corse 5 Poitou Charente 54

Franche Comté 71 Provence Alpes Côte d’Azur 162

Guadeloupe-Guyane-Martinique 16 Centre 104

Haute Normandie 159 Réunion 13

Ile de France 347 Rhône Alpes 358

TOM 1

Source Ministère de l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement


29


Tableau IV: Les 10 principaux polluants des sites pollués répertoriés par le Ministère de

l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement (novembre 2000)

Polluants % de sites répertoriés

Hydrocarbures 24,8

Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) 10,9

Plomb 8,7

Zinc 7,7

Solvants halogénés 7,3

Chrome 6,7

Cuivre 6,2

Arsenic 5,1

Nickel 4,3

Cadmium 3,3

Les sites inventoriés peuvent être regroupés en 4 catégories :

- les sites traités et libres de toute restriction d’usage (7,16 % des sites répertoriés)

- les sites traités avec restriction d’usage (33,16 % des sites). La pollution est compatible avec

l’usage actuel mais des précautions sont nécessaires avant d’envisager de changer d’usage ou de faire des

travaux

- les sites en activités devant faire l’objet d’un diagnostic (17,56 % des sites). Pour ces sites, la

pollution n’est pas avérée mais compte tenu du type d’activité passée ou présente, il est nécessaire de

réaliser un diagnostic

- les sites en cours d’évaluation ou de travaux (42,12 % des sites)

3.Réglementation en matière de sites pollués

Les définitions d’un site pollué données en 2001 par le Ministère de l’Aménagement du Territoire et

de l’Environnement sont les suivantes :

Site présentant un risque pérenne, réel ou potentiel, pour la santé humaine ou l'environnement du fait d'une pollution

de l'un ou l'autre des milieux, résultant de l'activité actuelle ou ancienne. (http://www.environnement.gouv.fr/)

ou

Site qui, du fait d’anciens dépôts de déchets ou d’infiltration de substances polluantes, présente une pollution

susceptible de provoquer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l’environnement. (http://www.senat.fr)


30


Contrairement à d’autres pays, la France ne s’est pas doté d’un cadre législatif spécifique aux sites

pollués. Les seules valeurs limites de concentrations des métaux lourds dans les sols sont spécifiques des

sols agricoles destinés à l’épandage des boues de station d’épuration. Les valeurs sont présentées dans le

tableau suivant :

Tableau V : Valeurs limites de concentration en métaux dans un sol agricole destiné à l’épandage de

boues de station d’épuration (mg.kg-1 de matières sèches)

Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn

Norme AFNOR NFU 44-041 2 150 100 1 50 100 300

Directive 86/278/CEE 3 200 140 1,5 75 300 300

Le cadre français actuel résulte d’un ensemble de dispositions législatives :

- la loi du 15 juillet 1975 sur les déchets : " toute personne qui produit des déchets de nature à porter atteinte à la

santé de l'homme et à l'environnement est tenue d'en assurer l'élimination ".

- la loi du 11 juillet 1976 sur les installations classées pour la protection de l'environnement (ICPE).

" Les installations pouvant présenter des dangers ou inconvénients ... pour la santé (...) ou pour la protection de

l'environnement ... doivent être autorisées. Cette autorisation est subordonnée à la réalisation d'une étude d'impact qui

présente les mesures qui suppriment, limitent et compensent les inconvénients de l'installation... ". D'autres mesures ont

été ajoutées par la suite, notamment l'obligation d'information de l'acheteur et de remise en état du site.

- la loi du 3 janvier 1992 sur l'eau, qui instaure l'obligation de prévention pour éviter la pollution des

eaux superficielles ou souterraines.

- la loi du 2 février 1995 sur le renforcement de la protection de la nature, qui instaure le principe de

précaution.

L’approche administrative est fondée sur un ensemble de circulaires adressées aux préfets.

(Source : www.senat.fr/rap/100-261/100-26121.html)

« La circulaire du 3 décembre 1993 énonce les principes de la politique nationale de recherche et de réhabilitation des sites pollués, avec la recherche systématique des sites potentiellement pollués, l'usage de la notion de risque, ou fondement de la démarche, et un traitement adapté à l'impact effectif du site sur l'environnement.

La circulaire du 3 avril 1996 pose le principe du recensement des sites potentiellement pollués et des sites industriels en activité.


31


La circulaire du 7 juin 1996 traite des procédures de réhabilitation, et précise les conditions de saisine de l'ADEME (dans le cas des " sites orphelins ").

La circulaire du 16 mai 1997 concerne les sites pollués par des substances radioactives.

La circulaire du 10 décembre 1999 décrit les deux catégories de risques à envisager et les objectifs de la réhabilitation. »

Les objectifs de réhabilitation sont choisis en fonction de l’usage envisagé du site, c’est-à-dire celui

auquel le détenteur le destine, et selon les techniques disponibles. Le principal problème est l’impact,

potentiel ou avéré, sur l’Homme ou l’environnement de la pollution. Le risque est défini comme la

combinaison de trois facteurs : le danger, qui prend en compte la quantité de matière polluante et sa

nocivité, le transfert des substances polluantes depuis le site vers la ou les cibles, et les caractéristiques de

la (ou des) cible(s). C’est une étude spécifique au site qui détermine les objectifs de traitement, celui-ci

devant réduire le risque à un niveau jugé acceptable. Elle est menée selon la méthodologie de l’évaluation

détaillée des risques et prend en compte les cibles suivantes : l’Homme et la ressource en eau, qui doivent

être protégés en priorité, les écosystèmes et les biens matériels.

« Cette méthode d’appréciation du risque se distingue de celle de certains pays voisins qui appuient leur politique sur des

critères de concentrations dans les sols. (...) au-delà d’une teneur donnée d’un polluant particulier, le sol est considéré comme

pollué. De plus en plus, on observe une évolution de cette approche dans les pays étrangers qui tend à se rapprocher de la

démarche française. Les valeurs guides utilisées sont établies à partir d’évaluation de risques pour des scénarios d’exposition.

Etre au-delà d’une valeur entraîne une action » d’après le rapport du Sénat sur les Effets des métaux lourds sur

l’environnement et la santé du 12 avril 2001.

4.Démarche méthodologique d’analyse environnementale

4.1. Évaluation Simplifiée des Risques (ESR)

Il s’agit non pas d’évaluer les risques à proprement parler, mais plutôt de classer les sites en différentes

catégories. Un ensemble de 49 paramètres (répartition et mobilité des substances, proximité des nappes,

perméabilité des sols...) permet de déterminer si le site doit être banalisé (aucune action particulière),

à surveiller ou si le site requiert des investigations complémentaires et plus approfondies.

4.2. Evaluation Détaillée des Risques (EDR)

Cette deuxième étape a pour but d’évaluer l’impact potentiel des substances dangereuses sur les

différentes cibles concernées en fonction de l’usage actuel et prévisible du site. L’EDR permet d’identifier

les sites qui présentent des risques jugés inacceptables et de définir une stratégie de traitement en vue.


32


Dans tous les cas, il revient aux responsables (exploitant à l’origine de la pollution, dernier exploitant,

détenteur,...) de faire cesser les dommages générés par ces pollutions, en application de la législation

relative aux installations classées pour la protection de l’environnement. Pour faciliter les décisions des

acquéreurs d’anciens sites industriels, l’article L.514-20 de la loi n°76-663 du 19 juillet 1976 relative aux

installations classées pour l'environnement a prévu qu’un terrain sur lequel une installation soumise à

autorisation a été exploitée ne peut être vendu sans que le vendeur informe par écrit l’acheteur de cette

exploitation et des dangers ou inconvénients importants qui en résultent ".

Lorsque le responsable d’un site est défaillant (insolvabilité, disparition, etc...) et que la pollution du

site présente un risque pour l’environnement et la sécurité des personnes, l’Etat peut intervenir pour

mettre le site en sécurité. Ces interventions sont financées par la TGAP (Taxe Générale sur les Activités

Polluantes) et sont toujours associées à un recours juridique contre le responsable.

Enfin, aujourd’hui, l’arrêt d’une activité doit obligatoirement s’accompagner d’une remise en état du

site de manière telle qu’il ne présente plus de risques pour la santé publique et l’environnement.

5.Traitements des sites pollués : aspects généraux

Les techniques de traitement de sites et sols pollués sont souvent complexes et coûteuses, le

traitement d’un site impliquant presque toujours les mises en œuvres simultanées ou successives de

plusieurs procédés.

On distingue généralement trois catégories de traitements :

Les traitements « in situ » (sans excavation) :

Ce type de traitements permet de travailler directement sur le milieu sans procéder à l’excavation des

terres polluées. Le système de traitement est apporté sur place et différents dispositifs mis en place. Voici

ci-dessous, une liste non exhaustive des procédés de traitements applicables in-situ.

- extraction des polluants par dégazage sous pression réduite, lavage à l’eau...

- traitement de la nappe par pompage, épuration en réacteur hors sol et réinjection de l’eau épurée,

- neutralisation chimique et stabilisation physique des terres en utilisant des liants et divers réactifs,

- traitement biologique par injection d’air, ou d’autres accepteurs d’électrons et/ou de nutriments afin

de stimuler l’activité microbienne.


33


Les traitements sur site, après excavation :

C’est le dispositif de traitement qui est emmené sur place pour traiter les terres polluées. On peut

avoir un confinement sur site par extraction des terres, pose de dispositifs d’imperméabilisation et remise

en place des terres (éventuellement après traitement).

Les traitements hors site par extraction :

Les déchets et matières polluées sont emmenés à l’extérieur du site. Dans le cas des sols pollués, il

s’agit d’enlever le sol à traiter par excavation, de le transporter hors du site jusqu’à un centre spécialisé

dans la technique choisie où il sera traité. Le sol peut être ultérieurement ramené et remis en place.

Le traitement d’un site ne se limite pas aux seules opérations de traitement des terres. Les déchets

et/ou ouvrages enfouis ou présents en surface doivent être également traités.

D’autres actions peuvent s’avérer nécessaires comme :

- les mesures d’urgence pour supprimer les risques immédiats, qui doivent être réalisées sans délai

- la mise en place d’une surveillance, afin de connaître l’évolution du site et des risques d’impact

- l’institution de restrictions d’usage

- l’information sur l’état du site.

La méthode hors site est souvent la plus coûteuse car elle nécessite l’excavation, le transport de

quantités parfois considérables de sol et le recours à des centres de traitement spécialisés. Les techniques

in situ sont souvent les plus économiques car elles nécessitent la mise en œuvre de moyens beaucoup

moins importants concernant la gestion du sol à traiter. Qu’elles soient mises en œuvre « in situ » , sur site

ou « hors site », les techniques de traitement des sites pollués peuvent être classées en cinq familles

principales souvent complémentaires : méthodes mécaniques, géochimiques, chimiques/électrochimiques,

thermiques et biologiques.


34


5.1. Méthodes mécaniques

Les principales techniques mécaniques mises en œuvre sont :

5.1.1. Excavation

Cette technique permet d’abord d’isoler les terres polluées du site afin d’éviter la propagation de la

pollution. Elle est souvent une étape préliminaire à d’autres techniques qui seront ensuite appliquées sur le

sol.

5.1.2. Tri

Il peut être granulaire ou gravimétrique. Dans le premier cas, il permet de séparer grossièrement les

gros constituants (cailloux, galets...) des plus fines particules du sol qui sont beaucoup plus polluées. Dans

le cas où il est gravimétrique, il permet de séparer des particules de plus petite taille (50 µm).

Le tri a pour principal but de caractériser la taille des particules et le niveau de contamination de

chacune des fractions granulométriques de façon à déterminer le procédé de traitement le plus adapté et

de réduire au maximum le volume de terre à traiter.

5.1.3. Broyage

Les particules, une fois séparées et caractérisées, peuvent être broyées mécaniquement afin de réduire

leur taille et d’homogénéiser le sol si le procédé de traitement qui sera appliqué par la suite le nécessite.

Ces techniques mécaniques servent en général à « préparer » la terre pour pouvoir ensuite appliquer

d’autres techniques.

5.2. Méthodes géochimiques

5.2.1. Confinement

La technique d’encapsulation (ou mise en alvéole) est particulièrement adaptée dans le cas de pollution

multi-produits en concentrations très importantes. Elle consiste à isoler physiquement le sol par un

dispositif de parois, couvertures ou de fonds étanches. Trois types de confinement peuvent être réalisés :

mise en décharge hors site, « mise en tombeau » sur site des terres excavées, et couverture et

étanchéification in situ de la zone polluée (sans excavation). La contrainte principale est d’éviter la

dispersion des polluants. Pour cela, il faut éviter toute infiltration et ruissellement d’eau dans la zone

polluée. Il faut aussi veiller, dans certains cas, à mettre en place des dispositifs de récupération de lixiviats.


35


5.2.2. Barrières actives

Cette technique consiste à disposer verticalement à l’aval du site des barrières géochimiques qui

imposent des conditions « bio-physico-chimiques » conduisant à immobiliser les polluants qui ont

tendance à migrer vers l’aval. Il est important de connaître parfaitement le comportement du ou des

polluants dans les conditions « bio-physico-chimiques » de la barrière mise en œuvre . Ceci demande une

très bonne connaissance des caractéristiques hydrologiques et hydrodynamiques du milieu.

5.2.3. Technique « Pump and Treat »

Un dispositif de pompage (série de piézomètres) est installé en aval de la zone polluée. Le pompage de

l’eau souterraine polluée crée une zone de dépression autour du point de pompage. La dispersion de la

pollution est ainsi fortement réduite. Il faut procéder à un suivi dans le temps afin de s’assurer de la qualité

de l’eau pompée, celle-ci devant être traitée avant réinsertion dans le milieu naturel ou en amont du site.

5.3. Méthodes chimiques et électrochimiques

5.3.1. Mobilisation et extraction

Le sol pollué est aspergé d’une phase liquide qui mobilise les polluants. La phase mobile chargée en

polluants est récupérée en aval et peut être réinjectée en amont du site après traitement pour des passages

successifs. Il convient de maîtriser le lavage afin d’éviter que les polluants ne soient entraînés en dehors de

la zone de récupération. Cette technique n’est applicable que dans le cas de sols suffisamment perméables.

5.3.2. Stabilisation / solidification

La première méthode consiste à transformer un composé relativement soluble en composé insoluble

en lui faisant subir un traitement chimique ou en l’adsorbant sur une matrice neutre. La seconde technique

consiste à mélanger le matériau pollué à différents adjuvants pour en faire un matériau solide, peu

perméable et non réactif. Dans les deux cas, le polluant n’est pas détruit mais son impact potentiel sur

l’environnement est fortement diminué. La méthode la plus utilisée consiste à mélanger le sol pollué à du

ciment (liants hydrauliques) afin d’obtenir un matériau peu lessivable, stable dans le temps. Le ciment est

injecté dans le sol par une série de forages dans la zone polluée. On obtient de la sorte une succession de

colonnes cimentées. Cette technique a montré une bonne efficacité dans le piégeage de nombreux métaux

lourds.


36


5.3.3. Electromigration

Cette technique a pour objectif de concentrer certains métaux par migration entre deux électrodes.

Les espèces ioniques vont migrer selon leur charge. Cette technique a été testée pour divers métaux

comme le plomb, le cuivre, le chrome, le mercure, le zinc, le fer et l’arsenic (Acar et al., 1995).

5.4. Méthodes thermiques

5.4.1. Désorption thermique

Cette technologie consiste à chauffer le sol de manière à désorber le polluant (c’est-à-dire rompre les

liaisons polluant-sol) en le faisant passer en phase gazeuse afin de l’extraire. Pour les composés organiques

volatils ou semi-volatils, la désorption thermique constitue une option intéressante et moins lourde à

mettre en place que l'incinération. Le processus comporte deux étapes : une première unité de

volatilisation des polluants de même type que celle réalisée dans l'incinération et une seconde de

traitement des gaz extraits.

Habituellement réalisée dans un séchoir rotatif ou non, le sol souillé est chauffé et éventuellement

remué, et les composés organiques volatilisés sont entraînés par un flux gazeux (air ou azote) vers la

seconde unité. La température utilisée est de l'ordre de 250 à 450°C. Le temps de résidence à l'intérieur du

séchoir sera modulé en fonction de la quantité de polluants volatils qu'il contient ; il peut varier de

quelques dizaines de minutes à plusieurs heures. Le flux gazeux entraîne ensuite les composés volatilisés

(entraînement à la vapeur) vers la partie de traitement des gaz composée d'un ou plusieurs condensateurs.

Préalablement, le flux de gaz passe dans l'eau où il est en partie refroidi ce qui permet de séparer les

particules solides qui auraient pu être entraînées avec lui. Dans le condensateur, les composés organiques

sont concentrés en phase liquide par refroidissement, environ 90% des polluants sont arrêtés. Le reste des

polluants est adsorbé ensuite sur du charbon actif et le gaz porteur ainsi recyclé est renvoyé vers le séchoir.

Les particules solides séparées de l'eau de refroidissement sont réenvoyées dans le séchoir. Ce type de

traitement s’applique principalement pour les pollutions organiques (Norris et al., 1999).

5.4.2. Incinération

Cette technique consiste à appliquer de hautes températures pour détruire les produits polluants, qui

sont convertis en gaz carbonique et en vapeur d'eau, et en différents autres résidus de la combustion. C'est

la méthode la plus efficace pour une gamme très large de produits, surtout pour les produits organiques.

Cette technique ne détruit cependant pas les métaux que l’on retrouve soit dans les effluents gazeux,

lorsqu'ils sont volatilisables, soit dans les résidus solides de la combustion (cendres). Techniquement il

existe plusieurs systèmes tels que les dispositifs à lit fluidisé ou à circulation, la technique infrarouge ou


37


encore le four rotatif. Ce dernier est le système le plus commun. Dans une première étape, le sol excavé

est séché et tamisé, et éventuellement broyé. Généralement, les éléments les plus grossiers, supérieurs à

quelques mm, ne seront pas incinérés mais envoyés en décharge. S'il existe un risque d'évaporation de

contaminants volatils, des précautions devront être prises pour récupérer les émanations en opérant, par

exemple, dans une enceinte complètement fermée où un système d'aspiration collectera les gaz qui seront

ensuite traités. L'incinération est habituellement réalisée en deux étapes: la volatilisation et la destruction.

La volatilisation est réalisée dans un four rotatif à une température d'environ 400°C, la destruction à plus

de 1000°C. Après avoir été préparé, le matériau placé dans le four rotatif est chauffé et remué. Et les

matériaux volatilisés sont entraînés dans un flux d'air. A cette température, tous les polluants présents sont

volatilisés et quittent le matériau solide. Le sol, une fois débarrassé de ses produits polluants et sorti du

four, pourra être remis en place après refroidissement. Par ailleurs le flux gazeux est entraîné au travers de

filtres pour retenir les matières solides fines (poussières).

5.4.3. Vitrification

La vitrification est une technique d’immobilisation des polluants. Des électrodes (torches à plasma)

sont placées dans le sol afin de générer un courant qui conduit à une élévation importante de la

température. C’est en se refroidissant que la vitrification à lieu. La température dans le sol peut atteindre

3000°C ce qui peut conduire à la production de gaz toxiques pendant le procédé. Cette technique peutêtre

utilisée pour les polluants organiques mais aussi pour certains métaux comme le cadmium, le mercure et le

plomb (Mulligan et al., 2001).

5.5. Méthodes biologiques

Ces techniques consistent à utiliser le potentiel biologique du sol ou à apporter des organismes vivants

dans ce sol pour réduire voire éliminer la pollution présente. Les organismes utilisés pour ces procédés,

peuvent être des micro-organismes endogènes ou exogènes (isolés pour la plupart dans des sites pollués :

sols, boues, sédiments…), ou bien encore des plantes. Dans ce dernier cas on parle de phyto-remédiation.

L’utilisation des plantes pour traiter un sol pollué est un procédé émergent. Cette technologie est basée sur

la capacité des plantes et/ou des micro-organismes associés à leur système racinaire à absorber, retenir et

transformer les polluants en substances moins toxiques. Un autre effet benefique des plantes est la

réduction de l’érosion de surface du sol grâce à la couverture végétale.


38


6.Traitement des sites pollués au chrome

6.1. Inventaire

En France, les sites pollués par du chrome sont répartis de façon inégale sur l’hexagone. La plus

grande densité se retrouve dans la région Nord-Pas-de-Calais au passé industriel sidérurgique important

(Tableau VI). Moins de 3,5 % des sites pollués au chrome ont été traités et « banalisés » (pas de restriction

d’usage). 35 % d’entre eux ont été traités avec restriction d’accès, et les autres doivent faire l’objet d’un

diagnostic ou sont en cours d’évaluation ou de travaux (Ministère de l’Aménagement du Territoire et de

l’Environnement, 2001).

Tableau VI : Répartition géographique des sites pollués au chrome recensés en novembre 2000

Régions Nombre

de sites Régions

Nombre

de sites

Alsace 10 Languedoc-Roussillon 4

Aquitaine 14 Limousin 1

Auvergne 5 Lorraine 21

Basse Normandie 5 Midi Pyrénées 13

Bourgogne 3 Nord-Pas de Calais 29

Bretagne 2 Pays de Loire 4

Champagne Ardennes 15 Picardie 20

Corse 2 Poitou Charente 5

Franche Comté 4 Provence Alpes Côte d’Azur 5

Guadeloupe Guyane Martinique 1 Centre 11

Haute Normandie 15 Réunion 2

Ile de France 28 Rhône Alpes 6

TOM 0

Source Ministère de l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement

Les entreprises générant ce type de pollution sont le plus souvent celles du traitement de surface, du

traitement du bois, les fabriques d’engrais, de produits chimiques, des ferrochromes et les tanneries. Dans

les fiches de la base de données BASOL du Ministère de l’Environnement, il est rarement précisé la

spéciation du chrome. Lorsqu’un site est pollué au chrome il peut l’être par la forme trivalente (sous forme

de trioxyde de chrome) ou sous forme hexavalente.


39


Les fiches de la base de données BASOL renseignent aussi sur l’état du site à savoir s’il a été traité, s’il

est sujet à restriction d’usage etc…Cependant, peu d’information est donnée concernant le traitement

exact qui a été appliqué sur certain d’entre eux. Le Tableau VII présente les 9 sites pollués par du chrome

classés « libres d’accès » par le Ministère.

Tableau VII : Les 9 sites pollués au chrome classés « libres d’accès » par le Ministère de

l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement, novembre 2000.

Lieu (département) Activité Traitement des déchets Traitement des terres polluées

Utilisation actuelle du site

St LOUBES (33)

Ancien centre de stockage et

conditionnement de gaz liquéfiés

Installations démontées Stationnement de véhicules

VILLEUNEUVE SUR LOT (47) Ancienne usine à gaz Incinérations des

déchets

Stockage des terres en DC2 et traitement

thermique Parc de promenade

AVRANCHES (50) Usine de production de bandes magnétiques

Confinement sur site des boues des lagunes

Recouvrement du sol par une couche de

béton pour le protéger

ST ELLIER DU MAINE (53)

Dépôts sauvages OM, DIB, DIS

Evacuation des déchets et stockage en DC1 et 2

Recouvrement du sol par une couche de terre Terres agricoles

VILLEURBANNE (69) Ancienne usine de traitement de surface

Excavation des terres et stockage en décharge de

classe 1

EU (76) Ancienne usine de traitement de surface Evacuation des déchets Traitement non spécifié

NIORT (79) Ancienne usine de traitement de surface

Evacuation et stockage en DC1

Excavation et stockage en DC1 Maison de retraite

AILLEVILLIER ET LYAUMONT (70)

Ancienne usine de traitement de surface Traitement biologique

et stockage en DC1

Nouvel examen à effectuer en cas de

changement d’usage du site

ST GEORGES LES BAILLARGEAUX (86) Décharge d’OM Confinement

OM : ordures ménagères, DIB : déchets industriels banaux, DIS : déchets industriels spéciaux, DC1 et DC2 : décharge de

classe 1 et 2.


40


6.2. Techniques de traitement

Certaines des techniques décrites dans le paragraphe 5 sont applicables aux sols pollués par les métaux

lourds et plus particulièrement par le chrome. Traiter la pollution au chrome (VI) in situ apparaît difficile.

Cette difficulté réside dans le fait que le chrome sous la forme hexavalente est très mobile. Lors d’une

pollution avec des ions chromate, il convient de réagir rapidement afin de limiter la dispersion de la

pollution. En effet, le chrome (VI) peut être entraîné vers les zones plus profondes d’un sol par les eaux

de percolation. Les méthodes de confinement apparaissent comme des mesures d’urgence si, bien sûr, les

volumes considérés sont compatibles avec cette technique. Une fois le sol pollué isolé physiquement des

autres compartiments de l’environnement, il est possible de le traiter. Deux approches sont alors

enviseageables : la première consiste à laver le sol pour récupérer un effluent qui sera chargé en chromates.

C’est cet effluent liquide qui sera alors traité. La seconde approche consiste à réduire le chrome (VI) dans

le sol. Dans ce dernier cas, le sol contiendra encore du chrome mais sous forme trivalente. Sous cette

forme, le chrome est très peu mobile et présente une toxicité réduite.

6.2.1. Extraction du chrome

a Lavage du sol

Cette technique permet de récupérer les métaux solubles dont le chrome (VI) dans la phase liquide

après lavage des terres polluées. On peut utiliser des additifs pour améliorer l’extraction comme des bases,

des acides, des surfactants, des agents chélatants. Les métaux dont le chrome, contenus dans la solution de

lavage, peuvent être récupérés par des procédés electrochimiques, par précipitation ou échange d’ions, afin

que la solution de lavage soit réutilisée. Il faut s’assurer, avant de remettre le sol en place, de l’absence de

solution de lavage et de ces additifs dans celui-ci (Mulligan et al., 2001).

b Extraction thermique

Il existe un procédé appelé Cement Lock développé par l’Institut of Gas Technology aux Etats Unis

qui a été utilisé sur des sédiments contenant 377 mg de Cr(VI).kg-1. Ces sédiments ont été placés dans un

réacteur à 1200-1600°C pour être fondus, puis refroidis. Le produit est ensuite pulvérisé pour être

mélangé à du ciment afin de produire un ciment utilisable en construction. Les gaz issus de ce procédé de

traitement sont filtrés pour éliminer les particules qui peuvent contenir des métaux, puis passés sur

charbon actif pour retenir les métaux lourds restants (Mulligan et al., 2001).

c Electromigration


41


Cette technique consiste à utiliser un courant de faible intensité (1 V/cm) entre une cathode et une

anode pour faire migrer des ions et de petites particules chargées. La distance entre les électrodes peut être

de plus de 3 m si le gradient de potentiel de 1 V/cm est respecté. Cette technique est applicable à d’autres

métaux comme le cuivre, le zinc, l’arsenic, le cadmium et le nickel (Mulligan et al., 2001). Le Hecho et al.

(1998) a décrit une technique qui peut être applicable aux sols pollués au chrome. La méthode consiste à

extraire le sol et à l’incuber en conditions alcalines afin de limiter l’adsorption des anions chromate entre

deux électrodes. L’agent alcalinisant neutralise les ions H3O+ à l’anode et l’hypochlorite qui est ajouté à la

cathode migre vers l’anode et oxyde le chrome qui se trouve sous la forme trivalente. Les essais en

laboratoire ont montré que pour que le rendement du procédé soit intéressant, il faut contrôler les valeurs

de pH afin de rester dans la gamme qui favorise la désorption du chrome (VI) (pH supérieur à 8). Le

facteur limitant de cette technique est le pouvoir tampon du sol qui, s’il est important, limite l’efficacité.

6.2.2. Immobilisation du chrome

a Stabilisation

Le procédé de stabilisation/solidification conduit à l’immobilisation des métaux en incluant les

particules de sol auxquels ils sont liés, dans un agent solidifiant. Ces agents peuvent être la chaux, et le

ciment. Pour le chrome, la forme hexavalente est réduite avant par ajout d’agents réducteurs ou pendant la

phase de mélange avec l’agent stabilisant. Ensuite, des monomères liquides, qui polymériseront, ou du

ciment sont injectés pour solidifier le mélange. Les blocs produits à partir de ces procédés de

stabilisation/solidification peuvent être réutilisés dans différents domaines comme remblai. Il conviendra

d’étudier le relargage des métaux lourds contenus dans des blocs de sol stabilisés en fonction de l’usage et

des conditions environnementales (scénario) (Mulligan et al., 2001). L’ambassade de France en Finlande

rapporte sur son site internet (http://www.france.fi) une expérimentation de stabilisation de 4000 tonnes

de sol pollué au chrome (ni la concentration ni la spéciation ne sont indiquées). Ce sol a été introduit dans

la composition de ciments. Ce procédé ECO-CONCRETE est développé par la société LOHJA RUDUS.

b Atténuation naturelle

Il existe dans les sols des agents réducteurs qui peuvent transformer le chrome (VI) en chrome (III). Il

s’agit de la matière organique, des acides humiques et fulviques, des ions Fe2+… L’atténuation naturelle

n’est pas une technique utilisable seule mais elle peut l’être en complément d’une autre comme le

confinement. En fonction du temps de confinement, des conditions de stockage…, la quantité de Cr(VI)

dans le sol pourra évoluer et le traitement consécutif au confinement devra tenir compte de l’atténuation

naturelle qui aura éventuellement eu lieu.

c Amendement en matières organiques


42


Losi et al. (1994) ont étudié en laboratoire l’influence de la quantité de matières organiques sur la

réduction du chrome (VI) dans un sol. Ils ont pour cela ajouté du fumier et irrigué le sol avec une solution

contenant 1 mg.L-1 de Cr(VI). Leurs résultats ont montré que si la quantité de fumier est suffisante, la

concentration en chrome (VI) de l’eau de ruissellement est nulle. Ils ont aussi prouvé que la réduction était

beaucoup plus efficace si le sol contenait la microflore indigène. Il semble que deux processus se

produisent : d’une part, une réduction chimique due à la présence de matières organiques et d’autre part

une réduction par les bactéries et champignons qui utilisent les matières organiques (source d’énergie)

pour leur développement.

d Techniques de Bio-remédiation

La découverte d’organismes pouvant utiliser le chrome et le rendre moins toxique à ouvert la voie à la

mise au point de procédés de bio-remédiation notamment pour le traitement des effluents liquides. Pour

que ces processus biologiques s’établissent, les organismes requièrent la présence de sels minéraux en tant

que nutriments, de sources de carbone, d’azote et de phosphore pour leur métabolisme énergétique.

D’autres facteurs comme la température, le pH, etc… ont une influence sur l’efficacité de ces processus.

Bio-réduction par les bactéries et les champignons

La première étude sur la réduction du chrome (VI) par une culture bactérienne a été écrite en 1977 par

Romanenko et Koren'kov. La souche isolée a été classée comme étant un Pseudomonas dechromaticans.

Depuis les années 80, les chercheurs se sont intéressés aux nombreuses autres bactéries capables de

réduire le chrome hexavalent (Gvozdiak et al., 1986) et proposent des techniques utilisant ces bactéries

réductrices de chrome pour le traitement des effluents liquides et plus récemment des sols pollués (Losi et

al., 1994 ; Salunkhe et al., 1998). Différents paramètres ont été évalués pour plusieurs types de bactéries

pour accélérer le processus afin de développer des techniques efficaces de bio-remédiation exploitant ces

micro-organismes. Le principal axe de recherche pour le traitement des effluents pollués est la mise au

point de bio-réacteurs où se déroulerait une phase de réduction du Cr(VI) par des bactéries immobilisées

sur des surfaces, suivie d’une phase de décantation ou de filtration des précipitats de chrome trivalent.

Le principal avantage de ce système serait d’être moins coûteux et de ne pas nécessiter de réactifs

chimiques. L’inconvénient majeur est l’utilisation d’organismes vivants dans des conditions

environnementales difficiles (toxicité du chrome présent et des autres polluants). De plus, si l’on considère

que la réduction doit avoir lieu dans le sol, il faut tenir compte de la complexité de sa matrice et de sa

diversité. Il est impossible de prévoir le comportement d’une souche bactérienne vivante dans ce type de

milieu dont les paramètres sont difficilement maîtrisables (pH, granulométrie, porosité, potentiel redox,

taux d’oxygène, taux de matières organiques, autres polluants…).

La réduction directe du chrome hexavalent par les bactéries représentent un mécanisme naturel


43


potentiellement utilisable pour la détoxification des eaux et sols contaminés par du chrome.

Cervantes et al (2001) décrivent, dans une synthèse bibliographique sur les interactions du chrome

avec les micro-organismes, des études de laboratoire menées sur des champignons qui ont porté sur leur

capacité à réduire le chrome hexavalent. Les résultats suggèrent l’utilisation de ces organismes pour des

procédés de bio-remédiation des sols pollués au chrome.

La phytoremédiation

A la différence du cadmium ou du mercure, il y a assez peu d’exemples de phytoremédiation de sols

pollués par du chrome. Dans leur synthèse bibliographique, Cervantes et al. (2001) décrivent le cas de la

jacinthe d’eau qui peut accumuler de grandes quantités de chrome.


44

BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION

III. RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET

MÉCANISMES DE RÉDUCTION

Dans ce chapitre, nous aborderons le phénomène de résistance au chrome et les mécanismes de

réduction du chrome par les micro-organismes. Dans les deux cas, c’est du chrome (VI) dont il est

question car c’est la forme qui est la plus toxique et qui peut être éventuellement réduite. La résistance et la

réduction du chrome seront envisagées pour la microflore, terme qui regroupe les bactéries, les

moisissures et les levures. Nous avons choisi de traiter séparément les phénomènes de résistance et de

réduction du chrome même si ce dernier peut-être un mécanisme de résistance. Mais étant donné que la

capacité à réduire le chrome n’est pas forcément liée à un phénotype résistant au chrome (Bopp et

Ehrlich, 1988), ce phénomène fera l’objet d’un paragraphe distinct.

1.Résistance au chrome : aspects généraux

Avant d’aborder plus précisément le phénomène de résistance au chrome, il convient de définir le

terme « résistance ». La toxicité d’un métal pour les micro-organismes est déterminée par sa capacité à

inhiber ou perturber la croissance cellulaire. Une souche résistante au métal considéré est capable de

croître normalement en présence de ce métal à des concentrations qui seraient toxiques pour les autres

micro-organismes. Les termes « résistance » et « tolérance » sont généralement utilisés indifféremment en

microbiologie. Lorsque l’on dit qu’une bactérie tolère tel métal, on peut comprendre qu’en dessous d’une

concentration limite, tout se passe « normalement » (la croissance cellulaire n’est pas affectée). En

revanche, dans une certaine gamme de concentrations plus élevée, la bactérie pousse (le nombre de

colonies sur boîte de Petri ne varie pas comparé à témoin sans métal) mais l’aspect des colonies est

différent : il peut y avoir changement de couleur, de taille, de morphologie qui traduit une perturbation

métabolique. Si dans le premier cas, tolérance et résistance semblent vouloir dire la même chose, dans le

second cas, le terme « tolérance » semble plus approprié. Enfin, au-delà d’une concentration limite, la

croissance devient totalement inhibée. On dira alors que la bactérie ne résiste pas au métal considéré (ou

ne le tolère pas) au-delà de cette concentration limite.

Plutôt que de parler de résistance dans l’absolu, il convient d’aborder ce phénomène en considérant

les niveaux de concentrations en espèce toxique engendrant une perturbation métabolique. Une bactérie

dite sensible pour une concentration de l’ordre du mM par exemple peut être résistante à des

concentrations de l’ordre de la dizaine de µM. En fait la définition de la résistance dépend de la

concentration considérée en espèce toxique choisie. Il faut aussi rappeler que la résistance à un métal


45


dépend de la souche étudiée mais aussi des conditions expérimentales notamment pour les éléments

métalliques dont la spéciation chimique dépend des conditions du milieu. En fonction du milieu, le degré

ou niveau de résistance varie pour une même souche.

Les mécanismes de résistance sont la combinaison de deux processus : l’adaptation et la sélection. Le

premier processus consiste en des mutations génétiques aléatoires provoquées par la présence de l’agent

toxique. Celui-ci peut altérer le matériel génétique et seuls les clones dont l’altération est bénéfique compte

tenu du contexte environnemental survivent. Il est aussi possible que dans une population bactérienne

deux types de cellules existent : les résistantes et les sensibles. Dans le cas où l’agent toxique est absent, les

deux types cellulaires coexistent et lorsqu’il est présent à des concentrations inhibitrices, seuls les clones

résistants survivent : il s’agit du processus de sélection.

L’adaptation aux agents toxiques se retrouve chez un large nombre d’espèces microbiennes terrestres

ou aquatiques avec une grande variété de mécanismes y compris la transformation de certaines espèces

toxiques (méthylation, déméthylation, oxydation et réduction). Des micro-organismes résistants au chrome

ont été isolés à partir d’eau de surface, de sédiments ou de sols pollués ou non.

Les mécanismes de résistance aux métaux lourds et autres substances toxiques ont un support

génétique. La résistance est un phénotype transmissible aux clones issus d’une cellule dite « souche ». Ce

phénotype résistant peut être transféré à une autre bactérie par un contact cytoplasmique que l’on appelle

conjugaison. Les bactéries sont des organismes procaryotes dont l’information génétique est portée par un

chromosome, circulaire ou linéaire. Ces bactéries sont parfois porteuses de plasmides, eux aussi pouvant

être circulaires ou linéaires. Les moisissures et levures sont quant à elles des organismes eucaryotes. Leur

ADN chromosomique peut être composé de plusieurs molécules linéaires confinées dans un noyau.

L’information génétique responsable de la résistance au chrome peut être chromosomique ou plasmidique.

Pour résister au Cr(VI), il existe trois grandes stratégies : empêcher le Cr(VI) d’entrer dans la cellule

(mutation du système de transport du sulfate), le faire ressortir de la cellule s’il y entre (ChrA) ou le réduire

en Cr(III). Ce dernier mécanisme sera étudié en détail au § 2 de ce chapitre comme nous vous l’avons déjà

précisé car réduction et résistance ne sont pas systématiquement liées.

1.1. Mutation du système de transport du sulfate

Comme nous l’avons mentionné au § 3.2 du chapitre I, à des pH supérieurs à 6, l’espèce dominante

du Cr(VI) est sous forme d’ions chromate plutôt que dichromates. Aux pH rencontrés dans le monde

vivant (proche de 7), l’ion chromate est la forme prédominante. C’est pour cette raison que l’étude de la

résistance au chrome hexavalent s’est limitée à l’étude de la résistance aux chromates.


46


La résistance aux chromates peut être due à une mutation chromosomique du système de transport du

sulfate (Ota et al., 1971). Les ions CrO42- peuvent pénétrer dans les cellules par le même transporteur que

les ions SO42- : la sulfate perméase. En effet, les charges des deux ions sont les mêmes et l’encombrement

stérique de même grandeur. De manière générale, les systèmes de transport sont des ensembles de

protéines intégrées dans la membrane de la cellule. Ces protéines se regroupent et s’associent de façon à

former un pore, sélectif d’une ou plusieurs substances, dans la membrane. Si une mutation survient dans

un des gènes codant l’une des protéines, celle-ci peut présenter par exemple un mauvais repliement qui

conduit soit à une mauvaise association des différentes protéines impliquées dans la formation du pore,

soit à une mauvaise reconnaissance de la molécule transportée. La protéine peut aussi tout simplement ne

plus être exprimée du tout. Chez une cellule sauvage (non résistante), le système de transport du sulfate est

fonctionnel. Par conséquent, les ions chromate peuvent pénétrer dans la cellule et perturber suffisamment

le métabolisme et l’ADN pour provoquer la mort de la cellule. Dans ce cas, la bactérie aura un phénotype

sensible. Lorsque que le système de transport du sulfate est muté, les ions sulfate ne peuvent pas pénétrer,

pas plus que les ions chromate qui ne peuvent donc pas endommager la cellule. Elle aura dans ce cas un

phénotype résistant (Figure 1). Ce mécanisme de résistance a été décrit chez le champignon filamenteux

Neurospora crassa (cys) par Marzluf en 1970, chez les levures Saccharomyces cerevisiae (sfp2) (Smith et al., 1995),

Candida sp. et Rhodosporidium sp. (Pepi et Baldi, 1992) et chez les bactéries Salmonella thyphimurium (cysA)

(Ota, 1971) et Streptomyces coelicolor (cysA) (Lydiate et al., 1988).

SO42- CrO42-

Action toxiqueconduisant

éventuellement à lamort cellulaire

SO42- CrO42-

cytoplasme

périplasme

Bactérie sensible au chrome Bactérie résistante au chrome

membrane

interne

Sulfate perméase fonctionnelle

Sulfate perméase mutée

Figure 1 : Mécanisme de résistance aux ions CrO42- par mutation du système de transport du sulfate


47


1.2. Système d’efflux : la protéine ChrA

La résistance au chrome chez plusieurs bactéries est liée à la présence d’un plasmide (pLHB1 chez

Pseudomonas fluorescens (Bopp et Ehrlich, 1988), pARI180 chez Pseudomonas mendocina (Dhakephalkar et al.,

1996), pUM505 chez Pseudomonas aeruginosa (Cervantes et Silver, 1992), pMOL28 chez Ralstonia metallidurans

(ancienne dénomination : Alcaligenes eutrophus)(Nies et al., 1990). L’analyse de la séquence des plasmides

pUM505 et pMOL28 a révélé un ORF (Open Reading Frame) qui code un polypeptide appelé ChrA.

Un ORF ou cadre de lecture ouvert est une séquence d’ADN susceptible de coder une protéine ou un

polypeptide (nombre de triplets (codons) suffisant, présence de la séquence de reconnaissance des

ribosomes, présence de codons d’initiation et de terminaison). La séquence d’ADN a permis de déduire la

séquence protéique. L’étude de celle-ci a montré 29 % d’identité entre les deux protéines ChrA déduites

des séquences situées sur pUM505 et pMOL28.

L’expression de la protéine hydrophobe ChrA chez Escherichia coli n’a pas conféré le phénotype

résistant à l’hôte mais a néanmoins montré que ChrA était localisée dans la membrane interne. Compte

tenu de la composition en acides aminés et des expériences de fusions traductionnelles avec phoA (gène

codant la phosphatase alcaline) et lacZ (gène codant la β-galactosidase), Nies et al. (1998) proposent un

modèle topologique de la protéine ChrA de R. metallidurans avec 10 passages trans-membranaires.

Les expériences de fusions traductionnelles consistent à fusionner le gène phoA ou lacZ en amont du

codon initiateur du gène chrA après X nucléotides (X devant être obligatoirement un multiple de 3 afin de

respecter le cadre de lecture). De cette façon, le début du gène chrA est traduit et à sa suite, le gène phoA

ou lacZ dans son intégralité. La protéine hybride obtenue, composée de la partie N-terminale de ChrA et

de PhoA ou LacZ en C-terminal va aller s’insérer dans la membrane et l’activité phosphatase alcaline ou β-

galactosidase va être mesurée. En fonction de la présence ou non de l’activité, il est possible de déterminer

la position de l’acide aminé à la jonction de la fusion. Si une activité enzymatique phosphatase alcaline est

mesurée, c’est que la protéine PhoA se trouve du côté extérieur de la membrane (puisque l’enzyme a accès

à son substrat). Dans le cas inverse, la protéine est à l’intérieur de la cellule, côté cytoplasmique, ainsi que

l’acide aminé de la protéine ChrA qui la précède. Pour LacZ, c’est l’inverse : une forte activité β-

galactosidase signifie que LacZ est du côté cytoplasmique car le substrat entre dans la cellule. En réalisant

des fusions traductionnelles à différents endroits du gène chrA, il est possible de déterminer quels acides

aminés sont dans le cytoplasme et lesquels sont dans le périplasme. Cette technique apporte des

informations importantes mais fait abstraction du rôle éventuel joué par la partie C-terminale dans la

topologie entière de la protéine considérée. De plus, les expériences de fusions traductionnelles ont été

réalisées avec le gène chrA de Ralstonia et exprimées chez un autre micro-organisme : Escherichia coli. Le fait

d’utiliser un autre micro-organisme pour l’expression de la protéine peut introduire un biais, d’autant que


48


l’expression de la protéine ChrA intacte (c’est-à-dire non fusionnée avec PhoA ou LacZ) chez Escherichia

coli ne confère pas le phénotype résistant au chrome.

Des homologues de la protéine ChrA ont été recherchés dans les banques de données chez d’autres

organismes. Seulement 9 protéines présentent une homologie significative avec ChrA de Ralstonia et de

Pseudomonas (Tableau VIII). Nous remarquons que les protéines dont la longueur est d’environ 400 acides

aminés possèdent deux domaines CHR alors que chez les deux dernières souches, il y a deux protéines

chacune d’environ 200 acides aminés (aa). La séquence consensus de 177 aa (CHR) du transporteur de

chromate a été recherchée. Les membres de cette famille sont probablement des transporteurs du

chromate et possèdent une ou deux copies de ce domaine. Une comparaison des 9 séquences avec la

séquence consensus est présentée en annexe page 214).

Nous remarquons qu’il y a environ 50 % d’identité entre la séquence consensus et les 7 premières

séquences, ce qui est relativement important. Les séquences de Borrelia ne présentent que 38 % environ

d’identité. Ce résultat peut paraître faible mais, si on le compare au pourcentage d’identité de la séquence

consensus et de la séquence du deuxième domaine (C-terminal), on remarque qu’il est plus important. En

effet, les deuxièmes domaines CHR de R. metallidurans, de P. aeruginosa, de Synechoccus sp, de Synechocystis sp

et de Methanococcus ne présentent qu’entre 23 et 32 % d’identité avec la séquence consensus.

Aucun rôle n’est pour l’instant établi pour ces homologues sauf pour SrpC qui jouerait un rôle dans le

transport du sulfate chez Synechococcus sp. La composition en acides aminés et le profil hydropathique

(profil rendant compte des zones de la protéine présentant un certaine hydrophobicité susceptible d’être

des passages transmembranaires) de ChrA sont similaires, sans pour autant présenter une identité, à ceux

de ArsB, protéine de la membrane interne qui permet d’expulser l’arsénite des cellules et qui confère donc

un phénotype de résistance à l’arsénite (Alvarez et al., 1999). Il apparaît donc que ChrA serait une protéine

d’efflux de la membrane qui permettrait de relarguer à l’extérieur les ions chromate.

Des expériences récentes sur Pseudomonas aeruginosa (Alvarez et al., 1999) ont montré que des vésicules

formées à partir de cellules résistantes exprimant ChrA transportent plus de chromates que les vésicules

formées à partir de cellules sensibles ne portant pas le gène chrA. Cet efflux d’ions chromate par ChrA est

inhibé par la présence d’ions sulfate suggérant que la protéine ChrA reconnaisse aussi SO42- et qu’en excès

le sulfate entre en compétition avec le chromate. D’après Alvarez et al. (1999), la protéine ChrA

expulserait les ions chromate en utilisant comme source d’énergie le potentiel de membrane. L’ajout de

nigericine, un agent découplant qui rend la membrane perméable aux protons, diminue fortement le

transport des chromates. L’absence de NADH qui conduit aussi à une diminution du transport des ions

CrO42- suggèrent que le gradient de protons à travers la membrane soit requis pour la translocation des

chromates. Le système de relarguage des ions arsenite fait aussi intervenir une protéine membranaire,


49


ArsB, qui expulserait les anions soit en partenariat avec une ATPase (ArsA) ou soit seule grâce à de

l’énergie électrochimique (potentiel de membrane). La protéine ArsB peut fonctionner, dans les bactéries

dépourvues du gène arsA comme Staphylococcus aureus (Ji et Silver, 1992 ; Silver, 1996), comme transporteur

d’efflux des ions arsénite chimio-osmotique. La similarité du profil hydropathique entre ChrA et ArsB et

l’implication du potentiel de membrane dans la translocation des chromates et des ions arsénite suggèrent

que le mécanisme d’efflux de ChrA soit comparable à celui de ArsB. En revanche l’implication d’un

partenaire ayant une fonction ATPase dans le système d’efflux des chromates n’est pas envisager par les

auteurs (Alvarez et al., 1999).

Tableau VIII : Les protéines de la famille CHR

N°accession

GENBANK abréviation sources

Longueur

amino-acides

Nombre de

domaines CHR

AAA88432 ChrA (Pae) Pseudomonas aeruginosa 416 2

CAC42411 ChrA (Aeu)

Chromate resistance

protein A Ralstonia metallidurans 401 2

Q55027 SrpC (Ssp) Synechococcus sp. PCC7942 393 2

BAA18657 Orf 1 (Ssp) Synechocystis sp PCC6803 399 2

Q58128 Orf1 (Mja) Methanococcus jannaschii 402 2

CAB07797 Orf1 (Bsu) Bacillus subtilis 197 1

CAB07796 Orf2 (Bsu) Bacillus subtilis 178 1

AAC66823 OrfBB0452 Borrelia burgdorferi 234 1

AAC66817 OrfBB0451

homologues ChrA

Borrelia burgdorferi 177 1

L’expression de la protéine ChrA chez R. metallidurans est régulée par la présence des ions chromate et

sulfates (Peitzsch et al., 1998). La souche de Ralstonia utilisée pour cette expérience dans ces travaux

présente la capacité de réduire le Cr(VI) en Cr(III) plus efficacement en présence de 30 µM de sulfate

qu’en présence de 3 mM. Les cellules possèdent le gène chrA et le système de transport du sulfate

fonctionnel, les ions chromate et sulfate peuvent donc pénétrer à l’intérieur de la cellule. Si la cellule ne

dispose que de 30 µM de sulfate dans le milieu, les chromates passent la membrane et sont réduits en

Cr(III). Dans ce cas, l’expression de chrA n’est pas induite. Si l’on apporte beaucoup plus de sulfate

(3 mM), les ions chromate et sulfate entrent dans la cellule mais le sulfate semble inhiber la réduction des

chromates. Par conséquent, il y aurait davantage de chrome (VI) dans la cellule ce qui induirait la

production de ChrA.


50


L’expression de la protéine ChrA permet d’expulser le Cr(VI) toxique présent dans les cellules.

Chez Ralstonia metallidurans il semble que le premier mécanisme pour lutter contre la toxicité du chrome est de le

réduire en sa forme trivalente. Lorsque, compte tenu des conditions environnementales (hautes concentrations

en chromate et/ou sulfate), la quantité de Cr(VI) à l’intérieur de la cellule devient toxique, l’expression de ChrA

est induite et la protéine permet de relarguer vers l’extérieur les ions chromate (Figure 2).

SO42- CrO42-

cytoplasme

périplasme

membrane

interne


CrO42- Cr(III)

ADN du gène chrANon toxique

SO42-

réduction

non induit

< à 30µM

SO42- CrO42- CrO42-

cytoplasme

périplasme

membrane

interne


CrO42-

Inhibition dela réduction

de CrO42-

Induction de lasynthèse de ChrA

ChrA

ADN du gène chrA

ARNm de chrA

Protéine ChrA

TRANSCRIPTION TRADUCTION

SO42-

> à 3 mM

Figure 2 : Mécanismes de résistance aux ions CrO42- par réduction et par la protéine ChrA chez Ralstonia metallidurans


51


2.Réduction du Cr(VI) par les bactéries

2.1. Introduction

Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons plus particulièrement aux phénomènes de réduction

bactérienne du chrome (VI) en abordant les mécanismes de réduction et leur utilisation potentielle dans

des procédés de traitement de sols ou d’effluents pollués au chrome (VI). Nous avons choisi de ne pas

inclure la réduction du chrome dans la présentation des mécanismes de résistance au chrome car des

bactéries sensibles à une certaine concentration en ions chromate peuvent néanmoins les réduire. Bopp et

Ehrlich (1988) ont montré qu’une culture de la souche L303 de Pseudomonas fluorescens, ChrS car dépourvue

du plasmide conférant la résistance au chrome, pouvait réduire le chrome en aérobiose (0,2 mM), après

une nuit d’incubation sans chrome, à la même vitesse que les cellules provenant d’une culture de la souche

LB300 ChrR ayant subi le même traitement. Cette expérience prouve donc que résistance au chrome et

réduction du chrome ne sont pas nécessairement en relation l’une avec l’autre. Une souche qui réduit le

chrome (VI) n’est pas systématiquement résistante.

Si les déterminants génétiques de la résistance au chrome (gènes du système de transport du sulfate et

gène de protéine d’efflux ChrA) sont assez bien connus, ceux de la réduction le sont beaucoup moins.

Certains auteurs pensent que le déterminant est porté par un plasmide. Ce serait le cas pour Pseudomonas

mendocina MCM B-180 (Dhakephalkar et al., 1996). Si les déterminants sont assez peu connus c’est aussi

parce que les mécanismes de réduction du chrome sont nombreux et très diversifiés. Il existe tout d’abord

le cas particulier des bactéries sulfato-réductrices (BSR) qui réduisent le chrome (VI) avec de l’H2S en

condition anaérobie. C’est un processus que l’on appelle indirect car c’est le métabolite, produit par les

bactéries, qui réduit le chrome.

Ensuite, chez d’autres micro-organismes, il existe la réduction du chrome dite directe car effectuée

grâce à des protéines (solubles ou membranaires). Cette réduction peut s’effectuer en présence ou en

absence d’oxygène. Ce type de réduction est aussi appelé réduction enzymatique. Les réactions chimiques

dans les systèmes biologiques se déroulent rarement sans catalyseur. Ces catalyseurs sont des

macromolécules que l’on appelle enzymes. Celles-ci contiennent une fraction protéique que l’on appelle

apo-enzyme et une fraction minérale et/ou organique qui s’appelle co-enzyme. Ce co-enzyme peut être un

ion métallique (Fe, Mn, Mg, Cu…) ou une molécule plus complexe comme le NAD par exemple.

Mais ce co-enzyme peut aussi être une protéine qui contient elle-même éventuellement un ou

plusieurs ions métalliques. C’est à ce titre que les cytochromes sont parfois appelés enzymes plutôt que co-

enzymes.


52


Même si les déterminants génétiques et les mécanismes de réduction du chrome (VI) sont encore mal

connus, ils font l’objet de nombreux travaux dans un objectif de recherche fondamentale ou d’utilisation

de ces bactéries dans des procédés de traitement de sols et d’effluents pollués au chrome.

2.2. Cas particulier des bactéries sulfato-réductrices

2.2.1. Cycle du soufre

La réduction du sulfate (SO42-) en sulfite (SO32-), lui-même réduit en soufre (S0), puis en sulfure (S2-)

peut servir au métabolisme de synthèse. Dans ce cas il s’agit de la réduction assimilatrice. Si par contre le

sulfate, le sulfite ou le soufre servent d’accepteurs d’électrons dans des réactions d’oxydo-réduction

génératrices d’énergie, on parle de réduction dissimilatrice (Figure 3). Les bactéries sulfo- ou sulfato-

réductrices sont capables de catalyser la réaction suivante (grâce à une hydrogénase et à des cytochromes) :

SO42- + 10 H2 → H2S + 4 H2O

équation 7

Les électrons sont transportés dans la chaîne respiratoire et par l’intermédiaire du cytochrome c3 et

vraisemblablement transférés à une ferrodoxine qui transforme le sulfate en sulfure qui, en milieu acide

donne de l’H2S.

Aérobiose

Anaérobiose

SulfateThiosulfate

...

Réduct ion assimilat r ice

Réduct ion dissimilat r ice

S2- S or ganique

Sulfur eH

2S

Oxydat ionchimique oubiologique

S0Oxydat ion

dissimilat r ice dusouf re

S0

Réduct ion assimilat r ice S2- S or ganique

dégradat ion

S0

PhotosynthèsePhotosynthèse

Figure 3 : Cycle du soufre chez les bactéries (d’après Le Faou et al., 1990)


53


2.2.2. Réduction indirecte du Cr(VI) chez les bactéries sulfato-réductrices

(BSR)

La réduction dissimilatrice du sulfate par les bactéries sulfato-réductrices en anaérobiose conduit à la

formation d’H2S. Cette molécule peut réduire le chrome (VI) en chrome (III). Losi et al. (1994) rapportent

que la réduction microbienne via la production d’H2S a été testée en bio-réacteur expérimental utilisant

des bactéries sulfato-réductrices d’origine marine pour réduire la concentration en chrome (VI) d’un

effluent.

2.2.3. Réduction enzymatique du chrome (VI) par les BSR

Cette réduction enzymatique, en conditions naturelles, ne représente qu’un faible pourcentage du

phénomène global de réduction du chrome qui est principalement dû à la production d’hydrogène sulfuré.

Chez ces bactéries, l’hydrogénase permet d’oxyder H2 en H+ et les électrons cédés par l’hydrogène sont

transférés au cytochrome c3 qui les cède alors au chrome (VI) au lieu de réduire le sulfite (Figure 4).

Lovley et Phillips (1994) ont déterminé que le transporteur d’électrons est le cytochrome c3 en utilisant la

fraction soluble des extraits cellulaires de Desulfovibrio vulgaris. En enlevant le cytochrome c3 de la fraction

soluble par utilisation d’une colonne échangeuse de cations, l’activité chromate réductase est perdue. Si

l’on ajoute le cytochrome c3 au mélange, on restaure l’activité.

Si l’on enlève un des partenaires de la voie de réduction du sulfite c’est-à-dire l’hydrogénase et/ou

l’hydrogène, la réduction du chrome n’est plus possible. Les auteurs ont également montré que la fraction

membranaire récupérée en parallèle de la fraction soluble présentait aussi une activité chromate réductase

non négligeable (environ 70 % de réduction en 1 heure, [Cr(VI)]ini = 500 µM) mais les protéines mises en

jeu n’ont pas été étudiées.

Une équipe de chercheurs a démontré récemment (Michel et al., 2001) que le cytochrome c3 qui

transporte les électrons de l’hydrogène vers le sulfite (Figure 4) pourrait être impliqué directement dans la

réduction des chromates. Cette étude a été réalisée avec le cytochrome c3 purifié de Desulfomicrobium

norvegicum. D’autres enzymes, cytochromes de type c et hydrogénases de bactéries sulfato-réductrices

comme Desulfovibrio vulgaris ATCC29579 ont une activité chromate réductase (Lovley et Phillips, 1994 ;

Michel et al., 2000). Les auteurs suggèrent que la réduction du chrome (VI) mais aussi du Fe(III), du V(V)

et du Mn(IV) puissent être catalysés par ces enzymes à condition qu’elles possèdent des centres hèmiques

de bas potentiel.


54


3 H2

6 H+

Hydr ogénase Cytochr ome c3 Fer r odoxine

S2- + 3 H2O

SO3

2-

6 e- 6 e- 6 e-6 e-

Figure 4 : Couplage entre la réaction de l’hydrogénase et la réaction du sulfite chez Desulfovibrio gigas

(d’après Moura et al., 1984)

2.3. Cas des autres bactéries

Plusieurs genres de bactéries peuvent réduire le chrome dans différentes conditions. Certaines

bactéries fonctionnent sous un mode strictement aérobie ou anaérobie et d’autres peuvent effectuer la

transformation du chrome (VI) en (III) dans les deux conditions (Tableau IX). Les premières recherches

sur les bactéries pouvant réduire le chrome (VI) en chrome (III) datent de la fin des années 70

(Romanenko et Korenkov, 1977). Cette équipe avait isolé, à partir de boues polluées, une bactérie du

genre Pseudomonas. Depuis, d’autres genres bactériens ont été isolés de sols pollués ou non comme

Microccocus, Escherichia, Enterobacter, Bacillus, Aeromonas, Achromobacter (Tableau IX). Lors des premières

études sur le phénomène de bio-réduction du chrome en milieu liquide, sa transformation était suivie par

disparition de la coloration jaune des ions chromate en solution aqueuse. Récemment, la corrélation entre

la disparition de la forme (VI) et l’apparition de la forme (III) vient d’être faite pour une souche

d’Escherichia coli, un isolat CRB5 de Pseudomonas (McLean et Beveridge, 2000) et chez les souches

Streptomyces thermocarboxydus NH50 et Pseudomonas fluorescens LB300 (Desjardin et al., 2002).


55


Tableau IX : Réduction du Cr(VI) par différentes bactéries. (D’après Wang et Chen, 1995)

organismes condition références

Achromobacter eurydice Anaérobie Gvozdyak et al., 1986

Aeromonas dechromatica Anaérobie Kvasnikov et al., 1988 (a)

Agrobacterium radiobacter Aérobie Llovera et al., 1993

Bacillus cereus Anaérobie Gvozdyak et al., 1986

Bacillus sp Aérobie Wang et Xiao, 1995

Bacillus subtilis Anaérobie Gvozdyak et al. 1986

Desulfovibrio vulgaris ATCC 29579 Anaérobie Lovley and Phillips, 1994

Enterobacter cloacae Anaérobie Ohtake et al., 1990

Escherichia coli Anaérobie Kvasnikov et al., 1988 (b)

Escherichia E. coli ATCC 33456 Aérobie et Anaérobie Shen et Wang, 1993

Micrococcus roseus Anaérobie Gvozdyak et al., 1986

Pseudomonas aeruginosa Anaérobie Gvozdyak et al., 1986

Pseudomonas dechromaticans Anaérobie Romanenko et Korenkov, 1977

Pseudomonas chromatophila Anaérobie Lebedeva et Lyalikova, 1979

Pseudomonas mendocina Aérobie Dhakephalkar et al., 1996

Pseudomonas ambigua G-1 Aérobie Horitsu et al., 1987

Pseudomonas fluorescens LB300 Aérobie et Anaérobie Bopp et Ehrlich, 1988

Pseudomonas putida PRS 2000 Aérobie Ishibashi et al., 1990

2.3.1. Mécanismes biochimiques

La réduction directe du chrome (VI) peut se dérouler en anaérobiose ou en aérobiose. Dans le

premier cas, c’est généralement un cytochrome qui est impliqué. En présence d’oxygène, l’activité

enzymatique peut-être soluble ou membranaire. Le caractère enzymatique de la réaction n’est pas

forcément démontré. Mais le fait que des poisons de la chaîne respiratoire ou qu’un traitement thermique

diminuent l’activité chromate réductase suggèrent fortement l’implication de protéines enzymatiques dans

la réduction du Cr(VI) pour les bactéries décrites dans ce paragraphe.

a En anaérobiose

Enterobacter cloacae HO1 est aussi capable de réduire le chrome (VI) de manière enzymatique en

absence d’oxygène via une protéine associée à la membrane (Wang et al., 1990). Cette protéine se situerait

à la surface externe de la membrane interne ce qui signifie que la réduction du chrome se produirait dans

le périplasme de cette bactérie. Compte tenu de sa très faible solubilité dans l’eau à des pH supérieurs à 5


56


(Cary, 1982), la forme trivalente du chrome ne peut pas traverser la membrane ce qui protège la cellule.

Wang et al. (1990) rapportent que des vésicules préparées à partir de cellules d’E. cloacae IAM1615 et

d’E. coli HB101 sensibles aux ions chromate sont incapables de les réduire aussi efficacement que les

vésicules d’E. cloacae HO1.

Chez ces trois souches, il existe une faible activité chromate réductase dans les fractions

périplasmiques et cytoplasmiques que l’on peut stimuler par l’addition de nicotinamide adénine

dinucléotide réduit (NADH). Ces résultats indiqueraient, d’après les auteurs, que pour E. cloacae HO1, la

réduction serait réalisée principalement dans l’espace périplasmique au niveau de la membrane interne.

Ainsi les chromates seraient réduits avant de pouvoir être toxiques à l’intérieur de la cellule. L’existence

d’une éventuelle réduction du chrome dans le cytoplasme laisse penser que les chromates qui n’auraient

pas pu être réduits dans le périplasme et qui passeraient la membrane interne, seraient pris en charge et

transformés en chrome (III) à l’intérieur de la cellule. Les deux souches IAM1615 et HB101 seraient

sensibles aux chromates car, étant dépourvues du système de réduction lié à la membrane interne (côté

externe) d’E. cloacae HO1, une grande quantité de Cr(VI) pénétrerait dans le cytoplasme et ne pourrait pas

être pris en charge en totalité par l’activité chromate réductase cytoplasmique.

Bopp et Ehrlich (1988) ont aussi décrit une activité chromate réductase en condition anaérobie chez

Pseudomonas fluorescens LB300. Celle-ci n’a pu être observée que dans le cas où la concentration en chromate

est très faible (< 50 µg de K2CrO4) et si la source de carbone est de l’acétate. L’explication donnée par les

auteurs est que l’enzyme qui catalyserait la réaction serait réprimée en présence de glucose en absence

d’oxygène. Ce type de répression a déjà été observé pour le cytochrome a1 d’une souche de Pseudomonas

aeruginosa (Clarke et Ornston, 1975).

Shen et Wang (1993) ont étudié la réduction du chrome chez Escherichia coli ATCC33456. Cette activité

serait associée à la chaîne respiratoire située dans la membrane interne. Mais cette réduction est bien

moins importante que celle réalisée en aérobiose et en anaérobiose par la fraction soluble. Deux

cytochromes b et d de la chaîne respiratoire permettraient de transférer les électrons nécessaires pour la

réduction du chrome (VI) grâce à une enzyme soluble dont l’absence conduirait à une perte de l’activité

chromate réductase. Ce type de mécanisme a déjà été décrit pour la réduction du nitrite chez E. coli K-12

(Abou-Joude et al., 1979).

Campos et al. (1995) ont décrit une souche de Bacillus sp. QC1-2 capable de réduire le chrome (VI) en

anaérobiose comme en aérobiose. Il semble que chez cette souche, l’activité chromate réductase soit une

enzyme soluble à NADH.


57


Plus récemment, la souche Shewanella putrefaciens MR-1 (Myers et al., 2000) a été décrite comme

pouvant réduire le chrome (VI) en absence d’oxygène. Chez cette bactérie, l’activité chromate réductase

est associée aux membranes. Les expériences de spectrométrie par résonance paramagnétique des

électrons (EPR) ont révélé la présence d’un pic correspondant au Cr(V). Ce résultat suggère aux auteurs

que la réduction du chrome (VI) chez cette souche se fait par au moins deux étapes dont la première

impliquerait le transfert d’un électron.

L’ensemble des souches réduisant le chrome (VI) de manière enzymatique en condition anaérobie est

présenté dans le Tableau X.

Tableau X : Bactéries réduisant les chromates de manière enzymatique en condition anaérobie

Souches Localisation probable de l’activité chromate

réductase

Donneurs d’électrons

Remarques Références

P. fluorescens LB300 Inhibé par la présence de glucose

Bopp et Ehrlich, 1988

E. coli ATCC33456 Soluble (périplasmique) majoritaire, participation

mineure de la chaîne respiratoire

(cytochrome c et d)

NADH + réserve

endogène

Shen et Wang, 1993

E. cloacae HO1 Associée à la membrane NADH Wang et al., 1990

D. vulgaris ATCC 29579 Majoritairement soluble mais aussi membranaire

Participation du cytochrome c3

hydrogénase et H2

Non inhibée par les sulfates (50 mM)

Lovley et Phillips, 1994

Bacillus sp. QC1-2 Soluble NADH Campos et al., 1995

Shewanella putrefaciens MR-1

Associée à la membrane NADH et formate (av. NADPH : pas d’activité Cr(VI) réductase)

Myers et al., 2000

b En aérobiose

Parmi les bactéries capables de réduire le chrome de manière directe en aérobiose, nous retrouvons

Pseudomonas fluorescens LB300 et Escherichia coli ATCC33456 déjà étudiées pour le même phénomène mais en

absence d’oxygène. Chez P. fluorescens, Bopp et Ehrlich (1988) décrivent une activité chromate réductase

contenue dans la fraction soluble et qui serait constitutive. Pour cette même souche, une activité chromate

réductase avait été détectée en anaérobiose (voir § 2.2.3 de ce chapitre). Cependant, compte tenu que la ou

les protéines n’ont pas été identifiées, il est difficile de savoir si l’activité chromate réductase en aérobiose

et en anaérobiose met en jeu les même enzymes. Chez E. coli ATCC33456, le mécanisme en aérobiose

semble identique à celui présenté dans le paragraphe précédent. Tout comme en anaérobiose, la fraction

soluble ou la fraction membranaire des souches bactériennes réduisant le chrome en présence d’oxygène

peuvent être impliquées dans la réduction.


58


Une culture de la souche Bacillus subtilis 168t+, une bactérie Gram positif, est capable de réduire en

totalité 0,5 mM de chrome en 24 heures à 30°C en aérobiose (Garbisu et al., 1998). Les auteurs ont

déterminé que la fraction soluble permettait de réduire les chromates. Le donneur d’électrons peut être du

NADH ou du NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide (-phosphate) réduit). Il semble que cette

activité enzymatique soit exprimée de manière constitutive et non induite par les chromates. Des cellules

pré-cultivées dans un milieu contenant du Cr(VI) ne réduisent en effet pas davantage les chromates que

des cellules pré-cultivées en absence de chrome. Ni la croissance, ni la réduction du chrome n’est affectée

par la présence de nitrate (10 mM).

Ces résultats suggèrent aux auteurs que le chrome n’est pas réduit par le transport d’électron de la voie

dissimilatrice mais plutôt par un système de détoxification puisque les nitrates qui peuvent servir

d’accepteurs d’électrons n’entrent pas en compétition avec les chromates. Le mécanisme de réduction du

chrome chez la souche de B. subtilis 168t+ ressemble à celui observé chez Pseudomonas fluorescens LB300

décrit par Bopp et Ehrlich (1988). Pour cette dernière, la fraction soluble réduit le chrome (VI) en chrome

(III) en présence de NADH (NADPH non testé). La fraction membranaire, même additionnée de

NADH, ne peut réduire le chrome (VI). La fraction soluble d’une souche sensible au chrome dérivée de

LB300, par perte du plasmide pLHB1 conférant la résistance au chrome (voir § 1.2 page 48) réduit les

chromates aussi efficacement. L’activité chromate réductase semble être, comme dans le cas de Bacillus

subtilis 168t+, exprimée de manière constitutive.

On retrouve le même mécanisme chez P. putida PRS2000 : le NADH et le NADPH peuvent servir de

donneurs d’électrons et la réaction n’est pas affectée par la présence de sulfates dans le milieu (Ishibashi et

al., 1990). Les travaux de recherche réalisés avec cette souche suggèrent aux auteurs l’implication d’une

enzyme dont l’activité serait détournée en présence d’ions chromate. Le ou les substrats « naturels » de

l’enzyme n’ont pas pu être identifiés mais de toute évidence, les sulfates n’interviennent pas. L’ensemble

des souches réduisant le chrome (VI) de manière directe en condition aérobie est présenté dans le

Tableau XI.


59


Tableau XI : Bactéries réduisant les chromates de manière directe en condition aérobie

Souche Localisation probable de l’activité chromate réductase

Donneurs d’électrons

Remarques Références

B. subtilis Fraction soluble NADH Campos et al., 1995

B. subtilis Fraction soluble NAD(P)H Constitutif Garbisu et al., 1998

P. ambigua G-1 Fraction soluble monomère 25 kDa et natif 65 kDa

NAD(P)H et co facteur endogène

Non constitutif Suzuki et al., 1992

P. fluorescens LB300 soluble NADH Constitutif Bopp et Ehrlich, 1988

P. putida PRS2000 soluble NAD(P)H Non inhibée par les sulfates

Ishibashi et al., 1990

P. putida MK1 Soluble (périplasmique) monomère 20 kDa, natif 50

kDa

NAD(P)H Inhibition non compétitive par

les sulfates

Park et al., 2000

E. coli ATCC33456 Soluble majoritaire participation mineure de la

chaîne respiratoire

NADH + réserve

endogène

Shen et Wang, 1993

R. metallidurans Intérieur cellule ? Inhibée par les sulfates

Peitzsch et al., 1998

Streptomyces sp 3M Fraction membranaire NAD(P)H Constitutif Das et Chandra, 1990

Il existe deux souches pour lesquelles le mécanisme a été plus précisément décrit. Il s’agit des souches

de Pseudomonas ambigua G-1 (Suzuki et al., 1992) et de Pseudomonas putida MK1 (Park et al., 2000). L’activité

chromate réductase des deux souches est contenue dans la fraction soluble. Chez P. ambigua (Suzuki et al.,

1992), l’enzyme serait une protéine di ou trimérique de 65 kilodaltons (kDa) sous sa forme native et la

taille du monomère est de 25 kDa.

Cette enzyme fonctionne dans une gamme de températures et de pH assez large (40-70°C, optimale :

50°C ; pH 6-9, optimal : 8,6). Cette enzyme permet la réaction de réduction du chrome en présence de

NADH ou de NADPH et la réduction de 1 mole CrO42- nécessite l’utilisation de 3 moles de NADH qui

sont oxydées en NAD+. Certains résultats expérimentaux suggérant aux auteurs que l’enzyme réduirait le

chrome en au moins deux étapes, une analyse spectrométrique ESR (Electron Spin Resonance) a été

entreprise et a permis de mettre en évidence la formation d’un intermédiaire : le Cr(V). Les auteurs

avaient, pendant la purification de l’enzyme réduisant le chrome (VI), détecté un autre pic présentant aussi

une activité chromate réductase. Ce pic n’a pas pu être purifié mais la taille de la protéine native a pu être

déterminée. Cette dernière, sous forme native, a une masse moléculaire de 130 kDa et ne présente pas le

monomère de 25 kDa lorsqu’elle est dénaturée. Ce résultat suggère fortement l’existence d’autres activités

chromate réductase chez P. ambigua G-1. Chez P. putida MK1 (Park et al., 2000), c’est aussi une protéine di

ou trimérique de 50 kDa qui serait impliquée.

La difficulté à déterminer précisément s’il s’agit d’un dimère ou d’un trimère réside dans l’existence

dans certaines protéines de ponts disulfures intra- ou inter-chaînes. Un trimère de monomères de 25 kDa

ne migrera pas, sur gel de polyacrylamide, à la même distance qu’un monomère de 75 kDa.


60


La multimérisation entraîne une migration non proportionnelle à la taille. Cette enzyme fonctionne avec

du NADH ou du NADPH. La séquence N-terminale a été déterminée et a montré que le premier acide

aminé n’était pas une méthionine. En effet, la séquence codante d’un ARNm commence toujours par le

codon AUG qui correspond à l’ARNt portant une méthionine. Ceci suggère fortement la présence d’un

peptide signal (qui possède la méthionine en première position) qui est clivé lorsque l’enzyme est

transloquée du cytoplasme vers le périplasme. L’absence de méthionine en première position est un

argument en faveur d’une enzyme à localisation périplasmique. Suzuki et al. ont déposé, en 1995 dans la

base de données GenBank, la séquence du gène codant la chromate réductase chez P. ambigua G-1. Park et

al. (2000) ont recherché la séquence de ce gène dans le génome de leur souche et ils n’ont pas retrouvé

d’homologues, indiquant que les deux enzymes décrites sont bien différentes.

La protéine déduite de la séquence du gène codant la chromate réductase de P. ambigua G-1 (Suzuki et

al., 1992) a été comparée aux bases de données et montré 37 % d’identité et 56 et 53 % d’homologie avec

deux autres protéines codée par les gènes ycnD de Bacillus subtilis et ecd de Pseudomonas putida KT2440

respectivement (Park et al. séquences déposées le 6 septembre 2001). Cette comparaison a été effectuée

grâce à BLAST version BLAST 2-2-2 disponible sur le site internet www.ncbi.nlm.nih.gov (National

Center for Biotechnology Information) en utilisant la matrice BLOSUM62. La recherche de domaine

(RPS-BLAST 2-2-2) a montré l’existence possible dans les 3 protéines d’un site nitroréductase utilisant le

FMN comme co-facteur (Tableau XII). La séquence des gènes chrR n’a montré en revanche aucune

homologie.

Tableau XII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas ambigua G-1

souches Gène n° accession GENBANK

Protéine n° accession GENBANK

Nb d’aa domaine Identité et homologie avec consensus nitroréductase

(166 aa)

Références

Pseudomonas ambigua G-1

chrR D83142

ChrR BAA11821

249 nitroréductase 41 % identité 56 % homologie

Suzuki et al., 1992

Pseudomonas putida KT2440

ecd AF417209

flavoprotéine AAL09699


Park et al., non publié

Bacillus subtilis ycnD AF417208

oxydoréductase AAL09698



Le deuxième type de protéine ayant une activité chromate réductase a été retrouvé chez P. putida

KT2440 (Park et al., séquence déposée le 6 septembre 2001). Le gène correspondant a été séquencé et a

été appelé chrR. La comparaison de la séquence protéique, effectuée avec BLAST, a permis de trouver

deux autres protéines présentant 45 et 96 % d’identité chez Escherichia coli AMS6 et Pseudomonas putida MK1

respectivement. Les protéines sont composées de 187 acides aminés en moyenne ce qui représente une

masse moléculaire d’environ 20 kDa (taille du monomère décrit pour P. putida MK1 de Park et al., 2000)

(Tableau XIII). La séquence des gènes chrR des 3 souches a été comparée. Celles des deux souches de


61


Pseudomonas présentent 90 % d’identité entre elles ce qui n’est pas surprenant compte tenu qu’il s’agit de la

même espèce : putida. La séquence de chrR de P. putida MK1 a été comparée à celle d’E. coli AMS6. On

retrouve une séquence située au milieu du gène qui présente 79 % d’identité dans les deux souches. Cette

séquence semble très conservée entre les deux genres bactériens. Les séquences protéiques ont été

déduites et présentent 76 % d’identité (sur une longueur de 21 acides aminés).

Nous avons recherché dans les trois séquences protéiques complètes s’il existait un domaine

fonctionnel connu (grâce à BLAST sur le site internet www.ncbi.nlm.nih.gov) et seule la séquence ChrR

de E. coli a donné un domaine tronqué NAD(P)H déshydrogénase à co-facteur FAD. La séquence

consensus pour ce domaine mesure 174 acides aminés et la séquence du gène de E. coli n’a d’homologie

que sur 46 aa dans la partie N-terminale. La comparaison des séquences des protéines ChrR de deux

souches de Pseudomonas ne donne aucun domaine conservé connu.

Tableau XIII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas putida MK1

souches Gène n° accession GENBANK

Protéine n° accession GENBANK

Nb d’aa domaine Identité et homologie avec consensus partielle

NAD(P)H déshydrogénase

Références

Pseudomonas putida MK1

chrR AF375641

Chromate réductase ChrR AAK56852

186 Park et al., non publié

Pseudomonas putida KT2440

chrR AF375642


186 Park et al., non publié

Escherichia coli AMS6

chrR AF385329


188 NAD(P)H déshydrogénase

partielle (46/174 aa)

35,5 % identité 55,5 % d’homologie

sur 46 aa


Les activités chromate réductases décrites jusqu’à présent en aérobiose sont localisées, pour l’immense

majorité, dans la fraction soluble périplasmique. Il semble, d’après Peitzsch et al. (1998), que chez

Alcaligenes eutrophus la réduction des chromates pourrait avoir lieu à l’intérieur des cellules mais ceci n’a pas

été démontré.

Il existe cependant un cas rapporté d’activité réductase aérobie liée à la fraction membranaire. Il s’agit

de Streptomyces sp 3M. L’enzyme utilise le NADH et le NAD(P)H et est constitutive. Ces résultats ont été

présentés par Das et Chandra en 1990 mais depuis aucune étude sur cette chromate réductase n’a été

publiée.


62


2.4. Influence de divers paramètres

2.4.1. Influence de la concentration en Cr(VI)

Comme nous l’avons décrit dans ce chapitre § 2.3, la réduction directe du chrome (VI) chez les

bactéries est le résultat d’une réduction enzymatique. La vitesse de la réaction répond à l’équation 8

suivante

CKsCVmv

+= .

équation 8

avec v, la vitesse de réduction du Cr(VI) en mg.L-1.h-1 ; Vm, la vitesse maximale en mg.L-1.h-1 , C, la

concentration en Cr(VI) en mg.L-1 au temps t et Ks, la concentration en Cr(VI) pour Vm/2.

La concentration en ions chromate dans les milieux de culture peut influer sur la vitesse de réaction

car le Cr(VI) est le substrat de la réaction.

Lorsque la concentration en Cr(VI) est très inférieure au Ks, alors l’équation 8 devient :

KsCVmv .=

équation 9

Dans ce cas, la réaction de réduction est d’ordre 1. Pour une concentration cellulaire donnée, la vitesse

dépend de la concentration en Cr(VI).

Lorsque la concentration en Cr(VI) est très supérieure au Ks alors, l’équation 8 peut être simplifiée :

KsVmv =

équation 10

Dans ce cas, la vitesse ne dépend que de Vm qui est en relation directe avec la concentration en

cellules vivantes dans le milieu de culture. La vitesse de réduction du chrome sera alors d’ordre 0.


63


Ceci n’est valable qu’à condition que le Cr(VI) ne joue aucun rôle inhibiteur. Or, les ions chromate ont

un effet toxique sur les cellules et les équations 8, 9 et 10 ne prennent pas en compte cet effet.

Wang et Shen (1997) proposent l’équation suivante pour modéliser la réduction du Cr(VI) par les bactéries

qui intègre la notion de toxicité du chrome au cours de la réaction.

CKsXCVmv

+= ..1

équation 11

avec

RcCCXX −= −

00

équation 12

avec Vm1, la vitesse maximale en mg.L-1.cellule-1 ; X, la concentration en cellules (cellule.L-1), X0 et C0,

les concentrations initiales en cellules et en Cr(VI) respectivement et Rc, la capacité maximale de réduction

des cellules (mg de Cr(VI).cellule-1).

Les auteurs Wang et Shen (1997) ont utilisé l’équation 11 pour modéliser la réduction du chrome en

culture pure. Leur étude montrent que les cinétiques obtenues à partir du modèle proposé, qui prend en

compte l’effet du Cr(VI) purement cinétique (ordre de réaction) et l’effet physiologique (toxicité),

coïncident avec celles obtenues expérimentalement avec E. coli ATCC33456, Bacillus sp, Pseudomonas

ambigua G-1, Desulfovibrio vulgaris et P. fluorescens LB300. La réduction du chrome est davantage gouvernée

par la capacité maximale de réduction (Rc) des cellules que par la croissance cellulaire elle-même. En effet,

chez P. ambigua G-1, en dépit d’une croissance cellulaire importante (de 150 à 1550 mg de poids sec.L-1 en

24 heures) la vitesse de réduction du Cr(VI) n’augmente pas mais décroît rapidement. Pour une

concentration initiale en Cr(VI) de 150 mg.L-1, la vitesse apparente de réduction du chrome pendant les 6

premières heures est de 15,4 mg.L-1.h-1 pour une concentration en cellules qui atteint 650 mg de poids sec

bactérien.L-1. Cette vitesse apparente chute à environ 2,8 mg.L-1.h-1 pendant les 6 heures suivantes (pour

une concentration cellulaire de 900 mg de poids sec bactérien.L-1). Si l’on exprimait les vitesses par mg de

poids sec bactérien, le ralentissement serait encore plus prononcé.

En présence de cellules vivantes, il n’est pas possible de dissocier l’effet cinétique du chrome de son

effet toxique. Si la concentration en Cr(VI) est importante, c’est l’effet toxique qui prédomine.


64


2.4.2. Influence du taux d’oxygène dissous sur la réduction du chrome (VI)

L’ion chromate, comme la molécule d’oxygène, peut être un accepteur d’électrons car la valeur de son

potentiel standard est relativement élevée (ε° CrO42-/Cr3+ = 1,350 Volts, ε° O2/H2O = 1,229 V).

Parmi les organismes capables de réduire le chrome (VI) à la fois sous conditions aérobie et anaérobie,

Escherichia coli ATCC 33456 réduit plus vite en absence d’oxygène (Shen et Wang, 1995). Les vitesses

observées par les auteurs sont de 0,50 mmol de Cr(VI).g-1 (poids sec) de cellules par heure en anaérobiose

contre 0,27 mmol.g-1 cellule.h-1 en présence d’oxygène.

En biochimie, on considère généralement les potentiels standards apparents ε°’ qui sont définis à

pH 7 et à 25°C. Dans ces conditions, le couple O2/H2O a un ε°’ de 0,82 V supérieur à celui de CrO42-

/Cr3+ qui est de 0,56 V (Wang et Shen, 1995). Par conséquent, d’un point de vue thermodynamique,

l’oxygène est un accepteur préférentiel des électrons comparé au chrome (Tableau XIV).

Tableau XIV : Comparaison des bilans énergétiques selon que Cr(VI) ou O2 sont utilisés comme

accepteurs d’électrons (d’après Shen et Wang, 1995)

réactions

∆G° (kJ/ électron

tranféré

1 Respiration aérobie C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O -121

2 Cr(VI) accepteur d’e- de l’oxydation C6H12O6 + 8 CrO42- + 34 H+ → 6 HCO3- + 20 H2O + 8 Cr3+ -83

3 O2 accepteur d’e- du cytochrome d O2 + 4 H+ + 4 cyt d réduits→ 2 H2O + 4 cyt d+ oxydés -52

4 Cr(VI) accepteur d’e- du cytochrome d CrO42- + 8 H+ + 3 cyt d réduits→ 4 H2O + 3 cyt d+ oxydés + Cr3+ -27

La réaction 2 du Tableau XIV consomme énormément de protons (plus de 4 moles de protons par

mole de Cr(VI)) ce qui conduit à une déplétion en H+ dans l’espace périplasmique. De ce fait, peu de

protons restent disponibles pour rentrer dans la cellule. En présence d’O2, la cellule peut réduire l’oxygène

ou le chrome (VI) disponible. Compte tenu de l’appauvrissement en protons et des bilans énergétiques, la

réaction 1 sera favorisée. Il apparaît que le chrome (VI) peut entrer en compétition avec l’oxygène lorsque

l’activité chromate réductase impliquée est liée aux protéines de la chaîne respiratoire.

Shen et Wang (1993) ont montré que chez E. coli ATCC33456, la réduction du chrome (VI)

([Cr(VI)]ini = 0,27 mM) par des cellules entières était de 100 % en 7 heures d’incubation à 35°C en

anaérobiose, d’environ 78 % pour une concentration en oxygène de 0,15 mM et de seulement 30 % pour

une concentration d’O2 de 0,63 mM. Les auteurs de cette étude ont utilisé la représentation de

Lineweaver-Burk pour déterminer la vitesse maximale, Vm et la constante d’affinité, Ks.


65


Par la représentation 1/V = f(1/C) avec C la concentration initiale en Cr(VI), ils ont trouvé une Vm

de 0,50 mmol de Cr(VI).g-1 (poids sec) de cellules par heure en anaérobiose contre 0,27 mmol.g-1 cellule.h-1

en présence d’oxygène et des Ks de 0,12 et 0,041 mM respectivement. En présence d’oxygène, la Vm et le

Ks sont modifiés ce qui suggèrent aux auteurs que l’oxygène est inhibiteur incompétitif. Cependant une

inhibition incompétitive implique un changement de la Vm, du Ks sans modification du rapport Ks/Vm.

D’après les valeurs données par les auteurs, en absence d’oxygène le rapport est de 0,24 et en présence

de O2 il est de 0,15. Des trois types principaux d’inhibition présentés dans le Tableau XV, la

représentation de Lineweaver-Burk obtenue avec les cinétiques d’E. coli ATCC33456 est plus proche d’un

modèle incompétitif que des modèles compétitif et non compétitif. Dans le modèle incompétitif, l’enzyme

(E) forme un complexe (ES) avec le substrat (S) mais pas avec (I). Une fois le complexe (ES) formé, il

peut se transformer en (E) + (P) ou interagir avec l’inhibiteur (I) pour former un complexe (ESI) inactif.

Le site de fixation à (I) n’est accessible qu’une fois le complexe (ES) formé. Il semble donc que le site de

fixation du Cr(VI) soit différent de lui de l’O2 car si les sites étaient identiques, l’inhibition aurait été de

type compétitif.

Tableau XV : Types d’inhibitions réversibles.

Vm’ Ks’ Représentation de Lineweaver-Burk

Compétitive Vm Ks(1+([I]/Ki))

Non compétitive Vm.(1+([I]/Ki))-1 Ks

Incompétitive Vm.(1+([I]/Ki))-1 Ks.(1+([I]/Ki))-1

1/V

1/C

-1/Ks

-1/Ks

1/Vm’21/Vm’11/Vm

[I]2 [I]1

[I] = 0

1/C

1/V

-1/Ks -1/Ks’2-1/Ks’1

1/Vm’21/Vm’11/Vm

1/Vm

[I]2 [I]1

[I] = 0

1/C

1/V

[I]1[I]2

[I] = 0


66


2.4.3.pH optimum et température optimum

La valeur de ces deux paramètres coïncide avec les conditions optimales de croissance des bactéries.

Pour Enterobacter cloacae HO1 par exemple, le pH optimal se situe entre 6 et 8,5 pour des températures

entre 20 et 40°C ou entre 7 et 7,8 pour des températures comprises entre 30 et 37°C (Komori et al., 1989).

Chez E. coli la gamme de pH est plus large : 3 à 8 entre 10 et 45°C avec un maximum à 36°C à un pH de 7

(Wang et Shen, 1995). Une étude en milieu riche contenant du peptone et de l’extrait de levure a été

réalisée avec Thermophilic bacterium TOR 39. Sa température optimale de croissance est comprise entre 50°C

et 70 °C. Les auteurs (Zhang et al., 1996) ont montré qu’à 75°C, la réduction du chrome (VI) par cette

bactérie est un phénomène prédominant par rapport à la réduction abiotique à la même température.

Des études ont été menées directement sur les enzymes purifiées. Les enzymes solubles de Pseudomonas

putida MK1 (Park et al., 2000) et de P. ambigua G-1 (Suzuki et al., 1992) fonctionnent de façon optimale à

80°C et 50°C respectivement. Les pH optimums sont de 5 pour l’enzyme de la première souche et de 8,6

pour celle de P. ambigua G-1.

2.4.4. Effet d’autres métaux

Les études appliquées portant sur la réduction du chrome (VI) par les bactéries ont pour but de les

utiliser dans le traitement d’effluents ou de sols contaminés. Les pollutions au chrome sont souvent

associées à d’autres pollutions métalliques. Par conséquent, l’influence de la présence de ces métaux a été

testée afin d’apprécier leurs effets. S’il s’agit d’évaluer l’effet sur la réaction enzymatique et non pas l’effet

toxique du métal considéré sur la croissance bactérienne, les travaux sont réalisés sur des extraits

cellulaires. Pour P. putida PRS2000, l’argent Ag+ et le mercure Hg2+, à des concentrations de l’ordre de

20 µM, sont de forts inhibiteurs de la réduction du chrome.

En revanche le Cr3+, à la concentration de 0,2 mM, n’a pas d’effet. D’autres études ont été menées sur

des cellules entières afin d'évaluer la toxicité des métaux sur la croissance des micro-organismes et sur la

réduction du chrome. La réduction du chrome chez D. vulgaris n’est pas affectée par la présence dans le

milieu de culture de Ni2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+ (0,1 mM) (Lovley et Phillips, 1994). La réduction du Cr(VI)

par une culture de la souche de Pseudomonas CRB5, isolée d’un site pollué au chrome (VI), à l’arsenic (V) et

au cuivre (II), n’est pas affectée (% de réduction après 24 heures) par la présence des deux derniers

éléments aux concentrations respectives de 0,8 et 0,6 mM (McLean et Beveridge, 2001).


67


3.Application au traitement de solutions ou de sols pollués par du

chrome : quelques exemples

La réduction du Cr(VI) par les bactéries est un moyen envisagé par les chercheurs pour traiter la

pollution aux chromates. Beaucoup d’études ont été réalisées en milieu liquide. Il est en effet beaucoup

plus facile de maîtriser la composition d’un milieu de culture et de mesurer différents paramètres lorsque

l’on travaille en phase liquide avec du matériel biologique vivant. Tout se complique lorsqu’il s’agit

d’utiliser les bactéries dans un milieu plus complexe comme le sol. Il faut prendre en considération les

différents échanges matrice-liquide qui peuvent s’opérer ainsi que les interactions bactéries-matrice.

Pour traiter un effluent ou un sol pollué par une méthode biologique, on peut envisager deux

approches : la première consiste à utiliser une culture, pure ou mixte, d’organismes endogènes ou

exogènes que l’on apporte au milieu pollué non stérile (la stérilisation d’un sol ou d’un effluent à l’échelle

du terrain n’est généralement pas envisageable d’un point de vue économique). On parle alors de « bio-

augmentation). La seconde approche consiste à stimuler la flore endogène en ajoutant certains nutriments

ou en optimisant les conditions d’aération. On parle alors de « bio-stimulation ».

L’avantage d’utiliser la flore endogène est qu’elle est déjà adaptée aux conditions environnementales.

En revanche, à mesure que l’on traite le sol ou l’effluent, la ou les souches d’intérêt peuvent entrer en

compétition avec celles qui, lorsque la pollution était plus importante, étaient minoritaires. Il en est de

même pour la flore exogène que l’on apporterait sous forme de culture. Mais le fait de posséder les

souches d’intérêt en culture pures ou mixtes permet d’envisager d’enrichir plusieurs fois le milieux en

cours de traitement, ce qui est moins facile si l’on essaye de stimuler l’activité de la flore endogène

uniquement.

3.1. Traitements anaérobies

3.1.1. Culture mixte exogène/Cr(VI) en solution

Les bactéries anaérobies réductrices (autres que les bactéries sulfato-réductrices) auraient un avantage

au niveau de la croissance sur les bactéries non réductrices grâce à leur capacité à utiliser le Cr(VI) dans la

respiration anaérobie. Turick et Apel (1997) ont donc proposé pour le traitement d’effluents liquides un

bio-procédé anaérobie qui incorpore et maintient une population mixte de bactéries réduisant le chrome

(VI) en créant un environnement dans un bio-réacteur qui optimise les conditions pour que cette

population mixte soit la population dominante. La culture mixte a été obtenue après enrichissement en

condition anaérobie d’une suspension de sol pollué. Un réacteur d’1,4 litres contenant 1 L de milieu TSB


68


(Trypsic Soy Broth, 2,5 % de dextrose) et des selles de Berl de 6 mm en porcelaine est ensemencé par la

pré-culture mixte choisie par les auteurs. Les selles de Berl vont être colonisées par la biomasse. Pendant

toute la durée de l’expérimentation, la température est maintenue à 30°C et la concentration en chrome

(VI) à l’entrée du réacteur supérieure ou égale à 200 mg.L-1 (4 mM de Cr(VI)) par ajout continu de K2CrO4

(afin de tester l’effet de l’augmentation de Cr(VI)). Les expériences ont montré qu’à la sortie du réacteur

(temps de rétention dans le réacteur : 48 h), il n’y a plus de Cr(VI). Le Cr est retrouvé sous forme (III)

dans le surnageant vraisemblablement compléxé avec les molécules organiques du milieu nutritif TSB ou

bien adsorbé sur la membrane des cellules mortes. Le consortium bactérien choisi a une grande capacité à

réduire le chrome (VI).

Les auteurs ont analysé la population mixte et ont remarqué que la nature du ou des isolats dominants

varie en fonction du temps. Dans les 100 premières heures, l’isolat dominant est une souche identifiée

comme étant certainement un Bacillus sp, puis passé ce temps après lequel les concentrations entrantes en

chrome étaient plus importantes, ce sont des souches de Microccocus et Rhodococcus plus résistantes au

chrome que Bacillus sp qui constituent la population dominante. Ce réacteur, dans les conditions testées,

offre donc l’avantage de permettre la réduction de concentrations importantes de chrome (VI) et d’avoir

un système bactérien qui s’adapte aux concentrations variables en chrome.

Turick et al. (1997) ont tenté d’augmenter le rendement du réacteur. Pour cela un autre réacteur

d’1,9 litres contenant 0,750 L de milieu liquide a été utilisé, les selles de Berl en porcelaine ont été

remplacées par des billes BioSep dont la porosité est beaucoup plus importante. La surface de contact

développée est plus grande et permet une colonisation plus importante. Le temps de rétention est de 12 h

(contre 48 h dans l’expérience précédente) et la température est maintenue à 30°C. Dans ces conditions,

la vitesse de réduction est 65 fois plus importante qu’avec les selles de Berl et atteint 260 mg.L-1.h-1. La

population mixte sélectionnée et le garnissage du réacteur semblent adaptés pour réduire efficacement le

Cr(VI).

Cette population mixte dans des essais en batch avec comme source de carbone du sucrose présente la

même efficacité de réduction qu’en milieu TSB (où la source de carbone est du dextrose) ce qui permet

d’envisager d’utiliser de la molasse peu onéreuse pour alimenter le réacteur en carbone.

Pour confirmer l’efficacité de ce consortium bactérien en présence d’autres organismes pouvant

provenir de l’effluent à traiter, des expériences complémentaires devraient être entreprises en alimentant le

réacteur avec un effluent chromé non stérile, pouvant provenir du lavage d’un sol, complémenté par une

source de carbone.


69


3.1.2. Culture mixte + Escherichia coli ATCC33456/Cr(VI) en solution

Chirwa et Wang (2000) ont étudié simultanément la réduction du chrome (VI) et la dégradation du

phénol qui peut être un co-polluant. Ils ont mélangé des organismes anaérobies dégradant le phénol à la

souche E. coli ATCC33456. Les essais ont été réalisés en batch dans des tubes de 75 mL à 35°C à

l’obscurité. La culture mixte anaérobie dégrade le phénol mais ne réduit pas le chrome. E. coli ne dégrade

pas le phénol mais peut réduire le chrome en anaérobiose (voir § 2.3.1.a de ce chapitre page 56). Cette

étude a montré que E.coli ATCC33456 utilisait les métabolites résultant de la dégradation du phénol par les

bactéries anaérobies ([Phénol]ini = 200 mg.L-1), comme donneurs d’électrons pour réduire le chrome (VI)

([Cr(VI)]ini = 2 mg.L-1).

3.2. Procédés aérobies

3.2.1. Flore endogène/Cr(VI) dans le sol

Losi et al. (1994) ont testé la possibilité de réduire le chrome présent dans un sol agricole en apportant

de la matière organique (sous forme de fumier). Les expériences ont consisté à incuber 50 g de sol stérilisé

ou non dans lequel a été ajouté du Cr(VI) (sous forme de K2Cr2O7) à la concentration de 800 µg.kg-1 et

éventuellement de la matière organique (qui correspond à un amendement de 50 tonnes.ha-1).

Après 3 semaines d’incubation (obscurité, 20°C) durant lesquelles l’humidité du sol a été contrôlée et

maintenue constante, il reste 400 µg.kg-1 de Cr(VI) dans les essais ne contenant pas de matières organiques

fraîches (fumier) apportées, que le sol soit stérilisé ou non. En revanche, dans le cas où le sol a été amendé

à 50 tonnes.ha-1, s’il a été au préalable stérilisé, il reste environ 200 µg.kg-1 et seulement 30 µg.kg-1 s’il n’a

pas été autoclavé. Il apparaît que le sol contient suffisamment de composés organiques et de Fe2+ pour

permettre une réduction de 50 % par des mécanismes chimiques (sol non amendé, stérile).

L’expérience avec le sol stérile amendé à 50 tonnes.ha-1 montre que l’apport de MO (fumier)

augmente la réduction du chrome qui atteint 75 % dans ces conditions. Si le sol n’est pas stérilisé, la quasi-

totalité (96,4%) du Cr(VI) présent initialement est réduit. La matière organique apporte des micro-

organismes exogènes et stimule l’activité microbienne endogène qui permet de compléter la réduction

chimique du chrome. Les auteurs ont dénombré les micro-organismes présents dans le sol. Lorsque le sol

n’est pas amendé en MO, il y a dix fois moins de bactéries. La stimulation de la flore endogène permet

d’obtenir un meilleur rendement de réduction.

Cependant, il faut noter que dans cette étude le chrome présent a d’une part été apporté pour les

manipulations (sol non pollué initialement donc microflore non adaptée à la présence de Cr(VI)) et d’autre

part est à une concentration relativement faible (< à 1 mg.kg-1).


70


3.2.2. Pseudomonas fluorescens LB300/Cr(VI) en solution

Dans cette étude, les auteurs (Chirwa et Wang, 1997) ont utilisé un réacteur (de 12,5 cm de hauteur et

2,54 cm de diamètre soit un volume vide d’environ 64 cm3) contenant des billes de pyrex de 3 mm de

diamètre ensemencé avec la souche Pseudomonas fluorescens LB300 cultivée en aérobiose. La température est

maintenue à 30°C pendant toute l’expérience et le débit dans la colonne est compris entre 1,1 et

4,4 mL.h-1. Du chrome (VI) est injecté périodiquement dans le réacteur de façon à avoir une concentration

à l’entrée de la colonne comprise entre 30 et 100 mg.L-1 afin d’évaluer l’évolution du système lorsque la

concentration en chrome à l’entrée du réacteur augmente (au total, environ 230 mg de Cr(VI) auront été

injectés sur une période de 118 jours).

Une partie des cellules va se fixer sur les billes et l’autre reste en suspension. Le fait que la biomasse

attachée sous forme de biofilm aux billes de verre augmente lorsque la concentration en Cr(VI) augmente

suggère aussi aux auteurs que la réduction s’effectuait davantage par les cellules fixées que par celles en

suspension. L’adhésion des cellules au support solide les protège de l’effet toxique du chrome. Quelles que

soient les concentrations en Cr(VI) à l’entrée, le bio-réacteur permet d’obtenir en sortie des concentrations

de l’ordre de 10 mg.L-1 sans renouveler le réacteur en cellules fraîches. La quasi totalité du chrome (III) est

retrouvé dans le surnageant (dont le pH est resté constant à 6,9 ± 0,1 unité durant les 118 jours) ce qui est

cohérent avec le mécanisme de réduction utilisé par P. fluorescens LB300 qui réduit le chrome grâce à une

enzyme soluble du périplasme, le chrome (III) n’est donc pas stocké dans les cellules.

De plus les cellules ont une faible capacité à fixer le Cr(III) sur leurs membranes. La forme sous

laquelle se trouve le chrome trivalent dans le surnageant du réacteur n’a pas fait l’objet d’investigation.

Etant donné qu’il est insoluble à des pH supérieurs à 5,5, il est probablement compléxé ou sous forme de

CrOOH.

3.2.3. Pseudomonas mendocina MCM B-180/Cr(VI) dans le sol

Cette étude (Salunkhe et al., 1998) a été réalisée afin d’évaluer le potentiel de la souche Pseudomonas

mendocina a réduire le chrome (VI) présent dans un sol en présence des micro-organismes indigènes. Les

expériences ont consisté à incuber 1 g de sol (d’origine agricole, non pollué) avec du milieu EG1 dans

différentes conditions d’humidité et avec des inocula de « tailles » différentes (la température d’incubation

n’est pas précisée par les auteurs).

1 Composition du milieu EG, en g.L-1 : NH4Cl, 0,03 ; K2HPO4, 0,03 ; KH2PO4, 0,05 ; MgSO4 7 H2O, 0,01 ;

CH3COONa, 2,0 ; extrait de levure, 0,15 ; peptone, 0,5 ; pH 7,5)


71


Ces deux facteurs semblent particulièrement importants : la taille de l’inoculum doit être de 107 à 108

UFC.g-1 de sol et l’humidité doit être supérieure à 80 % pour obtenir plus de 99 % de réduction du

chrome (VI) en 24 h (concentration initiale en Cr(VI) dans les sols de 100 mg.kg-1 de sol).

Les expériences avec du sol préalablement stérilisé ou non ont montré qu’il n’y avait qu’une faible

participation de la flore indigène au processus de réduction du chrome. Ce résultat n’est pas surprenant

compte tenu du fait que la microflore indigène n’est pas adaptée à la présence de chrome. En effet, le sol

initial n’était pas pollué au Cr(VI). Les auteurs (Salunkhe et al., 1998) ont ensuite testé la capacité d’un sol

traité par la souche Pseudomonas mendocina à permettre la germination et la croissance de blé (Triticum

vulgare). Le sol non contaminé et le sol contaminé non traité ont servi de témoins pour comparaison.

En deux semaines, sur le sol pollué non traité, les pousses de blé sont mal formées et chlorotiques, alors

que sur le sol pollué mais traité le blé est comparable à celui du sol témoin non pollué et les nouvelles

graines sont saines.

Le traitement biologique du sol permettrait d’immobiliser le chrome dans le sol et de le détoxifier par

réduction en chrome (III), complexation de celui-ci avec des molécules organiques et précipitation sous

forme d’hydroxydes.


72




73


1.Sol pollué et méthodes analytiques

1.1. Origine

Un sol de l’agglomération lyonnaise a été choisi pour cette étude. Il fait partie des sites contaminés

recensés en 1994 par les directions régionales de l’industrie, de la recherche et de l’environnement. Sur ce

site avaient été entreposés des fûts contenant des effluents chromés qui provenaient d’une industrie de

traitement de surface. Après la cessation d’activité de cette entreprise, les fûts ont été abandonnés sur ce

terrain. D’importantes fuites de ces containers ont conduit à une pollution localisée du site.

Aujourd’hui, à l’endroit où les fûts avaient été stockés, aucune végétation n’est visible. Le sol du site

pollué est constitué d’un horizon de surface limono-argileux d’une profondeur de 30 cm qui repose sur

une couche argileuse plastique très compacte d’environ 2 m d’épaisseur. C’est la partie superficielle, entre

0 et 30 cm qui a été prélevée, homogénéisée à la main, séchée à température ambiante pendant 24 heures,

tamisée à 2 mm et stockée à 4°C. Dans le cadre du contrat avec l’ADEME, ce sol a été appelé sol S3.

En 1996, les analyses par spectrophotométrie d'absorption atomique des métaux lourds présents dans

le sol avaient révélé une forte pollution en Cr, Ni, Pb, Zn et Cu. Les résultats d’analyses effectuées sur le

premier échantillonnage sont présentés dans le Tableau XVI.

Tableau XVI : Quantité de métaux lourds dans le sol exprimée mg.kg-1 de matière sèche

(Radovic, 1996). Extraction séquentielle (procédure de Tessier (1979)).

Métaux (mg.kg-1) Cd Cr Cu Fe Pb Ni Zn

Fraction échangeable 3 2195 4 5 14

35 2

Fraction liée aux carbonates 3 1174 36 29 19 170 45

Fraction liée aux oxydes de Fe et Mn 3 3680 224 1865 57 3010 239

Fraction liée à la matière organique

1 2076 173 88 12 811 205

Résidu 4 3491 115 33482 4557 1104 341

Total 14 12616 552 35469 4659 5131 832


74


Cette zone anciennement protégée de la pluie par un auvent est aujourd'hui à l'exposition des

intempéries suite à la chute de cet auvent. Ceci explique les différences de teneurs en chromate obtenues

en 1999 lors d’un deuxième prélèvement (Gendrault, 1999), bien plus faibles par rapport à celles obtenues

lors des prélèvements des années précédentes. Aujourd'hui, on suppose que la majorité du chrome (VI),

très soluble dans l'eau, est passée dans les couches inférieures du sol par lessivage.

1.2. Prélèvement du sol et re-contamination en chrome (VI)

Un nouveau prélèvement a été effectué sur ce même sol dans le cadre de cette étude. Les cinquante

kilogrammes prélevés ont été homogénéisés à la main, séchés à température ambiante pendant 3 jours,

puis tamisés à 2 mm.

On effectue un tamisage secondaire sur la totalité de l’échantillon prélevé sur le site soit environ 35 kg.

Pour cela, le sol est déversé sur une bâche en plastique dans une salle ventilée au sol plan bétonné. Après

séchage pendant 12h en couche mince à température ambiante, les sols sont homogénéisés par brassage

manuel.

Les analyses du chrome (VI) présent dans le sol S3 (Gendrault, 1999) nous donnent des

concentrations de l’ordre de 30 à 80 mg de chrome (VI) par kg de sol soit des concentrations nettement

inférieures à celles obtenus en 1996. Etant donné la difficulté à disposer d’un nouveau site de prélèvement

correspondant à ce type de pollution, nous avons alors pris la décision, en accord avec l’ADEME et

POLDEN, de polluer artificiellement le sol prélevé en 1999 afin d’obtenir une concentration en chrome

(VI) proche de celle mesurée en 1996. Pour cela, le chrome (VI) est apporté sous la forme d’une solution

de bichromate de potassium (K2Cr2O7)

Trois niveaux de pollution :

[Cr (VI)] = 300 mg.kg-1 de sol sec (extraction alcaline),

[Cr (VI)] = 1108 et 1216 mg.kg-1 de sol sec (extraction eau ou alcaline, respectivement),

[Cr (VI)] = 2000 et 2300 mg.kg-1 de sol sec (extraction eau ou alcaline, respectivement).

Le sol est ensuite tamisé et quarté en aliquotes de sol de 250 g par pelletage alterné. Le taux d’humidité

du sol S3 a été déterminé par mesure du poids sec (étuve 105°C pendant 24h). L’échantillonnage

secondaire permet de préparer les aliquotes de sol de masse réduite et représentatif de l’échantillon initial

pour les essais d’extraction du chrome (VI) et les essais de bio-immobilisation.


75


1.3. Extraction du chrome (VI) contenu dans le sol

1.3.1.Extraction par l’eau

100 mL d’eau distillée sont ajoutés à 5 g de sol (humide ou sec selon les cas) et mis à agiter dans un

Erlenmeyer. Le mélange est agité pendant 10 heures à 120 rpm à l’obscurité à 30°C puis récupéré et

centrifugé à 3000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est récupéré et le chrome (VI) dosé par la méthode

spectrophotométrique au diphénylcarbazide (voir page 76).

1.3.2.Extraction par une solution alcaline

Afin d’éviter la réduction du chrome (VI) en chrome (III) qui pourrait se produire avec la méthode

d’extraction par l’eau, une extraction par une solution alcaline (Na2CO3 0.28M NaOH 0.5M pH 11.8) sera

effectuée sur certains échantillons. A 5 g d’échantillon sont ajoutés 80 mL de la solution alcaline. La

suspension est mélangée énergiquement à la main pendant 5 minutes et ensuite placée à l’obscurité à

température ambiante pendant 1 heure. Le volume final est ajusté à 100 mL, le mélange est ensuite

centrifugé à 3000 g pendant 10 minutes. Le chrome (VI) est dosé par la méthode spectrophotométrique au

diphénylcarbazide (voir page 76).

1.4. Dosage du chrome et du cuivre Cu2+

1.4.1.Dosage du chrome (VI)

Le dosage du chrome (VI) se fait grâce à une réaction colorimétrique avec du diphénylcarbazide. Le

mélange réactionnel a un maximum d’absorption à 540 nm. Nous avons d’abord vérifier que les milieux

utilisés n’absorbaient pas ou peu à cette longueur d’onde. Ensuite il fallait s’assurer que l’absorbance des

échantillons purs ou dilués était comprise dans une gamme où l’absorbance est directement

proportionnelle à la concentration en chrome (VI). Pour pouvoir appliquer la loi de Lambert-Beer

(Abs540 nm = ε540 nm.l.c où ε est le coefficient d’extinction molaire, l la longueur de la cuve et c la

concentration de la solution) les concentrations ne doivent pas être supérieures à 10 µM. Nous avons

vérifié que la relation entre l’absorbance et les concentrations était bien linéaire dans cette gamme

(0 à 10 µM). Les échantillons dont la concentration est de l’ordre de 1 mM de Cr(VI) ont été dilués au

1/200. Le domaine d’incertitude est de l’ordre de 2,5 %.


76


Une absorbance à 540 nm d’un échantillon à 5 µM est en général de 0,200 ± 0,005. Ces 0,005 unités

de densité optique représentent 0,12 µmole soit 2,5 % de la concentration initiale. Si bien sûr on travaille

avec des échantillons moins concentrés en chrome, il convient de réajuster la dilution de manière à lire une

absorbance comprise entre 0,100 (5% d’erreur) et 0,200 (2,5 % d’erreur).

Le milieu minéral M63 contient du Fe2+ qui peut réduire le chrome hexavalent. Nous avons donc

vérifié que la réduction du chrome (VI) par le fer Fe2+ était négligeable de manière à attribuer le

phénomène de réduction à un phénomène biologique et non pas simplement chimique. A la concentration

de 3,2 µM, le Fe2+ présent ne permet pas d’observer une réduction significative même si l’on incube

l’échantillon stérile pendant une quinzaine de jours. En effet, si tout le Fe2+ réagit avec le chrome (VI), il

reste 0,9968 mM, soit 99,7 % du chrome présent et nous nous situons dans le domaine d’incertitude de

l’analyse colorimétrique.

La solution de diphénylcarbazide est composée de la façon suivante : 0,3 g de Diphénylcarbazide mis

en solution dans un volume final de 100 mL d’éthanol 95 %. Cette dissolution s’effectue à l’obscurité

pendant 15 minutes. Cette solution est complétée à 500 mL avec de l’acide sulfurique à 176 g.L-1. Cette

solution est stockée à 4°C pendant 1 mois.

1.4.2.Dosage du chrome total

Pour déterminer le chrome total contenu dans un échantillon, le chrome est converti en chrome (VI)

par oxydation avec l’hypobromite de lithium en condition acide et en présence de pyrosulfate de

potassium. Ensuite, le chrome (VI) est dosé avec le diphénylcarbazide (voir ci dessus).

1.4.3.Dosage du cuivre Cu2+

Le dosage du cuivre Cu2+ se fait grâce à une réaction colorimétrique avec du 2-2 biquinolyle. Le

mélange réactionnel a un maximum d’absorption à 546 nm. 1 mL d’échantillon à analyser est introduit

dans un tube en verre contenant 0,1 g de chlorydrate d’hydroxylamine et 0,1 g d’acétate de sodium. Puis

1 mL de solution de 2-2 biquinolyle (0,2 g.L-1 dans de l’alcool amylique) est ajouté. Le mélange est agité

puis après séparation des 2 phases, on récupère la phase supérieure de coloration rose-mauve qui contient

les ions Cu2+ compléxés avec le 2-2 biquinolyle. La gamme étalon est réalisée avec des solutions de CuSO4

dont les concentrations sont comprises entre 0,8 et 20 µM.


77


1.5. Humidité résiduelle des échantillons de sol

Une quantité connue de sol est séchée à 105 °C pendant environ 24 heures (temps nécessaire en

moyenne pour que la masse sèche soit constante). La différence entre la masse avant séchage et après

séchage permet de déterminer la quantité d’eau présente dans le sol analysé.

2.Milieux de culture

Les milieux de cultures doivent contenir une source azotée, une source carbonée, une source de

phosphore et de soufre et éventuellement des facteurs de croissance. De manière générale, les milieux de

culture sont stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes et conservés ensuite à température

ambiante. Deux cas sont possibles : ou la totalité des composés peut être autoclavée en même temps sous

forme de mélange, ou bien certains doivent être ajoutés après autoclavage d’un mélange initial. Les

composés qui doivent être ajoutés après l’autoclavage sont signalés par un astérisque *. Les antibiotiques,

lorsqu’ils sont ajoutés directement dans le milieu, sont introduits après autoclavage et refroidissement du

milieu. Il est possible de les ajouter sur les boîtes de Petri déjà coulées et solidifiées en ajoutant 1 mL d’une

solution concentrée que l’on répartit de manière homogène sur toute la surface de la boîte. Celle-ci est

mise à sécher sous la hotte à flux laminaire jusqu’à pénétration totale du liquide dans la gélose

(environ 30 min).

Deux types de milieux minéraux ou milieux minima ont été testés pour observer le phénomène de

réduction. Ces milieux permettent un bon développement bactérien de la souche étudiée (Streptomyces

thermocarboxydus NH50) mais beaucoup moins rapide qu’en milieu riche. Ces milieux ont l’avantage de ne

contenir que des minéraux et une seule source de carbone qui n’interfèrent pas dans les dosages. De plus

l’appréciation visuelle de la réduction du chrome (disparition de la couleur jaune) est beaucoup plus facile

dans un milieu incolore et translucide que dans un milieu riche de couleur marron.

2.1. Milieux liquides

2.1.1.Milieu M63

Le milieu minéral synthétique utilisé est couramment appelé au laboratoire M63. Sa composition est la

suivante : KH2PO4 0.1 M, (NH4)2SO4 15 mM, FeSO4 3.2 µM, MgSO4 1.6 mM, thiamine 0.0001 % ;

pH ajusté à 6.8 avec KOH 6 M).


78


Préparé de la manière suivante pour 1 litre :

KH2PO4 13,6 g ; (NH4)2SO4 (solution à 20%) 10,0 mL ; MgSO4, 7 H2O (solution à 20%) 1,0 mL ; FeSO4, 7 H2O (solution à 0,1%) 1,0 mL ; KOH (solution à 130 g.L-1) 8,3 mL ; Thiamine (solution à 0.05 %) 1,0 mL

Ce milieu est translucide et n’absorbe pas à 540 nm (longueur d’onde utilisée pour le dosage du

chrome). On y ajoute une source de carbone. Selon les cas, il s’agit de glucose* (noté G) à la concentration

finale de 10 g.L-1 ou de glycérol (noté Y) à 3 g.L-1.

2.1.2.Milieu VB (Vogel-Bonner)

Ce milieu minéral avait été utilisé par Nathalie Huck pendant son DEA. Il est obtenu en mélangeant

deux solutions S1 et S2 volume à volume après autoclavage.

S1 est une solution de glucose à 15 g.L-1 et S2 est préparée de la manière suivante (pour 1 litre) :

K2HPO4 20 g ; Na2HPO4, 12 H2O 12 g ; NH4Cl 1,8 g ; MgSO4, 7 H2O 0,4 g ; Acide citrique 4 g

Les milieux riches sont utilisés en général pour obtenir de grande quantité de cellules rapidement

(1 ou 2 jours).

2.1.3.Milieu LB (Luria Broth)

Composition pour 1 litre

Bactotryptone 10 g ; Extrait de levure 5 g ; NaCl 5 g Le pH est ajusté à 7 avec de la soude.

L’ensemble des constituants est solubilisé dans l’eau déminéralisée en chauffant le mélange jusqu’à

ébullition pour obtenir un milieu limpide.


79


2.1.4.Milieu PEG

Ce milieu a été utilisé principalement par N. Huck pendant son DEA. C’est un milieu riche très

proche du milieu LB. Il contient (pour 1 litre)

Bactopeptone 10 g ; Extrait de levure 5 g ; Glucose 3 g

2.1.5.Milieu YEME (Yeast Extract Malt Extract)

Ce milieu très riche, spécifique des Streptomyces (Hopwood, 1985).

Composition pour 1 litre

Bactopeptone 5 g ; Extrait de levure 3 g ; Extrait de malt 3 g ; Saccharose 340 g

Ce milieu est très riche en saccharose et permet de récupérer des mycéliums peu compacts. Le milieu

YEME est utilisé pour la préparation de protoplastes de Streptomyces.

2.2. Milieux solides

2.2.1.M63 et LB

Les milieux M63 et LB peuvent être solidifiés par de l’agar-agar ou gélose à 1,5 %. Cet agar-agar

permet au milieu de prendre en masse. C’est un polygalactoside qui n’est pas dégradé pas les bactéries en

général. Cependant, les Streptomyces ont la particularité de synthétiser plusieurs agarases ce qui permet un

ancrage des colonies dans la gélose. Après remplissage, les boîtes de Petri sont séchées pendant

15 minutes à l’étuve à 50°C. Elles sont stockées en chambre froide à 4°C pendant 2 à 3 semaines.


80


2.2.2.R5

Un autre milieu solide appelé R5 a été utilisé pour permettre la sporulation des Streptomyces.

Composition pour 1 litre :

Agar-agar 22 g ; Saccharose 103 g ; K2SO4 0,25 g ; MgCl2, 6H2O 10,12 g ; Casaminoacides 0,1 g ; Solution d’éléments traces 0,2 mL ; (ZnCl2 0.3 mM, FeCl3·6H2O 0.75mM, CuCl2·2H2O 60 µM, MnCl2·4H2O 50 µM, Na2B4O7·10H2O 27.5 mM,

(NH4)6Mo7O24·4H2O 8 µM)

Extrait de levure 5 g ; TES 5,73 g (acide N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonique ; acide 2-[(2-hydroxy-1,1-bis[hydroxymethyl]ethyl)amino]ethanesulfonique)

Ce mélange est chauffé, porté à ébullition pour permettre une dissolution complète de tous les

constituants. Après autoclavage et avant de couler les boîtes de Petri, on ajoute dans ce milieu les

composés suivants (pour 1 litre)

KH2PO4* (0,5 %) 5 mL CaCl2* (5M) 2 mL L-proline* (20 %) 7,5 mL Glucose* (40 %) 25 mL NaOH* (1N) 3,5 mL


81


2.2.3.NE

Ce milieu a été utilisé pour tester la sensibilité des souches de Streptomyces à certains antibiotiques

Composition pour 1 litre:

Agar-agar 20 g ; Glucose 10 g ; Casaminoacides 2 g ; Extrait de levure 2 g ; Extrait de viande 1 g.

2.2.4.Ajout des antibiotiques

Les antibiotiques peuvent être ajoutés dans les milieux solides (généralement R5) de 2 manières : soit

directement dans le milieu liquéfiés par chauffage après refroidissement et avant le coulage des boîtes, ou

alors, après avoir coulé les boîtes et étalé des bactéries en ajoutant 1 mL d’une solution concentrée

d’antibiotiques sur les 25 mL de milieu solidifié. Dans ce cas, les boîtes sont mises à sécher sous la hotte à

flux laminaire.

3.Isolement de Streptomyces thermocarboxydus NH50

3.1. Isolement de la souche réductrice (effectué par N. Huck en 1997)

La souche bactérienne capable de réduire le chrome (VI) en chrome (III) a été isolée au laboratoire en

1997. Une suspension de sol contaminé a été enrichie en micro-organismes réduisant les chromates. Ces

micro-organismes ont été isolés sur boîte de Petri et testés séparément pour leur aptitude à réduire le

chrome.

Etape d’enrichissement : 2,5 g de sol avaient été incubés avec 100 mL de milieu minimum VB

complémenté en glucose. Après 10 jours d’incubation à 30°C sous agitation, 100 % du chrome (VI)

avaient été réduit. Cette culture a été utilisée pour ensemencer d’autres essais contenant 2,5 g de sol et

100 mL de milieu minimum. Ces essais « enrichis » ont permis d’obtenir une réduction de 99 % en 3 jours.

L’isolement à été effectué à partir de la suspension contenue dans ces essais par étalement sur boîte de

Petri contenant un milieu riche et 1 mM de chrome (VI).


82


Les boîtes ont été incubées pendant 4 jours à 30°C. 3 types de colonies ont été obtenus par cette

méthode. Chaque type de micro-organisme a été ré-isolé plusieurs fois sur de nouvelles boîtes afin de

disposer de souches pures. 100 mL de milieu minimum VB liquide avec du glucose contenant 1 mM de

chrome ont été de nouveau inoculés avec chacun des isolats. Dans la moitié des essais, 5 g de sol

autoclavés au préalable ont été ajoutés. Un des isolats, en présence de sol, a permis d’observer une

réduction de 96 % du chrome en trois jours. C’est cet isolat qui a été utilisé pour l’étude de la bio-

réduction du chrome. Cet isolat a été appelé NH50.

3.2. Identification

L’identification de la souche réductrice a été effectuée par le laboratoire de John Willison au CEA de

Grenoble. Le principe est le suivant : l’ADN total de la souche bactérienne est extrait et des amorces

complémentaires de la région codant l’ARN ribosomique 16S sont ajoutés à la préparation après

dénaturation de l’ADN. Cette étape de dénaturation permet aux amorces d’aller s’hybrider avec la

séquence qui leur est complémentaire. Grâce à une enzyme appelée ADN polymérase la région codant

l’ARN 16 S est amplifiée. Ce morceau d’ADN amplifié (en grand nombre de copies) est utilisé pour être

séquencé. La séquence nucléotidique est ensuite analysée et comparée aux banques de données disponibles

sur internet. L’analyse a révélé que la séquence codant l’ARNr 16S de la souche NH50 était à 99,9 %

identique à celle d’une souche de Streptomyces thermocarboxydus.

4.Bactéries et techniques microbiologiques et biochimiques

4.1. Transformation d’Escherichia coli NM522

La souche NM522 est cultivée à 37°C pendant la nuit. Cette pré-culture est utilisée pour ensemencer

5 mL de milieu LB. La culture est mise à agiter à 37°C jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm soit comprise

entre 0,3 et 0,4. Pour une transformation, 1 mL de cette culture est centrifugée à 4000 rpm pendant 2 min

à température ambiante, le surnageant est éliminé et les cellules resuspendues dans 0,1 mL de tampon TSS

froid. (Chung et al., 1989). Le tampon TSS (Transformation Storage Solution) est composé de PEG 3350

10 %, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM et DMSO 5 % dans du milieu LB. L’ADN (0,1 µg) est mis en

contact avec les bactéries compétentes pendant 5 à 30 min sur la glace. Le volume final de la suspension

est ajusté à 1 mL avec du tampon TSS et le mélange incubé 1 heure à 37°C. Des aliquotes de ce mélange

sont étalés sur des boîtes LB contenant un antibiotique (pour la sélection des clones ayant été transformés

par le plasmide). Le rendement attendu est de 105 à 106 UFC par µg d’ADN.


83


4.2. Streptomyces

4.2.1.Préparation du stock de spores

10 mL d’eau stérile sont déposés sur une boîte de Petri contenant du milieu R5 ensemencée par une

souche de Streptomyces et incubée pendant 5 à 7 jours jusqu’à sporulation des bactéries (pellicule grise ou

blanche facilement détachable à la surface du tapis cellulaire ou des clones isolés). La surface de la boîte

est grattée avec la pointe d’une pipette. La suspension est placée ensuite dans un tube à essai stérile et

vortexée 1 min. environ. La suspension est ensuite filtrée sur du coton stérile placé dans une seringue

stérile de 10 mL pour éliminer les morceaux d’agar. Le filtrat est centrifugé 5 min à 5000 rpm et les spores

resuspendues dans 1 mL de glycérol 20%, pour être conservées au congélateur à –20°C ou dans 1 mL

d’eau stérile dans le cas d’une utilisation immédiate.

4.2.2.Cultures

Les milieux liquides sont ensemencés avec des spores de Streptomyces. Les cultures sont réalisées dans

des Erlenmeyers de 250 mL contenant 50 mL de milieu liquide ou dans des tubes contenant 5 mL de

milieu. Les cultures sont incubées en chambre thermostatée à 30°C à l’obscurité sous agitation orbitale

d’environ 120 rpm. Le chrome est apporté sous forme de chromate (K2CrO4) à partir d’une solution mère

à 1 M. La dilution est de 1/1000 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. Cette dilution très faible

permet de ne pas modifier la concentration des minéraux composant les milieux liquides. Le cuivre est

apporté dans les cultures ou dans les surnageants de culture sous forme de CuSO4 ou de CuCl2 à partir de

solutions stock 100 mM. Une dilution au 1/1000 permet d’obtenir une concentration finale de 0,1 mM.

4.2.3.Préparation de protoplastes de Streptomyces

100 mL de milieu YEME auxquels ont été ajoutés 0,5 mL de MgCl2 6H2O sont inoculés avec 1 mL de

spores fraîches pendant 40 heures à 30°C. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 3000 rpm

pendant 10 minutes à 4°C. Si les cellules ont du mal à sédimenter, le milieu de culture est dilué par 2 avec

de l’eau stérile. Le tampon P est préparé comme suit : pour 80 mL de saccharose 10,3 % on ajoute 1 mL

KH2PO4 0,5 %, 5 mL CaCl2 (0,5 M), 10 mL TES 0,25 M pH 7,2. Le tampon P complet est filtré à 0,2 µm

et refroidi à 4°C. Le culot de cellules est lavé 2 fois avec du saccharose 10,3 % froid. Après le dernier

lavage, les cellules sont resuspendues dans 36 mL de tampon P complet auquel on ajoute 10 mL d’une

solution de lysozyme à 10 mg.L-1. L’incubation se fait à 37 °C pendant au moins une heure. On peut

suivre la disparition du mycélium au microscope. Lorsque ceux ci sont bien désagrégés, les protoplastes et

le mycélium restant sont filtrés sur du coton hydrophile mouillé avec du tampon P glacé contenu dans des

seringues sans mettre le piston. Les protoplastes sont alors centrifugés lentement et doucement en évitant


84


tout choc thermique qui pourraient entraîner leur lyse. La centrifugation à 2700 rpm dure 7 minutes. Ils

sont lavés une fois avec du tampon P glacé et repris au final dans 10 mL de tampon P. Ce lavage sert à

éliminer le lysozyme. Des aliquotes de 200 µL sont préparées, le reste est jeté. Si des dilutions sont

nécessaires, elles s’effectuent au tampon P ou au saccharose 10,3 % froid. Les protoplastes peuvent être

congelés à –80°C en procédant au préalable à une congélation à –20°C pendant une nuit.

4.2.4.Transformation des protoplastes

Les protoplastes, s’ils sont congelés, sont décongelés très rapidement en passant les eppendorfs sous

de l’eau chaude. Ils sont centrifugés à 1500 g pendant 7 min. et repris dans 100 µL de tampon P. On

ajoute la solution d’ADN (qui doit représenter moins de 10 % du volume pour éviter une lyse des

protoplastes, 5 µL en général) puis immédiatement 0,4 mL de PolyEthylène Glycol 1000 (PEG 1000 de

NBS Biological) à 25 % dans du tampon P, préalablement fondu au four à micro-ondes pendant

9 secondes puis filtré sur filtre 0,2 µm. A l’aide de la pipette, le tout est mélangé en aspirant et en refoulant

très doucement pendant 2 min. Le contenu du tube Eppendorf est ensuite déposé sur une boîte R5 sèche

et étalé en évitant d’utiliser un râteau (en agitant la boîte). Les boîtes sont mises à sécher sous la hotte à

flux laminaire pendant une quinzaine de minutes puis incubées à 30°C pendant une nuit. L’antibiotique est

ajouté sur la boîte le lendemain et les boîtes sont de nouveau incubées à 30°C.

4.2.5.Conjugaisons

Deux protocoles de conjugaison ont été utilisés.

Protocole A. conjugaison avec pré-germination. 1 mL d’une suspension de spores de chacune des

2 souches (receveuse et donneuse) est centrifugé. Les spores sont resupendues dans 1 mL de tampon TES

(N-[hydroxymethyl]-2-aminoéthane-acide sulfonique) 0,05 M. Après homogénéisation le volume est ajusté

à 5 mL avec du tampon TES et le tube est placé à 50°C pendant 10 minutes puis retiré et placé sur la

glace. 5 mL de milieu de pré-germination (extrait de levure 10 g.L-1, casaminoacides 10 g.L-1, CaCl2 0,01 M

ajouté après autoclavage à partir d’une solution 2,5 M) sont ajoutés. Après une incubation d’1 h 30 à 37°C,

la suspension est centrifugée et les cellules sont lavées et resuspendues dans 1 mL de tampon TES 0,05 M.

Dans des tubes Eppendorfs stériles, 200 µL d’un mélange (v/v) de la suspension pure ou diluée (10-2, 10-4)

de chacune des souches sont mis en contact pendant 5 heures à 37°C. Le mélange est ensuite déposé sur

une boîte de Petri LB 5 mM de Cr(VI) et réparti sur toute la surface. Les boîtes sont mises à sécher sous la

hotte à flux laminaire pendant 30 minutes puis à incuber à 30°C pendant 1 nuit. Le lendemain,

l’antibiotique est ajouté (thiostrepton 10 µg.mL-1 ou chloramphénicol 50 µg.mL-1 pour les croisements

avec les souches S. albus hsp18::tsr et TK24 respectivement). Les boîtes sont alors incubées à 30°C pendant

3 à 5 jours.


85


Protocole B : le principe est de mettre en contact directement les spores. 100 µL de spores de chacune

des souches (donneuse et receveuse) sont mises en contact et étalés sur milieu R5 non sélectif. Les boîtes

sont incubées à 30°C jusqu’à sporulation. Les spores de ce mélange sont récupérées selon le protocole de

préparation d’un stock de spores. Le mélange est étalé à différentes dilutions sur le milieu sélectif (chrome

+ antibiotique correspondant).

4.3. Electrophorèse en champ pulsé

Ces expériences ont été réalisées au laboratoire de Génétique et Microbiologie - UMR INRA 1128 -

IFR 110 à Vandoeuvre-les-Nancy dans l’équipe du Professeur Pierre Leblond.

4.3.1.Préparation des « inserts » (« plugs »)

Le mycélium est récupéré par centrifugation d’une culture de 48 h en YEME à 30°C. Les cellules sont

resuspendues dans du tampon SucTE (saccharose 10,3 %, Tris HCl (pH 8) 10 mM, EDTA 1 mM). La

densité optique à 600 nm est ajustée à 2,0 après avoir mélangé dans un volume équivalent de LMPA

1,5 %.

4.3.2.Traitement des « inserts »

Les inserts sont incubés à 37°C pendant 6 à 12 h dans une solution de TE-lysozyme (Tris HCl (pH 8)

10 mM, EDTA 1 mM, lysozyme 2 mg.mL-1). Les inserts devenus blancs à cette étape sont ensuite incubés

pendant 2 fois 12 heures à 50°C dans une solution contenant du SDS 1 % (w/v) et de la pronase E

5 mg.mL-1. Les inserts, devenus transparents, sont rincés pendant 4 heures à température ambiante dans

du tampon TE (Tris HCl (pH 8) 10 mM, EDTA 1 mM) et sont ensuite stockés à 4°C. Les inserts, qui ne

sont pas traités par protéinase, sont incubés dans une solution contenant du SDS 2 %. Le reste de la

procédure reste inchangé.

4.3.3.Electrophorèse

L’électrophorèse en champ pulsé est réalisée dans une cuve system CHEF (Biorad) en gel d’agarose

entre 0.8 et 1 % (w/v) dans un tampon TBE (Tris-Acide Borique-EDTA) 0,5 X ou TAE (Tris-Acide

Acétique-EDTA) 0,5 X. Les tampons sont préparés concentrés : TAE 50 X : trizma base 242 g.L-1, acide

acétique 57,1 mL.L-1 et EDTA pH 8 0,05 M. et TBE 10 X : trizma base 108 g.L-1, Acide borique 27,5 g.L-

1, EDTA pH8 0,02 M. L’ADN concatémère du phage λ est utilisé comme standard de taille.


86


5.Etude des molécules réductrices dans les surnageants de cultures

5.1. Récupération des surnageants

Des cultures de Streptomyces de plusieurs jours (entre 10 et 15 jours en général) sont utilisées pour

récupérer le surnageant. Si la concentration initiale en Cr(VI) (à j = 0) dans la culture était de 1 mM, le

surnageant est appelé SCr. S’il n’y a pas eu de chrome dans la culture, le surnageant est appelé S. Les

cultures sont transvasées dans les tubes de 50 mL et après dépôt des mycéliums au fond des tubes

(environ 30 min), la phase liquide est récupérée dans un nouveau tube de 50 mL en prenant soin de ne pas

prélever de mycélium. Les échantillons, débarrassés d’un maximum de leurs bactéries, sont alors

centrifugés à 2000 g pour culoter les derniers mycéliums encore présents. Cette méthode permet d’éviter la

lyse cellulaire. Ainsi dans les surnageants que nous récupérons, ne seront présentes que les molécules

excrétées et non celles contenues dans le cytoplasme de cellules avant la lyse.

Les surnageants obtenus sont alors filtrés sur filtre Millipore 0,22 µm qui permet de les stériliser. Les

surnageants sont conservés à 4 °C après cette étape de filtration. Juste avant utilisation, les concentrations

en Cr(VI) sont ajustées : s’il s’agit d’un surnageant SCr, la concentration en Cr(VI) est mesurée, la

concentration initiale réajustée à environ 1 mM, puis de nouveau mesurée pour connaître exactement la

concentration en Cr(VI) présente. S’il s’agit d’un surnageant S, le Cr(VI) est ajouté puis sa concentration

mesurée. Les surnageants sont ensuite aliquotés pour les expérimentations.

5.2. Lyophilisation des surnageants

Après filtration du surnageant, 50 mL de S ou SCr sont placés dans une boîtes de culture cellulaire.

Les boîtes contenant les surnageants sont placées à –80°C dans une position permettant d’obtenir une

surface de liquide congelé maximale pour optimiser la lyophilisation. Les boîtes (au maximum 5 par

lyophilisation) contenant les surnageants congelés sont placées dans le lyophilisateur (appareil MODULO

modèle EDWARDS). L’ouverture des boîtes est obturée par du parafilm percé de petits trous. La pression

diminue pour atteindre, après quelques heures, la valeur de 3.10-2 bars et la température du système est

abaissée à –55°C.

Les échantillons sont récupérés après 2 jours. Les surnageants lyophilisés sont récupérés sous forme

de poudre blanche.


87


Figure 5 : Boîte de culture cellulaire contenant le surnageant SCr après lyophilisation.

5.3. Fractionnement des surnageants lyophilisés

Après lyophilisation, les surnageants sont resuspendus dans un volume d’eau dix fois plus petit que le

volume initial. Les constituants des surnageants sont alors fractionnés en fonction de leur masse

moléculaire en utilisant MACROSEPTM 3kDa et MACROSEPTM 1 kDa de Pall Gelman. Ces tubes

contiennent une membrane qui ne laisse passer que les molécules dont la masse moléculaire est inférieure

à 3000 et 1000 Daltons respectivement. Dans le réservoir, nous récupérerons les molécules qui n’ont pas

pu passer la membrane pendant la centrifugation. Le volume des deux phases liquides récupérées est alors

ajusté au volume initial placé dans le réservoir de façon à ne pas les concentrer. Le protocole d’utilisation

suivi est celui donné par Pall Gelman avec une modification : le temps centrifugation. En effet le temps

indiqué par le fournisseur n’était pas suffisant pour obtenir un volume égal à la moitié du volume initial

dans la partie inférieure du MACROSEPTM même si le liquide placé dans le réservoir était de l’eau distillée.

Par conséquent toutes les centrifugations ont été réalisées pendant au moins 6 heures.

5.4. Dosage des protéines contenues dans les surnageants par la

méthode de Bradford

Le bleu de Coomassie existe sous trois formes (anionique bleu λ max : 595 nm, neutre vert λ max =

650 nm et cationique rouge λ max = 470 nm). C’est la forme anionique qui se lie préférentiellement aux

protéines. La méthode de Bradford est basée sur le déplacement du maximum d’absorption de 470 à

595 nm d’une solution bleu acide de Coomassie G250 lorsque le colorant se fixe aux protéines.


88


Pour chaque série de dosage, il est nécessaire d’établir un gamme étalon γ-globuline comprise entre 0,2

mg.mL-1 et 1,4 mg.mL-1.

Le dosage s’effectue sur des prises d’essai de 20 µL, complété avec 980 µL de réactif (dye reagent dilué

au 1/5 filtré sur 0,2 µm conservé à 4°C pendant 15 jours). La lecture des absorbances se fait à 595 nm

entre 5 et 60 min après le début de la réaction.

5.5. Résonance Magnétique Nucléaire du carbone

Ces expériences ont été réalisées au laboratoire de Résonance Magnétique en Biologie Moléculaire

dirigé par le professeur Claude Roby (CEA Grenoble).

Le spectromètre Bruker AMX 400 est équipé d’une tête de mesure large bande pour des tubes d’un

diamètre de 10 mm. La fréquence utilisée pour les spectres du carbone est de 100,6 MHz. La séquence

répétée plusieurs fois pour obtenir le spectre contient une impulsion de 40° (soit une durée de 8,3 µs =

P1), un délai de relaxation de 0,278 s appelé D1. Le signal (sinusoïdale amorite = FID) est obtenu en

répétant 1000 fois la séquence P1 + D1.

Les échantillons contiennent une référence éthanol dans du MDP (Méthylène Diphosphorique Acide)

contenu dans un fin capillaire. Un des carbones de l’éthanol résonne à 58,24 ppm en présence de MDP.

La fréquence de résonance des pics observés dans le spectre carbone d’une fraction du surnageant SCr a

été comparé à une base de données disponible au laboratoire où ont été réalisées ces expériences.

La liste des molécules et la fréquence de résonance des carbones les composants est donnée en annexe.


89


6.Procédures expérimentales d’étude de la réduction du Cr(VI) en

présence de sol

6.1. Milieu dispersé (« batch »)

Les expériences en batch sont réalisées en Erlenmeyer de 250 mL avec des quantités variables de sol

pollué avec du Cr(VI) et de milieu liquide M63 contenant une source de carbone. Le glycérol est utilisé à la

concentration finale de 3 g.L-1 et le glucose à 10 g.L-1, sauf indication contraire. Si les concentrations en

glucose utilisées sont supérieures à 10 g.L-1, le glucose est apporté sous forme de poudre directement dans

le sol. La concentration en chrome (VI) en solution est suivie par prélèvement en condition stérile d’un

échantillon liquide qui est ensuite centrifugé pour sédimenter les particules de sol. La quantité de chrome

(VI) total restant dans les échantillons est déterminée par extraction à l’eau.

Si le sol apporté doit être stérile, il est au préalable autoclavé 2 fois à 120°C pendant 20 minutes.

L’enrichissement par la flore endogène s’effectue en ajoutant dans un nouvel essai 5 mL d’un essai en

batch où le chrome (VI) a été réduit.

L’apport de souches bactériennes exogènes (Streptomyces thermocarboxydus NH50 et Pseudomonas fluorescens

LB300) peut s’effectuer sous forme de spores (400 µL d’une suspension stock soit 0,4 109 spores) ou de

mycéliums pour NH50 ou à partir d’une préculture pour la souche LB300. Les mycéliums de la souche

NH50 sont obtenus après une culture de 50 mL de 2 jours en milieu LB. Ils sont ensuite récupérés par

centrifugation à 2000 g, lavés avec du milieu M63 et resuspendus dans un volume de 100 mL de M63.

La préculture de Pseudomonas fluorescens LB300 est obtenue en une nuit dans le milieu LB. 7 mL de cette

pré-culture servent à ensemencer 93 mL de milieu liquide.

6.2. Microcosmes

Les expériences en microcosmes sont réalisées dans des boîtes de Petri en verre avec des quantités

variables de sol pollué avec du chrome (VI). L’incubation a lieu à 30°C à l’obscurité. Les sels minéraux

((NH4)2SO4 et NaHPO4) sont apportés sous forme de poudre et mélangés au sol ou sont apportés en

solution dans le milieu M63. Le glucose est aussi apporté sous forme de poudre lorsque la concentration

testée est supérieure à 10 g.L-1.


90


6.3. Lysimètres

Les lysimètres sont des casiers en PVC de 50 cm sur 30 cm dans lesquels nous avons placé 2 ou 3 kg

de sol pollué. La couche de sol est répartie en couche d’épaisseur uniforme sur un géotextile qui permet

d’éviter l’entraînement des fines particules de terre. La surface du sol est arrosée grâce à trois asperseurs

situés au sommet du couvercle de PVC qui recouvre le casier. La circulation du liquide se fait en boucle

fermée (voir la Figure 39 page 188). Les lysimètres fonctionnent à température ambiante (environ 25°C).

6.4. Lit bactérien

Les colonnes utilisées sont en verre et sont munies d’un robinet. Les dimensions sont les suivantes :

hauteur 30 cm, diamètre interne 6 cm, volume interne d’environ 0,80 L, ces colonnes sont remplies avec

le milieu M63Y après avoir placé le garnissage (hauteur de liquide : 20 cm). Avant utilisation, les colonnes,

emballées dans de l’aluminium, ont été autoclavées à 120°C pendant 20 minutes. Le robinet est quant à lui

rincé plusieurs fois à l’éthanol puis replacé en bas de la colonne. Les tuyaux Masterflex Tygon ont été

autoclavés de la même manière que les colonnes. Le montage a été réalisé en prenant soin de minimiser les

contaminations biologiques mais n’a pas pu être réalisé sous atmosphère stérile. Une fois installées dans

une pièce non thermostatée (température minimum : 22°C, température maximum : 33°C), les colonnes

sont emballées dans de l’aluminium pour maintenir l’obscurité.

Le garnissage est soit du bidim, soit des anneaux Raschig en céramique. Les anneaux de céramique ont

les dimensions suivantes : 1 cm de haut, diamètre externe de 1,1 cm, diamètre interne de 0,7 cm, pèsent

1,15 g en moyenne et ont une surface spécifique de 440 m2.m-3.

L’extrémité du tuyau arrivant en haut de colonne ne plonge pas dans le liquide (voir Figure 6).

Nous avons branché la pompe de manière à faire « buller » de l’air dans les colonnes deux heures par jour,

Streptomyces étant un genre bactérien strictement aérobie. La pompe fonctionne en sens inverse pour

réaliser les prélèvements.


91


garnissage anneaux de Raschig

plaque en inox percée

robinet

Niveau maximal deliquide

coton cardé

pompe

tuyau bulles d’air

Figure 6 : Schéma d’une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac


92

RÉSULTATS

RESULTATS


93

RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME

I. CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE

Streptomyces thermocarboxydus NH50

ISOLÉE D’UN SOL POLLUÉ PAR DU Cr(VI) ET

DE SA RÉSISTANCE AU Cr(VI)

1. Historique

1.1. Introduction

Un sol fortement pollué par des ions chromate a été étudié au LAEPSI. Ce sol est issu d’un site de

l’agglomération lyonnaise où se trouvait un atelier de traitement de surface. La pollution provient de fuites

de fûts contenant diverses solutions de chromates entreposés pendant des années sur le site. A partir de ce

sol, trois types de bactéries capables de résister à 1 mM de chrome (VI) ont été isolés. Un seul de ces trois

isolats s’est révélé capable de réduire le chrome (VI) en chrome (III) en milieu liquide minéral VB1 (Vogel-

Bonner) avec du glucose comme source de carbone. Cette bactérie a été identifiée comme appartenant au

genre Streptomyces et à l’espèce thermocarboxydus après analyse par J. Willison, au laboratoire DBMS/BBSI,

CEA Grenoble, d’une partie de sa séquence d’ADN codant l’ARNr 16S (Desjardin et al., 2002).

La séquence de 1333 paires de bases (pb) est disponible dans la base de données GenBank sous le

numéro d’accession AJ249627. Cette séquence est identique à plus de 99,9 % à celle d’un autre Streptomyces

thermocarboxydus : AT37 (appelé aussi DSM44293). Sa séquence complète (1500 pb) est disponible dans la

même base de données sous le numéro U94490.

1.2. Remise en culture de la souche

Une ancienne culture sur boîte de Petri de la souche d’intérêt a été utilisée. 1 mL de milieu PEG1

liquide a été déposé sur la gélose. Des tubes contenant 5 mL de PEG liquide avec ou sans 1 mM de Cr(VI)

ont été ensemencés avec 50 µL de la suspension récupérée sur la boîte après grattage. Les tubes ont été

1 La composition complète des milieux est présentée dans le chapitre Matériels et Méthodes.


94


incubés à 30°C sous faible agitation. Après 3 jours d’incubation, de petits agrégats blancs se sont formés et

ont adhéré aux parois des tubes.

L’aspect des cultures ressemblait à celui d’une culture de Streptomyces en milieu liquide. En effet, ces

bactéries se développent en formant des mycéliums visibles à l’œil nu. Le reste du liquide est clair et

limpide. Une des cultures en PEG1 à 1 mM de chrome a été utilisée pour ensemencer des boîtes de Petri

VB1 à 0 ou 1 mM de chrome (VI) ainsi que des boîtes PEG à 0 ou 1 mM de chrome (VI). Pour cela, une

culture de 5 mL a été centrifugée et le culot resuspendu dans 500 µL de VB liquide. 50 µL de cette

suspension bactérienne ont été étalés sur chacune des boîtes.

Après 5 jours, aucune colonie n’a pu être observée sur les boîtes VB. Par contre des colonies, dont

l’aspect correspondait à celui de colonies isolées de Streptomyces en milieu solide (ancrées dans la gélose)

sont apparues sur les boîtes PEG 0 et 1 mM. La souche a été nommée NH50 : NH pour Nathalie Huck,

qui avait isolé cette souche en 1997 (Huck, 1997), et 50 car 1 mM correspond à 50 mg.L-1 de Cr(VI).

2. Principales caractéristiques physiologiques et biochimiques de la

souche Streptomyces thermocarboxydus NH50

2.1. Aspect des cultures

2.1.1.En milieu liquide

Comme nous l’avons expliqué dans la partie bibliographique, l’aspect des cultures de Streptomyces peut

être très différent selon la souche, le milieu et l’agitation. Néanmoins, quelques grandes tendances se

dégagent :

- en milieu très riche, YEME1 (Yeast Extract-Malt Extract) par exemple qui contient 34 % de

saccharose, les mycéliums des Streptomyces sont relativement dispersés. Le milieu est trouble comme celui

d’une culture d’Escherichia coli. Ce phénomène est accentué quand les cultures sont réalisées en

Erlenmeyers à « picots » car le mouvement conféré au système contribue à dissocier les mycéliums par un

effet mécanique. Lorsque l’on cesse d’agiter l’Erlenmeyer, les mycéliums se déposent au fond et l’on peut

constater qu’au-dessus des mycéliums, le milieu est limpide. Si l’on travaille en milieu riche de type LB

1 La composition complète des milieux est présentée dans le chapitre Matériels et Méthodes.


95


(Luria Broth), les mycéliums se développent de façon diffuse. Si la croissance dure plusieurs jours, le

milieu devient complètement trouble et les mycéliums sont bien visibles au microscope.

- si l’on réalise des cultures de Streptomyces dans un milieu minéral moins riche, de type M63G ou

M63Y, les cellules ont tendance à se développer et se fixer sur la paroi du tube ou de l’Erlenmeyer au

niveau de la butée du liquide en mouvement. Il arrive aussi que les cellules poussent sous forme de tapis

cellulaire au fond de l’Erlenmeyer ou du tube surtout lorsque celui-ci est peu ou pas agité. Le biofilm se

détache au bout de 3 jours quand il devient un peu plus épais. En condition de faible agitation, des

mycéliums se développent aussi à la surface du liquide. La souche Streptomyces thermocarboxydus NH50, dans

ces milieux, ne synthétise aucun pigment (en milieu M63G, S. lividans TK24 donne une coloration rose

correspondant à la synthèse de l’actinorhodine).

2.1.2.Sur milieu solide

Selon la composition du milieu de culture, la morphologie des colonies sur boîte est différente. La

caractéristique commune est que les Streptomyces s’accrochent à l’agar à la différence d’autres genres

bactériens. Cet ancrage dans la gélose est due à la synthèse d’agarases qui permettent au mycélium basal de

se développer en creusant l’agar. Cet ancrage permet de discriminer les cultures qui sont ou non

contaminées par d’autres micro-organismes. Pour vérifier qu’une culture liquide de Streptomyces est pure,

une goutte de celle-ci est déposée sur un milieu gélosé LB. Ce milieu riche non sélectif permet le

développement de colonies en une douzaine d’heures en général, sauf pour les bactéries du genre

Streptomyces qui ont besoin de plus de temps pour que leurs colonies soient visibles à l’œil nu sur les boîtes.

Donc des colonies qui apparaissent en moins d’une journée sont suspectes. Si les boîtes sont incubées

pendant 2 jours, il suffit de gratter la surface de la boîte. Si les colonies restent attachées à l’agar c’est qu’il

s’agit du genre Streptomyces. Dans le cas contraire, il s’agit de clones d’un autre genre bactérien.

- sur milieu R5, les Streptomyces sporulent. Ils développent un mycélium aérien avec des hyphes

terminées par des spores. La colonie est alors recouverte d’une poudre (les spores) qui peut être blanche,

grise ou légèrement rosée selon les souches considérées. La souche S. lividans TK24 présente la

particularité de synthétiser un pigment de couleur rose sur ce type de boîte, S. thermocarboxydus NH50

produit des spores de couleur grise et l’agar prend une teinte marron autour des colonies (Figure 7).

C’est à partir de ce type de boîte que l’on récupère les sporées pour la mise en conservation. Lorsque l’on

cultive NH50 sur milieu LB, il n’y a pas sporulation.

- le milieu M63 permet d’obtenir des colonies dont les spores sont en général très blanches ou

légèrement grisâtres. L’absence de source de carbone dans le milieu M63 n’empêche pas le développement

des colonies car l’agar, lorsqu’il est dégradé par l’action d’enzymes (agarases) produites par le genre


96


Streptomyces, peut servir de source de carbone.

Le milieu R5 est donc utilisé pour préparer des spores ou pour obtenir des colonies sporulantes de

manière à pouvoir déposer l’empreinte de la boîte sur un velours dans l’objectif de réaliser des répliques.

Le milieu LB est utilisé pour tester différentes résistances et pour vérifier que la culture n’est pas

contaminée.

Figure 7 : Aspect de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu R5 après 4 et 8 jours d’incubation à 30°C.

2.2. Réduction du chrome (VI)

Streptomyces thermocarboxydus NH50 a été cultivé dans différents milieux liquides pour tester la capacité

de cette souche à réduire le chrome (VI). Les deux milieux utilisés par N. Huck (VB et PEG) ont été testés

ainsi que les milieux LB et M63. Dans les deux milieux riches (PEG et LB) avec 1 mM de Cr(VI), la

souche NH50 avait une bonne croissance et réduisait le chrome hexavalent en quelques jours.

Dans ce type de milieux, deux phénomènes se produisent. D’une part une réduction abiotique par les

matières organiques de l’ordre de 25 % du Cr(VI) apporté. D’autre part, on observe un phénomène de

bio-réduction dû à la présence des bactéries. Les essais avec la souche NH50 réduisent toujours beaucoup


97


plus vite que les essais stériles. En 3 jours, dans les essais abiotiques, il reste les ¾ du chrome (VI) présent

au départ alors que dans les essais avec la souche bactérienne, cette réduction est totale.

Ces milieux riches permettent un bon développement bactérien mais ne sont pas adaptés pour

apprécier le phénomène de réduction réalisé par les bactéries puisque la réduction abiotique est

significative. De plus les milieux riches ont une coloration marron ce qui rend difficile l’observation de la

disparition du chrome (VI) de couleur jaune. En revanche, en milieu minéral, la disparition de la

coloration jaune des ions chromate en solution est visible à l’œil nu (voir Figure 8). Par conséquent les

milieux riches seront utilisés de préférence pour obtenir de grandes quantités de cellules.

Dans les milieux minéraux (VB et M63), contenant du glucose (G) ou du glycérol (Y), le phénomène

de réduction abiotique est beaucoup plus faible : 5 à 10 % du chrome est réduit par les composants du

milieu en 15 jours. Il a cependant été impossible d’obtenir des cultures de la souche NH50 en milieu VB

avec du glucose alors qu’en M63G, avec et sans chrome (VI), les cellules n’ont aucune difficulté à

développer un mycélium. Les micro-organismes, lorsqu’ils sont cultivés in vitro, peuvent perdre certaines

caractéristiques. C’est le cas pour les bactéries pathogènes qui peuvent perdre leur caractère de virulence

lorsqu’elles sont cultivées pendant plusieurs générations dans les milieux de culture standards en

laboratoire (Brown et Williams, 1985). Il est donc envisageable que la souche S. thermocarboxydus NH50 ait

perdu la capacité à croître en milieu VB. Compte tenu de ces résultats, le milieu M63 sera utilisé pour

l’étude de la réduction du chrome (VI).

Figure 8 : Coloration du milieu M63 glycérol contenant initialement 1 mM de Cr(VI) : à gauche :

témoin abiotique et à droite : après 15 jours de culture de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50

(après réduction du Cr(VI))

La souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 se développe en milieu M63 (glucose ou glycérol)


98


avec ou sans 1 mM de Cr(VI) de la même manière. En revanche pour des concentrations supérieures ou

égales à 2 mM, les mycéliums se développent beaucoup plus lentement.

2.3. Sensibilité à différents antibiotiques

Un antibiogramme de la souche NH50 a été réalisé à l’Institut Pasteur à Paris, cette information

pouvant être intéressante si l’on s’oriente vers une étude génétique de la résistance au Cr(VI) et/ou de sa

bio-réduction. En effet, pour tester certaines hypothèses, il est nécessaire d’introduire dans la cellule un

« vecteur » (qui est une molécule d’ADN portant différents gènes). Pour vérifier que le vecteur est bien

présent dans la cellule, il faut pouvoir disposer d’un « marqueur ». En général, il s’agit d’un gène de

résistance à un antibiotique. Pour pouvoir utiliser un vecteur portant le gène de résistance à un

antibiotique X, il faut donc, au préalable, avoir vérifié que la souche que l’on veut étudier ne présente pas

le phénotype « résistant à l’antibiotique X ».

La souche S. thermocarboxydus NH50 a été étalée sur une boîte de Petri contenant du milieu riche NE

de façon à former un tapis cellulaire confluent plutôt que des clones isolés. De petits disques imprégnés de

différents antibiotiques ont ensuite été déposés à la superficie de l’agar et on observe la zone d’inhibition

de la croissance de la souche S. thermocarboxydus NH50 autour des disques après 5 jours d’incubation à

30°C. La charge en antibiotique est indiquée dans le Tableau XVII.

Les résultats montrent que la souche NH50 est sensible à la streptomycine, à l’hygromycine à la

kanamycine, à la gentamycine, le choramphénicol et au thiostrepton (Tableau XVII et Figure 9). Ces

différentes sensibilités rendent envisageable l’étude génétique de la résistance au Cr(VI) ou de sa réduction

en permettant de réaliser une mutagenèse ou des transformations avec différents vecteurs. La souche

tolère très bien l’acide nalidixique ce qui permet d’envisager une conjugaison Escherichia coli - Streptomyces où

l’acide nalidixique sert à tuer les bactéries Gram négatif, en l’occurrence E. coli. La sensibilité à la

gentamycine, à la kanamycine et au thiostrepton permet d’envisager une mutagenèse au hasard grâce au

plasmide pSIT151, portant les gènes de résistance à ces trois antibiotiques, que l’on introduira dans la

souche NH50. Nous avons testé la sensibilité de la souche NH50 à ces trois antibiotiques aux

concentrations recommandées par le protocole de P.J Dyson (communication personnelle). Les spores

ont été étalées sur milieu gélosé R5 et incubées une nuit à 30°C. 1 mL d’une solution d’antibiotique a

ensuite été ajouté le lendemain de manière à avoir une concentration finale de 8 µg.mL-1 pour la

gentamycine, 20 µg.mL-1 pour la kanamycine et 0,5 µg.mL-1 pour le thiostrepton. La souche NH50 n’a pas

pu croître sur les boîtes contenant les différents antibiotiques.

La sensibilité au chloramphénicol permet d’envisager une expérience de conjugaison entre Streptomyces

thermocarboxydus NH50 et S. lividans TK24 (et entre NH50 et S. albus hsp18::tsr à cause de la sensibilité au


99


thiostrepton déjà mentionnée).

Tableau XVII : Antibiogramme de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50

Antibiotiques Charge Zone d’inhibition de la croissance en cm

Acide nalidixique 30 µg 0 Ampicilline 10 µg 0 Chloramphénicol 30 µg 1,2 Erythromycine 15 UI 0,4 Gentamycine 10 UI 0,5 Hygromycine 100 µg 0,65 Kanamycine 20 µg 0,4 Néomycine 20 µg 0,4 Pristinamycine ND 0,5 Spiramycine 100 UI 0,7 Streptomycine 500 µg 1,1 Thiostrepton 20 µg 0,9 Tobramycine 10 µg 0,5 Viomycine 20 µg 0,3


100


Figure 9 : Antibiogrammes de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu NE après 5 jours.

2.4. Recherche d’un éventuel plasmide

L’électrophorèse en champ pulsé (Pulse Field Gel Electrophoresis ou PFGE) a été utilisée pour

déterminer si la souche endogène possède ou non un plasmide. En effet, les Streptomyces peuvent contenir

de très grands plasmides de plusieurs centaines de kb. La technique consiste à inclure dans de l’agarose des

mycéliums de Streptomyces afin d’obtenir un « plug » ou « insert ». Celui-ci est traité au lysozyme pour rendre

la membrane des cellules perméable et permettre la migration dans un gel d’agarose sous l’influence d’un

champ électrique de tout l’ADN (chromosomique et extra-chromosomique). Il est possible de digérer

l’ADN c’est-à-dire le fractionner en plusieurs fragments grâce à l’utilisation d’enzyme de restriction.

Si l’ADN n’est pas digéré, le chromosome est beaucoup trop grand pour pénétrer dans le gel. Par contre

s’il existe des plasmides, compte tenu de leur taille plus réduite (comparé au chromosome), ils pourront

entrer dans le gel et migrer à une distance inversement proportionnelle à leur taille. Pour la souche NH50,

la migration de l’ADN total non digéré a révélé la présence :

● d’une bande proche du puits de dépôt que l’on appelle « front de résolution ». (voir Figure 10).

Cette bande correspond à de grands fragments d’ADN chromosomique qui résultent d’un clivage non

enzymatique. En effet l’ADN est une molécule fragile qui sous l’action d’un champ électrique peut se

casser. Ce front de migration est retrouvé dans tous les gels après migration quelque soit la souche

bactérienne considérée. Son intensité dépend de la qualité de la préparation : si la préparation de l’ADN a

été réalisée plusieurs mois avant la migration, l’ADN est beaucoup plus fragile et le nombre de fragment

sera beaucoup plus important mais elle dépend aussi de la charge dans le puits de dépôt : si les inserts

utilisés contiennent beaucoup de mycéliums, le front de résolution sera beaucoup plusimportant.

● d’une molécule d’ADN extra-chromosomique que nous avons appelé pLN01 (Figure 10) dont la

taille a été estimée à 40 kb par comparaison avec un marqueur de taille.

Puits de dépôt

pLN01Front de résolution

migration


101


Figure 10: Electrophorèse en champ pulsé de la souche S. thermocarboxydus NH50.

Programme : 6 V/cm, 20 s-40 s pendant 20 h. (-, sans traitement à la pronase ; +, traitement à la pronase).

Pour tester la linéarité de la molécule, deux approches ont été testées. D’abord des temps de pulsation

différents ont été appliqués. Si la molécule était circulaire, elle aurait une migration aberrante par rapport à

un marqueur de taille de molécules linéaires (concatémères du phage lambda) (Kinashi et al., 1987).

Or pLN01, pour des temps de pulsations différents, migre toujours à la même distance relative du

marqueur de taille. La deuxième approche est le traitement à la pronase. En effet pour observer des

plasmides circulaires, il n’est pas nécessaire de traiter les inserts à la pronase car il n’y a pas de protéine

liées de manière covalente à ce type de molécule. Sur la Figure 10, on peut observer que l’ADN extra-

chromosomique n’est visible que dans l’échantillon noté (+), c’est-à-dire celui qui a été débarrassé des

protéines terminales par traitement à la pronase. Les deux approches suivies indiquent donc que l’ADN

extra-chromosomique de la souche NH50 est une molécule linéaire. L’analyse de l’ADN (+), c’est-à-dire

traité à la pronase, de la souche S. thermocarboxydus AT37 (dont la séquence du gène codant l’ARN16S est

identique à plus de 99,9 % à celle de NH50) a révélé l’absence de molécules extra-chromosomiques. AT37

ne possèdent donc pas le plasmide pLN01.

2.5. Conclusion

La souche bactérienne isolée au laboratoire capable de résister à 1 mM de Cr(VI) sur milieu

gélosé et capable de le réduire en milieu liquide a été identifiée comme étant un Streptomyces

thermocarboxydus. Elle a été nommée NH50. Elle possède un grand nombre des

caractéristiques du genre des Streptomyces : formation de mycéliums et sporulation sur milieu

approprié, formation de mycéliums en milieu liquide, ancrage dans la gélose et dégagement

d’une odeur de « sous-bois » très caractéristique de ce genre bactérien. La souche NH50 est

capable de réduire le chrome en milieux liquides minimum et riche. L’antibiogramme de la

souche a révélé une sensibilité pour le chloramphénicol, la kanamycine, la gentamycine et le

thiostrepton ce qui permet d’envisager une étude génétique utilisant ces différents

antibiotiques comme marqueurs de sélection. L’analyse de l’ADN de cette souche a révélé la

présence d’une molécule d’ADN extra-chromosomique (plasmide) linéaire d’environ 40 kb

qui est absente dans la souche Streptomyces thermocarboxydus AT37.


102


3. Résistance au chrome

Les plasmides des Streptomyces peuvent porter les gènes de résistance à différents antibiotiques (ainsi

que les gènes de synthèse des antibiotiques) mais aussi des gènes de résistance à des métaux lourds.

La souche S. thermocarboxydus NH50 ayant été isolée à partir d’un sol pollué au chrome et à d’autres métaux

(plomb...) pourrait donc avoir ses gènes de résistance au chrome sur le plasmide linéaire pLN01 identifié

précédemment. Cette hypothèse a donc été testée.

Nous avons étudié la résistance au chrome de la souche S. thermocarboxydus NH50 et nous l’avons

comparée à celle d’autres souches de Streptomyces. Comme la souche NH50 a été isolée d’un sol pollué par

de nombreux métaux outre le chrome, nous avons aussi testé la toxicité de ceux-ci. Ensuite, différentes

approches ont été suivies pour trouver le déterminisme du phénotype de résistance au chrome (VI).

Des expériences de curage du plasmide pLN01, de conjugaison et de mutagenèse ont été entreprises dans

cet objectif.

3.1. Étude préliminaire

3.1.1.Résistance comparé de différentes souches de Streptomyces

Des boîtes de Petri contenant exactement 25 mL de milieu LB ont été utilisées pour cette expérience.

Un tapis de différentes souches de Streptomyces (voir Tableau XVIII) a été étalé et un puits de 0,5 cm de

diamètre a été pratiqué dans l’agar, au centre de la boîte. 100 µL d’une solution de Cr(VI) 1M ont été

déposés dans le puits et ont diffusé dans l’agar. Les boîtes ont été incubées pendant 5 à 7 jours à 30°C.

La zone d’inhibition a ensuite été mesurée. Les résultats sont reportés dans le Tableau XVIII.

Tableau XVIII : Diamètres (cm) des zones d’inhibition et de ralentissement de la croissance de

différentes souches de Streptomyces sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µL de Cr(VI) 1 M

(sous forme de K2CrO4) après 7 jours à 30°C.

Zone d’inhibition1 Zone de ralentissement de la croissance2 S. lividans TK24 2,6 2,6 S. glaucescens DSM40716 2,4 6,2 S. griseus 3,5 6,5 pas de tapis mais des colonies isolées S. albus 3,8 5 pas de tapis mais des colonies isolées S. thermocarboxydus NH50 0 4,2

1 : absence de tapis cellulaire. 2 : tapis cellulaire moins dense.


103


On note que parmi les 5 souches testées, NH50 est la seule souche qui puisse pousser sur toute la

superficie de la boîte (pas de zone d’inhibition). Pour les autres souches, on observe une zone comprise

entre 2,4 et 3,8 cm où aucun clone n’est apparu. L’existence d’une zone d’inhibition de la croissance

bactérienne pour 4 autres souches de Streptomyces montre que la souche NH50 est bien plus résistante au

chrome que les autres. Pour 3 des 4 autres souches, on observe, outre une zone d’inhibition totale, une

zone de ralentissement de la croissance où des colonies, parfois isolées pour les souches S. griseus et

S. albus, arrivent tout de même à pousser. Pour les deux souches S. griseus et S. albus, il peut s’agir de

mutants du système de transport du sulfate sélectionnés par la présence de chrome. Pour la souche NH50,

il existe aussi une zone de ralentissement de la croissance dans laquelle le tapis bactérien est moins dense

que celui du pourtour de la boîte. La concentration testée en Cr(VI) (1 M) n’empêche pas le

développement de la souche NH50, mais le ralentit un peu.

3.1.2.Détermination de la concentration létale 50 en chrome

Cette concentration, appelée CL50, correspond à la concentration en chrome (VI) pour laquelle 50 %

des bactéries meurent. Un nombre connu de spores est étalé sur boîte de Petri LB sans chrome et avec des

concentrations croissantes en chrome. Les colonies sont comptées après incubation à 30°C pendant 5 à 7

jours. Comme le montre le Tableau XIX, c’est la souche NH50 qui se montre la plus résistante puisque sa

CL50 est 5 à 50 fois plus élevée que celles des autres souches testées. Pour les souches S. lividans et S. albus,

il suffit d’ 1 mM de chrome pour tuer des cellules. La souche S. thermocarboxydus AT37, qui est la souche la

plus proche (génotypiquement pour l’ARN16S) de la souche S. thermocarboxydus NH50, montre un niveau

de résistance au chrome relativement important par rapport aux souches S. lividans et S. albus mais tout de

même inférieur d’un facteur 5 à celui de la souche NH50.

Tableau XIX : Concentration létale 50 (CL50) de Cr(VI) (apporté sous forme de K2CrO4) pour 4

souches de Streptomyces sur milieu solide LB.

souches de Streptomyces CL50 (mM de Cr(VI))

S. thermocarboxydus NH50 50

S. lividans TK24 1

S. thermocarboxydus AT37 10

S. albus 1

Le même type d’expériences a été réalisé avec d’autres milieux (M63, R5...). Les résultats s’avèrent

différents selon le type de milieux en ce qui concerne la valeur de la concentration inhibitrice en Cr(VI),

mais les résultats relatifs sont les mêmes : NH50 est toujours la souche la plus résistante testée parmi les 4

souches de Streptomyces testées. Par exemple, sur le milieu R5, NH50 pousse sans aucune difficulté avec


104


2 mM de Cr(VI), les clones deviennent très petits sur un milieu contenant 5 mM de chrome (VI) et ne

poussent plus du tout à 10 mM de chrome. En parallèle AT37 ne pousse plus à 5 mM de chrome alors

que sur milieu LB, il fallait atteindre la concentration de 10 mM de chrome pour avoir 50 % de létalité.

La composition du milieu influe donc sur le niveau de résistance au chrome. Dans un milieu très riche

comme le milieu R5, les ions métalliques peuvent se complexer avec les composants organiques du milieu

(extrait de levure par exemple) (Ramamoorthy et Kushner, 1975). Ainsi, une partie des ions chromate est

piégée. La concentration en ions chromate libres est inférieure à la concentration ajoutée dans le milieu.

Pour la suite des expériences nous choisirons de tester la résistance au chrome sur boîte contenant du

milieu LB car les différences de phénotypes sont beaucoup plus facilement observables (moins

d’ambiguïté quant à l’analyse des résultats) que sur le milieu R5.

3.1.3.Résistance à d’autres métaux lourds

Le sol, à partir duquel a été isolée la souche NH50, contenait des quantités importantes de cadmium et

de cuivre (14 et 552 mg.kg-1 de matières sèches respectivement)1. La souche NH50 pourrait être résistante

à certains des autres métaux présents dans ce sol. Pour tester cette hypothèse, nous avons comparé les

niveaux de résistance au cadmium et au cuivre de la souche NH50 à ceux d’autres bactéries du genre

Streptomyces. Des boîtes de Petri contenant exactement 25 mL de milieu LB ont été ensemencées avec des

spores de Streptomyces afin d’obtenir après croissance un tapis cellulaire. 100 µL d’une solution à 0,1 M de

cadmium ou de cuivre (sous forme de CdCl2 et CuCl2) ont été déposés dans le puits au centre de la boîte.

L’incubation se fait dans les mêmes conditions que pour les expériences avec le chrome (voir § 3.1.1).

On remarque que les deux métaux testés entraînent une inhibition de la croissance plus ou moins

importante pour toutes les souches testées y compris pour la souche S. thermocarboxydus NH50 (Tableau

XX).

Si NH50 se différencie des autres souches de Streptomyces testées par son niveau de résistance au

chrome (VI) plus élevé, son niveau de résistance au cadmium Cd2+ et au cuivre Cu2+ est quasi identique à

celui des autres souches testées. NH50 est notamment aussi sensible au cadmium et au cuivre que la

souche AT37 dont elle est très proche.

1 Ces valeurs sont au moins 4 fois plus importantes que les teneurs maximales autorisées si le sol était un sol

agricole destiné à l’épandage de boues de stations d’épuration. (voir Bibliographie, Chapitre II, § 3)


105


Tableau XX : Diamètre (cm) de la zone d’inhibition de la croissance de différentes souches de

Streptomyces sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µL de Cd2+ (sous forme de CdCl2) et Cu2+ (sous

forme de CuCl2) après 7 jours à 30°C

Cadmium Cuivre

S. lividans TK24 4,3 5,0

S. glaucescens DSM40716 4,0 5,1

S. thermocarboxydus AT37 3,6 4,6

S. griseus 3,1 4,7

S. albus 4,8 5,8

S. thermocarboxydus NH50 3,8 4,8

3.2. Etude de la résistance au chrome

Comme nous l’avons décrit dans la partie bibliographique, la résistance au chrome chez les bactéries

peut être le résultat de la mutation du système de transport du sulfate ou la conséquence de l’expression

d’une protéine ChrA qui transporte, vers le milieu extra-cellulaire, les chromates qui ont pénétré dans la

bactérie. Dans ce dernier cas, le gène chrA est porté par un plasmide de grande taille chez Ralstonia et

Pseudomonas, deux bactéries à Gram négatif (Cervantes et al., 1990 ; Nies et al., 1990).

Nous rappelons ici que la réduction du Cr(VI) en Cr(III) ne sera pas traitée comme un mécanisme de

résistance au chrome car ces deux phénomènes (résistance et réduction) ne sont pas nécessairement liés.

En effet, les extraits cellulaires d’une souche de Pseudomonas fluorescens, ayant perdu le plasmide lui

conférant le phénotype ChrR, sont capables de réduire le chrome (VI) de manière aussi efficace que ceux

de la souche résistante au chrome (Bopp et Ehrlich, 1988). Chez P. fluorescens LB300, la réduction du

chrome (VI) n’est pas un mécanisme de résistance. Etant donné que nous ne disposons pas de clones ChrS

dérivant de la souche NH50, nous ne pouvons pas déterminer, pour cette souche, si la résistance au

chrome (VI) est liée à la réduction des ions chromates.

3.2.1.Transport du sulfate

La mutation du système de transport du sulfate donne aux bactéries un phénotype ChrR. Ces

bactéries, dans lesquelles ni les ions CrO42- ni les ions SO42- ne peuvent pénétrer, doivent assimiler le

soufre par une autre voie. Il faut donc, dans le cas de la mutation du système de transport du sulfate,

donner aux bactéries une autre source de soufre. Le milieu peut contenir de la cystéine ou de la

méthionine, deux acides aminés contenant un atome de soufre dans leur chaîne latérale. Leur catabolisme

donnera à la bactérie le soufre nécessaire pour la synthèse d’autres molécules. Les bactéries ayant une

mutation du système de transport du sulfate sont donc incapables de croître sur un milieu contenant


106


uniquement du soufre sous forme de sulfate (hétérotrophie). La souche NH50, résistante au chrome, a pu

être cultivée sur un milieu ne contenant que du sulfate comme source de soufre (M63G). Il n’est donc pas

nécessaire d’apporter le soufre sous une autre forme. Il semble donc que le système de transport du sulfate

de NH50 ne soit pas modifié et que la résistance au chrome obéisse à un autre mécanisme.

3.2.2.Recherche du support génétique responsable de la résistance au chrome

a Curage du plasmide

Comme nous l’avons vu précédemment, nous avons mis en évidence dans NH50 la présence d’un

plasmide, appelé pLN01, dont la taille est d’environ 40 kb. Compte tenu du niveau de résistance au

chrome (VI) plus élevé chez la souche NH50 par rapport à d’autres souches du même genre dépourvues

de plasmide (S. lividans TK24, S. thermocarboxydus AT37, S. albus), on peut envisager que le gène responsable

de la résistance soit porté par l’ADN extra-chromosomique. Pour tester cette hypothèse, nous avons tenté

d’obtenir des clones de la souche NH50 ChrS (sensibles au chrome (VI)) pour les analyser ensuite par

PFGE afin de déterminer si la sensibilité acquise est liée à la perte du plasmide pLN01 (curage du

plasmide).

Cette méthode consiste à essayer de provoquer la perte du plasmide en perturbant la cellule

bactérienne. Les protoplastes sont des cellules vivantes obtenues après action du lysozyme, enzyme qui

dégrade les polysaccharides de la paroi cellulaire. Les protoplastes qui ne possèdent que la membrane

plasmique sont donc beaucoup plus fragiles. Il faut les manipuler avec précaution (éviter les chocs

osmotiques, thermiques et mécaniques) pour ne pas lyser les cellules. Les cellules débarrassées de leurs

polysaccharides vont nécessairement orienter leur métabolisme vers la synthèse de ceux-ci lorsqu’elles

seront incubées sans lysozyme. Les plasmides, quant à eux, se répliquent grâce à des enzymes synthétisées

par la cellule. Si l’on perturbe le métabolisme d’une cellule en l’orientant vers la synthèse de

polysaccharides au détriment des autres voies cataboliques et anaboliques, on peut perturber la réplication

des plasmides et ainsi générer des clones qui auront perdu le plasmide initialement présent dans la souche

NH50. La régénération des protoplastes peut avoir lieu à 30 ou à 40°C. L’élévation de 10° de la

température d’incubation peut aussi changer le métabolisme de la cellule et conduire à la perte du

plasmide.

Pour cette expérience, deux souches de NH50 ont été utilisées : la souche « sauvage » NH50 et la

souche transformée par incorporation du plasmide pSIT151 (voir Chapitre I § 2.3), qui porte les gènes de

résistance à la gentamycine et à la kanamycine. La souche transformée contient toujours le plasmide

pLN01 (vérifié par PFGE). La souche NH50 pSIT151 permet de nous assurer que nous travaillons bien

avec cette souche tout au long de l’expérience puisque nous pouvons tester la résistance aux deux


107


antibiotiques.

Des protoplastes sont étalés après dilution sur des boîtes contenant du milieu R5 avec un antifongique

afin d’éviter la contamination de celle-ci par des champignons. En effet à la différence des spores que l’on

étale sur le même type de boîtes pour obtenir des sporées et qui ne nécessite que deux étapes (prélèvement

et étalement), la préparation et la régénération de protoplastes requièrent l’utilisation de plusieurs solutions

de traitement, ainsi qu’une étape d’étalement dit « doux » qui nécessite le séchage de la boîte de Petri sous

hotte, autant de manipulation susceptibles de contaminer les préparations. Après 5 à 8 jours, les clones

isolés sont repiqués sur boîte R5. Le « patch » ainsi obtenu (ensemble des clones à tester « rangés » sur

milieu R5) est ensuite répliqué sur velours sur lequel on applique des boîtes contenant le milieu LB 10 mM

de Cr(VI) (choisi pour tester la résistance au chrome, voir 3.1.2) et R5 Gm Kan (gentamycine et

kanamycine aux concentrations respectives de 1 et 5 µg.mL-1) pour tester la résistance aux deux

antibiotiques. Parmi les clones repiqués, certains peuvent avoir perdu la résistance au chrome. Il convient

de déterminer si la perte de résistance au chrome est liée à la perte du plasmide en faisant une

électrophorèse en champ pulsé pour le rechercher dans les clones sensibles.

Parmi 250 clones testés, issus de protoplastes régénérés de souche NH50, aucun n’a présenté de

phénotype ChrS (sensibilité au Cr(VI)). Nous avons aussi travaillé avec des dérivés de la souche NH50

portant les gènes de résistance à des antibiotiques (plasmide pSIT151). L’avantage de travailler avec des

souches portant de tels marqueurs est la possibilité de vérification rapide des phénotypes pour s’assurer

que l’on obtient des clones dérivant bien de la souche parentale. Les souches NH50 pSIT151 et ses

dérivés obtenus, appelés TI (pour transposon induit) après induction de la transposase, ont été utilisés. La

construction de ces souches sera détaillée dans le paragraphe c page 114. La régénération de protoplastes

de ces souches n’a pas permis non plus d’obtenir des clones ChrS (80 clones dérivés de NH50 pSIT151,

1493 protoplastes régénérés à 30°C et 650 régénérés à 40°C dérivés des TI).

Nous n’avons donc pas pu obtenir de dérivés de la souche NH50 qui soient sensibles au chrome.

Deux interprétations sont possibles :

- le plasmide a effectivement pu être perdu dans certains clones mais le phénotype

ChrR n’est pas associé. Dans ce cas, le gène conférant la résistance au chrome n’est

pas sur le plasmide.

- aucun protoplaste régénéré n’a perdu le plasmide compte tenu d’une très grande

stabilité de celui-ci dans la cellule ou l’intégration de celui-ci dans le chromosome.

Dans ce dernier cas, le gène conférant la résistance au chrome (VI) est sur le

plasmide pLN01 qu’il n’a pas été possible de curer.


108


En admettant qu’environ 1 % des protoplastes régénérés perdent le plasmide (P. Mazodier,

communication personnelle), l’étude de plus de 2000 clones auraient dû nous permettre d’obtenir une

dizaine de clones ChrS si le gène responsable du phénotype ChrR était sur le plasmide pLN01.

Mais il est difficile de dire si la technique de curage du plasmide utilisée est efficace. Dans le cas où le

gène codant la résistance au chrome serait sur le chromosome, le seul moyen de vérifier qu’environ 1 %

des clones, issus de la régénération de protoplastes, a perdu le plasmide pLN01 (sur lequel nous n’aurions

aucun marqueur de sélection) serait de faire une électrophorèse en champ pulsé avec 300 à 400 clones

pour espérer en observer 3 ou 4 sans le plasmide (l’étude d’autant de clones n’est pas envisageable).

L’absence du phénotype ChrS chez les clones ayant été obtenus par cette méthode ne permet pas de

conclure quant à l’implication ou non du plasmide pLN01 dans le phénotype de résistance au chrome (VI)

pour la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50.

b Conjugaison

Certaines bactéries sont capables de transférer leur plasmide à travers un pont cytoplasmique vers

d’autres bactéries en général du même genre. On appelle ce processus « conjugaison ». La conjugaison

nécessite un contact des bactéries suffisamment long pour permettre le passage de l’ADN extra-

chromosomique (plasmide) de la souche dite donneuse vers la souche dite receveuse. Nous disposons au

laboratoire de la souche NH50 résistante au chrome qui possède un plasmide susceptible de porter le gène

de résistance au chrome. Nous disposons aussi de souches beaucoup plus sensibles au chrome :

Streptomyces lividans TK24 qui est résistante au chloramphénicol et Streptomyces albus hsp18::tsr (le gène hsp18

est interrompu par le gène de résistance au thiostrepton). Ce seront les souches receveuses. Pour ce type

d’expériences, il faut un moyen de sélectionner les clones qui auraient acquis le plasmide portant

éventuellement la résistance au chrome.

Dans notre cas, après conjugaison, la souche donneuse NH50 ne sera pas sélectionnée car elle est

sensible aux 2 antibiotiques qui permettent la discrimination et les souches receveuses sont avant la

manipulation sensibles au chrome. Si l’on utilise un milieu contenant du chrome et un des deux

antibiotiques on ne sélectionnera que les souches receveuses ayant acquis la résistance au chrome (Figure

11). Il convient de déterminer si les clones portent ou non le plasmide de la souche NH50 en utilisant le

PFGE.

Le Tableau XXI montre que seule la souche NH50 est capable de croître sur un milieu gélosé LB

contenant des concentrations supérieures à 5 mM de Cr(VI) sans provoquer de létalité. Pour les deux

souches receveuses, à partir de 5 mM aucun clone ne pousse. La souche TK24 a été étalée à partir d’une


109


sporée dense sur des boîtes LB 10 mM de chrome + Cm. Sur les boîtes témoins (sans chrome), un tapis

cellulaire s’est développé. En revanche, sur les boîtes 10 mM Cr(VI) + Cm (chloramphénicol), des clones

très petits sont apparus. Ces clones, repiqués sur des boîtes contenant 10 mM de chrome, ne se sont pas

développés. En parallèle, la souche NH50 a été étalée dans les mêmes conditions (10 mM Cr(VI) + Cm,

tapis cellulaire) et aucun clone n’a pu se développer. Compte tenu de ces résultats, l’expérience de

conjugaison entre TK24 et NH50 a tout de même été tentée puisque sur les boîtes 10 mM de Cr(VI) +

Cm ne pourront croître que les TK24 conjuguants et les clones qui seront très petits pourront être

éliminés car ne ils ne poussent plus lorsqu’ils sont repiqués.

En parallèle, la résistance aux antibiotiques a été testée pour les 3 souches en étalant des sporées

denses de chacune des souches. Nous avons vérifié que la souche NH50 était sensible au thiostrepton (10

µg.mL-1) et au chloramphénicol (50 µg.mL-1) et que les souches TK24 et S. albus hsp18::tsr étaient

résistantes au chloramphénicol et au thiostrepton respectivement.


110


LB CmLB 10 mM Cr

Absence de colonies Colonies

Le chrome empêche la croissance de la souche

receveuse

Le chloramphénicol (Cm) empêche la croissance de la

souche donneuse

Chromosome

linéaire

cm

Plasmide pLN01

LB 10 mM Cr + Cm Témoins Témoins

LB Cm LB 10 mM Cr

Absence de colonies Colonies

chrR

Plasmide

pLN01

S. thermocarboxydus NH50 Chromosome linéaire Chromosome TK24

cm

SOUCHE DONNEUSE SOUCHE RECEVEUSE, ex : TK24

CONJUGANT : S. lividans TK24 résistant au chrome

Figure 11 : Principe de la conjugaison entre bactéries. Hypothèse : NH50 posséderait le gène de la

résistance au chrome sur le plasmide pLN01.

Tableau XXI : Détermination de la valeur de la concentration en chrome (VI) pour la sélection des

conjugants. Nombre de colonies en fonction de la concentration en chrome (VI) dans le milieu LB

Concentration en Cr(VI) (mM) souches 0 1 2 5 10

S. thermocarboxydus NH50 175 217 192 178 174 S. lividans TK24 453 367 10 0 0 S. albus hsp18::tsr 121 153 147 0 0

Pour les expériences de conjugaison, deux protocoles ont été testés, le premier consistant à mettre en


111


contact des spores prégermées (A) et le deuxième des spores non prégermées (B).

Protocole A : des spores prégermées des deux souches (donneuse et receveuse) ont été mise en

contact pendant 5 heures. Pour cette expérience, seuls les croisements entre la souche NH50 utilisée pure

et mise en contact avec une suspension, pure ou diluée par un facteur 102 et 104, de spores prégermées de

S. albus hsp18::tsr ont donné une vingtaine de clones à la fois résistant au thiostrepton et au chrome. Les

clones ont été repiqués sur le milieu R5 pour permettre la sporulation et répliqués ensuite sur les milieux

sélectifs LB 5 mM de Cr(VI) et R5 Tsr. Aucun des clones qui avait poussé dans la première partie de

l’expérience n’a maintenu sa résistance au chrome.

Protocole B : la deuxième méthode consiste à mettre en contact les spores non prégermées des deux

souches. Le croisement s’effectue sur la boîte de Petri, et les spores qui résultent de ce croisement sont

sélectionnées sur LB 10 mM de chrome + antibiotique. Les croisements ont été réalisés avec les deux

types de souches receveuses : Streptomyces albus hsp18::tsr et Streptomyces lividans TK24.

Du premier croisement 69 clones ont poussé mais après repiquage, aucun n’a conservé le phénotype

ChrR. Les croisements avec la souche TK24 ont donné deux types de clones : de minuscules clones

semblables à ceux que nous avions déjà observé en effectuant les témoins (TK24 sur LB 10 mM de Cr(VI)

+ Cm) et une centaine de clones (99) deux à trois fois plus gros. Les petits clones ont aussi été analysés

mais aucun d’entre eux n’a gardé la résistance au chrome. Les 99 autres clones ont été repiqués. Ces clones

possèdent bien le phénotype de la souche receveuse car ils présentent une pigmentation rose et la

résistance au chloramphénicol. 58 des 99 clones ont maintenu la résistance au chrome après repiquage et

réplique. Dix d’entre eux ont été analysés en PFGE mais aucun ne possèdent le plasmide de 40 kb

(Figure 12). Ce résultat a été confirmé par l’analyse d’inserts de C8 et C10 contenant davantage d’ADN.

En effet, l’absence de bande sur un gel de PFGE correspondant au plasmide pLN01 peut être due à

l’absence du plasmide recherché mais aussi au fait que les inserts ne contiennent pas beaucoup d’ADN.

Pour vérifier l’absence de plasmide, la préparation des cellules qui seront incluses dans l’agarose est faite à

partir de deux cultures distinctes et les puits sont chargés avec des quantités d’inserts variables.

La mise en cause de la mutation du système de transport du sulfate qui confère bien le phénotype

ChrR peut être exclue car les clones (C1 à C8) ont été répliqués par la méthode de l’empreinte sur velours

sur un milieu ne contenant du soufre que sous forme de sulfate et tous les clones analysés en PFGE (C1 à

C10) ont pu croître sans aucune difficulté. Si ces clones sont des mutants, la mutation qui confère la

résistance au chrome n’implique donc pas le système de transport du sulfate. C’est un autre mécanisme,

inconnu, qui est mis en jeu. On peut penser que le plasmide pLN01 serait stable dans la souche donneuse

NH50 (et donc visible en PFGE) mais que lorsqu’il passe dans la souche receveuse TK24, il s’intègre au

chromosome.


112


Pour vérifier cette dernière hypothèse, il conviendrait de fabriquer une sonde du plasmide pLN01 et

de l’hybrider avec l’ADN chromosomique des clones de TK24 résistants au chrome. Cependant, nos

tentatives pour récupérer le plasmide pLN01, afin de le marquer et de l’hybrider, n’ont pas abouti.

Les extractions n’ont pas donné suffisamment de matériel pour effectuer les expériences. Il est en effet

assez difficile de récupérer un fragment d’ADN de grande taille.

Par ailleurs, on peut envisager que le plasmide pLN01 soit effectivement passé dans la souche

receveuse TK24, qu’il ne soit pas intégré dans le chromosome de la souche hôte mais qu’il soit devenu

invisible à l’analyse par PFGE. Il arrive en effet que dans certaines souches bactériennes, chez Erwinia par

exemple, des plasmides soient présents dans la cellule mais que l’extraction d’ADN plasmidique ne révèle

aucune molécule d’ADN extra-chromosomique. L’existence du plasmide dans la bactérie est vérifiée par

l’analyse du phénotype et par la conjugaison. Il est possible de transférer un plasmide portant un gène de

résistance à une molécule X depuis Escherichia coli vers Erwinia. L’analyse des clones d’Erwinia portant la

résistance à la molécule X ne montre aucun plasmide, mais, la conjugaison des clones d’Erwinia avec une

souche d’E. coli sensible à X, permet d’obtenir des clones d’E. coli résistants à X et l’analyse des clones par

extraction d’ADN plasmidique montre alors la présence du plasmide initial (G. Condemine,

communication personnelle). Il est possible qu’un mécanisme analogue ait lieu dans notre cas pour le

transfert de pLN01 depuis NH50 vers TK24 même si ce phénomène n’a pas été décrit pour le genre

Streptomyces. On peut bien sûr s’interroger sur l’existence de ce mécanisme chez deux souches du même

genre bactérien d’autant plus que des expériences de conjugaison entre une autre souche (CHR28) portant

un plasmide (pRJ28) conférant la résistance au mercure et la souche TK24 ont été réalisées et l’analyse de

l’ADN des ex-conjugants possédant le phénotype résistant au chloramphénicol et au mercure a révélé la

présence du plasmide (Ravel et al., 1998).

Néanmoins pour tester notre hypothèse, il faudrait réaliser une conjugaison avec les clones C1 à C10

comme souches donneuses avec des spores d’une souche de NH50 qui serait sensible au chrome (mais

que nous n’avons pas réussi à obtenir) ou encore avec les spores d’un nouveau stock de S. lividans TK24

qui porterait un autre marqueur de sélection que le chloramphénicol et qui après conjugaison avec la

souche CHR28 permettrait l’observation du plasmide.


113


Figure 1

Les expé

bactérienne a

chromosomiq

résistance au

pSIT151 qui

possède une

de la réplicat

copier le plas

obtenu en gr

de ne pas inc

plasmide libr

bactérie Stre

L’intégration

portées par le

L’insertio

plasmide pSI

(dans notre c

thiostrepton

antibiotiques

1 Universi

THÈSE V. DLAEPSI IN

TK24

NH50

2

a

o

i

m

a

u

e

p

T

t

C8

:

rie

fin

ue

ch

é

ri

on

i

nd

b

tom

d’

pl

n

1

as

(ts

(F

y o

ESSA

C1
0
PFGE de Streptomyces thermocarboxydus NH50, de Streptomyces

10 obtenus après conjugaison entre NH50 et TK

c Mutagenèse

nces de mutagenèse au hasard consistent à introduire

qu’il aille s’intégrer de manière aléatoire dans le chrom

de celle ci. On cherche à interrompre le gène d’intérêt

rome) par insertion du plasmide intégratif. Dans notre ét

té introduit dans la souche NH50 par transformation. Ce p

gine de réplication d’E. coli et une de Streptomyces. Ceci signi

de l’ADN vont reconnaître l’origine de réplication spéc

de pour en faire plusieurs copies. On dit que chez E. coli, il

e quantité. Chez Streptomyces, le plasmide peut être mainte

er les clones à plus de 40°C. A partir de cette température,

sera perdu. Les séquences portées par ce plasmide ne p

yces qu’à condition que le plasmide qui les porte s’

un ADN étranger dans le génome d’une bactérie requi

asmide que l’on regroupe sous le terme de transposon.

est réalisée par une enzyme (la transposase) dont le gène est

51. L’intégration du transposon entraîne l’intégration des

les gènes conférant les résistances à la kanamycine (aphII

r)). Ainsi la souche transformée, NH50 pSIT151 poss

igure 13).

f Wales, Swansea, United Kingdom

JARDIN-2002 DE LYON

pLN01

migration

lividans TK24 et des clones 8 et

24.

un plasmide dans une cellule

osome ou dans l’ADN extra-

(ici le gène responsable de la

ude, c’est le plasmide circulaire

lasmide, donné par P.J. Dyson1,

fie que chez E. coli, les enzymes

ifique d’E. coli et vont pouvoir

est multicopie et peut être ainsi

nu dans la bactérie à condition

la réplication est perturbée et le

euvent être conservées par la

intègre dans le chromosome.

ert des séquences particulières

contenu dans le transposon du

gènes se trouvant à proximité

), à la gentamycine (aacI) et au

ède les résistances aux trois

114


pSIT151(11,4 kb)

aphII

tsrtransposon

aacIR-L

IR-R

β-la

Ori(E)

Ori(S)

XhoI

EcoRIPstI

EcoRI

ADN cible

aacI

IR-L IR-R IR-L IR-R

aacIβ-la aphII tsr

transposon

EcoRI XhoI EcoRI PstI

1,6 kb 11,4 kb

13 kb

AVANT INTÉGRATION

APRÈS INTÉGRATION

Figure 13 : Plasmide circulaire pSIT151 et séquences intégrées dans l’ADN cible après induction de la

transposase avec aacI : gène de résistance à la gentamycine ; aphII : gène de résistance à la kanamycine ; tsr : gène de résistance

au thiostrepton ; EcoRI, XhoI et PstI sont des sites de restriction..

Après transformation et récupération des spores de la souche NH50 pSIT151, un tapis de spores est

étalé sur des boîtes R5 Tsr 0,5 µg.mL-1 qui permet d’induire la synthèse de la transposase et provoque

l’insertion du transposon. Les boîtes sont incubées pendant 6 heures à 30°C pour permettre aux spores de

commencer leur germination puis transférées à 40°C pendant 5 à 7 jours. L’élévation de température

permet d’éliminer les clones de la souche NH50 pSIT151 qui possèdent le plasmide sous forme non

intégrée. Les seuls clones obtenus sont a priori ceux dont le pSIT151 s’est intégré dans le génome

(Figure 14). Les clones sont d’abord « patchés » sur milieu R5 puis répliqués sur les milieux contenant les

antibiotiques pour vérifier les phénotypes. Ils sont appelés TI pour Transposon Induit.


115


1107 clones TI ont été analysés par réplique sur velours sur milieu LB à 10 mM de Cr(VI) et R5 Gm

1 µg.mL-1 Kan 5 µg.mL-1. Moins de 1 % des clones sont devenus sensibles au chrome alors qu’environ

6,7 % des clones testés ont présenté des phénotypes de sensibilité à la gentamycine et à la kanamycine.

La stabilité des phénotypes résistants aux antibiotiques, conférés par le plasmide pSIT151 intégré est assez

mauvaise. Il n’y a priori aucune raison de perdre ces résistances sauf si le plasmide qui s’est intégré

s’excise. L’excision peut être suivie d’une intégration du plasmide ailleurs dans le génome. Bien sûr, si la

réintégration de ce plasmide ne se fait pas après l’excision, il est perdu, ce qui pourrait expliquer la perte de

résistance aux antibiotiques. Si cette hypothèse est vraie, la stabilité du pSIT151 intégré dans notre souche

NH50 peut-être mise en doute et les clones devenus sensibles au chrome pourraient très bien redevenir

résistants au chrome par la suite. Néanmoins, l’ADN des 11 clones TI ChrS dérivant de la NH50 après

induction de la transposition du pSIT151 a été analysé par PFGE.

Si notre hypothèse est vraie, c’est-à-dire si la résistance est portée par un gène localisé sur le plasmide

pLN01, le pSIT151 devrait s’être intégré dans le plasmide linéaire pLN01 dans les clones TI sensibles au

chrome. L’analyse par PFGE devrait alors révéler la présence dans ces clones d’un plasmide linéaire plus

grand de 13 kb supplémentaires par rapport à celui de la souche NH50.

En revanche, si le gène est porté par le chromosome, il faudrait alors entreprendre de travailler sur

l’ADN chromosomique, en réalisant une hybridation d’une sonde du plasmide pSIT151 avec l’ADN

digéré de la souche NH50 sensible au chrome (VI) pour localiser le(s) gène(s) responsable(s) du

phénotype ChrR.


116


tsr aacI

aphII

transposase

Plasmide linéaire pLN01

Chromosome linéaire

Plasmide circulaire pSIT151

tsr aacI

aphII

transposase

TRANSFORMATION

On a introduit, dans la souche NH50, le plasmide pSIT151 qui porte les gènes de résistanceà la gentamycine (aacI), à la kanamycine (aphII) et au thiostrepton (tsr). On obtient aprèstransformation de la souche NH50, une souche NH50 qui contient toujours le plasmidelinéaire pLN01 et désormais le plasmide circulaire pSIT151. Ces clones NH50 pSIT151 ontété sélectionnés sur un milieu contenant de la gentamycine et de la kanamycine.

NH50

NH50 pSIT151

LB tsr 0,5 µg.ml-1

2 cas possibles

1 2

pLN01

Chromosome linéaireavec le pSIT151intégré

Chromosome linéaire

PlasmidepLN01avec leplasmide pSIT151intégré

Streptomyces thermocarboxydus NH50 avec transposon induit

à 40°C

Figure 14 : Principe de la mutagenèse au hasard avec le plasmide pSIT151 dans la souche NH50.


117


NH50 TI1 TI2 TI3 TI4 TK24 TI5 TI6 Puits de dépôts

migration

Front de résolution

pLN01

Figure 15 : Gel de PFGE agarose 0,9 %, programme 40-160 s pendant 20 h de l’ADN + de

Streptomyces thermocarboxydus NH50, des dérivés TI ChrS et de la souche Streptomyces lividans TK24

La Figure 15 montre les résultats obtenus avec 6 des mutants ChrS. Les 5 autres clones ont donné le

même type de profil (« en échelle »). L’expérience a été réalisée avec des inserts d’agarose très chargés en

ADN ce qui explique la densité importante de la bande correspondant au front de migration. On peut

noter que la densité de la bande correspondant au front de migration de l’ADN de NH50 est comparable

à celle de l’ADN des transposons induits TI. On peut remarquer que tous les TI ont un profil inattendu.

En effet, nous nous attendions à deux types de résultats.

Le premier : le plasmide pSIT151 se serait intégré au plasmide pLN01, auquel cas la bande

correspondant au pLN01 aurait disparue et la nouvelle bande attendue serait d’environ 55 kb. La

deuxième possibilité était que le plasmide pSIT151 se soit intégré dans le chromosome et dans ce cas, la

bande de 40 kb serait présente et donc au même niveau que la bande témoin correspondant au pLN01. Or

nous observons ici un phénomène assez étrange. Les 11 clones présentent au moins 2 bandes

correspondant à 2 molécules d’ADN extra-chromosomique (Figure 15). La bande qui a le plus migré

correspond au pLN01 puis les autres semblent correspondre à 2 copies bout à bout de ce plasmide,

la troisième bande à 3 copies etc...


118


migration

lambda

TI1

Figure 16 : gel de PFGE avec l’ADN non digéré du phage lambda et de TI1.

Nous avons déposé dans un gel de PFGE l’ADN du clone TI1 et l’ADN du phage lambda dont la

molécule d’ADN forme des concatémères. Comme le montre la Figure 16, le profil de migration de

concatémères est similaire au profil obtenu avec nos clones TI. Si l’on relève les distances de migration et

que l’on applique la relation : Log (taille du fragment) = f(distance de migration) on obtient pour le phage

lambda une droite d’équation y = -0,13 x + 5,85 avec un coefficient de corrélation linéaire d’environ 0,97

(ce qui n’est pas si mauvais si l’on considère le fait que les fragments sont très grands (multiples de 47,8 kb

pour lambda) et les distances de migration faibles).

Lorsque l’on estime, grâce à l’équation de droite obtenue précédemment la taille du pLN01, on trouve

une taille d’environ 41,7 kb ce qui est en accord avec l’estimation déjà faite au préalable par le Pr. Leblond

à Nancy. Si l’on relève la distance de migration des fragments plus grands et qu’on leur attribue une taille

multiple de 41,7 kb, nous obtenons une équation reliant les log de la taille des fragments à la distance de

migration qui est assez proche de celle obtenue avec le phage lambda : -0,16 x + 6,14 avec un coefficient

de corrélation de 0,97. Nous pouvons donc dire que les fragments du profil du clone TI1 ont un

comportement électrophorétique semblable à celui de concatémères. Il a été vérifié par hybridation avec

une sonde du plasmide pSIT151 marquée qu’aucune copie de celui-ci ne s’était intégré au plasmide

pLN01. Il s’avère donc que les « transposons induits » devenus ChrS possèdent des concatémères du

plasmide pLN01.

L’intensité de bande correspondant au plasmide pLN01 est beaucoup moins importante que celle des

bandes de même taille observées pour les TI. Ceci peut être dû au fait que les inserts d’agarose de la

souche NH50 avaient été conservés une année à 4°C et le délai écoulé entre la préparation des inserts et

leur utilisation peut diminuer la qualité de l’ADN et donc celle de la révélation par le bromure d’éthidium.

Les premières expériences réalisées dans le but de récupérer de grandes quantités du plasmide pLN01

pour en faire une sonde avait nécessité la préparation et l’utilisation d’inserts d’agarose contenant de très

grande quantité d’ADN. Dans ces conditions (inserts préparés juste avant utilisation et fortement chargés

en ADN), la souche NH50 n’avait pas présenté de profil en « échelle ».


119


Le profil des clones TI est assez difficile à expliquer. L’existence de concatémères chez certains virus

s’explique par le mode de réplication en cercle roulant (rolling circle replication). C’est le cas pour le phage

lambda. Pendant son cycle lytique, il y a une synthèse importante de molécules d’ADN qui sont des copies

de l’ADN du phage qui seront ensuite encapsidées pour produire de nouveaux virus. La réplication de

l’ADN viral selon le modèle du cercle roulant conduit à la formation de concatémères qui sont en fait

plusieurs copies du génome viral les unes derrière les autres. Pour l’encapsidation de l’ADN viral dans la

tête du phage, les sites cos (cohesive end site) des concatémères se fixent sur les protéines qui forment l’entrée

de la tête du phage et l’ADN compris entre ces sites cos entre à l’intérieur du phage.

La linéarité des molécules d’ADN dans le monde bactérien semble être une conséquence de

l’évolution. Il semblerait qu’elle résulte de l’insertion de plasmides linéaires dans le chromosome. Et ces

plasmides linéaires eux mêmes dériveraient de bactériophages. Les plasmides et les virus possèdent une

caractéristique commune : ce sont de petites molécules d’ADN, comparées à un chromosome, dont la

réplication est autonome. Pour que le plasmide soit transmis à la descendance d’une bactérie, il doit

posséder sa propre origine de réplication.

Une autre ressemblance est son mode de réplication. Lorsque les molécules d’ADN sont linéaires,

elles possèdent des extrémités particulières. Chez Borrelia, les extrémités des plasmides et du chromosome

sont en « épingle à cheveux », structure télomérique que l’on retrouve chez des virus d’animaux comme le

poxvirus. La présence de protéines attachées de manière covalente aux extrémités 5’ est rencontrée chez

Streptomyces mais aussi chez le bactériophage Φ29 de Bacillus subtilis. Les virus, pour se répliquer, peuvent se

circulariser. Il semble que le même phénomène se produise chez les bactéries possédant des molécules

linéaires (Volff et Altenbuchner, 2000).

Si l’on considère les ressemblances entre les virus et les plasmides linéaires bactériens, on peut

imaginer que la réplication de certains plasmides comprend une phase où l’ADN est sous forme de

concatémères. Cette hypothèse, pour les Streptomyces, pourrait se justifier par la particularité de leur mode

de développement. En effet, les Streptomyces forment des mycéliums dont les hyphes sont polyploïdes avant

la septation pour la formation de spores haploïdes. Il est possible que durant la formation du mycélium

aérien, les copies du plasmide soient sous forme de multimères qui seront monomérisés lors de la

formation de spores individualisées. La multimérisation permettrait de protéger, contre l’action des

endonucléases par exemple, un grand nombre d’extrémités de plasmides puisque ne seraient susceptibles

d’être modifiées que celles se trouvant aux extrémités du concatémère.

La concatémérisation permettrait de palier à une déplétion en protéines terminales liée au 5’ de la molécule

d’ADN. Il est possible qu’en introduisant dans la souche NH50 le transposon du plasmide pSIT151, celui-

ci soit allé s’intégrer dans un gène impliqué dans la monomérisation des concatémères qui est donc

perturbée chez les clones TI. Ceci ne serait vrai que dans le cas où effectivement le plasmide pLN01 se


120


répliquerait selon un mode « cercle roulant » conduisant à la formation de multimères. Il demeure

troublant que la présence des concatémères soit associée au phénotype ChrS. On peut toutefois imaginer

que le gène conférant la résistance au chrome se trouve sur le plasmide pLN01 à l’une de ces extrémités.

La présence de gènes de résistance est en effet souvent localisée aux extrémités des molécules d’ADN.

Cette organisation peut s’expliquer par la nécessité qu’ont les bactéries à transférer de l’information

génétique vers d’autres bactéries en fonction des variations des conditions du biotope. La

concatémérisation « obligée » du plasmide chez les clones TI empêcherait alors le gène de résistance d’être

transcrit normalement. Il est en effet possible qu’au niveau de deux plasmides associés, l’ADN prenne une

conformation tridimensionnelle limitant ou empêchant l’accessibilité aux gènes adjacents à cette région des

enzymes nécessaires à la transcription. Bien sûr, dans le profil des clones TI, le plasmide pLN01

monomérique existe. Mais sa présence seule ne suffirait peut-être pas à produire en quantité suffisante la

ou les protéines impliquées dans le mécanisme de résistance au chrome.

3.3. Conclusion

La résistance au Cr(VI) de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée du sol

pollué a été testée et comparée à celle présentée par d’autres souches de Streptomyces.

Cette étude a révélé que la souche NH50 peut pousser sur des milieux gélosés contenant des

concentrations en Cr(VI) jusqu’à dix fois plus élevées que pour d’autres souches du même

genre bactérien. En revanche, le niveau de résistance à d’autres métaux (Cu2+, Cd2+…) de la

souche NH50 est du même ordre de grandeur que celui des autres Streptomyces testés. Les

mécanismes de résistance au chrome, étudiés dans la partie bibliographique, peuvent être

liés soit à la mutation du système de transport du sulfate, soit à la présence de la protéine

ChrA dont le gène chrA est porté par un plasmide (chez Alcaligenes et Pseudomonas). Chez la

souche NH50, le système de transport du sulfate ne semble pas impliqué. Concernant la

deuxième hypothèse possible, plusieurs approches ont été utilisées. La régéneration de

protoplastes (qui peut conduire à la perte de plasmide chez les Streptomyces) n’a pas permis

d’obtenir de clones sensibles au chrome. Les expériences de conjugaison avec Streptomyces

lividans TK24 ChrS ont permis d’obtenir des conjugants ChrR mais l’analyse de leur ADN n’a

pas révélé de molécule extra-chromosomique. Enfin, les expériences de mutagenèse au

hasard (par insertion d’un tranposon) ont permis d’obtenir des clones ChrS mais l’analyse de

leur ADN n’a pas montré d’insertion du tranposon dans le plasmide pLN01 mais a montré la

concatémérisation de celui-ci. Même si nos résultats ne le prouvent pas, il est possible que le

phénotype de résistance au chrome soit lié à la présence du plasmide pLN01. Les résultats

obtenus ne permettent pas d’exclure la possibilité que le plasmide porte le (ou les) gène(s)

responsable de la résistance aux ions chromate.


121

RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES

II. RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION

PAR NH50 EN CULTURES PURES

1.Introduction

Il existe, dans les sols, un phénomène d’atténuation naturelle de la pollution qui dépend du polluant et des

propriétés physiques, chimiques et microbiologiques du sol. Pour les pollutions au chrome (VI), la teneur en

matières organiques du sol (acides humiques et acides fulviques) et la teneur en fer ferreux peuvent influencer la

réduction du Cr(VI) en Cr(III). Les sols pollués aux métaux lourds contiennent souvent une grande variété de

micro-organismes capables de diminuer l’impact de la pollution sur l’environnement par transformation des

composés polluants en composés moins mobiles et/ou moins toxiques. En parallèle des phénomènes chimiques

de réduction du Cr(VI), des processus de réduction biologique, peuvent se dérouler, liés à la présence de micro-

organismes vivants qui peuvent métaboliser différentes molécules. C’est dans cette démarche que s’inscrit la

présente étude conduite à partir d’un sol prélevé en Région Rhône-Alpes. Des études préliminaires menées au

laboratoire LAEPSI ont montré que l’activité biologique contenue dans ce sol pouvait être mise à profit pour

réduire la toxicité et la mobilité du chrome (VI) (XIème contrat de Plan Etat-Région, 2000).

En incubant ce sol pollué au chrome (VI) en milieu minéral VB pendant 10 jours à 30°C avec apport de

glucose, Stevko Radovic (1996) a observé 100 % de réduction. Cette culture a été stockée pendant 6 mois à 4°C.

Elle a ensuite été utilisée par Nathalie Huck pendant son DEA (1997) pour isoler le micro-organisme

responsable de la réduction du chrome (VI). À partir d’une suspension de sol en milieu minéral VB enrichie en

glucose (10g.L-1) inoculée par la suspension de 1996, N. Huck a observé une disparition quasi complète (> 99

%) du chrome (VI) dans les essais (concentrations initiales en Cr(VI) 0,5 et 1 mM) en 3 jours à 30°C.

En parallèle, un témoin abiotique (sol autoclavé, sans inoculum) a confirmé que la réduction observée dans

les autres essais non stériles était due à la présence dans le sol de micro-organismes vivants. Les essais où la

réduction avait été la plus efficace ont servi à isoler le micro-organisme responsable de la réduction (N. Huck,

1997, XIème contrat de Plan Etat-Région, 2000). Nous avons essayé, au début de cette thèse, de reproduire ces

résultats à partir de suspension de sol (conservé à 4°C). Le problème rencontré a été qu’avec le même milieu

VB, le pourcentage de réduction obtenu alors s’est avéré beaucoup plus faible (+ de 15 jours pour obtenir 50 %

de réduction contre 3 jours dans les premières expérimentations). Ce ralentissement du phénomène de réduction

peut s’expliquer par le fait que le stockage à 4°C du sol pendant 2 ans a entraîné un appauvrissement de la flore

microbienne. De plus, comme nous l’avons mentionné dans le chapitre I des Résultats, en culture pure, la

souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 a de grandes difficultés à croître dans ce milieu. Pour nos


123


expériences, nous avons donc testé un autre milieu minéral, le milieu M63. Nous avons, grâce à celui-ci, pu

observer des phénomènes de réduction plus rapides qu’en milieu VB mais cependant moins « spectaculaires »

que ceux obtenus par S. Radovic et N. Huck. Nous avons choisi de travailler en cultures pures à une

concentration de 1 mM car au-delà de cette concentration, les mycéliums de Streptomyces thermocarboxydus NH50

ont de grandes difficultés à se développer.

A. Lauriat (1998) a montré, par analyse XANES et EXAFS, que la disparition du chrome (VI) dans les

échantillons de N. Huck avec l’isolat pur était une réduction du chrome (VI) en Cr(III) et non pas le résultat

d’une adsorption du chrome (VI) sur les membranes de la biomasse qui se développe (XIème contrat de Plan

Etat-Région, 2000). Par conséquent, la disparition du chrome (VI) dans les échantillons sera généralement

appelée réduction dans ce qui suit même si en pratique, on mesure la disparition du chrome hexavalent et non

l’apparition de la forme trivalente.

2.Effet de différents paramètres

2.1. Effet de la taille de l’inoculum

Afin d’étudier le phénomène de réduction du chrome par la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50, il

était intéressant de connaître la taille optimale de l’inoculum pour voir apparaître le phénomène assez

rapidement. Les Streptomyces sont conservés sous forme de spores qu’il est facile de dénombrer. Il suffit de faire

des dilutions successives du stock initial et d’étaler une fraction de ces dilutions sur boîte pour connaître le

nombre de spores capables de former une colonie sur milieu solide. Il est beaucoup plus aisé de déterminer la

concentration en spores du stock initial que de dénombrer les cellules en croissance dans un milieu liquide. En

effet ces bactéries forment des mycéliums et dans ces conditions, un prélèvement homogène est impossible à

réaliser ce qui empêche une analyse quantitative en cours de croissance.

Pour tester l’effet de la taille de l’inoculum, nous avons ensemencé 100 mL de milieu M63 enrichi avec une

source de carbone (glucose ou glycérol) en triplicat pour chacune des dilutions. Les spores sont ajoutées à raison

de 400 µL de suspensions mères de concentration 1.1010, 1.109, 1.108, 1.107 spores.mL-1 pour obtenir

respectivement les concentrations initiales de 4.107, 4.106, 4.105, 4.104 spores.mL-1. Il n’a pas été possible

d’obtenir de stock de spores de concentration de l’ordre de 1.1011 spores.mL-1. En effet, lorsque l’on récupère

les spores en grattant une culture ayant poussé sur le milieu approprié (voir Matériel et Méthodes), on peut

récupérer une sporée de concentration de l’ordre de 1.109 spores.mL-1 maximum. Pour obtenir le stock initial à

1.1010, il a fallu utiliser 10 sporées à 1.109, les centrifuger et les reprendre toutes dans un volume final de 1 mL.

Pour le stock à 1.1011, il faudrait une centaine de sporées ce qui demande un travail considérable difficile à

reproduire en routine.


124


La Figure 17 montre les résultats obtenus en présence de sources de carbone différentes. On peut

remarquer que les cinétiques de réduction sont plus rapides en présence de glycérol qu’en présence de glucose.

En ce qui concerne l’effet de la taille de l’inoculum, on observe logiquement que plus il est important, plus la

réduction est rapide. Pourtant si on travaille avec 10 fois plus de cellules, le phénomène ne se produit pas 10 fois

plus vite. Pour la suite des expériences, nous avons choisi d’ensemencer les cultures avec un minimum de 4.106

spores.mL-1 ce qui nous permet d’utiliser les sporées directement sans avoir à les concentrer tout en obtenant

une vitesse initiale de réduction assez élevée.

0

20

40

60

80

100

4 jours

6 jours

% de Cr(VI) restant

glycérol 3 g/L glucose 10 g/L

4.E4 4.E54.E6

4.E7

4.E4 4.E5 4.E6

4.E7

Figure 17 : Effet de la taille de l’inoculum (concentrations initiales en spores.mL-1 dans le milieu) sur la

réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 en présence de glycérol 3 g.L-1 ou de

glucose à 10 g.L-1. Après 4 et 6 jours d’incubation à 30°C sous agitation 120 rpm en milieu minéral M63 avec

1 mM de chrome (VI) de concentration initiale.

2.2. Effet de la source de carbone

Les premières études en culture pure ont montré que la souche NH50 réduisait plus vite le chrome (VI) en

présence de glycérol (3 g.L-1) qu’en présence de glucose (10 g.L-1) (Figure 17). Avec du glycérol, on observe une

réduction totale en moins de 10 jours (concentration initiale de 1 mM de Cr(VI) en milieu minéral M63) contre

plus de 18 jours avec du glucose (Figure 18) alors que les concentrations initiales en spores sont identiques et la

quantité de cellules dans les Erlenmeyers après 10 jours de culture est comparable. Ce résultat peut s’expliquer

par l’effet de la nature de la source de carbone sur l’expression de certains gènes de la bactérie. Il existe de

nombreux exemples de répression catabolique par le glucose dans le monde bactérien. Il est possible que

l’activité réductrice de la souche NH50 soit soumise à l’effet du glucose.


125


Des expériences antérieures avec du sol pollué au chrome (Figure 28) avaient cependant montré que la

réduction ne pouvait avoir lieu que si le milieu était complémenté en glucose. La réduction du chrome en

présence de glycérol n’était alors pas significative ce qui indique qu’en présence de sol, le glucose est une

meilleure source de carbone pour permettre aux bactéries de réduire le chrome contrairement à ce qu’on

observe en cultures pures. Lorsque l’on travaille avec du sol et une flore endogène mixte, il existe de nombreux

paramètres difficilement appréciables. Il est possible que le glycérol, en présence de sol, ne soit pas disponible

pour la souche qui réduit le chrome. Le glycérol a pu être métabolisé par les autres micro-organismes présents

au détriment de la souche qui réduit le chrome. Lorsque la réduction du chrome sera étudiée avec des

suspensions de sol, la source de carbone sera le glucose. En revanche, compte tenu des meilleurs résultats

obtenus en présence de glycérol en culture pure, la suite des manipulations avec S. thermocarboxydus NH50 sera

réalisée avec du milieu minéral M63 glycérol appelé M63Y.

Nous avons tenté d’augmenter la vitesse de réduction du chrome en augmentant les quantités de glycérol. Si

l’on travaille à 4,5 g.L-1 soit une fois et demi plus de glycérol, il n’est toutefois pas possible d’obtenir une

réduction plus rapide.

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 jours

mg/

L de

Cr(

VI)

en s

olut

ion

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Glucose (10 g/L) Glycérol (3 g/L)

mM

de Cr(V

I) en solution

Figure 18 : Cinétique de bio-réduction du chrome (VI) en culture pure de Streptomyces thermocarboxydus NH50

inoculé sous la forme de spores à 4.106 spores.L-1 (milieu nutritif M63, [glc]i = 10 g.L-1 ou

[Y]i = 3 g.L-1, 30°C, obscurité, [Cr(VI)]i = 50 mg.L-1, 18 jours d’incubation).


126


2.3. Effet d’autres métaux

La souche de S. thermocarboxydus avec laquelle nous travaillons a été isolée à partir d’un sol pollué par d’autres

métaux que le chrome. Il faut donc envisager que la présence de ces métaux puisse jouer un rôle sur l’efficacité

de la réduction. Il est possible que les métaux présents empêchent la réduction par un phénomène de toxicité ou

l’accélèrent si la molécule qui réalise la transformation du Cr(VI) en Cr(III) nécessite un atome métallique

comme dans le cas des métallo-enzymes.

Nous avons testé le nickel, le cadmium et le cuivre sous forme divalente. Ces métaux ont été ajoutés sous

forme de chlorure aux concentrations de 0,1 et 0,5 mM à des cultures de NH50 de 4 jours en M63Y contenant

initialement 1 mM de Cr(VI). Le chrome (VI) contenu dans les cultures a été dosé 24 heures après l’ajout des

ions métalliques. Des témoins contenant du milieu M63Y sans bactérie ont été traités de la même manière.

Aucun d’entre eux n’a permis la disparition du chrome (VI) dans les échantillons. Dans les essais avec les

cultures de NH50, le cadmium et le nickel n’ont eu aucun effet comparé au témoin sans métal même après 3

jours (Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Par contre, le cuivre Cu2+ a permis d’avoir 100 % de réduction

en 24 heures.

Nous avons répété l’expérience avec du cuivre sous forme de sulfate (CuSO4) et l’effet a été le même

qu’avec le CuCl2. L’action du cuivre peut être double : soit il augmente la synthèse de la ou des molécules

responsables de la réduction du chrome (en induisant par exemple l’expression d’un ou plusieurs gènes), soit il

participe directement à la réaction de réduction (par exemple comme cofacteur enzymatique). Dans une

nouvelle série d’expériences, le cuivre a été ajouté à 0,1 mM dès le début de la culture.

Dans ces conditions, il n’y a eu aucun développement bactérien. Le Cu2+, à la concentration de 0,1 mM est

toxique et ne permet pas d’obtenir de culture bactérienne et donc d’observer le phénomène de réduction du

chrome (VI). Si le cuivre est ajouté en même temps que les spores de S. thermocarboxydus NH50, le pourcentage

de réduction du chrome ne dépasse pas 5 % (pourcentage comparable à celui du témoin abiotique) (voir

Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Il semble donc, compte tenu de son caractère très toxique vis-à-vis

de la souche NH50, que le cuivre agisse plutôt directement sur la réaction de réduction du chrome que sur

l’expression de l’activité réductrice elle-même.


127


Tableau XXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI), en présence de Ni2+, Cd2+ ou de Cu2+ de cultures de S.

thermocarboxydus NH50 après 3 jours d’incubation à 30°C en milieu M63Y. Les cations métalliques sont ajoutés

sous forme de NiCl2 6H2O, CdCl2 H2O et CuCl2 2H2O à la concentration de 0,1 mM. Le chrome est ajouté sous

forme de K2CrO4 à la concentration de 1 mM.

Ajout dès le début de la culture Ajout après 4 jours de culture Contrôles abiotiques

Cu2+ Ni2+ Cd2+ Cu2+ aucun Ni2+/ Cd2+/Cu2+ou sans métal

<5 % 40 35 100 35.5 <5 %

Note : 100 % de réduction avec le cuivre Cu2+ ont été observés dans les premières 24 heures

Nous avons voulu savoir si la spéciation sous laquelle se trouvait le cuivre était importante. Nous avons

donc pour cela utilisé des cultures de 3 jours en milieu M63Y de différentes souches de Streptomyces (6.106

spores.L-1 initiale). Nous avons ensuite ajouté dans le milieu du Cr(VI) (à la concentration de 1 mM) et du cuivre

sous forme Cu+ ou Cu2+ à la concentration de 0,1 mM à partir de solutions 100 fois concentrées. Le Cu+ est

ajouté à partir d’une solution de CuCl dans de l’acide chlorhydrique car il est très peu soluble dans l’eau (0,0047

g pour 100 g d’eau (Handbook, 82nd Edition)). Pour pouvoir interpréter les résultats, nous avons réalisé un

témoin qui nous permet de juger de l’effet du changement de pH. En effet, en ajoutant du CuCl, le pH du milieu

qui est de 6,8 chute à 2 à cause de l’acide. Si nous observons un effet, il faut pouvoir déterminer qui du Cu+ ou

du changement de pH est responsable de l’effet. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIII.

Tableau XXIII : Effet du Cu2+ et du Cu+ à la concentration de 0,1 mM ajoutés dans des cultures de 3 jours

de Streptomyces thermocarboxydus NH50, S. lividans TK24 et S. cœlicolor (milieu M63Y, 30°C). Le Cr(VI) est ajouté en

même temps que le cuivre à la concentration de 1 mM.

Pourcentage de réduction du chrome après 3 jours

Pas d’ajout Cu2+ Cu+

(pH 2) HCl

(pH 2)

S. thermocarboxydus NH50 52 +/- 2 99,7 +/- 1 65 +/- 5 58 +/- 5 S. lividans TK24 16 +/- 2 22 +/- 3 16 +/- 3

S. coelicolor 31 +/- 1 41 +/-2 27 +/-5 abiotique 1 +/-1 4 +/-2 3 +/-3

Les témoins abiotiques ne permettent pas de réduire le Cr(VI) présent en solution. En revanche, toutes les

cultures des différentes souches de Streptomyces permettent la réduction du chrome (VI). Cette expérience montre

que plusieurs souches de Streptomyces sont capables de réduire le chrome. Cependant S. thermocarboxydus NH50

s’avère la plus efficace. Nous observons toujours l’effet positif du cuivre Cu2+ sur la réduction du chrome (bien

que de manière limitée pour S. lividans et S. cœlicolor) ce qui laisse supposer que le mécanisme de réduction est


128


semblable chez les trois souches testées. L’ajout de Cu+ a un effet faible chez NH50 et n’a pas d’effet chez les

autres souches pour lesquelles les pourcentages de réduction sont comparables à ceux observés sans cuivre. Le

témoin NH50 + HCl montre que l’acidification du milieu n’empêche pas la réduction du chrome d’avoir lieu.

3.Etude de la localisation de l’activité réductrice

3.1. Localisation de l’activité réductrice

Selon les espèces bactériennes, l’activité chromate réductase peut être attribuée à une enzyme membranaire

ou cytoplasmique. Das et Chandra (1990) ont montré qu’une souche de Streptomyces réduisait enzymatiquement

le chrome. Chez cette souche, c’est la fraction membranaire qui est responsable de l’activité réductrice.

Nous avons utilisé pour cette étude des cultures de deux semaines à 30°C de la souche S. thermocarboxydus

NH50 en milieu M63 glycérol (M63Y) avec une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mM. Les cellules ont été

récupérées par centrifugation douce (2000 g) et les surnageants ont été filtrés à 0,22 µm afin d’éliminer toutes les

bactéries. La concentration en Cr(VI) est alors ajustée à 1 mM dans les surnageants. Nous avons vérifié que dans

les conditions testées, le milieu minéral contenant du glycérol ne permet pas de réduire le chrome (VI) en une

semaine même en présence de cuivre.

La Figure 19 montre qu’environ 40 % du chrome est réduit en 24 heures dans les échantillons sans que la

présence des cellules ne soit requise. La ou les molécules responsable(s) de la réduction du chrome ne sont donc

pas présentes uniquement dans les cellules. Il s’agit de molécules libérées dans le surnageant de culture. Les

culots cellulaires ont été resuspendus dans du milieu M63 glycérol contenant 1 mM de Cr(VI) et il a fallu

attendre une semaine pour observer de nouveau un phénomène de réduction du chrome d’environ 50 %.

3.2. Effet des ions Cu2+ sur la réduction du Cr(VI) par des

surnageants de culture

Nous avons testé l’effet du cuivre Cu2+ à 20 µM sur les surnageants (Figure 19). Dans les surnageants dopés

en Cu2+, la réduction est totale en 24 heures. Le cuivre n’augmente donc pas l’efficacité de la réduction du

chrome en induisant l’expression de molécules réductrices dans la cellule bactérienne. Puisqu’il a un effet sur les

surnageants filtrés, c’est qu’il agit sur la réaction de réduction du Cr(VI) elle-même. Nous avons aussi testé l’effet

de l’ajout d’un chélatant de cations divalents, l’EDTA. En présence de cet agent, le pourcentage de réduction est

comparable à celui observé dans l’essai ne contenant pas de cuivre. Le cuivre Cu2+, complexé avec l’EDTA,

n’est plus disponible pour interagir avec les molécules réductrices.


129


0

20

40

60

80

100

% d

e ré

duct

ion

du C

r(V

Figure 19 : Pourcentage de réduction du C

cuivre. SCr : pourcentage de réduction par

culture de NH50 + 20 µM de Cu2+ après 2

de Cu2+ après 7 jours (t

Compte tenu de l’effet du cuivre

concentrations de cuivre sous forme d

NH50 et récupéré les surnageants en

utilisé ici provient d’une culture de 10

du chrome (VI) a été ajouté pour aju

fractions complémentées ou non avec

Cr(VI) en fonction du temps. Les résul


SCr SC

r(VI) par des

le surnagean

4 h, culot ce

émoin abioti

observé su

e CuSO4. N

procédant d

jours en prés

ster la conc

du Cu2+. On

tats sont prés

r + Cu2+

c

surnagean

t de culture

llulaire : cul

que). Conce

r les surna

ous avons

e la même

ence de 1

entration in

incube en

entés dans

culot ellulaire

M

ts de cultur

de NH50

ot cellulair

ntration in

geants de

utilisé de n

manière q

mM de Cr

itiale à 1,3

suite à 4 e

la Figure 2

63Y + Cu2+

e de S. thermocarboxydus NH50 avec ou sans

après 24 heures, SCr + Cu2+: surnageant de

e de NH50 après 7 jours et M63Y + 20 µM

itiale en chrome : 1mM.

culture, nous avons testé différentes

ouvelles cultures de S. thermocarboxydus

ue précédemment. Le surnageant SCr

(VI). Ce surnageant a été récupéré puis

mM avant d’aliquoter en différentes

t à 30°C et on suit la concentration en

0.

130


0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

0 1 2 3 4 5 6jours

Cr(VI), mM

sans cuivre, 4°C sans cuivre, 30°C5 µM Cu2+, 30°C 10 µM Cu2+, 30°C20 µM Cu2+, 30°C

Figure 20 : Réduction du Cr(VI) en fonction de la concentration en Cu2+ par un surnageant SCr provenant

d’une culture de 10 jours de S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63Y à 1 mM de Cr(VI).

La cinétique de réduction du chrome est beaucoup plus lente à 4°C qu’à 30°C. L’augmentation de la vitesse

de réaction en fonction de la température est un phénomène généralement observé dans les réactions chimiques

ou biologiques. Les cinétiques de réduction du chrome sont d’autant plus rapides que la concentration en Cu2+

est importante. L’ajout de 5 µM de Cu2+ permet d’obtenir 100 % de réduction en 6 jours d’incubation à 30°C

alors qu’en absence de cuivre à la même température d’incubation, la réduction du Cr(VI) n’est que d’environ 50

%. On remarque aussi que le pourcentage de réduction du chrome après 24 heures par le surnageant SCr avec

20 µM de Cu2+ atteint environ 87 % contre 100 % dans l’expérience précédente (Figure 19). Cette différence

peut provenir du fait que les surnageants proviennent de deux cultures distinctes, ensemencées à partir de deux

sporées différentes et récupérées à des temps légèrement différents (entre 10 et 15 jours). Il apparaît donc que

l’âge de la culture joue un rôle et influe sur la quantité de molécules disponibles pour la réduction mais l’effet du

Cu2+ est comparable.


131


Le cuivre, sous sa forme divalente, augmente de manière significative la vitesse de réduction du chrome. Cet

effet n’est visible que si les cellules ont poussé au préalable sans cuivre car à la concentration de 0,1 mM, celui-ci

empêche le développement bactérien. Le cuivre n’agit donc pas en stimulant les cellules mais interagit avec les

molécules, produites et excrétées dans le surnageant, responsables de la réduction du Cr(VI). Nous avons donc

testé différentes concentrations en cuivre Cu2+ directement sur les surnageants de culture afin d’observer son

effet sur la vitesse de réaction. Nous avons pour cela utilisé le type de surnageant présentant la plus grande

efficacité c’est-à-dire le surnageant SCr.

Le surnageant SCr d’une culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 de 10 jours a été récupéré et

fractionné en 4. Dans chaque aliquote, la concentration en Cr(VI) a été ajustée à 1, 2, 3 ou 4 mM

respectivement. Puis chacune des différentes fractions contenant des concentrations variables en Cr(VI) ont été

aliquotées par 4. Le Cu2+, sous la forme de CuSO4, a été ajouté à trois d’entre elles aux concentrations de 20, 100

ou 500 µM. Nous avons mesuré la vitesse moyenne de réduction (en µM.h-1) pendant les 36 premières heures.

Nous n’avons pas mesuré les vitesses initiales car elles sont difficilement appréciables. En effet, pour les

concentrations en Cr(VI) supérieures à 1 mM, il est nécessaire de procéder à une dilution supplémentaire pour

doser le Cr(VI) avec le DPCZ. Cette dilution augmente les incertitudes sur la mesure d’absorbance à 540 nm. Si

nous avions utilisé les valeurs de vitesses obtenues pendant les deux premières heures par exemple, la variation

de la concentration en Cr(VI) dans les échantillons fortement concentrés en chrome est assez faible et les

incertitudes de la méthode assez importantes. C’est pour cette raison que nous avons choisi de mesurer les

vitesses moyennes après 36 heures pour les 16 conditions testées. Les résultats sont présentés dans le Tableau

XXIV.

Quelle que soit la concentration initiale en chrome (VI), plus la concentration en cuivre Cu2+ est élevée, plus

la vitesse moyenne est grande. Pour une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mM, l’ajout de 20 µM de Cu2+

permet d’augmenter la vitesse d’un facteur 7 environ. Les vitesses, pour un ajout de 100 et 500 µM, n’ont pas pu

être calculées puisqu’en 36 h la réduction était totale et aucun prélèvement n’avait été effectué à des temps

inférieurs. En revanche, nous avons pu les calculer pour des concentrations initiales en Cr(VI) de 2, 3 et 4 mM.

L’apport de 100 et 500 µM de CuSO4 permet d’augmenter encore davantage la vitesse de réduction du Cr(VI)

mais la différence entre les vitesses mesurées à 100 et 500 µM de Cu2+ est beaucoup plus faible que la différence

observée entre les vitesses mesurées à 20 et 100 µM. Pour une concentration initiale en chrome de 2 mM, 500

µM de Cu2+ permettent d’avoir un effet maximum. Si dans ces conditions la réduction avait été totale au bout de

36 h, la vitesse calculée aurait été de 55,6 µM.h-1 (2000 µM/36 h). En revanche pour des concentrations initiales

de 3 et 4 mM de Cr(VI) l’effet maximal n’est pas atteint en 36 h avec 500 µM de cuivre. Les vitesses obtenues

sont respectivement de 59,4 et 69,7 µM.h-1 pour 3 et 4 mM de concentrations initiales en Cr(VI) en présence de

500 µM de Cu2+ contre 83,3 et 111,1 µM.h-1 (3000 µM/36 h et 4000 µM/36 h) si la réduction avait été totale en

36 h.


132


Tableau XXIV : Vitesses de réduction du Cr(VI) observées pendant les 36 premières heures dans le

surnageant SCr avec différentes concentration en Cu2+

Vitesse de réduction du Cr(VI) (µM.h-1)

[Cr(VI)]ini (mM) Sans cuivre 20 µM 100 µM 500 µM

1 3,33 24,44 > 27,8 > 27,8 2 5,66 35,83 51,66 53,33 3 7,5 33,88 57,22 59,44 4 9,72 43,05 65,83 69,72

3.3. Effet de la présence de Cr(VI) au préalable dans les cultures

Deux cultures de S. thermocarboxydus NH50 ensemencées à partir de la même sporée ont été incubées

pendant 10 jours en milieu M63Y respectivement sans Cr(VI) et en présence de Cr(VI) à 1 mM. Le seul

paramètre qui diffère est donc la présence au préalable de Cr(VI) dans la culture. Les surnageants

respectivement notés S et SCr ont été récupérés par centrifugation et filtration à 0,22 µm puis la concentration

en Cr(VI) a été ajustée à 1,3 mM et du cuivre Cu2+ ajouté à 20 µM. Les résultats sont présentés dans le Tableau

XXV ci dessous.

Tableau XXV : Influence de la présence au préalable de Cr(VI) dans la culture. Pourcentage de réduction du

Cr(VI) par les surnageants S et SCr en présence de 20 µM de Cu2+ à 30°C.

% de réduction du Cr(VI)

24 heures 48 heures

S + 20 µM Cu2+ 46,3 59,5

SCr + 20 µM Cu2+ 86,9 98,5

Nous remarquons que la présence au préalable de chrome dans la culture permet d’obtenir une meilleure

efficacité de réduction du chrome. Tandis que le surnageant SCr + Cu2+ permet d’obtenir 98,5 % de réduction

en 48 heures à 30°C, le surnageant S + Cu2+ ne permet de réduire dans le même temps qu’un peu plus de la

moitié du chrome présent initialement. La présence de chrome (VI) semble activer la production dans le

surnageant de la ou des molécules responsables de l’activité chromate réductase. Cet effet est aussi observé

lorsque les surnageants S et SCr ne sont pas complémentés par du cuivre.


133


3.4. Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la réduction par

des surnageants de cultures

Les expériences présentées page 133 permettent d’observer l’effet de la concentration en Cr(VI) sur la

vitesse de réduction du Cr(VI). Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIV. Plus il y a de Cr(VI) dans le

surnageant, plus la vitesse est importante (quelle que soit la concentration en Cu2+). La concentration en substrat

est donc limitante et la réaction est proche de l’ordre 1. On peut supposer que la vitesse est reliée à la

concentration en Cr(VI) par la relation suivante (Michaelis Menten) :

)]([)](.[

VICrKsVICrVmv

+=

équation 13

où Vm est la vitesse maximale et Ks est la concentration en Cr(VI) donnant ½ de Vm.

Si la concentration en chrome (VI) est beaucoup plus faible que Ks, alors l’équation devient une expression

d’ordre 1 :

KsVICrVmv )](.[=

équation 14

Nous avons donc tracé le graphique 1/v = f(1/[Cr(VI)] (voir Figure 21) avec les valeurs de vitesses

obtenues pour différentes concentrations initiales en Cr(VI) et sans cuivre. Dans ce cas, et dans celui ci

uniquement, nous pouvons considérer que la concentration en Cr(VI) varie suffisamment peu en 36 heures pour

faire l’hypothèse que les vitesses moyennes mesurées sont proches des vitesses initiales de réduction du Cr(VI).

Grâce à cette représentation, (dite de Lineweaver-Burk en enzymologie), nous pouvons déterminer deux

paramètres : la vitesse maximale (Vm) et la constante d’affinité (Ks). Les valeurs de la Vm et du Ks déterminées

ainsi sont de 22,8 µM.h-1 et de 5,8 mM respectivement. Le coefficient de régression linéaire (R2) de la droite

d’équation y = 0,258x + 0,0439 est supérieur à 0,99 ce qui signifie que les valeurs expérimentales sont proches

de cette droite. Ayant obtenu des valeurs de Vm et de Ks, nous avons appliqué l’équation 13 et superposé le

modèle aux valeurs expérimentales. Les résultats sont présentés dans la Figure 22.


134


Les valeurs expérimentales sont très proches du modèle. Pour une concentration initiale de 4 mM en Cr(VI),

l’écart entre la valeur expérimentale et la valeur du modèle est plus important que pour des concentrations

inférieures. La principale cause de cette différence est l’incertitude sur les valeurs de concentrations mesurées

dans ces essais. En effet, une concentration initiale de 1 mM en chrome nécessite pour un dosage une dilution

1/200 pour que la lecture soit dans la gamme où la loi de Beer-Lambert est vérifiée. Pour doser le Cr(VI) dans

un échantillon où la concentration est beaucoup plus importante, le facteur de dilution est lui aussi augmenté.

Une dilution 1/200 peut être effectuée en une étape (5 µL dans 1000 µL final), en revanche une dilution 1/1000

nécessite deux dilutions « en cascade » ce qui augmente l’incertitude sur le résultat.

Compte tenu de ces incertitudes, l’équation qui relie la vitesse de réduction du Cr(VI) à la concentration en

chrome (VI) est un bon modèle. Cette équation est l’équation de Monod utilisée par Shen et Wang (1997) pour

modéliser la réduction du chrome par les enzymes solubles. Nous n’avons pas besoin de tenir compte de l’effet

toxique du chrome comme ont du le faire Shen et Wang puisque la réduction du chrome a lieu dans le

surnageant exempt de toutes cellules vivantes.

y = 0,258x + 0,0439R2 = 0,9989

0

0,1

0,2

0,3

0,4

-0,50 -0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

1/v (h.µM-1)

1/[Cr(VI)] (mM-1)

1/Vm

-1/Ks

Figure 21 : Représentation de Lineweaver-Burk : 1/v = f(1/[Cr(VI)], avec v vitesse de réduction du chrome

(36 premières heures) à différentes concentrations initiales en Cr(VI) (1, 2, 3 et 4 mM)


135


0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5valeurs expérimentalesvaleurs obtenues d'après le modèle

[Cr(VI)] mM

vitesse de réduction du Cr(VI)(µM.h-1)

Figure 22 : Comparaison des valeurs expérimentales de vitesses de réduction du chrome en fonction de la

concentration initiale en Cr(VI).

Nous avons observé que le cuivre pouvait augmenter la vitesse de réduction du chrome. Cependant les

vitesses que nous avons calculées pour différentes concentrations initiales en Cr(VI) et en Cu2+ (Tableau XXIV)

sont des vitesses moyennes très différentes des vitesses initiales (la concentration en Cr(VI) a fortement diminué

en 36 h dans les essais avec du cuivre, par exemple pour une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mM, après 36

h elle atteint une valeur de 0,12 mM en présence de 20 µM de Cu2+). Nous ne pouvons donc pas traiter ces

données de la même manière que précédemment (où les variations de concentrations en Cr(VI) pendant les 36

premières heures étaient suffisamment faibles pour faire l’hypothèse que les vitesses mesurées étaient proches

des vitesses initiales).

3.5. Effet de la température d’incubation

Le surnageant SCr d’une culture de 7 jours de la souche S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63Y contenant

1 mM de Cr(VI) a été récupéré, filtré sur filtre Millipore 0,22 µm et la concentration en Cr(VI) ajustée à 1 mM.

Huit conditions ont été testées : les différentes températures d’incubation sont 4, 30, 37 et 42°C et pour chacune

des températures, nous avons testé l’effet de la présence de cuivre Cu2+, sous forme de CuCl2 à la concentration

de 0,1 mM. Les pourcentages de réduction du chrome après 24 heures sont présentés dans le Tableau XXVI.

Nous remarquons qu’en absence de cuivre, 24 heures ne suffisent pas pour observer la réduction du chrome

présent dans les essais. La quantité de molécules réductrices dans le surnageant n’est donc pas suffisante pour

voir le phénomène apparaître rapidement. En revanche, la présence de Cu2+ permet d’obtenir entre 9 et 52,2 %

de réduction selon la température d’incubation.


136


Nous avions observé précédemment que l’incubation en absence de cuivre à 4 et 30°C présentait des

cinétiques différentes (voir § II 3.2 et Figure 20). De la même manière, en présence de cuivre Cu2+, l’élévation

de la température permet d’augmenter le pourcentage de réduction du chrome (VI).

Tableau XXVI : Pourcentage de réduction par le surnageant SCr après 24 heures à différentes températures

températures 4°C 30°C 37°C 42°C 50°C 75°C 100°C

Cu2+ (0,1 mM) - + - + - + - + + + +


< 5 % 9 % < 5 % 26,8 % < 5 % 38,8 % < 5 % 52,8 % 100 % 100 % 100 %

Nous avons cherché la température à partir de laquelle la réduction du chrome était ralentie. En effet, plus

on augmente la température, plus la vitesse de réaction augmente jusqu’à une température optimale à partir de

laquelle la réaction ralentit si celle-ci est enzymatique car l’augmentation de la température conduit à la

dénaturation des protéines. De manière générale, la température optimale d’une enzyme coïncide, à plus ou

moins quelques degrés, à la température optimale de croissance du micro-organisme qui la synthétise.

Nous avons réalisé les incubations à 50, à 75 et à 100°C et la réduction en présence de 0,1 mM de Cu2+ était

totale en 24 heures dans les 3 conditions testées (nous n’avons pas testé l’effet de l’élévation de la température

au-delà de 42°C sans cuivre). En revanche, le traitement à 120°C pendant 20 minutes (autoclavage) du

surnageant SCr avant ajout du chrome (1 mM) et du cuivre (0,1 mM) ne permet pas d’observer la réduction du

chrome en 24 heures. Ces résultats suggèrent que la réduction du chrome ne soit pas de nature protéique. Il

nous apparaît peu probable que la protéine qui réduit le Cr(VI) en Cr(III), s’il s’agissait vraiment d’une protéine,

puisse rester active à 75 et 100°C. Pour confirmer cette hypothèse, des expériences en présence d’agent

dénaturant comme le sodium dodécyl sulfate ou en présence de protéases ont été réalisées.

4.Etude de la nature de la (des) molécule(s) responsable(s) de la

réduction du Cr(VI)

4.1. Recherche de molécules protéiques

4.1.1.Action de protéases

Ces expériences ont été réalisées avec le surnageant SCr d’une culture de S. thermocarboxydus NH50 de 10

jours afin de déterminer si les molécules responsables de la réduction du chrome sont de nature protéique ou

non. Les protéases sont des enzymes qui dégradent les protéines. Si l’activité chromate réductase est due à une

protéine, alors, en présence de protéase, la réduction du chrome sera beaucoup plus faible voire nulle.


137


La première protéase testée est la protéinase K (Sigma) à la concentration de 0,1 mg.mL-1. Le pourcentage

de réduction a été mesuré après 90 minutes et après 20 h d’incubation à 30°C. La Figure 23 présente le

pourcentage de chrome (VI) restant dans les essais à différentes concentrations en Cu2+ comprises entre 20 et

500 µM.. En absence de protéinase K, l’augmentation de la concentration en cuivre permet de diminuer la

concentration des ions chromate dès les premières 90 minutes. Dans l’essai sans cuivre, la réduction est

négligeable alors qu’à la concentration de 100 µM, elle de l’ordre de 15 %. L’ajout de protéinase K ne permet pas

d’abolir le phénomène de réduction du chrome. Ce résultat suggère que si l’activité chromate réductase est de

nature protéique, la protéine ou les protéines ne sont pas dégradées par la protéinase K. La disparition du

chrome a été mesurée après 20 heures d’incubation à 30°C. La Figure 24 montre la concentration en chrome

restant sous forme (VI). Sans cuivre, 20 % du chrome (VI) a été réduit avec ou sans protéinase K. En présence

de 20 µM de cuivre, on observe que la présence de protéinase K entraîne une baisse de la réduction du chrome.

Néanmoins, en 20 heures, il y a eu plus de 75 % de chrome (VI) réduit. Pour des concentrations en cuivre de

100 et 500 µM, nous n’avons pas fait figurer les résultats car pour les deux conditions (avec ou sans protéinase

K) la réduction a été complète.

L’ajout de protéinase K n’a donc pas d’effet significatif sur la réduction du chrome. La protéinase K est

pourtant une protéase qui peut dégrader une grande variété de protéines. De plus cette enzyme est très résistante

à la température, à la présence de détergent, elle est active dans une large gamme de pH. L’activité de la

protéinase K peut difficilement être mise en cause. Dans les conditions de pH (6,8) et de température dans

lesquelles les essais ont été effectués, l’activité chromate réductase, si elle était de nature enzymatique, aurait été

fortement réduite voire abolie. Ce résultat suggère que la réduction du chrome ne nécessite pas la présence d’une

enzyme.

Pour confirmer ce résultat, nous avons réalisé les mêmes expériences mais en présence d’une autre

protéase : la pronase. L’ajout de cette enzyme, à la concentration de 0,1 et 0,2 mg.mL-1 n’a pas permis de réduire

significativement l’activité chromate réductase. En 24 heures, en présence de 0,1 mM de cuivre, la réduction est

totale même en présence de pronase.


138


0

20

40

60

80

100

% de Cr(VI) restant

0 20 100 500 µM Cu2+

sans

pro

t K

avec

pro

t K

Figure 23 : Effet de la protéinase K sur le pourcentage de Cr(VI) restant dans le surnageant SCr incubé

pendant 90 minutes avec ou sans Cu2+. [Cr(VI)]ini = 0,8 mM

0

20

40

60

80

100

% de Cr(VI) restant

0 20 µM Cu2+

sans

pro

t K

avec

pro

t K


pendant 20 heures avec ou sans Cu2+. [Cr(VI)]ini = 0,8 mM

(la réduction est complète à 100 et 500 µM de Cu2+ avec ou sans protéinase K)


139


4.1.2.Effet du SDS

Une autre méthode pour déterminer la nature de l’activité chromate réductase est d’ajouter du Sodium

Dodécyl Sulfate (SDS) dans les essais. Cette molécule est un détergent qui dénature les protéines. La

dénaturation des protéines conduit à la perte de la structure tridimentionnelle et donc à la perte de l’activité. Si

l’on ajoute 0,1 % de SDS aux essais contenant 0,1 mM de cuivre Cu2+, on observe que la réduction du chrome

est complète en 24 heures, tout comme dans les essais ne contenant pas de SDS.

Les résultats obtenus dans les expériences réalisées en incubant le surnageant SCr avec du Cu2+

en présence de protéases (protéinase K et pronase) ou de détergent (SDS) indiquent donc que

l’activité chromate réductase n’est très probablement pas de nature protéique. La bio-réduction de

chrome (VI) observée dans des cultures de Streptomyces thermocarboxydus NH50 n’est donc pas

une réduction enzymatique.

4.1.3.Précipitation du surnageant à l’éthanol

Le dosage des protéines par la méthode Bradford a révélé des teneurs inférieures au seuil de détection (de

l’ordre du mg.L-1). Nous avons cependant cherché à quantifier le contenu protéique, et avons pour cela procédé

à une précipitation à l’éthanol qui permet de concentrer les protéines (Figure 25).

La première étape à consister à vérifier que la précipitation à l’éthanol n’affectait pas l’activité chromate

réductase. Nous avons utilisé pour cela des surnageants S de cultures de 11 jours de S. lividans TK24 et de

S. thermocarboxydus NH50 en M63Y.


140


30°C

30°C Sp

Cr(VI) (1 mM), +/-Cu2+ (0,1 mM)

+ NADH (0,2 mM)

Reprise du culot dans 1 mL d’eau

Récupération du culot,

séchage au speedvac

Incubation 20 min sur la glace,

centrifugation 15000 g

1 mL d’éthanol 100 %

Aliquotes de 1 mL

Mycéliums de Streptomyces

Récupération du surnageant par centrifugation et filtration sur 0,2 µm

Réduction totale du chrome (VI) après

4 jours

11 jours de culture sans

chrome

Cr(VI) (1 mM) + Cu2+ 0,1 mM

Test de l’activité chromate réductase des surnageants non précipités

Dosage du

Cr(VI) après 4 jours Test de l’activité chromate réductase

des surnageants précipités

Figure 25 : Précipitation du surnageant S à l’éthanol

Nous avons précipité 1 volume de surnageant S par ajout d’un volume d’éthanol . Après incubation sur la

glace pendant 20 minutes et centrifugation, nous avons repris le culot par 1 volume d’H2O :

le surnageant que l’on appelle Sp n’a donc pas été concentré. La concentration en Cr(VI) est ensuite ajustée à 1

mM puis les échantillons sont incubés à 30°C pendant 4 jours. La réduction du chrome par les surnageants non

précipités est réalisée sans l’ajout de donneurs d’électrons exogènes. Comme nous ignorons si les donneurs

d’électrons endogènes seraient toujours présents dans les échantillons, nous avons décidé d’ajouter du NADH à

0,2 mM dans les échantillons Sp. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXVII.


141


Tableau XXVII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 jours à 30°C par les surnageants S et Sp de

S. lividans TK24 et S. thermocarboxydus NH50 en fonction de la présence de 0,1 mM de cuivre Cu2+ sous forme de

CuCl2 avec concentration initiale en Cr(VI) de 1 mM. Les surnageants Sp sont complémentés par 0,2 mM de

NADH en tant que donneur d’électrons

Sp TK24 + NADH 0,2 mM

Sp NH50 + NADH 0,2 mM

Eau + NADH 0,2 mM S TK24 S NH50

Sans Cu2+ 0,1 mM Cu2+ Sans Cu2+ 0,1 mM

Cu2+ Sans Cu2+ 0,1 mM Cu2+

0,1 mM Cu2+

0,1 mM Cu2+

% de réduction du Cr(VI) en 4 jours

28 % +/- 2

50 % +/- 1

50 % +/- 1

82 % +/-1

< 5 %

< 5 %

100 %

100 %

Les résultats obtenus en présence de 0,1 mM de Cu2+ avec les surnageants non précipités et précipités

montrent que la réduction du Cr(VI) est beaucoup moins importante avec les surnageants ayant été précipités à

l’éthanol. La précipitation permet donc de conserver une partie de l’activité réductrice.

Avec le surnageant Sp de la souche TK24, on observe en absence de Cu2+ environ 30 % de réduction du

chrome et 50 % avec le surnageant Sp de la souche NH50. La souche TK24 excrète dans son surnageant des

molécules capables de réduire le chrome (VI). Ce résultat est en accord avec celui obtenu précédemment et

présenté dans le Tableau XXIII page 128.

Les cultures de la souche de S. lividans TK24 permettent dans une moindre mesure de réduire le chrome

(VI) et le mécanisme impliqué semble être identique à celui présenté par la souche S. thermocarboxydus NH50 :

c’est-à-dire production de molécules dans le surnageant de culture capables de réduire le chrome et dont le

pouvoir réducteur est augmenté en présence de cuivre sous la forme Cu2+ (puisque l’ajout de cuivre permet

d’obtenir 50 % de réduction chez TK24 et 82 % chez NH50). Le surnageant Sp de NH50 permet dans les deux

conditions testées (avec ou sans cuivre) de réduire plus de chrome (VI). Ce résultat concorde avec celui présenté

dans le Tableau XXIII où l’on obtient un meilleur pourcentage de réduction du chrome avec la culture de la

souche NH50.

Le NADH est une molécule qui peut réduire le chrome (VI) de manière purement chimique sans la

présence d’enzyme. Nous avons donc cherché à évaluer si dans les conditions testées, la réduction par le NADH

était importante ou non. Les témoins réalisés avec de l’eau (Tableau XXVII) montrent que la réduction du

chrome par le NADH à 0,2 mM avec ou sans cuivre est négligeable (< 5 %).


142


Nous avons réalisé les même essais en multipliant par 10 la concentration de NADH (soit 2 mM) dans de

l’eau ou du M63 stérile avec et sans glycérol. La forte concentration en NADH permet d’observer une réduction

importante du chrome notamment dans le milieu M63. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXVIII.

Tableau XXVIII : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) à la concentration initiale de 1 mM dans

l’eau et dans les milieux M63 et M63Y avec ajout éventuel de 2 mM de NADH et/ou 0,1 mM de Cu2+

Sans ajout Cu 2+ 0,1 mM NADH 2 mM Cu2+ (0,1 mM) et NADH (2 mM)

H2O < 5 % < 5 % 11 24,5

M63 < 5 % < 5 % 40 60,4

% de réduction

du chrome (VI) en

24 heures à 30°C M63Y < 5 % < 5 % 41 60,0

Cette expérience montre que la présence de cuivre Cu2+ seul sans la présence de substrat réducteur ne

permet de réduire de manière significative le chrome (VI) contenu dans les essais. Que l’on ajoute ou non 0,1

mM de cuivre, la réduction est inférieure à 5 % quel que soit le milieu testé. En l’absence de cuivre ajouté, le

NADH à la concentration de 2 mM permet de réduire de manière abiotique 11 % du chrome dans de l’eau mais

peut réduire environ 40 % dans le milieu M63 avec ou sans glycérol. La présence de sels minéraux dans le milieu

M63 favorise la réduction abiotique du chrome par le NADH. Le glycérol, quant à lui, ne joue pas de rôle

puisqu’en présence ou non de 3 g.L-1 de glycérol, on observe environ 40 % de réduction par le NADH. Si l’on

ajoute du cuivre (0,1 mM) et du NADH (2 mM), le pourcentage de réduction abiotique du chrome augmente

encore pour atteindre environ 60 % dans le milieu M63 avec ou sans glycérol. Ce résultat indique que le cuivre

augmente de manière significative la réduction du chrome par le NADH. Ce phénomène ressemble beaucoup à

celui présenté par les surnageants de culture de la souche S. thermocarboxydus NH50 mais aussi par d’autres

souches de Streptomyces, où des molécules, qui vraisemblablement ne sont pas de nature protéique, réduisent le

chrome (VI), et de manière beaucoup plus rapide si on ajoute du cuivre.

Nous pouvons alors penser que les molécules présentes dans les surnageants sont des molécules de NADH.

Cependant, le NADH est à l’intérieur des cellules, il n’y a, a priori, aucune raison pour que ce type de molécules

se retrouve dans les surnageants de culture de Streptomyces. Nous verrons plus tard, grâce à une étude RMN, que

les surnageants de culture ne contiennent pas de NADH.

Nous avons voulu déterminer quels minéraux, contenus dans le milieu M63, favorisait la réduction abiotique

du chrome par le NADH. Nous avons donc préparé individuellement chacune des solutions salines stériles aux

concentrations présentes dans le milieu M63, et avons testé la réduction du Cr(VI) dans ces milieux avec ou sans

l’ajout de NADH et/ou de cuivre. Les résultats sont présentés dans le

Tableau XXIX.


143


Tableau XXIX : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) en 24 heures à 30°C en présence des

différents minéraux présents dans le milieu M63 en présence de 2 mM de NADH et/ou de 0,1 mM de CuCl2,

concentration initiale en Cr(VI) = 1 mM

Minéraux Sans ajout Cu2+ 0,1 mM NADH 2 mM Cu2+ (0,1 mM) et NADH (2 mM)

MgSO4 1,6 mM 8 9,1 4,5 45,5

FeSO4 3,2 µM 10,2 14,4 28,8 38,5

(NH4)2SO4 15 mM 5,1 9,3 57,2 73,6 KH2PO4 0,1 M 5,2 < 5 57,7 72,2

Les résultats obtenus montrent que chacun des minéraux présents dans le milieu M63 favorise la réduction

abiotique du chrome par le NADH en présence de 0,1 mM de Cu2+. En effet, si dans de l’eau pure, nous

n’observons en 24 heures qu’environ 25 % de réduction du chrome (VI) en présence de NADH et de Cu2+

(Tableau XXVIII), le pourcentage de réduction est de 45,5 % dans une solution de MgSO4 1,6 mM, et supérieur

à 70 % dans les solutions de (NH4)2SO4 15 mM ou KH2PO4 0,1 M.

Ces expériences avaient été réalisées pour trouver le ou les minéraux principalement responsables de cette

réduction abiotique afin d’envisager de diminuer leur concentration dans le milieu M63 et ainsi obtenir des

surnageants où la réduction abiotique serait mineure. Si un seul des minéraux avait été responsable de la

réduction abiotique du chrome (VI), nous aurions essayé de cultiver les différentes souches de Streptomyces dans

le milieu M63 dépourvu de ce minéral. Nous avons réalisé des cultures où les concentrations en KH2PO4 et en

(NH4)2SO4 étaient deux fois moins importantes. Dans ces conditions, la croissance bactérienne était fortement

ralentie. Nous n’avons donc pas modifié le milieu M63 pour obtenir des cultures bactériennes mais dans les

essais de réduction du chrome (VI) dans les surnageants de ces cultures en présence de NADH et de cuivre, il

conviendra de vérifier la part de la réduction abiotique dans les conditions testées.

4.1.4.Lyophilisation

La technique de précipitation à l’éthanol nécessite d’aliquoter le surnageant puis d’ajouter l’éthanol dans un

volume d’environ 20 mL compte tenu du matériel à disposition (volume maximal recommandé dans les tubes

compatibles avec la centrifugeuse SORVAL utilisée). Pour précipiter 100 mL de surnageant, il faut donc

fractionner au moins en 5 aliquotes, ajouter l’éthanol, précipiter sur la glace, centrifuger, éliminer l’alcool et

sécher le culot, puis le reprendre dans de l’eau et enfin rassembler les 5 fractions en une pour disposer d'un

stock à une certaine concentration identique pour les expériences suivantes. L’étape de séchage pour évaporer

l’éthanol était longue car les tubes utilisés pour la centrifugation ne pouvaient être placés dans le speed-vac

(appareil permettant de sécher rapidement les culots). Par conséquent, l’étape de séchage s’effectuait à

température ambiante sous atmosphère normale pendant plusieurs heures.

Pour limiter les opérations et le temps de séchage à température ambiante qui peuvent diminuer le contenu et la


144


qualité des surnageants, nous avons lyophilisé les surnageants à –55°C (appareil MODULYO modèle

EDWARDS sous 3.10-2 mbars). La poudre obtenue, de couleur blanche, a ensuite été reprise dans un volume

d’eau 10 fois inférieure au volume initial. Les échantillons obtenus sont donc concentrés 10 fois.

Nous avons testé l’activité chromate réductase d’un surnageant avant et après lyophilisation. Les surnageants

concentrés 10 fois après lyophilisation ont été dilués 10 fois pour cette expérience de façon à avoir une

concentration comparable dans les essais avant et après lyophilisation. Les résultats sont présentés dans le

Tableau XXX.

Tableau XXX : Pourcentage de réduction du chrome (VI) (à la concentration initiale de 1 mM) par un

surnageant de culture avant lyophilisation et après lyophilisation à –55°C avec ou sans cuivre Cu2+ à la

concentration de 0,1 mM après 1, 3 et 9 jours d’incubation à 37°C.

Avant lyophilisation Après lyophilisation à -55°C

Cu2+ Sans Cu2+ Cu2+ Sans Cu2+

Après 1 jour 36,7 10,7 41,1 23,4

Après 3 jours 72,3 25,7 ND ND


Après 9 jours ND ND 92,8 38,0

ND : non donné

Le surnageant utilisé pour cette expérience provient d’une culture de la souche NH50 de 10 jours en milieu

M63Y avec 1 mM de chrome (VI). Ce surnageant SCr a été filtré à 0,2 µm puis stocké à 4°C pendant 2 mois et

demi avant de le lyophiliser et de tester l’activité chromate réductase. Du fait de cette longue période de

stockage, nous avons d’abord vérifié que l’activité était toujours présente dans le surnageant non lyophilisé.

Nous observons en 3 jours environ 25 % de réduction en absence de cuivre et plus de 70 % de réduction en

présence de 0,1 mM de CuCl2 (Tableau XXX). Ceci nous indique qu’il existe une activité chromate réductase

non négligeable après un stockage de plusieurs mois à 4°C.

Les résultats présentés dans le Tableau XXXI montrent que le surnageant concentré dix fois peut réduire

100 % du chrome (VI) contenu dans les essais avec et sans cuivre en 9 jours. La concentration initiale en

chrome (10 mM) était 10 fois supérieure à celle utilisée habituellement. En parallèle, le même surnageant

lyophilisé mais resuspendu dans un volume final identique à l’initial (qui n’est donc pas concentré) ne peut pas

réduire la même quantité de chrome. Le pourcentage de réduction est d’environ 15 % avec cuivre et de 9 sans

cuivre. Dans les deux cas (surnageant concentré et non concentré), l’effet du cuivre est beaucoup moins net

qu’avec les surnageants non lyophilisés. Dans les essais où la concentration en chrome est de 1 mM, la


145


concentration en cuivre est de 0,1 mM soit dix fois moindre (soit un rapport Cu/Cr(VI) de 1/10). Dans cette

expérience, la concentration initiale en chrome est de 10 mM mais la concentration en cuivre est toujours de 0,1

mM (soit un rapport Cu/Cr(VI) de 1/100). C’est certainement en raison d’un rapport Cu/Cr(VI) beaucoup plus

faible que l’effet du cuivre est beaucoup moins important. Pour observer une différence significative entre les

conditions avec et sans cuivre, la concentration en cuivre devait être de l’ordre du millimolaire et non pas du

dixième de millimolaire.

Tableau XXXI : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les surnageants concentrés 10 fois et non

concentrés après lyophilisation avec ou sans Cu2+ à la concentration initiale de 0,1 mM.

Concentration initiale en Cr(VI) = 10 mM

Surnageant conc. 10 fois Surnageant non conc.

10 mM de Cr(VI)

Cu2+ Cu2+

Après 1 jour 44,3 +/- 5 40,0 +/- 5 < 5% < 5 % % de

réduction du Cr(VI) Après 9

jours 100 100 15 +/- 6 9 +/- 5

4.2. Fractionnement des surnageants de culture lyophilisés

D’après les résultats obtenus en présence de protéases, il semble que cette activité réductase ne soit pas

portée par une protéine enzymatique. Le dosage des protéines par la méthode de Bradford n’a pas permis

jusqu’alors de les quantifier et tous les gels de polyacrylamide réalisés avec des surnageants non concentrés

n’avaient pas permis, après coloration au bleu de Comassie, la visualisation de bandes. Disposant à présent de

surnageants lyophilisés, concentrés dix fois et possédant une activité chromate réductase, nous avons réalisé de

nouveaux gels de polyacrylamide avec des échantillons de S et SCr lyophilisés, concentrés 10 fois puis précipités

à l’acide tri-chloro-acétique et resuspendus dans un dixième du volume initial. Cette concentration par 100 par

rapport à un surnageant récupéré après culture permet la visualisation de nombreuses bandes qui correspondent

aux protéines présentes (photographie du gel de polyacrylamide non présentée). Les surnageants contiennent

donc des protéines mais en très faibles quantité. Il faut en effet concentrer l’échantillon 100 fois et colorer les

gels de polyacrylamide à l’argent (Silver Stain Plus de Biorad), méthode de coloration très sensible (30 à 50 fois

plus sensible que la coloration au bleu de Comassie).

Les surnageants contiennent donc de nombreuses protéines. Afin de déterminer si elles sont impliquées

dans l’activité chromate réductase, nous avons fractionné en fonction de leur poids moléculaire les différents

constituants présents dans les surnageants lyophilisés et concentrés dix fois.


146


Pour cela, nous avons filtré les surnageants et récupéré, après centrifugation à 5000 g pendant 6 h dans des

« concentrateurs » MACROSEPTM, les fractions supérieures et inférieures à 3000 Daltons ainsi que les fractions

supérieures et inférieures à 1000 Daltons. Les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 3000 Da sont

contenues dans la fraction que nous avons appelée R3000 et les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à

3000 Da sont contenues dans la fraction que nous avons appelée F3000.

Nous avons utilisé la même nomenclature pour les fractions supérieures et inférieures à 1000 Da. L’activité

chromate réductase de chacune des fractions provenant de surnageants S et SCr lyophilisés et concentrés dix

fois a été testée en incubant des échantillons contenant 1 mM de Cr(VI) avec ou sans la présence de CuCl2

pendant 1 nuit à température ambiante. Les résultats sont présentés dans le

Tableau XXXII.

Tableau XXXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les fractions R3000, F3000, R1000, F1000 des

surnageants S et SCr lyophilisés et concentrés dix fois en 10 à température ambiante.

Surnageant S lyophilisé et concentré 10 fois Surnageant SCr lyophilisé et concentré 10 fois

R3000 F3000 R1000 F1000 R3000 F3000 R1000 F1000

Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ -


9 5 95,6 76.7 24 17,2 100 57,2 9,6 5 100 94,2 28,9 20,3 100 80

M63Y lyophilisé et concentré 10 fois

R3000 F3000 R1000 F1000

Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ - Cu2+ -


7 5 6 5 6 7 8 4

[Cr(VI)] initiale = 1 mM et [CuCl2] = 0,1 mM

Les fractions qui présentent l’activité chromate réductase la plus importante sont les fractions F1000 et F3000.

En absence de Cu2+ ajouté, le pourcentage de réduction du Cr(VI) dans la fraction F3000 est supérieur à 75 %

dans le cas des fractions issues du surnageant S et supérieur à 94 % dans le cas des fractions issues du surnageant

SCr. En présence de Cu2+, la réduction du Cr(VI) est totale avec la fraction F1000 des deux surnageants.

On remarque que le surnageant SCr lyophilisé provenant d’une culture de la souche NH50 en présence de

Cr(VI) présente une activité chromate réductase supérieure à celle présentée par le surnageant S lyophilisé (issu

d’une culture sans Cr(VI)). Nous avions déjà observé cette différence lors des expériences avec les surnageants

non lyophilisés.


147


Les fractions R3000 qui contiennent des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 3000 Da,

présentent une activité bien moindre, comparable à celle mesurée dans des essais abiotiques contenant du milieu

M63Y traité dans les mêmes conditions que les surnageants (lyophilisation et concentration).

Ces résultats indiquent que les molécules de taille supérieure à 3000 Da, ce qui pour des protéines correspond à

plus de 30 acides aminés (1 aa correspond à environ 100 Daltons) ne sont pas impliquées dans l’activité

chromate réductase des surnageants de cultures de Streptomyces thermocarboxydus NH50. Les fractions R1000 des

surnageants S et SCr présentent une activité réductrice assez faible également puisque la réduction est comprise

entre 17 et 29 % du chrome (VI) présent en solution contre 60 à 100 % dans les fractions F1000. Ce sont donc

essentiellement des molécules de faible poids moléculaire (inférieur à 1000 Da) qui sont responsables de

l’activité chromate réductase mesurée dans les surnageants. La faible réduction observée dans les fractions R1000

peut s’expliquer par le fait que la « coupure » à 1000 Da n’est jamais parfaite : il reste toujours quelques

molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 1000 dans les fractions R1000. On peut aussi penser que

d’autres molécules dont le poids est compris entre 1000 et 3000 Daltons peuvent réduire le chrome (VI) mais de

manière beaucoup moins significative que les petites molécules (la différence est d’un facteur 4 environ).

Compte tenu du fait que l’ajout de protéases ou de SDS ne permet pas d’empêcher la réduction du chrome,

et que la majorité des molécules impliquées dans cette réduction a donc une masse moléculaire inférieure à 1000

Daltons, l’activité chromate réductase n’est très probablement pas une activité enzymatique.

Beaucoup de molécules de faible poids moléculaire sont capables de réduire le Cr(VI) en Cr(III). Kaiwar et

Rao (1995) ont étudié le pouvoir réducteur de certaines molécules biologiques vis-à-vis du chrome (VI).

Les molécules contenant un groupement thiol tiennent une place importante dans les phénomènes de

réduction du chrome dans les cellules. Le dérivé éthylester de la L-cystéine, le gluthation et la L-cystéine sont de

puissants réducteurs du Cr(VI). L’estérification du groupement carboxylique de la L-cystéine permet confère un

pouvoir réducteur plus important. L’estérification des groupements carboxyliques du glutathion conduit aussi à

une augmentation du pouvoir réducteur.

Les auteurs (Kaiwar et Rao, 1995) ont aussi testé la capacité des saccharides et de leurs dérivés à réduire le

chrome (VI). Dans les conditions normales de pH rencontrées dans les sols, la réduction est très lente. En

revanche, la réduction du Cr(VI) à pH 0,35 par ce type de molécule est possible mais elle est beaucoup moins

efficace que celle réalisée par les molécules à groupements thiols. La comparaison de plusieurs oses a montré

que la présence de deux fonctions alcools consécutives surtout en orientation cis et que la présence de

groupements carboxyliques favorisent la réduction du Cr(VI).


148


L’étude de la capacité des nucléotides et leurs dérivés à réduire le chrome (VI) à pH 0,35 (Kaiwar et Rao,

1995) a aussi montré que la guanine et la cytosine sont les nucléotides ayant le plus fort pouvoir réducteur. Le

nombre de phosphates liés aux nucléosides (nucléotide + pentose) augmente le pouvoir réducteur, ainsi l’ATP

est un meilleur réducteur que l’ADP, qui lui-même réduit plus efficacement le Cr(VI) que l’AMP. Il apparaît

aussi que les ribonucléotides sont plus efficaces que les désoxyribonucléotides. En effet, tout comme pour les

saccharides seuls, la présence de deux fonctions OH consécutives est primordiale pour une meilleure activité

chromate réductase.

Compte tenu du fait que la fraction ayant une activité chromate réductase est composée de molécules de

faible poids moléculaire, nous avons essayé de déterminer si la ou les molécules présentes dans la fraction F1000

des surnageants de culture de S. thermocarboxydus NH50 présentait des caractéristiques communes aux molécules

décrites ci-dessus. Pour cela, nous avons analysé, par résonance magnétique nucléaire (RMN) du 13C, les

fractions F1000 des surnageants de la souche NH50.

4.3. Etude par Résonance Magnétique Nucléaire du 13C

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une méthode d’analyse qualitative et quantitative dont le

principe est le suivant :

Lorsque le nombre de protons et de neutrons qui composent un noyau atomique n’est pas identique, le spin

total du noyau génère un dipôle magnétique le long de l’axe du spin et l’amplitude de ce dipôle est une

caractéristique propre du noyau considéré appelée moment magnétique nucléaire.

En pratique, on excite les atomes des molécules étudiées par un champ magnétique. Chaque atome résonne

à une fréquence qui lui est propre et qui dépend de son environnement chimique. L'atome ré-émet un signal à

cette fréquence. La superposition des signaux provenant de tous les atomes est enregistrée puis analysée.

L’isotope 12C du carbone est le plus abondant sur Terre. Cependant, cet atome possède un noyau composé

d’un nombre égal de protons et de neutrons. Par conséquent, cet atome ne possède pas de spin. C’est l’isotope 13C qui possède un spin. Ce sera donc la résonance du 13C, qui représente environ 1 % du carbone contenu dans

les molécules, qui sera mesurée dans la RMN du Carbone. En fonction de l’environnement chimique, c’est-à-

dire en fonction de la nature des atomes engagés dans une liaison avec le 13C considéré, la fréquence à laquelle

l’atome de carbone va résonner sera différente. Par exemple, un atome de 13C engagé dans une liaison avec un

atome d’azote résonnera à environ 50 ppm alors qu’un 13C impliqué dans un cycle aromatique résonnera entre

110 et 160 ppm environ.


149


Nous avons réalisé un spectre RMN 13C des fractions F1000 (qui contiennent l’essentiel de l’activité chromate

réductase) des surnageants S et SCr et d’un blanc abiotique composé uniquement du milieu de culture traité dans

les mêmes conditions que S et SCr (lyophilisation et concentration). Nous n’avons pas fait de spectres sur les

surnageants S et SCr non fractionnés car ils contiennent trop de molécules et le nombre de pics observés serait

beaucoup trop important pour pouvoir les analyser. Nous avons donc réalisé ces spectres sur les molécules dont

le poids moléculaire est inférieur à 1000 Daltons provenant d’échantillons concentrés de façon à observer des

pics d’une hauteur suffisante pour pouvoir être détectables. Les spectres du 13C des fractions F1000 des

surnageants S (en rouge) et SCr (en vert) sont comparés à celui du milieu M63Y (en bleu) dans la Figure 26 A, B

et C respectivement.

Une référence externe contenant de l’éthanol dans de l’acide méthylène diphosphonique (MDP) dans un

capillaire en verre, a été placée dans deux des échantillons. L’éthanol est une molécule possédant 2 atomes de

carbone. Un des atomes de carbone appartient à un groupement méthyl et résonne à 18,06 ppm en présence de

MDP. L’autre carbone est engagé dans une liaison avec l’oxygène du groupement alcool et résonne à 58,24 ppm.

Cette référence permet de comparer les spectres deux à deux. La référence a été la même d’un échantillon à

l’autre, la hauteur des pics correspondant à l’éthanol permet d’estimer la hauteur relative des autres pics des deux

spectres comparés. Dans le spectre du milieu M63Y (Figure 26 B), on observe les deux pics correspondant à

l’éthanol puis deux autres pics à 63,2 et 72,9 qui correspondent aux deux types de carbone présents dans la

molécule de glycérol. En effet cette dernière est une molécule symétrique. Les carbones C1 et C3 sont liés

chacun avec un autre carbone, deux atomes d’hydrogène et avec l’oxygène du groupement alcool. Le carbone

C2, qui est au milieu de la molécule, est lié avec les carbones C1 et C3, un atome d’hydrogène et avec l’atome

d’oxygène. Deux résonances sont donc associées à la molécule de glycérol, celle à 72,9 ppm qui correspond au

carbone C2 et celle à 63,2 ppm qui correspond aux carbones C1 et C3 (c’est pour cette raison que la hauteur du

pic à 63,2 ppm est beaucoup plus grande). On retrouve les pics à 63,2 et 79,9 ppm dans les surnageants S et SCr.

Mais la hauteur de ces pics est beaucoup plus petite que celle observée dans le milieu M63Y. En effet, dans le

milieu M63Y, les pics à 63,2 et 72,9 ppm sont beaucoup plus grands que ceux de l’éthanol à 58,24 et 18,07 ppm

(Figure 26 B). Par contre, dans la fraction F1000 du surnageant SCr, la hauteur des pics à 63,2 (glycérol) et à 58,24

(éthanol) sont quasiment identiques (Figure 26 C). Dans le milieu M63Y, il y a donc beaucoup de plus de

glycérol que dans la fraction F1000 de SCr où il a été consommé par la souche NH50 pendant la culture.

En fonction des atomes liés au carbone, celui-ci ne résonnera pas à la même fréquence. On peut ainsi définir

différentes zones dans un spectre. Les atomes de carbone résonnent entre 0 et 220 ppm.

Entre 0 et 30 ppm, on retrouve les carbones engagés dans une liaison de type alcane. Aux environs de 50 et 60

ppm, on trouve les liaisons C-N et C-O respectivement. Entre 110 et 160 ppm, on trouve les carbones engagés

dans une double liaison (alcène et C aromatique). Entre 160 et 180 ppm, ce sont les carbones formant un

groupement ester, amide ou acide qui résonnent et au-delà de 190, ce sont les carbones formant les cétones et

les aldéhydes.


150


Les spectres du carbone de S et de SCr se ressemblent beaucoup (Figure 26). Les pics supplémentaires par

rapport au témoin M63Y (indiqués par une flèche) résonnent à la même fréquence dans S et SCr. On observe

cependant deux pics de faible amplitude dans SCr autour de 180 ppm qui ne sont pas détectés dans S. Il est

possible que les atomes de carbone correspondant à ces deux pics existent dans S mais qu’on ne les observe pas

car ils sont confondus avec le bruit de fond du signal. Nous avons étudié plus précisément les fréquences de

résonance des atomes de carbone de SCr en agrandissant le spectre de celui-ci. Le détail du spectre est présenté

dans la Figure 27.


151

RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES A : F1000 surnageant S

Glyc

érol

C1

et C

3 (6

3,2)

Glyc

érol

C2

(72,

9)

spik

e

spik

e

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

B : milieu M63 Y

Glyc

érol

C1

et C

3 (6

3,2)

Glyc

érol

C2

(72,

9)

spik

e *

spik

e *

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

C : F1000 du surnageant SCr

Glyc

érol

C1

et C

3 (6

3,2)

*

*

Glyc

érol

C2

(72,

9)

spik

e

spik

e

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

Ester, amide, acide C=C et C aromatique C—O C—N C—C (alcane) Cétone, aldéhydes

Figure 26 : Spectres RMN du 13C : A : de la fraction F1000 du surnageant S ; B : du milieu M63Y avec une référence éthanol ;

C : de la fraction F1000 du surnageant SCr avec une référence éthanol.

Les deux pics correspondants aux atomes de carbone de la référence éthanol sont indiqués par un astérisque (C1 et C2 à 18,07 et 58,24 ppm respectivement).Les deux « spikes » observés dans chacun des spectres sont des artefacts que l’on retrouve toujours aux mêmes résonances.

152


Région du spectre où l’on retrouve les atomes de carbone engagés dans une liaison alcane ex : chaîne latérale des acides aminésA : de 16,8 à 22,8 ppm

Atomes de carbone engagés dans une fonction carboxylique COOH (acides aminés)

Atomes de carbone engagés C—O (sucres)

Glyc

érol

C2

Atomes de carbone engagés dans les liaisons C—N et C—O (ex : acides aminés et sucres)

Glycérol C1 et C3

Référence éthanol C2

Référence éthanol C1

D : de 172 à 189 ppm

189 188 187 186 185 184 183 182 181 180 179 178 177 176 175 174 173 (ppm)

179.

7842

183.

2637

96.6 96.4 96.2 96.0 95.8 95.6 95.4 95.2 95.0 94.8 94.6 94.4 94.2 94.0 (ppm)

93.8

466

96.7

349

C : de 93,8 à 96,8 ppm

73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 (ppm)

58.4

055

58.2

400

61.2

266

63.3

033

69.2

075

73.0

644

72.8

818

71.8

236

70.4

139

B : de 57,5 à 73,5 ppm

22.8 22.4 22.0 21.6 21.2 20.8 20.4 20.0 19.6 19.2 18.8 18.4 18.0 17.6 17.2 16.8 (ppm)

17.6

426

18.0

665

18.0

596

20.8

997

21.5

098

Figure 27 : Agrandissements du spectre RMN du 13C du carbone de la fraction F1000 du surnageant SCr

153


Dans la Figure 27 A, on retrouve vers 18 ppm le pic correspondant au carbone 1 de l’éthanol de la

référence. On observe en outre 3 pics (à 17,6 ; 20,9 et 21,5 respectivement) qui peuvent correspondre à

des atomes de carbone engagés dans des liaisons de type alcane. De nombreux carbones d’acides aminés

résonnent dans cette zone. Puis entre 58 et 73 ppm (Figure 27 B), on observe, en plus de la référence de

l’éthanol à 58,24 ppm, 6 pics à 61,2 ; 63,3 ; 69,2 ; 70,8 ; 72,9 et 73,0 respectivement. Les pics à 63,3 et 72,9

correspondent aux atomes de carbone du glycérol. Entre 58 et 60 ppm, on retrouve généralement d’autres

carbones d’acides aminés et aux environs de 70 ppm, ce sont les atomes de carbone de nombreux sucres

qui résonnent. On trouve deux autres pics à 93,8 et 96,7 (Figure 27 C) qui se trouvent dans une région où

résonnent des carbones de molécules appartenant à la famille des sucres et enfin les deux derniers pics

visibles sont à 179,8 et 183,3 ppm (Figure 27 D) où résonnent, entre autre, les atomes de carbone des

groupements carboxyliques des acides aminés par exemple. Aucun pic n’a pu être observé dans la zone où

résonnent les atomes de carbone engagés dans un cycle aromatique (110-160 ppm). Donc le surnageant

SCr ne contient pas de molécule contenant un ou plusieurs cycles aromatiques.

Un récapitulatif des pics observés dans la fraction F1000 du surnageant SCr est présenté dans le Tableau

XXXIII (la fraction F1000 du surnageant S présentent les mêmes pics sauf ceux vers 180 ppm). Les surfaces

de pics sont déterminées par l’appareil de mesure : on fixe arbitrairement à 1 l’intensité d’un pic (ici celui à

183,26 ppm) et l’intensité des autres pics est calculée par rapport à celle du pic choisi. L’intensité des pics

est proportionnelle au nombre d’atomes de carbone engagés dans la liaison correspondant à la fréquence

mesurée.

On observe que les pics correspondant au glycérol (63,3 et 72,9 ppm) présentent les intensités les plus

importantes ce qui signifie que le glycérol est la molécule que l’on retrouve majoritairement dans la

fraction analysée. La ou les autres molécules présentes le sont à des concentrations beaucoup plus faibles.

Si l’on se réfère aux données présentées en annexe, on peut remarquer que les résonances observées dans

la fraction F1000 ne correspondent à aucune molécule listée. Certains pics se retrouvent dans certaines des

molécules listées mais aucune de ces molécules ne présente l’ensemble des pics présentés dans le Tableau

XXXIII. Il ne nous est donc pas possible de déterminer avec certitude la ou les molécules présentes.

Néanmoins, nous pouvons dire que les résonances observées pourraient être celles de molécules

semblables à des acides aminés puisque nous détectons des pics dans la zone 0-30 ppm qui peuvent

correspondre à des atomes de carbone engagés dans des liaisons alcanes de chaîne latérale, puis un pic vers

40 ppm qui correspond aux liaisons de type C-N rencontrées dans tous des acides aminés, et enfin des

pics dans la région 160-170 ppm où résonnent les groupements carboxyliques des acides aminés.

L’aspartate qui contient deux groupements COOH présente deux résonances à 175 et 178,3 ppm. Nous

avons donc dans la fraction F1000 du surnageant SCr soit une molécule avec 2 groupements COOH, soit


154


2 molécules avec 1 groupement COOH chacune compte tenu du fait que l’intensité de chacun des pics est

comparable. Les résonances observées entre 60 et 90 ppm suggèrent fortement la présence d’un sucre. Les

carbones du glucose et du ribose résonnent dans cette zone.

Nous avions observé dans les expériences présentées page 143, que le NADH peut réduire le Cr(VI)

et que la vitesse de réaction est augmentée en présence d’ions Cu2+. Ce phénomène est le même que celui

observé avec les surnageants de culture. On pouvait donc penser que les surnageants contenaient des

molécules de NADH. La molécule de NADH est composée d’un noyau adénosine et d’un noyau

nicotinamide. Dans les résonances présentées par la fraction F1000, nous n’observons pas de pics dans la

zone 120 à 150 ppm où 5 atomes de carbone de l’adénosine résonnent. Ceci indique que dans les

molécules présentes dans F1000, on ne trouve pas le noyau adénosine. Ces molécules ne sont donc pas du

NADH.

Tableau XXXIII : Intensités et fréquences auxquelles résonnent les carbones des molécules présentes

dans la fraction F1000 du surnageant SCr.

ppm intensité Type de liaison

ppm intensité Type de liaison

17,1498 0,52 72,8818 1 10,18

17,6469 1,08 73,0644 ND

20,8997 1,53

alcane

73,2659 1,02

C—OH

40,8182 1,23 93,8466 1,11

61,2266 1,02 96,7349 ND

63,3033 1 16,21 161,6232 0,75

69,2075 1,70 179,7842 0,90

70,4139 0,99 183,2629 1 COOH

71,8236 1,29

C—N et

C—OH

1 résonance des atomes de carbone du glycérol C1 et C3 à 72,8818 et C2 à 63,3033 ppm. ND : non déterminée.


155


5.Conclusion

Les résultats obtenus en présence de protéases ou de détergent indiquent que la bio-

réduction de chrome (VI) observée dans des cultures de Streptomyces thermocarboxydus

NH50 n’est pas une réduction enzymatique. Les spectres RMN du carbone du surnageant

SCr ont révélé la présence de petites molécules contenant plusieurs atomes de carbone

présentant de fortes homologies avec les acides aminés et les sucres. Si nous ne pouvons pas

déterminer avec exactitude le nombre de molécules différentes présentes dans la fraction

F1000 du surnageant SCr ni leur formule chimique, nous pouvons dire qu’il ne s’agit pas de

NADH.


156

RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ

III. ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN

PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ

1.Caractéristiques du sol

Le sol que nous avons utilisé pour ces expérimentations est issu d’un site pollué de la région Rhône-

Alpes présentant des concentrations en métaux lourds importantes (voir Matériels et Méthodes)

Le site, anciennement protégé de la pluie par un auvent, est aujourd’hui à l’exposition de toutes

intempéries suite à la chute de cet auvent. Ceci explique les différences de teneurs en chrome (VI)

obtenues lors d’un deuxième prélèvement : en 1999, les concentrations en chrome (VI) dans le sol étaient

comprises entre 30 et 80 mg.kg-1. Nous avons donc dû re-polluer le sol en ajoutant du dichromate de

potassium. Trois niveaux de pollutions en Cr(VI) ont été obtenus : 300 mg.kg-1 (extraction alcaline),

1108 et 1216 mg.kg-1 (extraction à l’eau et alcaline respectivement) et enfin 2000 et 2300 mg.kg-1

(extraction à l’eau et alcaline respectivement). Nous avons aussi mesuré le carbone organique total (COT)

qui est de 33000 mg.kg-1. Des essais de lixiviation de ce sol ont été réalisés en mettant en contact 100 g de

sol avec 1 litre d’eau déminéralisé avec un renouvellement à deux reprises de l’éluat après 16 h de contact.

Ces essais, réalisés par POLDEN, ont montré que 1842 mg.kg-1 de Cr(VI) est lixiviable soit 80 % du

Cr(VI) total présent dans le sol. Tout le Cr(VI) lixiviable est sous forme (VI). Concernant la COT, on

retrouve 858 mg de carbone organique en solution pour 1 kg de sol.

Pour réduire et donc immobiliser le chrome dans un sol, on peut stimuler et/ou augmenter la

microflore endogène ou encore apporter une souche exogène réductrice dans le sol. Différents paramètres

peuvent influencer l’efficacité de la réduction du Cr(VI), en particulier, la présence ou non d’oxygène et

l’apport de minéraux et de carbone.


157


2.Réduction du chrome (VI) dans un sol pollué : étude en milieu

dispersé (batch)

Dans un premier lieu, deux conditions d’incubation ont été testées : l’aérobiose et l’anaérobiose.

Comme nous l’avons vu dans la bibliographie, la bio-réduction du Cr(VI) est en effet possible en

aérobiose ou en anaérobiose. Les premières expériences avaient été réalisées par Nathalie Huck (1997) en

aérobiose et avaient montré une activité chromate reductase. Lucile Barthet pendant son DEA (2000) a

testé les conditions anaérobies afin de déterminer si l’absence d’oxygène était plus favorable à la bio-

réduction du Cr(VI).

2.1. Conditions aérobies

Dans un premier temps, nous avons testé différents milieux liquides (eau et M63) dans lesquels le sol

est mis en suspension (sans enrichissement de la flore microbienne) et différentes sources de carbone

(glucose (glc) 10 g.L-1 (soit 333 mM de carbone) et glycérol (Y) 3 g.L-1 (soit 83 mM de carbone)) afin de

déterminer les conditions les plus favorables pour stimuler l’activité réductrice contenue dans le sol.

Chaque condition a été réalisée en triplicat.

La Figure 28 montre qu’une disparition significative du chrome (VI) n’a pu être observée que dans

une seule condition : en apportant des minéraux et du glucose. Si l’on n’apporte que de l’eau, ou si l’on

remplace le glucose par du glycérol, nous n’observons pas de réduction du chrome. Pourtant dans tous les

essais, une microflore abondante, visible à l’œil nu, s’est développée même sans apport de source de

carbone et/ou de minéraux. Le sol contient des molécules organiques (COT = 33000 mg.kg-1) et

minérales en quantité suffisante qui permettent le développement de la microflore. Celle-ci n’a pas été

quantifiée compte tenu de la difficulté à effectuer cette mesure. En effet, dans les différents Erlenmeyers,

le milieu est devenu trouble mais on observe la présence d’amas de cellules ressemblant à des

champignons formant des agglomérats. Il est assez difficile d’estimer rapidement le nombre de micro-

organismes par simple dilution d’un échantillon et lecture de la densité optique à 600 nm. La présence

d’agglomérats de taille variable ne permet pas de prélèvement homogène. Un témoin abiotique M63 +

glucose avec un agent biocide (azoture de sodium 0,2 %) a révélé l’absence de réduction du chrome dans

ces conditions. Cet essai témoin confirme bien que la disparition du chrome (VI) est reliée à l’activité de

micro-organismes vivants.


158


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20

temps en jours

mM de Cr(VI) en solution

0

10

20

30

40

50

60

mg/L de Cr(VI) en solution

H2OH2O + GlcH2O + YM63M63 + GlcM63 + Y

Figure 28 : Réduction du Cr(VI) dans des suspensions de sols pollués dans différentes conditions (eau

ou M63 avec ou sans glucose 10 g.L-1 (glc) ou glycérol 3 g.L-1 (Y)), 2,5 g de sol dans 100 mL de milieu,

incubation à 30°C, agitation orbitale 120 rpm.

Sachant que la souche responsable de la réduction du chrome était un Streptomyces, (voir § 1.1 du

chapitre I des Résultats) nous avons essayé de retrouver ce genre bactérien après étalement de différentes

dilutions sur des boîtes de Petri PEG 1 mM de Cr(VI). Nous avons utilisé les essais où la réduction avait

été la plus efficace c’est-à-dire M63 + glucose. Après incubation à 30°C sur des boîtes contenant du

chrome, nous avons observé l’aspect des colonies isolées.

La première remarque a été le développement très important et rapide de champignons filamenteux

sur beaucoup de boîtes. Pour ne sélectionner que les bactéries, un agent anti-fongique a été ajouté. Nous

avons cherché sur ces boîtes des bactéries possédant les caractéristiques des Streptomyces, c’est-à-dire des

bactéries s’accrochant à l’agar. Aucune bactérie de ce type n’a été retrouvée. Il est possible que l’étape

d’enrichissement soit nécessaire pour avoir quelques colonies sur boîte. Le Streptomyces effectuant la

réduction du chrome, isolé par N. Huck (1997), ne constituait pas la population dominante des micro-

organismes résistants au chrome, même après l’étape d’enrichissement. Il est possible que nous n’en ayons

pas observé ici à cause de la nécessité d’enrichir la population réductrice.


159


Un autre paramètre à considérer est le stockage du sol à 4°C pendant une longue période (depuis

1995). Il est tout à fait possible que la population bactérienne globale soit modifiée compte tenu des

niveaux de survie différents à cette température. Disposant de la souche isolée par Nathalie Huck, nous

n’avons pas continué dans cette voie. Elle avait été entreprise car les conditions de conservation de la

souche pure n’avaient pas été optimales. Nous aurions souhaité disposer d’une souche endogène n’ayant

pas subi de dommages consécutifs à une déshydratation importante (paragraphe 1.2 du chapitre I des

Résultats). Toutes les études sur la souche pure ont donc été réalisées à partir de la souche NH50 isolée

par Nathalie Huck et qui avait été stockée pendant 1 an sur milieu gélosé.

2.2. Conditions anaérobies

En condition anaérobie, la réduction des sulfates en sulfures par les bactéries sulfato-réductrices (BSR)

présentes naturellement dans certains sols peut permettre soit la précipitation des métaux sous la forme de

sulfures soit la réduction des métaux par le sulfure d’hydrogène synthétisé par les BSR (bio-réduction

indirecte). Nous avons donc incubé le sol pollué au Cr(VI) en anaérobiose à 30°C avec un milieu

contenant des sulfates (1,6 mM de MgSO4 dans le milieu M63).

Les deux sources de carbone testées sont le glucose et l’éthanol. Il n’y a pas d’enrichissement avec une

souche bactérienne exogène. La différence principale (outre l’aération) par rapport à l’expérience en

aérobiose, décrite au paragraphe précédent, est le ratio L/S. Dans le premier cas, nous avons incubé 2,5 g

de sol avec 100 mL (= 100 g) de milieu liquide soit un ratio de 40. Pour l’expérience en anaérobiose, nous

avons choisi un ratio de 10 (10 g de sol pour 100 mL de milieu liquide, ce qui explique les concentrations

initiales en Cr(VI) plus importantes dans le deuxième cas. Afin de pouvoir comparer plus facilement les

résultats, nous avons reproduit les expériences en aérobiose avec un ratio de 10. Les résultats des

cinétiques obtenues (moyenne de trois essais) en aérobiose et en anaérobiose sont présentés dans les

figures suivantes.

Dans les deux conditions testées, la concentration maximale de chrome (VI) en solution est atteinte

seulement après 2 jours d’agitation (à t=2 jours, C = 190 mg.L-1 de chrome (VI) en solution). On observe

que la réduction du chrome (VI) par la microflore endogène du sol étudié est plus faible en condition

anaérobie qu’en condition aérobie pour la durée d’incubation testée (3 semaines à 30°C). Dans le meilleur

des cas, c’est-à-dire avec le glucose comme source de carbone, la bio-réduction du chrome (VI) n’atteint

que 25% en condition anaérobie contre plus de 50% avec la même source de carbone en condition

aérobie. Les essais en présence de biocide, ou sans source de carbone ou avec l’éthanol donnent des

résultats similaires (environ 15% de bio-réduction) indiquant d’une part que l’éthanol ne permet pas

d’augmenter la bio-réduction et d’autre part que l’essentiel de la réduction observée est alors de nature

chimique.


160


0

25

50

75

100

125

150

175

200

0 5 10 15 20

jours

mg/L de Cr(VI)

biocide

sans carboneorganique

glucose

Figure 29 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore

endogène en condition aérobie en milieu M63. Influence de la source de

carbone organique. (30°C, 10 g de sol dans 100 mL de milieu)

0

25

50

75

100

125

150

175

200

0 5 10 15 20

jours

mg/L de Cr(VI)

biocide

sans carboneorganique

glucose

éthanol

Figure 30 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore

endogène en condition anaérobie en milieu M63. Influence de la source de

carbone organique. (30°C, 10 g de sol dans 100 mL de milieu)


En conclusion, les essais de bio-réduction du chrome (VI) indiquent que la bio-réduction du chrome

(VI) par la microflore endogène du sol est plus faible en condition anaérobie qu’en condition aérobie dans

les conditions de culture testées.

Dans cette première partie de l’étude, nous avons vérifié que les conditions testées par

Nathalie Huck pendant son DEA (1997) étaient les plus propices à l’observation de la

disparition du chrome (VI). En effet, l’incubation en anaérobiose d’une suspension de sol

avec du glucose ou de l’éthanol (conditions testées par Lucile Barthet (2000)) ne permet pas

d’obtenir de réduction significative du Cr(VI) en solution par rapport aux témoins

abiotiques. Le fait qu’en milieu M63 la réduction soit plus importante en aérobiose qu’en

anaérobiose est en accord avec le type de souche isolée ayant une activité chromate

réductase. En effet, il s’agit d’un Streptomyces thermocarboxydus qui est une bactérie décrite

comme étant strictement aérobie. L’étude de la réduction du chrome (VI) avec des

suspensions de sol (« milieu dispersé ») a été réalisée dans l’objectif d’évaluer la faisabilité

du traitement du sol pollué au chrome. Les expériences décrites dans les paragraphes

suivants ont donc été réalisées en aérobiose.

2.3. Réduction du chrome (VI) par la flore endogène aérobie

Comme nous venons de le voir, le sol pollué étudié contient une flore microbienne aérobie capable de

réduire le chrome (VI) en condition aérobie. Nous avons testé différentes conditions de culture afin de

connaître celles qui sont optimales pour une réduction rapide.

2.3.1.Effet de la source de carbone

Afin de réduire microbiologiquement le Cr(VI) dans un sol pollué, il est nécessaire d’apporter une

source de carbone mais à des doses trop élevées pour ne pas obtenir des concentrations résiduelles de

COT trop grandes. Le glycérol (noté Y) qui permet d’obtenir des résultats bien meilleurs avec la souche

pure (voir § II 2.2) présente l’avantage d’apporter peu de carbone organique comparé au glucose. En effet

3 g.L-1 de glycérol correspond à 83 mM d’atome de carbone contre 333 mM lorsque que l’on apporte

10 g.L-1 de glucose. Nous avions déjà testé cette source de carbone dans les premières expériences avec du

sol (voir Figure 28 page 159). Seul le glucose permettait d’obtenir la réduction du chrome (VI) dans les

essais. Dans le cas où l’on travaille avec des suspensions de sol, le glucose est donc une bien meilleure

source de carbone.


162


Le fait que les résultats divergent de ceux obtenus en cultures pures peut s’expliquer par le fait que le

glycérol est peut-être métabolisé plus vite par toute la flore présente dans le sol ce qui réduit sa

disponibilité pour la souche réductrice. On peut aussi imaginer que dans un milieu aussi complexe que le

sol, le glycérol se combine avec d’autres molécules présentes dans la suspension, le rendant ainsi

indisponible pour le métabolisme de Streptomyces thermocarboxydus NH50. Nous avons aussi testé d’autres

concentrations en glucose moins importantes pour limiter l’apport de carbone organique, mais 10 g.L-1 est

la concentration optimale (voir chapitre II de la partie Résultats § 2.2). Dans le souci de n’apporter que ce

qui est nécessaire à un échantillon de sol pour permettre la réduction du chrome (VI), nous avons testé

l’absence de nutriments minéraux apportés. Il apparaît que, même si l’on apporte la source de carbone la

plus favorable pour la réduction du chrome, à savoir le glucose, il n’est pas possible d’obtenir une

réduction efficace (voir Figure 28).

Compte tenu de ces résultats, nous choisirons d’apporter du glucose plutôt que du glycérol

lorsque nous travaillerons avec des suspensions de sol.

2.3.2.Effet d’une augmentation de la flore endogène

Dans cette étude, 2,5 g de sol pollué (à environ 1000 mg de Cr(VI) par kg de sol) ont, dans un premier

temps, été incubés pendant 18 jours à 30°C en suspension dans 100 mL de milieu nutritif minéral M63

complémenté en glucose (10 g.L-1). Puis le mélange a été décanté pour récupérer le surnageant. 5 mL de ce

surnageant, contenant la flore endogène enrichie, a servi à inoculer un nouvel essai contenant 2,5 g de sol

et 95 mL de milieu M63 glucose (10 g.L-1). Le mélange obtenu est incubé dans les mêmes conditions

expérimentales que précédemment et on suit la concentration en Cr(VI) en solution en fonction du temps.

Sur la Figure 31, on observe nettement l’effet positif de l’inoculum qui enrichit la suspension de sol en

micro-organismes réducteurs de chrome (VI). Cette étape d’enrichissement permet de ne pas attendre que

la flore endogène se développe en présence de chrome et d’autres métaux toxiques présents dans le sol

pollué étudié.


163


05

101520253035

0 5 10 15 20

jours

mg,L-1 de Cr(VI)

sol

sol enrichi

Figure 31 : Effet de l’enrichissement en flore endogène sur l’évolution de la concentration en chrome dans les

essais contenant 2,5 g de sol (pollution initiale environ 1000 mg.kg-1) pour 100 mL de milieu minéral liquide

M63 glucose (10 g.L-1).

2.3.3.Effet de la concentration initiale en glucose

Dans cette expérience, nous avons incubé pendant 21 jours à 30°C 10 g de sol dans 100 mL de milieu

minéral M63 avec des concentrations variables en glucose (essais en triplicats). Les résultats sont présentés

dans la Figure 32.

On remarque que plus la concentration en glucose est importante, plus la réduction du chrome est

rapide et ceci pour deux raisons essentielles : la matière organique est plus importante et peut réduire le

chrome de façon abiotique, et le glucose présent permet une croissance optimale de la microflore qui peut

réduire le chrome. Les essais similaires ont été réalisés dans les mêmes conditions mais avec un apport de

la souche NH50 (sous forme de spores). Les résultats (Figure 33) sont identiques à ceux obtenus avec la

flore endogène seule (Figure 32). Nous avions remarqué, dans les expériences précédentes que l’apport

d’un inoculum (flore endogène enrichie) permettait de réduire plus rapidement le Cr(VI) contenu dans le

sol (Figure 31). On constate ici que l’apport de la souche pure sous forme de spores ne permet pas

d’accélérer les cinétiques de réduction du Cr(VI). Il est possible que la quantité de spores ne soit pas

suffisante pour accélérer la réduction ou que la forme sous laquelle est apportée la souche NH50 ne soit

pas adéquate. Les spores sont des cellules dont le métabolisme est ralenti. Apporter Streptomyces

thermocarboxydus NH50 sous forme de mycéliums pourrait peut-être permettre de réduire plus rapidement

le chrome présent. Cette hypothèse sera testée plus loin ( III 2.4.2).


164


0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20temps (jours)

0 g/L

1 g/L

10 g/L

100 g/L

Abs

54

0nm

nor

mali

sée

(10

g so

l/1

00 m

L m

ilieu

liqu

i

Figure 32 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la

réduction du Cr(VI) en suspension de sol sans enrichissement (L/S = 10,

température d’incubation : 30°C)

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20temps (jours)

0 g/L

1 g/L

10 g/L

100 g/L

Abs

540

nm n

orm

alisé

e (1

0g so

l/10

0 m

L m

ilieu

liqu

ide)

Figure 33 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la

réduction du Cr(VI) en suspension de sol avec enrichissement (NH50 sous

forme de spores) (L/S = 10, température d’incubation : 30°C)


2.3.4.Effet de la concentration initiale en chrome (VI)

Le chrome (VI), ainsi que les autres métaux contenus dans le sol pollué étudié, peut présenter une certaine

toxicité pour la flore microbienne endogène et exogène. En faisant varier la quantité de sol par unité de volume

de milieu liquide, on peut modifier la concentration initiale en chrome dans les essais. Comme nous avons dû

re-contaminer le sol, nous disposons cependant d’échantillons avec des degrés de pollution variable permettant

de travailler à des concentrations variables en Cr(VI) tout en maintenant le même ratio L/S dans les essais.

a Essai avec la flore endogène sans enrichissement

Pour cette expérience, nous avons choisi de garder le même ratio L/S dans les essais : seule la

concentration en chrome présente dans le sol varie d’un essai à l’autre. Ainsi le ratio L/S n’influencera pas les

résultats, et l’on pourra observer l’effet de la concentration initiale en Cr(VI). Le Tableau XXXV donne les

résultats obtenus pour trois concentrations initiales différentes. Pour ces expériences, nous avons complémenté

le milieu M63 par du glucose à 10 g.L-1 et tous les essais ont été réalisés en triplicats.

Tableau XXXV : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore

endogène en condition aérobie après 21 jours d’incubation à 30°C en suspension de sol (milieu M63, glucose à

10 g.L-1, ratio L/S = 100 mL pour 10 g de sol).

Concentration initiale en Cr(VI) moyenne *

% de réduction du chrome (VI) masse de Cr(VI) réduit

200 mg.L-1 (4 mM) 50 % +/- 3 9,4-10,6 mg

100 mg.L-1 (2 mM) 83 % +/- 4 7,9-8,7 mg

50 mg.L-1 (1 mM) 99 % +/- 1 4,9-5 mg

* : en considérant que la totalité du chrome (VI) apporté par le sol passe en solution


167


Si l’on s’intéresse au pourcentage de réduction du chrome, on peut remarquer que l’efficacité de réduction

augmente lorsque la concentration en Cr(VI) diminue. Cependant puisque les concentrations initiales en Cr(VI)

sont différentes, il convient d’analyser les résultats en quantité de chrome réduit. On remarque, dans ce cas,

que la masse de chrome réduit augmente fortement lorsque la concentration en Cr(VI) passe de 50 à

100 mg.L-1, pour augmenter plus faiblement quand on passe à une concentration initiale en Cr(VI) de 200

mg.L-1. On peut penser à un effet inhibiteur du Cr(VI) à des concentrations dépassant 100 mg.L-1. Pour réduire

en totalité le Cr(VI) à partir d’une concentration initiale de 200 mg.L-1, une durée d’incubation supérieure à 42

jours serait nécessaire d’après les données du Tableau XXXV. Travailler sur une durée si longue demande de

vérifier régulièrement l’évaporation. De plus, la source de carbone peut devenir limitante. Pour maintenir la

croissance microbienne et ainsi permettre la réduction complète du Cr(VI) à partir d’une concentration initiale

élevée, il est possible que du glucose doive être rajouté dans l’Erlenmeyer.

b Essai avec la flore endogène enrichie

Ces essais ont été réalisés en mettant le sol en suspension dans le milieu liquide M63 avec 10 g.L-1 de

glucose surnageant inoculé avec le surnageant d’une suspension de sol d’un essai précédent. Cette procédure

permet d’enrichir la suspension de sol avec la flore endogène. Nous avons travaillé avec le sol pollué à environ

1000 mg de Cr(VI).kg-1. La concentration initiale en Cr(VI) a ici été contrôlée en utilisant des masses

différentes de sol dans les différents essais pour un même volume de milieu liquide. On peut cependant

considérer que la variation du ratio L/S n’a probablement pas, dans les limites utilisées ici (de 10 à 40) d’effet

significatif sur l’activité microbienne. Les résultats ont été reportés dans le Tableau XXXVI.

Tableau XXXVI : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore

endogène enrichie en condition aérobie après 3 jours d’incubation à 30°C (100 mL de milieu M63,

glucose 10 g.L-1).

g de sol Concentration initiale en Cr(VI) moyenne *

% de réduction du chrome (VI) mg de Cr(VI) réduit

2,5 (L/S = 40) 25 mg.L-1 (0,5 mM) 98 +/- 2 2,4-2,5 mg

5 (L/S = 20) 50 mg.L-1 (1 mM) 99 +/- 1 4,9-5 mg

10 (L/S = 10) 100 mg.L-1 (2 mM) 21,5 +/- 4 1,75-2,55 mg

* : en considérant que la totalité du chrome (VI) apporté par le sol passe en solution

On remarque que la réduction est beaucoup plus rapide lorsque la suspension est enrichie par la flore

endogène (Tableau XXXVI) que dans l’essai précédent (Tableau XXXV). On note qu’à 100 mg.L-1 la réduction

ne concerne que 21,5 % du chrome présent soit entre 1,7 et 2,5 mg. Lorsque la concentration en chrome est

deux fois plus faible, la réduction est deux fois plus rapide (5 mg de Cr(VI) en 3 jours pour une concentration

initiale de 50 mg.L-1 contre environ 2 mg pour une concentration initiale de 100 mg.L-1). Pour les


168


concentrations initiales en Cr(VI) de 25 et 50 mg.L-1, 3 jours d’incubation à 30°C suffisent ici à réduire la quasi-

totalité de Cr(VI) (Tableau XXXVI), alors que sans enrichissement préalable, un temps d’incubation plus long

est nécessaire (Tableau XXXV). Cependant, lorsque que la concentration initiale en Cr(VI) est de 100 mg.L-1,

on observe que la réduction du Cr(VI) est moins rapide puisqu’en 3 jours d’incubation, seuls 2 mg de Cr(VI)

sont réduits en moyenne, contre environ 5 mg pour une concentration initiale en Cr(VI) de 50 mg.L-1

(Tableau XXXVI). L’effet inhibiteur apparaît donc dès 100 mg.L-1 soit 2 mM. Lors de l’étude de la réduction

du Cr(VI) par des cultures pures de la souche NH50, nous avons toujours utilisé une concentration initiale de 1

mM de Cr(VI) car à partir de 2 mM, les mycéliums de Streptomyces thermocarboxydus NH50 avaient beaucoup de

difficulté à se développer.

Nous avions aussi testé l’ajout de 2 mM de chrome (VI) dans des cultures de 3 jours où les mycéliums

s’étaient développés sans la présence de chrome et nous avions constaté que la vitesse de réduction était

beaucoup plus longue qu’avec une concentration en Cr(VI) deux fois moindre. Dans les expériences réalisées

en milieu dispersé avec la flore endogène enrichie, nous observons 21,5 % de réduction en 3 jours avec une

concentration initiale en Cr(VI) de 2 mM (Tableau XXXVI), pourcentage de réduction jamais atteint aussi

rapidement avec une telle concentration initiale en Cr(VI) en culture pure. Il semble donc qu’en culture pure, la

réduction du chrome (VI) soit inhibée par de plus faibles concentrations initiales en Cr(VI). Travailler en milieu

dispersé permet de réduire le Cr(VI) plus rapidement et à des concentrations en Cr(VI) plus importantes qu’en

cultures pures.

2.4. Réduction du chrome (VI) par des flores exogènes aérobies

Comme nous avons pu l’observer dans les paragraphes précédents, la réduction du chrome (VI) contenu

dans le sol pollué est plus rapide lorsque la suspension de sol est inoculée par une culture mixte de la flore

endogène. Ces essais avaient pour objectif de déterminer si l’enrichissement de la flore endogène du sol

(technique dite de bio-augmentation) permettrait d’améliorer le rendement de bio-immobilisation du chrome

(VI) présent à concentration relativement élevée. Nous avons aussi envisagé d’enrichir le sol avec une souche

pure plutôt qu’avec une culture mixte afin d’enrichir la suspension de sol par la bactérie endogène responsable

de la réduction (Streptomyces thermocarboxydus NH50) ou par une souche exogène. Nous avons donc utilisé une

souche de Pseudomonas fluorescens LB300, provenant de la collection ATCC (American Type Culture Collection)

référence 27663 et décrite dans la littérature comme réduisant le Cr(VI) en Cr(III) enzymatiquement, et la

souche que nous avons isolée du sol pollué lui-même, Streptomyces thermocarboxydus NH50. Ces deux souches

bactériennes ont été ajoutées à des suspensions de sol et la réduction du chrome (VI) a été suivie afin de

déterminer les conditions les plus favorables au phénomène de réduction du chrome.


169


2.4.1.Pseudomonas fluorescens LB300

La première série d’expériences a consisté à vérifier qu’une culture pure de la souche de Pseudomonas

fluorescens LB300 dont nous disposions réduisait effectivement le chrome (VI). Ces essais préliminaires ont été

réalisés sans sol afin de ne pas avoir de problème de toxicité liée à la présence d’autres métaux contenus dans le

sol. Les résultats sont présentés dans la Figure 34.

0

10

20

30

40

50

0 5 10 15 20 jours

mg.L-1 de Cr(VI) en solution

glucose 10g/Lglycérol 3 g/L

Figure 34 :Bio-réduction du chrome (VI) par Pseudomonas fluorescens LB 300 en culture pure en milieu M63

à 30°C. Influence de la source de carbone (glucose.10 g.L-1 ou glycérol à 3 g.L-1 soit respectivement 333 et

83 mM de carbone)

On remarque que la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 est capable de réduire le chrome (VI) mais de

manière efficace seulement en présence de glucose. Il faut néanmoins une vingtaine de jours pour voir

disparaître tout le chrome (VI). Nous obtenions des cinétiques identiques pour le glucose avec Streptomyces

thermocarboxydus NH50 (voir Figure 18 page 126). Le glycérol qui permet d’obtenir des cinétiques plus rapides

avec la souche NH50, permet un bon développement bactérien de P. fluorescens LB300 mais ne permet de

réduire le chrome (VI) que de 20 %.

Après avoir vérifié que la souche P. fluorescens réduisait le chrome (VI) en milieu liquide, nous avons testé

son efficacité sur des suspensions de sol. Les essais ont été réalisés en mettant en suspension 10 g de sol dans

100 mL de milieu M63 avec ou sans glucose, inoculé par P. fluorescens LB300 (voir Matériels et Méthodes).

Les résultats sont donnés dans le Tableau XXXVII.


170


Tableau XXXVII : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol par Pseudomonas fluorescens LB300 en 21

jours d’incubation à 30°C.

g.L-1 de glucose

Concentration initiale en Cr(VI) en solution après 2

jours

% de réduction du chrome (VI)

mg de Cr(VI) réduit

P. fluorescens 0 200 mg.L-1 6 % +/- 1 1-1,4 mg

P. fluorescens 10 200 mg.L-1 22% +/- 2 4-4,8 mg

Flore endogène non enrichie 10 200 mg.L-1 50 % +/-3 9,4-10,6 mg

Les résultats obtenus révèlent que l’apport exogène de Pseudomonas fluorescens LB300 ne permet pas

d’augmenter la bio-réduction du chrome (VI) contenu dans le sol. Cette bio-réduction est même moins

importante qu’avec la flore endogène non enrichie. La faible réduction du chrome (VI) par P. fluorescens LB300

dans ces essais en suspension de sol pourrait s’expliquer par la concentration en chrome quatre fois plus élevée

que dans les essais préliminaires (Figure 34) qui pourrait avoir un effet inhibiteur sur la souche. Les résultats

obtenus avec cette souche exogène n’étant pas meilleurs, ni même équivalents à ceux obtenus avec la flore

endogène non enrichie, nous avons choisi de ne pas continuer davantage avec Pseudomonas fluorescens LB300.

2.4.2.Streptomyces thermocarboxydus NH50

a Enrichissement sous forme de spores

Nous avons essayé d’enrichir la suspension de sol par cette souche afin d’améliorer l’efficacité de la

réduction. La disparition du chrome (VI) a été suivie dans des essais contenant 10 g de sol (Cr(VI) à environ

2000 mg.kg-1) et 100 mL de milieu minéral liquide M63 complémenté ou non en glucose. 400 µL d’une

suspension de spores ont été apportés dans chaque essai, soit une concentration dans le milieu liquide de

107 spores.mL-1, concentration relativement suffisante pour voir le phénomène de réduction apparaître assez

rapidement (en culture pure : voir chapitre II des Résultats § 2.1). Les résultats sont présentés dans la

Figure 35.


171


0

50

100

150

200

0 5 10 15 20 jours

mg.L-1 de Cr(VI) en solution

sansglucose

glucose à10 g/L

Figure 35 : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par ajout de la souche Streptomyces

thermocarboxydus NH50 sous forme de spores (107 spores.mL-1, 30°C).

Ces résultats montrent que l’ajout de spores de NH50 à une suspension de sol permet une réduction de

40 % ± 5 du chrome présent initialement en 21 jours en présence de glucose 10 g.L-1. Si nous comparons ces

résultats à ceux obtenus avec la flore endogène non enrichie dans les mêmes délais et avec la même

concentration initiale en chrome dans le sol (Tableau XXXV page 167), nous remarquons que l’enrichissement

par S. thermocarboxydus NH50 sous forme de spores n’améliore pas la réduction (50 % sans enrichissement et 40

% avec). De la même manière qu’avec P. fluorescens LB300 ( III 2.4.1 page 170), l’introduction d’une souche

pure comme inoculum n’améliore donc pas la réduction, voire la rend moins efficace. L’ajout d’une souche

pure exogène ou endogène enrichie peut provoquer une compétition entre les micro-organismes qui peut

conduire à la diminution d’activité de la population réduisant le chrome. Un autre facteur peut entrer en jeu.

Un certain temps s’est écoulé entre la série d’essais avec la flore endogène et ceux avec la flore exogène. Il est

possible que la population endogène soit modifiée tant quantitativement que qualitativement. Si l’on répète les

manipulations avec un échantillon de sol qui a été conservé plusieurs mois à 4°C, il faut plus de temps pour

avoir le même pourcentage de réduction. On peut aussi penser que le fait d’ajouter la souche NH50 sous forme

de spores n’est pas la meilleure méthode comme nous l’avions observé au § III 2.3.3 Figure 32 et Figure 33.

En effet ces bactéries existent dans le sol sous forme de mycélium. La présence du chrome et d’autres métaux

dans le sol peut ralentir la germination des spores et le développement des mycéliums de Streptomyces. C’est

pour cette raison que nous avons comparer l’efficacité de la bio-réduction en fonction de la forme sous laquelle

était apportée la souche NH50.


172


b Ensemencement de S. thermocarboxydus NH50 sous la forme mycélienne

Pour produire un mycélium, les spores doivent germer. Pour cela, il est nécessaire que le milieu de culture

soit riche. Nous avons donc incubé les spores 2 jours dans 50 mL de milieu LB à 30°C pour permettre aux

spores de germer et de donner naissance à un mycélium important. Cette culture a ensuite été centrifugée et le

culot lavé puis resuspendu dans 100 mL de milieu minéral M63 glucosé (10 g.L-1) afin de n’apporter dans les

essais que les mycéliums et non pas du milieu LB. Puis 10 g de sol pollué ont été mis en suspension dans ce

milieu. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXXVIII.

Tableau XXXVIII : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par Streptomyces

thermocarboxydus NH50 sous forme de spores ou de mycélium en 16 jours à 30°C.

Concentration maximale en Cr(VI) en solution

% de réduction du chrome (VI)

NH50 spores 200 mg.L-1 35 % +/- 5

NH50 mycélium 200 mg.L-1 60 % +/- 4

Flore endogène 200 mg.L-1 40 % +/-3

Le Tableau XXXVIII montre que l’ensemencement de la suspension de sol par Streptomyces thermocarboxydus

NH50 sous la forme mycélienne permet d’augmenter le rendement de bio-réduction du chrome (VI). En effet,

60 % du chrome (VI) initialement présent dans le sol est réduit après 16 jours d’incubation en condition

aérobie.

Sur des échantillons de sol fortement pollué, la croissance des micro-organismes est difficile et ralentie à

cause de la toxicité des métaux présents. L’ajout de spores de NH50 ne permet pas d’améliorer l’efficacité de la

bio-réduction. Par contre, si cette même quantité de spores est au préalable germée en milieu riche, la

réduction est un peu plus rapide.

Utiliser la microflore endogène d’un sol dans un procédé de dépollution est intéressant mais peut présenter

des inconvénients. En effet, il faut être sûr qu’entre les études de faisabilité en laboratoire et les applications

industrielles éventuelles, la population globale du sol ne sera pas modifiée si l’on veut obtenir des résultats

comparables. Or le stockage du sol pendant plusieurs mois peut être à l’origine d’une baisse d’activité des

micro-organismes d’intérêt. Elaborer un procédé utilisant une souche pure exogène ou endogène enrichie

présente l’avantage permet d’espérer une meilleure reproductibilité. La survie et le bon développement dans le

sol de la souche ainsi apportée seront a priori meilleurs dans le cas d’une souche endogène. On peut envisager

de travailler avec la flore endogène mixte enrichie mais il est assez difficile de contrôler sa qualité sur de

longues périodes. Il faut en effet maîtriser les conditions de culture pour conserver préserver toutes les

caractéristiques de la flore mixte. Or il est tout à fait possible que les cultures successives en présence de

chrome provoquent des mutations telles que les propriétés initiales de l’inoculum soient affectées.


173


Dans la perspective de la mise au point d’un procédé de traitement de sol pollué au chrome hexavalent

avec apport de flore exogène ou endogène enrichie (afin d’avoir des résultats plus reproductibles qu’avec la

flore endogène dont la qualité peut varier en fonction du temps de stockage mais aussi du sol considéré), nous

avons continué à envisager l’utilisation de la souche de S. thermocarboxydus NH50. Cette souche peut être

apportée sous forme de mycéliums ou les surnageants de culture peuvent être utilisés puisque les travaux

présentés au chapitre II ont montré qu’ils referment l’activité réductrice.

2.5. Conclusions

Les résultats obtenus en suspension de sol nous ont permis de constater que les conditions

d’incubation aérobie donnent une meilleure réduction biologique du chrome (VI) en chrome

(III) qu’en condition d’incubation anaérobie.

La souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée au LAEPSI et la souche Pseudomonas

fluorescens LB 300 utilisées pour ensemencer le sol pollué n’ont pas permis d’augmenter très

significativement le rendement de réduction du chrome (VI) à teneur relativement élevée dans le

sol. Néanmoins, compte tenu des résultats sensiblement meilleurs avec S. thermocarboxydus

NH50 sous forme de mycéliums, les essais en microcosmes et en lysimètres seront réalisés avec

cette souche. En outre, il s’avère indispensable d’ajouter une source de carbone organique et de

préférence sous la forme de glucose pour garantir le bon développement des micro-organismes

endogènes et/ou exogènes responsables de l’activité bio-réductrice.

Enfin, la localisation extra-cellulaire de l’activité réductrice de S. thermocarboxydus NH50 permet

d’envisager des expériences utilisant les propriétés réductrices des surnageants de culture pour

réduire le chrome (VI) contenu dans le sol. L’utilisation de ces surnageants pourra permettre de

s’affranchir du problème de toxicité de certaines substances contenues dans le sol vis-à-vis de la

flore endogène ou exogène


174


3.Expériences en microcosmes

Les études en microcosmes (« image réduite du monde ») consistent à incuber de petites quantités de sol

avec un milieu liquide pour reproduire un scénario de traitement in-situ ou ex-situ selon les cas. Contrairement

aux essais décrits précédemment, le sol n’est pas mis en suspension par agitation dans une phase aqueuse. Dans

les expériences en microcosmes, le ratio L/S est en effet diminué par rapport aux essais en milieu dispersé afin

de réduire le volume réactionnel pour se retrouver dans des conditions visant à simuler l’incubation du sol en

biopile. Plus les volumes sont importants, plus la gestion du procédé sera difficile et coûteuse. C’est pour ces

raisons que nous avons étudié ici l’immobilisation du chrome dans le sol en utilisant de faibles volumes de

milieu liquide.

Nous avons vu précédemment dans les expériences en milieu dispersé (voir III 2) que la source de carbone

avec laquelle nous obtenions les meilleurs résultats était le glucose. La plupart des expériences seront donc

conduites en présence de cette source de carbone mais nous avons cependant testé le glycérol pour

vérification. Nous avions aussi montré que la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 n’était pas aussi efficace

que la souche endogène NH50 pour la réduction du chrome contenu dans le sol ( II 2.4.1). L’essentiel des

essais a donc été conduit avec la souche S. thermocarboxydus NH50. Certains essais ont toutefois été réalisés avec

la souche P. fluorescens LB300 pour comparaison.

3.1. Effet de l’apport d’un inoculum de NH50 (sous forme de spores)

et de la source de carbone pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de

100/8/0,5/1,25

Ces expériences ont été réalisées avec le sol pollué à 300 mg.kg-1 de Cr(VI). Nous avons incubé 10 g de sol

(apportant 3 mg de Cr(VI)) avec 3 mL de milieu liquide. Dans les essais en culture pure avec la souche NH50

en milieu M63 glucose (10 g.L-1), la concentration en chrome (VI) était généralement de 1 mM soit 50 mg.L-1.

Nous avons choisi de garder, pour ces premières expériences en microcosmes, un rapport carbone/Cr(VI)

identique à celui des expériences en culture pure (soit 80 mg de carbone/mg de Cr(VI) correspondant à un

rapport massique C/C de 100/1,25). Si l’on suppose que la totalité du Cr(VI) (sous forme de CrO42-) oxyde le

glucose selon la réaction suivante :

C6H12O6 + 8 CrO42- + 34 H+ → 8 Cr3+ + 6 HCO3- + 20 H2O


175


1 mole de glucose réagit avec 8 moles de Cr(VI). Dans nos essais, nous avons apporté 3 mg de Cr(VI) soit

environ 57,7 µmoles qui peuvent donc oxyder 7,21 µmoles de glucose (soit environ 1,3 g de glucose)

Dans ce cas le rapport C/Cr(VI) est de 100/600. En utilisant le rapport C/N de 100/1,25, nous sommes en

très large excès de carbone par rapport au chrome (VI). L’excès de glucose sert, pour une majeure partie, à la

croissance des micro-organismes Cependant, cette quantité excessive de carbone peut augmenter

significativement le phénomène de réduction abiotique.

Nous avons donc apporté 0,6 g de glucose ou 1,2 g de glycérol sous forme de poudre dans chacun des

essais. L’azote et le phosphore sont ensuite ajoutés (sous forme de (NH4)2SO4 et de Na2HPO4 en poudre) de

façon à obtenir un rapport massique C/N/P de 100/8/0,5 proche du rapport admis comme idéal (100/4/1)

pour le développement de la microflore. Le pourcentage de réduction du Cr(VI) est calculé en faisant le

rapport de la quantité de Cr(VI) restant dans le sol après 3 semaines d’incubation (déterminé par extraction à

l’eau sur la totalité de l’échantillon) sur la quantité de Cr(VI) contenu dans 10 g de sol avant incubation. Les

résultats obtenus, présentés dans le Tableau XL, sont la moyenne de 3 essais pour chacune des conditions

testées. L’incubation a eu lieu à 30°C à l’obscurité dans des boîtes de Petri en verre de 9 cm de diamètre.

Tableau XL :Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d’incubation à 30°C en microcosmes

(10 g de sol apportant 3 mg de Cr(VI) et 3 mL de milieu liquide) avec un rapport massique C/N/P/ Cr(VI) de

100/8/0,5/1,25)

Stérilisation préalable du sol (autoclavage) oui non non non

Inoculum exogène non non NH50 (109 spores)

NH50 (109 spores)

Source de carbone ratio C/N/P 100/8/0,5 Glucose (0,2 g/mg de Cr(VI)) Glycérol (0,4 g/mg de Cr(VI))

% de réduction 45 % ± 3 80 % ± 4 80 % ±-4 25 % ± 2 Cr(VI) réduit 1,35 mg 2,4 mg 2,4 mg 0,75 mg

En considérant que l’autoclavage a été efficace, on observe que la réduction abiotique du Cr(VI) est très

importante et atteint 45 % (Tableau XL). Le glucose, qui est à la concentration de 200 g.L-1 dans les 3 mL de

milieu liquide, peut être un donneur d’électrons qui permet de réduire le Cr(VI) en Cr(III). Avec du sol non

stérile (donc avec la flore endogène), et avec 0,2 g de glucose/mg de Cr(VI), on atteint 80 % de réduction,

pourcentage identique à celui obtenu avec l’ajout de la souche NH50 au sol non stérile. L’ajout de la souche

NH50 sous forme de spores au sol non stérile ne permet pas d’obtenir des résultats significativement

supérieurs comparés à ceux avec la flore endogène ce qui confirme les résultats obtenus en milieu dispersé.

Les résultats obtenus ne justifient pas que l’on dope le sol avec une quantité importante de glucose car cette

quantité de carbone organique supplémentaire augmente uniquement la réduction abiotique du chrome.


176


Le Tableau XL montre, d’autre part, que même avec des quantités importantes de glycérol (0,4 g/mg de

Cr(VI)), la réduction du chrome est relativement faible. En effet, avec une flore endogène active et la souche

NH50, la réduction du chrome n’atteint que 25 % soit quasiment deux fois moins que sans aucune activité

microbienne mais avec 0,2 g de glucose/mg de Cr(VI). Ce résultat confirme le résultat obtenu en milieu

dispersé présenté dans la Figure 28 page 159 à savoir que le glycérol n’est pas la source de carbone appropriée

pour permettre la réduction du chrome (VI) en présence de sol.

3.2. Effet de l’apport d’un inoculum (NH50 ou LB300) pour un

rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5 (milieu M63)

Cette deuxième série d’expériences a été réalisée avec du sol pollué à raison d’environ 1000 mg de Cr(VI)

par kg de sol. Le Tableau XLI présente les pourcentages de réduction du Cr(VI) obtenus en incubant 5 g de sol

(apportant 5 mg de Cr(VI)) dans 3 mL de milieu M63 à 7,5 g.L-1 de glucose (rapport C/N/P de 100/14/103) à

30°C pendant 3 semaines et à l’obscurité (chaque essai a été réalisé en triplicat). Le rapport C/Cr(VI) est ici de

100/55,5, ce qui correspond à un apport de carbone 45 fois plus faible (par mg de Cr(VI)) que dans l’essai

précédent mais le glucose est toujours en excès. Pour réduire 5 mg de Cr(VI), il faudrait, selon l’équation

précédente 2,16 mg de glucose. Dans ces essais, nous en apportons seulement 7 fois plus de glucose que

nécessaire (contre environ 450 fois trop dans l’expérience précédente).

Cette expérience a permis d’observer que la réduction du Cr(VI) dans le sol non stérile est négligeable (de

l’ordre de 3 %). Le faible rapport C/Cr(VI) utilisé ici par rapport aux essais précédents explique la quasi-

absence de réduction abiotique d’une part et de réduction par la flore endogène d’autre part. L’apport d’un

inoculum de la souche NH50 sous forme de mycélium au sol non stérile ne permet pas la réduction du chrome

(VI). Par rapport aux essais où la suspension de sol était agitée, nous nous trouvons ici avec des volumes

beaucoup plus petits ce qui signifie une concentration en chrome (VI) en solution très grande (si tout le

chrome (VI) contenu dans le sol passe en solution, nous attendons des concentrations de l’ordre de

1670 mg.L-1). Dans ce cas il est donc possible de penser à un effet toxique du chrome compte tenu des hautes

concentrations en solution. Cette toxicité pourrait expliquer le faible taux de réduction observé même avec

l’apport de NH50.

Cependant si l’on apporte un inoculum de NH50 sous forme de mycélium, au sol stérile, on observe un

pourcentage de réduction de 57 %. Il semble donc que dans le premier cas, le principal phénomène qui

empêchait la réduction du chrome était la compétition de NH50 apportée avec les micro-organismes

endogènes déjà présents. Le fait de stériliser le sol permet de s’affranchir de cette compétition. Ainsi, les

nutriments apportés sont disponibles exclusivement pour la souche NH50 ajoutée.


177


Tableau XLI : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d’incubation à 30°C en

microcosmes (5 g de sol apportant 5 mg de Cr(VI) et 3 mL de milieu M63 à 7,5 g.L-1 de glucose avec

S. thermocarboxydus NH50 et P. fluorescens LB300 avec un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5

Stérilisation préalable du sol (autoclavage)

non oui non oui

Inoculum exogène non NH50 (mycélium) 1

NH50 (mycélium)1 LB3001

% de réduction 3 % +/-2 57 % +/-3 3 % +/-2 28 % +/-4

Cr(VI) réduit 0,15 mg 2,85 mg 0,15 mg 1,4 mg 1 : les inoculums proviennent d’une culture de la souche correspondante de 6 jours en milieu minéral sans chrome à 30°C.

Les essais avec la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 confirment ceux obtenus en milieu dispersé.

Cette souche réduit le chrome (VI) présent dans le sol mais en réduit moitié moins que la souche de Streptomyces

dans les mêmes conditions.

Ces deux premières séries d’expérience en microcosmes n’ont pas permis d’obtenir une réduction totale du

chrome (VI) dans le sol en trois semaines. L’incubation du sol avec une si faible quantité de liquide entraîne

des concentrations très fortes en ions chromate en solution et donc une toxicité possible pour la flore

endogène ou exogène. Dans cette série d’essais, l’apport réduit de carbone peut également expliquer que la

réduction du Cr(VI) ne soit pas totale. On observe également, comme dans les essais en milieu dispersé, que

l’apport exogène de P. fluorescens LB300 ou de spores de S. thermocarboxydus NH50 dans du sol non stérile ne

permet pas d’améliorer la réduction du Cr(VI). Nous avons enfin constaté à nouveau que la source de carbone

la plus adaptée pour avoir une flore endogène ou exogène active en présence de sol est le glucose plutôt que le

glycérol.

Les études complémentaires en microcosmes que nous allons présenter dans les paragraphes suivants ont

donc été conduites avec des volumes de liquide plus importants et sur une durée un peu plus longue pour

tenter d’obtenir des réductions totales. D’autre part, ces travaux ont porté sur l’utilisation des surnageants de

culture pour tenter de s’affranchir des problèmes de toxicité possibles avec les cellules vivantes.


178


3.3. Etude en microcosmes de la réduction par des surnageants de

culture

Lors de l’étude de la réduction du chrome (VI) en culture pure de Streptomyces thermocarboxydus NH50 (voir

chapitre II de la partie Résultats), nous avons observé que l’activité réductrice était contenue dans le

surnageant. La souche NH50 produit des molécules capables de réduire le chrome (VI) en chrome (III). Le

principal avantage d’utiliser des surnageants de culture est que l’on n’utilise pas d’organismes vivants pour

réduire le chrome, on apporte les molécules actives produites. Ainsi, nous n’avons plus les problèmes liés à la

toxicité du chrome et des autres métaux présents dans le sol pollué à traiter.

3.3.1.Effet de la dilution des surnageants

Lorsque nous avons étudié la réduction du chrome par S. thermocarboxydus NH50 en culture pure, nous

avions observé que :

- la réduction est plus rapide si la source de carbone est du glycérol,

- l’activité réductrice est contenue dans le surnageant de culture de ces bactéries et est d’autant plus

efficace que les bactéries ont été en contact avec du chrome au préalable (le surnageant S, provenant d’une

culture de quelques jours de NH50 en milieu minéral glycérolé, est moins efficace que SCr, provenant d’une

culture de la même souche dans le même milieu mais contenant initialement une concentration en chrome

de 1 mM).

Nous avons donc, dans ces essais en microcosmes, utilisé le surnageant SCr le plus actif obtenu d’une

culture de la souche NH50 en milieu minéral M63 + glycérol + 1 mM de Cr(VI). Ce surnageant, après avoir été

filtré sur filtre 0,2 µm pour éliminer toute cellule bactérienne, a été utilisé pur ou dilué au ½ ou au 1/10. Pour

comparer les pourcentages de réduction, nous avons incubé 2,5 g de sol dans 25 mL de milieu M63Y, milieu

qui sert à obtenir le surnageant SCr.

Pour cette expérience, nous avons utilisé le sol à 1800 mg de Cr(VI) par kg. L’incubation a lieu à 30°C à

l’obscurité pendant 4 semaines et chaque essai a été réalisé en triplicat. Le pourcentage de réduction du Cr(VI)

est calculé comme précédemment en faisant le rapport de la quantité de Cr(VI) restant dans le sol après

4 semaines d’incubation (déterminé par extraction à l’eau sur la totalité de l’échantillon) sur la quantité de

Cr(VI) contenu dans le sol avant incubation.


179


Cette troisième série d’expériences a été réalisée en boîtes de Petri en verre avec des quantités de liquide

8 fois plus importantes que dans les deux premières séries (soit 25 mL de milieu liquide pour 4,5 mg de Cr(VI)

contre 3 mL pour 5 mg de Cr(VI) précédemment). De cette façon, si l’on suppose que tout le chrome (VI)

passe en solution, la concentration initiale en chrome dans ces expériences serait de l’ordre 180 mg.L-1 (3,5 mM

de Cr(VI)) contre environ 1600 mg.L-1 dans les essais précédent. Les résultats obtenus sont présentés dans le

Tableau XLII.

Tableau XLII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 semaines d’incubation à 30°C en

microcosmes (2,5 g de sol non stérile apportant 4,5 mg de Cr(VI) et 25 mL de surnageants de culture de

S. thermocarboxydus NH50, de milieu M63 (rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/15) ou d’eau

Milieu liquide M63 + glycérol (3 g.L-1) SCr pur SCr ½ SCr 1/10 eau

Inoculum non NH50 (spores) non non non non

% de réduction 28,9 % ± 4 55, 6 % ± 2 99,6 % ± 0,4 51,2 % ± 3 17,8 % ± 5 26,7 ± 5

Cr(VI) réduit 1,3 mg 2,5 mg 4,48 mg 2,3 mg 0,8 mg 1,2 mg

On remarque que dans les essais contenant du sol non stérile (donc avec la flore endogène active) et du

milieu minéral glycérolé, on obtient environ 29 % de réduction ce qui est comparable au pourcentage de

réduction obtenu en incubant le sol avec de l’eau. La flore endogène est donc peu active dans ces conditions

car le glycérol n’est pas une source de carbone favorable. Si l’on ajoute la souche NH50 sous forme de spores,

on atteint environ 55 % de réduction du chrome. Ces résultats montrent que le fait d’avoir augmenté le ratio

L/S permet d’avoir une concentration en chromates en solution plus faible et donc moins toxique pour la

souche NH50 ajoutée. Dans les essais précédents avec 3 mL de milieu minéral glucosé pour 5 g de sol non

stérile contenant 5 mg de Cr(VI), nous obtenions à peine 3 % de réduction du chrome (voir Tableau XLI) alors

que NH50 était apportée sous forme de mycélium dont on a montré qu’elle était plus favorable (voir § III

2.4.2).

L’apport de la souche NH50 en présence de sol non stérile peut donc donner de meilleurs rendements de

réduction du chrome à condition d’avoir une concentration en chromates pas trop élevée.

Les résultats montrent aussi que l’utilisation de surnageant pur permet d’obtenir une réduction du Cr(VI)

quasi complète. La dilution au ½ ne permet de réduire que la moitié du chrome présent et la dilution au 1/10

donne un pourcentage de réduction du Cr(VI) similaire à celui obtenu avec de l’eau compte tenu des

incertitudes expérimentales.


180


Cette troisième série d’expériences a donc donné des résultats encourageants quant à l’utilisation des

surnageants de cultures de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 pour réduire le chrome (VI) contenu

dans un sol pollué.

3.3.2.Utilisation de surnageants lyophilisés et concentrés

Dans les expériences précédentes en microcosmes avec les surnageants de culture de la souche NH50,

nous avons utilisé des volumes de liquide relativement importants par rapport aux quantités de sol à traiter

(2,5 g de sol dans 25 mL de milieu liquide soit 10 litres pour 1 kg de sol). Il nous est apparu intéressant de

chercher à réduire ces volumes.

Nous avons, pour cela, utilisé la technique de lyophilisation à –55°C sous une pression de 10-2 bars (voir

page 144). Après lyophilisation, les surnageants ont été resuspendus dans 1/10ème du volume initial pour

concentrer les molécules actives. Nous avons d’abord vérifié que ces surnageants lyophilisés étaient toujours

capables de réduire le chrome (VI). Nous avons incubé les surnageants SCr concentrés 10 fois (SCr conc.) avec

1 ou 10 mM de chrome (VI) en présence de 0,5 mM cuivre et nous avons comparé ces résultats à ceux obtenus

avec un surnageant SCr non concentré et ceux obtenus avec le milieu de culture M63Y concentré stérile afin de

vérifier que le milieu de culture seul n’est pas responsable de la réduction du chrome. Les résultats sont

indiqués dans le Tableau XLIII.

Tableau XLIII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en solution par SCr et SCr et M63 Y concentrés

10 fois en présence de cuivre Cu2+ en 24 heures à 30°C.

SCr SCr SCr conc. SCr conc. M63Y conc.

Concentration initiale en

Cr(VI) 1 mM 10 mM 1 mM 10 mM 10 mM

% de réduction 100 % 0 % 100 % 100 % 0 %

Le surnageant SCr qui était actif avant la lyophilisation, l’est toujours après concentration. Le surnageant

SCr concentré peut réduire 10 mM de Cr(VI). En concentrant le surnageant, on peut réduire des quantités de

chrome plus importantes. Ceci est un résultat important car il est possible, par cette technique, de réduire des

concentrations en chrome incompatibles avec un bon développement microbien. Nous avons aussi vérifié que

dans les mêmes conditions le milieu de culture concentré ne permet pas la réduction du chrome. La réduction

du chrome observée est bien le résultat de l’action des molécules produites par la souche NH50.


181


Nous avons donc testé la possibilité d’utiliser ces surnageants lyophilisés pour immobiliser le chrome dans

le sol (re-pollué à 1800 mg de Cr(VI) par kg de sol). Pour cela nous avons incubé 1 g de sol avec 0,4 ou 0,8 mL

de surnageant (provenant de cultures de 10 jours en milieu M63Y avec et sans 1 mM de chrome à 30°C)

concentrés 10 fois par lyophilisation. Cette série d’expériences a été réalisée en eppendorfs. Les concentrations

initiales (mesurées après 1 heure) dans le milieu liquide sont très importantes : de l’ordre de 1000 mg de

Cr(VI).L-1 lorsque l’on ajoute 0,4 mL de milieu liquide et 500 mg.L-1 pour 0,8 mL de milieu liquide

(voir Figure 36). Tout le chrome (VI) contenu dans le gramme de sol ne passe pas en solution compte tenu des

faibles volumes de liquide considérés. Si tel était le cas, les concentrations initiales seraient 4 fois plus élevées.

Nous pouvons observer sur la Figure 36 que l’apport de surnageant S ou SCr concentré sur 1 g de sol permet

de diminuer la concentration du chrome (VI) en solution, phénomène que nous n’observons pas si nous

ajoutons uniquement du milieu M63Y concentré. Nous remarquons une fois de plus que le surnageant SCr

permet d’obtenir un meilleur pourcentage de réduction du chrome que le surnageant S.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15 20 25

temps en jours

mg de Cr(VI).L-1

400 µL S conc. 800 µL S conc. 800 µL S conc. + 1 mM Cu2+

400 µL SCr conc. 800 µL SCr 800 µL SCr conc. + 1 mM Cu2+

400 µL M63Y conc. 800 µL M63Y conc.

Figure 36 : Suivi de la concentration en Cr(VI) en solution en fonction du temps en microcosmes : 1 g de

sol (apportant 1,8 mg de Cr(VI)) incubé à 30°C avec 400 ou 800 µL de surnageants S ou SCr concentrés 10

fois. En pointillé figurent les témoins réalisés avec 1 g de sol et le milieu de culture stérile concentré 10 fois.


182


3.3.3.Effet du cuivre

Nous avons testé l’effet du cuivre (apporté sous forme de CuCl2 à 1 mM) mais nous n’avons pas pu

observer une augmentation significative de la vitesse de réduction en présence de Cu2+ (Figure 36)

contrairement à ce que nous avions observé lorsque les chromates sont apportés en solution et non pas par du

sol pollué (Figure 20 page 131).

Nous avons donc dosé le cuivre Cu2+ relargué en solution pour savoir si le sol contient déjà suffisamment

de cuivre Cu2+ pour que la réaction de réduction du chrome (VI) soit maximale. Nous avons pour cela incubé

5 g de sol avec 5 ou 15 mL (ratio L/S de 1/1 et 3/1 respectivement) de milieu liquide (M63Y ou eau

déminéralisée stériles) mis en contact, sous agitation (120 rpm), pendant 30 minutes à 30°C. Cette expérience

étant réalisée en une demi-journée, nous n’avons pas utilisé de sol stérile. Sur un intervalle de temps si court, le

phénomène de bio-réduction est négligeable. La phase liquide, récupérée par centrifugation, est renouvelée

toutes les 30 minutes. Nous avons dosé, sur chaque essai, le cuivre Cu2+ et le Cr(VI) relargué en solution par

les 5 g de sol. Les résultats des désorptions sont présentés dans les deux figures suivantes.

00,10,20,30,40,50,60,7

0 30 60 90 120 150 180 210

M63, L/S = 1/1 M63, L/S = 3/1eau, L/S = 1/1 eau, L/S = 3/1

masse cumulée de Cu2+( mg)

temps de contact en minutes

Figure 37 : Désorption du Cu2+ à 30°C contenu

dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d’eau

déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec

renouvellement de la phase liquide toutes les 30

minutes.

00,5

11,5

22,5

33,5

0 30 60 90 120 150 180 210

M63, L/S = 1/1 M63, L/S = 3/1eau, L/S = 1/1 eau, L/S = 3/1

masse cumulée de Cr(VI) (mg)

temps de contact en minutes

Figure 38 : Désorption du Cr(VI) à 30°C contenu

dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d’eau

déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec

renouvellement de la phase liquide toutes les 30

minutes.


183


Dans la Figure 37, on observe que le milieu dans lequel est incubé le sol influe sur le relargage du

cuivre Cu2+ en solution. L’eau, avec un ratio L/S de 1/1, permet d’extraire 0,03 mg de Cu2+ (pour 5 g de

sol) alors qu’avec le même ratio L/S, le milieu M63 permet de récupérer dans les mêmes conditions

0,3 mg. Nous remarquons aussi que la quantité de liquide en contact avec le sol joue un rôle important.

Plus le volume de la phase liquide est important, plus on retrouve de cuivre Cu2+ en solution.

Le phénomène est donc limité par la solubilité de l’ion. Ainsi, avec le milieu M63, avec un ratio L/S de

3/1, on peut extraire jusqu’à 0,55 mg de Cu2+ (après 7 extractions). Ce résultat montre qu’en incubant le

sol avec des surnageants de culture, obtenus en milieu M63Y, nous sommes dans des conditions

favorables pour avoir du cuivre Cu2+ en solution qui peut donc interagir avec les molécules réductrices

pour augmenter la vitesse de réduction du chrome. De plus, la totalité du cuivre Cu2+ n’est pas passé en

solution après avoir renouvelé 7 fois la phase liquide.

Le chrome, quant à lui, est suffisamment soluble pour être extrait très facilement. Les cinétiques de

désorption avec de l’eau ou du milieu M63, et ce quel que soit le ratio L/S, sont comparables (Figure 38).

Après avoir renouvelé 7 fois la phase liquide, environ 3 mg de chrome (VI) ont été mis en solution dans

les 4 conditions testées. Nous pouvons remarquer que ces 3 mg de Cr(VI) ne représentent qu’un tiers du

chrome (VI) présent dans les 5 g de sol (5 * 1,8 mg de Cr(VI) = 9 mg).

Si l’on incubait 1 g de sol pollué avec 1800 mg.kg-1 de Cr(VI) dans 1 mL de milieu M63 (conditions

similaires à celles utilisés en microcosmes avec les surnageants de cultures concentrés, voir Figure 36),

nous aurions une concentration maximale en Cr(VI) d’environ 35 mM. Ce gramme de sol contient au

minimum 0,11 mg de Cu2+ soit une concentration minimale d’environ 1,7 mM dans 1 mL de M63. Ces

conditions (35 mM de Cr(VI) pour 1,7 mM de Cu2+ soit 1 mM de Cr(VI) pour 0,5 mM de Cu2+) sont très

proches des conditions utilisées dans les expériences pour tester l’effet du cuivre sur les surnageants de

culture où l’on ajustait généralement la concentration en Cr(VI) à 1 mM et où l’on ajoutait 0,1 mM de

Cu2+. La présence de cuivre Cu2+, dans les quantités rencontrées dans le sol utilisé pour les

expérimentations avec les surnageants lyophilisés, peut expliquer que l’addition de CuCl2 ne permet pas

d’augmenter la vitesse de réaction de réduction du Cr(VI). Le cuivre Cu2+ contenu dans le sol permet

d’accélérer déjà au maximum la vitesse de réaction.


184


3.4. Conclusions

Nous remarquons à la Figure 36 qu’il est possible de réduire tout le chrome (VI) présent

dans les échantillons (1 g de sol contenant 1,8 mg de Cr(VI)) en 18 jours en utilisant 0,8 mL

de surnageant SCr concentré 10 fois. Nous avons vérifié qu’il s’agissait de tout le chrome

présent au début de l’expérience et pas seulement du chrome qui était passé en solution. Les

échantillons contenant du sol et du SCr conc. dans lesquels la réduction avait été totale ont

été resuspendus dans des volumes d’eau plus importants pour en désorber le maximum et

doser le chrome (VI) qui n’aurait pas été réduit. Ces expériences ont montré que, dans ces

échantillons, il n’y avait plus de chrome sous forme (VI).

Cette expérience montre que l’on peut envisager de réduire le chrome dans un sol et

l’immobiliser relativement rapidement en utilisant des surnageants provenant de culture de

Streptomyces thermocarboxydus NH50 en présence de chrome. La présence, au préalable, du

métal oxydé permet d’obtenir des surnageants contenant plus de molécules réductrices et

donc plus actifs. La lyophilisation permet de concentrer les surnageants afin de diminuer le

volume de liquide apporté au sol pour le traitement. D’après les résultats de cette dernière

expérience, il serait possible de traiter 1 kg de sol fortement pollué (1800 mg de Cr(VI).kg-1)

par moins d’un litre de surnageant lyophilisé contre 10 L de surnageant non concentré

(cf. page 181). D’après ces résultats, la lyophilisation n’entraînerait pas de perte de molécules

réductrices puisqu’en concentrant le surnageant 10 fois, on diminue par 10 le volume à

appliquer sur le sol.

La difficulté majeure est de disposer de surnageants de culture de Streptomyces

thermocarboxydus NH50 en grande quantité qu’il faudra lyophiliser pour pouvoir traiter un

sol pollué. Les Streptomyces sont des bactéries largement utilisées dans le monde

pharmaceutique car elles produisent une grande variété d’antibiotiques. Ces bactéries ont

fait l’objet de très nombreuses études en recherche fondamentale mais aussi pour la mise au

point des procédés de fabrication des antibiotiques. Les cultures à grande échelle sont donc

parfaitement maîtrisées. On peut envisager d’utiliser ces procédés pour produire des

quantités importantes de culture. Nous avons déterminé durant cette étude les conditions de

culture qui favorisaient la production de molécules actives, c’est-à-dire : en présence de

glycérol (à 3 g.L-1) et de 1 mM de Cr(VI).


185


Les antibiotiques produits industriellement sont récupérés sous forme de poudre ce qui

suggère que les procédés pour concentrer les molécules d’intérêt existent. De plus, les

antibiotiques obtenus représentent un faible pourcentage en masse des cultures de

Streptomyces, ceci suggérant fortement la production durant le processus d’élaboration, d’une

grande quantité de « déchets ». Ces résidus de fabrication pourraient peut-être contenir des

molécules ayant une activité chromate réductase.

On peut donc imaginer plusieurs façons de produire les molécules responsables de la

réduction du Cr(VI) :

Utiliser le même type de procédés que ceux utilisés dans la fabrication d’antibiotique pour

obtenir des surnageants actifs de la souche NH50 puis ensuite les concentrer. Il n’est

d’ailleurs pas utile dans un procédé de traitement de sol de séparer les cellules vivantes du

surnageants avant concentration (par lyophilisation par exemple). Ajouter des cellules

vivantes au sol, ne pose a priori pas de problèmes écologiques majeurs. En effet, les

Streptomyces ont pour habitat naturel le sol et ne sont pas des bactéries pathogènes ni pour la

flore ni pour la faune. De plus, les surnageants actifs sont produits par la souche NH50 non

modifiée génétiquement. Cette souche ne possède pas de résistance qu’elle ne possédait pas

« naturellement » avant d’être isolée au laboratoire. Il est possible que les cultures

successives en laboratoire aient provoqué des mutations mais aucune de celles-ci n’est le

résultat d’une introduction d’ADN étranger dans son génome.

On pourrait envisager de tester l’activité chromate réductase des déchets générés par la

fabrication des antibiotiques. En effet, comme nous l’avons vu dans le chapitre II 2.3

(Tableau XXIII), d’autres espèces de Streptomyces (lividans et cœlicolor) sont capables de

réduire le Cr(VI) et très probablement par le même processus que S. thermocarboxydus

NH50. D’autres espèces que celles déjà citées, utilisées en industrie pharmaceutique,

produisent peut-être le même type de molécules. Si tel était le cas, les résidus des procédés

de préparation des antibiotiques ou autres molécules d’intérêt médical, pourraient être

appliqués sur un sol pollué au chrome (VI). Dans le cas de résidus provenant d’autres

espèces de Streptomyces, il faudrait s’assurer que dans le sol à traiter, aucune cellule vivante

ne soit introduite. En effet, les bactéries utilisées en industrie pharmaceutique, si elles ont

été modifiées génétiquement afin de surproduire un antibiotique par exemple, ne doivent

pas être réintroduites dans le milieu naturel.


186


4.Etudes en lysimètres et lit bactérien

4.1. Etude en lysimètres

Les essais en lysimètres ont pour but de reproduire à l’échelle du laboratoire le procédé de traitement

en « biopile » d’un sol pollué que l’on pourrait éventuellement appliquer sur le site même. Nous avons

travaillé avec des quantités de sol de l’ordre du kg (soit environ 500 à 1000 fois plus que pour les

expériences en microcosmes).

Les lysimètres utilisés sont des casiers en PVC de 50 cm sur 30, dans lesquels nous avons placé 3 kg

de sol à traiter, de manière à obtenir une couche d'environ 5 cm d’épaisseur pour permettre l’aération sans

système d’aération forcée. La couche de sol est déposée sur un géotextile, évitant ainsi l'entraînement de

fines particules de terre qui pourraient boucher les conduits ainsi que les pompes. Le casier est recouvert

d'un dôme en PVC au sommet duquel sont disposés trois asperseurs permettant l’arrosage de la surface du

sol et l’aération de la solution. Une circulation de trois litres d'eau ou de milieu nutritif se fait en boucle

fermée, aspergeant le sol pollué de façon homogène et par alternance, par l'intermédiaire d’un réacteur qui

collecte par gravité la solution (cf. Figure 39). Une agitation est maintenue dans les réacteurs pour aérer la

solution. Cependant l’agitation est suspendue lorsque la pompe de recirculation fonctionne de façon à ne

pas réinjecter les dépôts de terre qui auraient pu passer le géotextile et qui pourraient endommager

l'installation. Le débit des pompes est de 12 litres/heure. Les pompes fonctionnent ½ heure toutes les

deux heures sauf la nuit et les fins de semaines pour des raisons de sécurité. Les lysimètres fonctionnent à

température ambiante (environ 25°C).

Nous avons réalisé les essais en lysimètres avec du sol pollué à différentes concentrations en Cr(VI) :

les teneurs sont d’environ 300, 1200 et 2300 mg de Cr(VI) par kg de sol dans les trois types d’essais. Seuls

les essais en lysimètres contenant du sol pollué avec environ 1200 mg.kg-1 a fait l’objet d’un bilan complet

(bilan matière sur le chrome total et évaluation écotoxicologique).


187


Asperseur

Sol pollué

Géo-textile

Grille

Réacteur

Agitateurmagnétique

Barreaumagnétique

pompe

Figure 39 : Schéma d’un lysimètre avec circulation en boucle fermée

4.1.1.Evaluation préliminaire de la bio-stimulation et de la bio-augmentation

Le sol utilisé contient une quantité de chrome (VI) d’environ 300 mg.kg . Six kilogrammes de ce sol

ont été répartis dans deux lysimètres notés 1A et 1B. Dans le premier (1A), on ne fait circuler que de l’eau

permutée et dans le second (1B), après 3 jours de circulation d’eau, la source de carbone (300 g de glucose)

et les nutriments (28,2 g de (NH ) SO et 5,4 g de Na HPO ) sont apportés dans l’eau contenue dans le

réacteur ainsi qu’un ensemencement constitué par 150 mL d’une culture de S rmocarboxydus

NH50 de 2 jours en milieu LB directement sur le sol (afin d’éviter que les m

asperseurs). Le ratio C/N/P/Cr(VI) pour cette expérience est de 100/5/1/

introduit en très large excès par rapport à la quantité de Cr(VI) présente dans

réfère à l’équation suivante, le rapport massique C/Cr(VI) est de 100/600.

-1

4 2 4 2 4

C H O + 8 CrO + 34 H → 8 Cr + 6 HCO + 20 H O 6 12 6 3+ 3- 2

On combine donc dans cette première approche à la fois la bio-stimulation

aération et apport de glucose et de nutriments et la bio-augmentation par apport

2- +4


treptomyces the

ycéliums n’obstruent les

0,75. Le carbone est ici

le sol. En effet si l’on se

de la flore endogène par

de mycélium de NH50.

188


a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours

Après 15 jours de circulation du milieu liquide, l’aspect du sol des lysimètres est différent. Dans le

lysimètre 1B dans lequel ont été ajoutés la souche NH50 et le milieu nutritif, la terre s’est couverte en

surface d’une pellicule blanchâtre qui est le résultat du développement des micro-organismes. Il s’agit

certainement d’un développement de champignons filamenteux, de bactéries et de la souche de Streptomyces

thermocarboxydus NH50 que l’on a ajoutée sous forme de mycélium au bout de 3 jours. Les conditions

expérimentales dans ce lysimètre sont favorables à la croissance microbienne : nutriments (ratio C/N/P

de 100/5/1), une grande quantité de glucose (ratio C/Cr(VI) de 100/0,75) et une température ambiante

entre 25 et 30°C (expériences réalisées en juin). Sur la terre du lysimètre 1A dans lequel n’a circulé que de

l’eau permutée, la terre a gardé son aspect initial (Figure 40).

Figure 40 : Aspect du sol : à gauche dans le lysimètre 1A (eau permutée), à droite dans le lysimètre 1B

(ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de 100/5/1/0,75)


189


b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution

La concentration en chrome (VI) dans les deux réacteurs a été mesurée pendant deux semaines. Les

résultats sont présentés dans la Figure 41.

Figure 41 : Évolution de la concentration en chrome (VI) en solution dans les réacteurs des lysimètres

1A (eau permutée) et 1B (ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de

100/5/1/0,75)

-1

-1

-1

Dans le réacteur 1B dopé en glucose et nutriments et ensemencé, la concentration en chrome (VI)

diminue progressivement au cours du temps, assez lentement entre les jours 4 et 9 puis plus rapidement

ensuite. La première phase de 5 jours correspond à la mise en place d’une microflore endogène et exogène

active. On peut supposer que le chrome qui est réduit (20 %) pendant cette phase, l’est principalement par

0

20

40

60

0 2 4 6 8 10 12 14 16temps en jours

Lysimètre 1A Lysimètre 1B

mg de Cr(VI).L-1Ajout des nutriments et de NH50 dans le lysimètre 1B

On constate en premier lieu que, la concentration initiale en chrome en solution n’est pas celle que

nous attendions. En effet le sol contient 300 mg de Cr(VI).kg et compte tenu du ratio L/S de 1, nous

devrions obtenir des concentrations de l’ordre de 250-300 mg.L alors que celles mesurées ne dépassent

pas 65 mg.L . Tout le chrome hexavalent du sol, pourtant très soluble dans l’eau, ne passe pas en solution.

La percolation de la solution sans agitation du sol ne permet de mobiliser qu’un quart du contenu total en

chrome (VI). Il est possible que l’adsorption des chromates réduise leur lixiviation, ou que l’existence de

chemins préférentiels à l’écoulement limite l’entraînement des chromates par la solution du fait de la

formation de zones stagnantes. Compte tenu que ce phénomène est identique dans les deux lysimètres, le

suivi des concentrations en chrome en solution dans les réacteurs permet cependant de comparer les deux

conditions testées.


190


des phénomènes abiotiques (réduction par la matière organique du sol et par la grande quantité glucose).

Puis durant les 6 derniers jours, tout le chrome (VI) en solution a disparu. La couleur verte du réacteur

témoigne de la réduction du chrome (VI) (jaune) en chrome (III) (bleu-vert).

Dans le réacteur 1A percolé uniquement avec de l’eau, la concentration en chrome (VI) n’évolue

quasiment pas pendant les deux semaines de suivi. La couleur du milieu liquide du réacteur est jaune vif

reflétant la présence des ions chromate.

4.1.2.Comparaison des techniques de bio-stimulation et de bio-augmentation

Dans les expériences précédentes en lysimètres, nous avons à la fois stimulé la flore endogène par un

apport de carbone et de nutriments et augmenter la biomasse en apportant des mycéliums de la souche

NH50. Dans ces nouvelles expériences, nous avons apporté du carbone et des nutriments dans les deux

lysimètres et seul un des deux a été ensemencé avec NH50. Nous pourrons donc apprécier la participation

de la flore endogène stimulée et de la souche endogène apportée dans les phénomènes de réduction du

Cr(VI) dans le sol pollué. Nous avons aussi apporté une quantité de carbone moins importante que dans

les essais en lysimètres précédents. En effet, lorsque les essais sont réalisés avec des quantités importantes

de glucose, la réduction abiotique du Cr(VI) est le phénomène prépondérant (voir résultats des

expériences en microcosmes § III 3.1 et § III 3.2 pages 175-177)

Le sol utilisé contient une pollution d’environ 1000 mg de Cr(VI).kg . 2 kg de ce sol ont été placé

dans chacun des lysimètres contenant 2 litres d’eau permutée + nutriments. Le glucose est apporté à

raison de 7,5 g.L dans le lixiviat de chacun des deux lysimètres. Les sels minéraux sont apportés en

respectant le rapport C/N/P du milieu M63 (ratio utilisé dans les expériences en microcosmes décrites §

III 3.2). Les expériences en microcosmes réalisées avec un rapport massique C/N/P de 100/14/103,

n’avait pas permis d’observer de réduction du Cr(VI) significative avec du sol non stérile et un inoculum

de NH50 sous forme de mycélium en 3 semaines. Etant donné que les expériences en lysimètres sont

toutes conduites avec du sol non stérile, nous avons choisi de suivre la réduction sur une durée beaucoup

plus longue (6 mois). Le rapport C/Cr(VI) est dans cette expérience de 100/25. Les phénomènes de

réduction abiotique seront donc mineurs.

-1

-1

Le fait que la concentration en Cr(VI) n’augmente pas en solution durant 15 jours alors que le contenu

total du sol n’est pas épuisé suggère que la limitation de l’entraînement des chromates n’est pas due à

l’existence de zones stagnantes mais plutôt à des phénomènes physico-chimiques (adsorption) ou à la

réduction abiotique.


191


La concentration en chrome dans le réacteur de chacun des deux lysimètres a été suivie en fonction du

temps. Le lysimètre 2A constitue l’essai « flore endogène + NH50 » (bio-augmentation) et le lysimètre 2B,

l’essai « flore endogène » (bio-stimulation). Le suivi de la concentration en Cr(VI) dans chacun des

réacteurs est présenté sur la Figure 42.

0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150 200temps en jours

lysimètre 2A lysimètre 2B

mg de Cr(VI).L-1

Ajout de glucose

Figure 42 : Suivi des concentrations en Cr(VI) dans la solution contenue dans les réacteurs des

lysimètres 2A (flore endogène +NH50) et 2B (flore endogène)

a Aspect du sol dans chacun des lysimètres

Le sol contenu dans les deux lysimètres a gardé son aspect initial. Il n’a pas présenté de

développement intense de la microflore. En effet, la concentration en glucose en solution est d’environ

100 g.L dans la première expérience en lysimètres (§ III 4.1.1) et de 7,5 g.L dans le cas présent. La

microflore se développe (apparition de « flocons » dans les réacteurs et dans les tuyaux) mais pas

suffisamment pour voir apparaître une pellicule blanche à la surface du sol.

-1 -1


192


b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution

Les concentrations en Cr(VI) initiales sont moitié moindre par rapport à celles attendues si tout le

chrome (VI) passait en solution. Ce phénomène avait déjà été observé dans la série d’expériences en

lysimètres précédente. Nous avons suivi la concentration en Cr(VI) pendant 6 mois sans observer de

différences significatives entre les lysimètres 2A et 2B. Que l’on ajoute ou non la souche NH50 dans le sol,

la réduction du chrome n’est pas plus rapide.

Le seul paramètre qui semble permettre d’obtenir une vitesse de réduction du chrome plus rapide est

l’apport de glucose. En effet, après l’ajout de 20 g de glucose dans chacun des lysimètres, la réduction du

chrome reprend. Ces résultats confirment que la présence de glucose en large excès est nécessaire pour

obtenir des cinétiques plus rapides.

Les résultats obtenus dans les deux premières expériences en lysimètres confirment les résultats

obtenus en milieu dispersé et en microcosme.

Nous avions constaté en milieu dispersé que plus la concentration en glucose était importante, plus la

réduction du chrome (VI) était rapide que ce soit avec ou sans ajout de la souche NH50 dans les essais

(Figure 32 et Figure 33). Cette observation avait aussi été faite avec les résultats obtenus en microcosmes

présentés dans le Tableau XL page 176. Le glucose en excès (C/Cr(VI) de 100/1 environ) est

indispensable pour obtenir des pourcentages de réduction importants. Il est peut être nécessaire

d’apporter plus de glucose en microcosmes et en lysimètres qu’en milieu dispersé car celui-ci est

certainement moins bio-disponible pour la flore endogène. Cependant dans ce contexte (teneur en glucose

relativement élevée) le phénomène de réduction abiotique est probablement très important.

-1

Lorsque l’on travaille en microcosmes ou en lysimètres, la bio-augmentation par apport de mycéliums

de NH50 ne permet pas d’obtenir des pourcentages de réduction du Cr(VI) supérieurs à ceux obtenus par

bio-stimulation.

Lorsque l’on travaille à des concentrations plus faibles en glucose (10 g.L ), la bio-stimulation de la

flore endogène seule ou la bio-augmentation (par apport de la souche NH50 sous forme de mycélium) ne

permettaient pas d’avoir des pourcentages de réduction significativement différents. Ce type de résultats

avait aussi été observé en microcosmes (Tableau XXXVIII page 173 ). Si l’on envisage de traiter un sol

pollué au Cr(VI) avec un apport « modéré » en glucose, la réaction sera lente et ajouter des mycéliums de

la souche NH50 ne permettra pas d’obtenir de meilleurs résultats.


193


4.1.3.Evaluation globale du traitement par bilan matière et caractérisation

écotoxicologiques

Ces essais en lysimètres ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles des premiers essais mais

avec un sol beaucoup plus pollué en chrome (VI) (2300 mg de Cr(VI).kg ). Le ratio C/Cr(VI) est

d’environ 100/5. Dans le premier lysimètre (3A), on ne fait circuler que de l’eau permutée et dans les trois

autres (3B,C et D en triplicat), après 3 jours de circulation d’eau, la source de carbone (300 g de glucose) et

les nutriments (28,2 g de (NH ) SO et 5,4 g de Na HPO ) sont apportés dans l’eau contenue dans le

réacteur ainsi qu’un ensemencement constitué par 150 mL d’une culture de Streptomyces thermocarboxydus

NH50 de 2 jours en milieu LB. Le ratio C/N/P/Cr(VI) est de 100/5/1/5.

-1

2 4 2 4

a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours

b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution en début de

traitement

La concentration initiale en chrome dans les réacteurs n’est pas celle que nous attendions. En effet, le

sol contient 2000 mg de Cr(VI).kg et compte tenu du ratio L/S de 1, nous devrions obtenir des

concentrations de l’ordre de 1800-2000 mg.L alors que celles mesurées ne dépassent pas 1000 mg.L .

Nous avions déjà observé ce phénomène dans les expériences précédentes.

-1

-1 -1

4

Tout comme nous l’avons vu précédemment (Figure 40), le sol du lysimètre témoin 3A garde son

aspect initial alors que les 3 autres lysimètres présentent une pellicule blanche à la surface du sol.

c Aspect de la solution contenue dans les réacteurs

Après 1 mois d’incubation, on observe la formation d’une biomasse microbienne à l’intérieur des

réacteurs 3B, 3C et 3D contenant le milieu de culture destiné à être recirculé dans le sol. Le

développement microbien sous la forme d’une « mère » localisé à la surface du milieu liquide nous a posé

des difficultés dans l’automatisation de la recirculation du milieu nutritif suite au colmatage à répétition des

buses d’aspersion. Dans la solution du réacteur du lysimètre 3A (eau permutée), aucun développement

microbien n’a pu être observé.

d Devenir du chrome après 3 mois de traitement et bilan matière

L’ensemble des résultats des analyses effectuées sur les solutions et le sol après 3 mois de traitement

est rassemblé dans le Tableau XLV. Signalons que dans cette série d’essais, la recirculation des lixiviats a

été suspendue pour des raisons de sécurité durant la fermeture estivale (1 mois).


194


Tableau XLV : Bilan des essais en lysimètre 3A, 3B, 3C et 3D après 3 mois de traitement.

3 kg de sol ([Cr total] = 4900 mg.kg et [Cr(VI)] = 2300 mg.kg de sol sec), 3 litres de milieu nutritif

recirculé en boucle fermée à température ambiante.

-1 -1ini ini

Lysimètre 3Atémoin (eau) Lysimètre 3B Lysimètre 3C Lysimètre 3D Moyenne

(3B+3C+3D)

[Cr total] dans le sol (mg.kg )

ini 4900 4900

[Cr(VI)] dans le sol (mg.kg )

ini-1 2300

[Cr(VI)] en solution après 3 jours (mg.L )

ini-1 1000 900 700 800

% de Cr(VI) en solution après 3 jours 47,3 % 42,6 % 37,8 %

-1

2300

800

33 %

[Cr(VI) ] en solution après 3 mois (mg.L ) -1 1350 48 2 66 39

-1 1393 390 391 344 345

-1 3550 2700*

-1 820 9*

[Cr total] en solution après 3 mois (mg.L )

[Cr total] dans le sol après 3 mois (mg.kg )

[Cr(VI)] dans le sol après 3 mois (mg.kg )

% d’immobilisation après 3 mois 5,6 % 97,9 %*

* Le sol des lysimètres 3B, 3C et 3D a été rassemblé et homogénéisé après traitement et avant analyse. La concentration en Cr total a été analysée par POLDEN

On constate une bonne efficacité du traitement en trois mois d’incubation. La quasi totalité du Cr(VI)

présent a été réduit dans les essais où du milieu nutritif a circulé (glucose, azote et phosphore + mycélium

NH50). Le chrome (III) présent en solution est probablement sous forme de complexes avec la matière

organique et/ou les autres ions présents dans la solution. Une très faible fraction du chrome est présente

sous forme hexavalente dans le sol des lysimètres B, C et D.

Si nous considérons le lysimètre 3A (eau permutée), nous constatons qu’environ la moitié du Cr(VI)

présent initialement a été extrait par lixiviation. Si l’on fait le bilan matière après 3 mois on retrouve dans

l’eau et dans le sol (1393 + 3550 = 4743 mg.kg ) la quasi totalité du chrome présent initialement

(4900 mg.kg ). La différence de 3 % entre ces deux valeurs peut être attribuée aux incertitudes de mesure.

-1

-1

Si l’on réalise le bilan matière avec les moyennes obtenues avec les 3 lysimètres où un milieu nutritif a

circulé, nous constatons que la concentration en Cr total après traitement (375 + 2700 = 3075 mg.kg ) est

bien inférieure à celle initialement présente (4900 mg.kg ). L’explication la plus plausible serait une

fixation du chrome (34 % du chrome total) sur la biomasse microbienne qui s’est développée dans les

-1

-1


195


réacteurs. Compte tenu de la couleur bleu-vert de cette biomasse, le chrome immobilisé sur celle-ci est

vraisemblablement sous forme trivalente.

Dans les lysimètres où du milieu nutritif à circuler et dans lesquels ont été apportés des mycéliums de

la souche NH50, le chrome (VI) a été extrait du sol par lixiviation et réduit en grande partie en chrome

(III). Une fraction importante du chrome trivalent a été immobilisé dans le sol et dans la biomasse et

l’autre fraction est en solution (336 mg.L ). Compte tenu qu’il reste en solution et dans le sol beaucoup

moins de Cr(VI) après 3 mois de traitement, le potentiel toxique de ce sol est donc a priori beaucoup

moins important qu’avant traitement. Afin d’évaluer cette écotoxicité, on réalise des tests

écotoxicologiques sur le sol et son percolat.

-1

e Evaluation de l’écotoxicité du sol et de son percolat avant et après

traitement (étude réalisée par POLDEN)

Le sol

Les essais ont été réalisés sur des semences d'orge (Hordeum vulgare) et de cresson (Lepidium sativum). La

germination des graines d’orge et de cresson est mesurée après 7 jours et la croissance après 14 jours. Les

graines sont placées dans du sol contenant une fraction de sol pollué avant ou après traitement mélangé à

du sol de référence. Les résultats sont comparés à un essai ne contenant que le sol de référence (0 % de

sol pollué) et sont présentés dans le Tableau XLVI.

Nous remarquons qu’avant traitement, un mélange de sol pollué/sol référence de 29 % environ

permet de faire germer toutes les graines (No Observable Effect Concentration). En revanche, pour ne

pas observer d’effet sur la croissance de l’orge et du cresson, il faut travailler avec un mélange sol

pollué/sol référence de 11 et 7 % respectivement.

Après traitement, on constate que pour permettre la germination de toutes les graines de cresson, la

fraction de sol pollué peut être plus importante (46 % contre 29 % avec le sol pollué avant traitement).

L’écotoxicité du sol traité est inférieure après traitement (dans le cas du test avec le cresson). Cependant,

pour les graines d’orge, on observe une inhibition de la germination à partir de 18 % de sol pollué (contre

29 % précédement). Dans le cas de l’orge, le sol traité a un potentiel toxique supérieur à celui présenté

avant traitement. Lors du traitement du sol pollué, notre objectif était d’immobiliser le chrome. La

circulation du milieu liquide nutritif et l’activité microbienne a peut-être mobilisé et rendu plus

biodisponibles d’autres métaux, et l’orge et le cresson ont probablement des sensiblités différentes.


196


Tableau XLVI : Ecotoxicité du sol pollué avant et après traitement sur les semences d’orge (Hordeum

vulgare) et de cresson (Lepidium sativum) - Méthode ISO 11 269-2

Valeur avant traitement

Valeur après traitement

Paramètre

Inhibition de germination orge (NOEC) 28,75 % 18 %

Inhibition de germination cresson (NOEC) 28,75 % 46 %

Inhibition de croissance orge (NOEC) 11 % ND

Inhibition de croissance orge (LOEC) 18 % ND

Inhibition de croissance cresson (NOEC) 7 % ND

Inhibition de croissance cresson (LOEC) 11 % ND

NOEC : No Observable Effect Concentration et LOEC : Lower Observable Effect Concentration

Le percolat

L’écotoxicité de la solution obtenue à l’issue de la percolation correspondant à un rapport

liquide/solide cumulé de 2,0 a été caractérisée par quatre types d’essais présentés dans le Tableau XLVII

ci-dessous :

Tableau XLVII : Ecotoxicité du percolat du sol pollué avant et après traitement (obtenu par

percolation d’eau permutée sur une colonne de sol avec un ratio L/S cumulé de 2,0)

Paramètre Méthode Résultat avant traitement

Résultat après traitement

Écotoxicité aiguë

Essai Microtox CE50 15 min 3,4 % 5,93 % NF EN ISO11 348-3

0,87 % 4,09 %

Écotoxicité aiguë

Essai daphnies CE50 24 h 0,05 % 0,22 %

Écotoxicité chronique

Essai algues CE50 72 h NF T 90-375 0,04 % 2,6 %

Génotoxicité

Sans activation Suspicion d’effet Présence d’effet

Avec activation Mutatox

Présence d’effet

Essai Microtox CE50 30 min

NF EN ISO 6341

Présence d’effet


197


L’écotoxicité du percolat résultant de l’essai de percolation en colonne du sol pollué est

particulièrement importante puisque des effets toxiques aigus et chroniques sont observés en présence de

concentrations très faibles en percolat. Le percolat résultant de la percolation en colonne du sol traité en

lysimètre présente encore des effets toxiques importants, bien que diminués, vis-à-vis de la luminescence

de Vibrio fischeri, de la mobilité de Daphnia magna, de la croissance de l’algue Pseudokirchneriella subcapitata et

sa génotoxicité est clairement établie dans une gamme de concentrations inférieures aux concentrations

toxiques pour la souche d’essai.

4.1.4.Conclusions

Les essais en lysimètres par biostimulation de la flore endogène et bioaugmentation (apport

de NH50) ont confirmé les résultats obtenus en microcosmes :

L’apport de la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 sur les échantillons de sol ne

permet pas d’obtenir une réduction du chrome significativement plus importante qu’en

présence exclusive de la microflore endogène.

Pour obtenir une réduction importante de chrome par la flore endogène, il faut ajouter des

quantités de glucose considérables.

4.2. Traitement des lixiviats en lit bactérien

Le traitement du sol pollué en lysimètre génère un lixiviat chargé en Cr(VI). On peut envisager de

traiter ces lixiviats en utilisant la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 qui réduit le chrome (VI) en

Cr(III) en milieu liquide (voir chapitre II des Résultats page 123). Les Streptomyces peuvent se développer

en se fixant sur différente surface en formant un biofilm. Nous avons utilisé cette propriété pour utiliser la

souche NH50 que nous avons isolée au laboratoire pour réduire le Cr(VI) contenu dans un milieu liquide.

Nous avons préparé 4 colonnes de 0,8 L, la première contient du bidim (bandes de 5x15 cm superposées

jusqu’à atteindre une épaisseur de 4 cm), les deux suivantes contiennent 23 colliers de 20 perles de

céramique (anneaux de Raschig) chacun soit 460 perles et la quatrième contient 460 perles en vrac

(Figure 43). Les matériaux utilisés présentent une très grande surface disponible pour la fixation des

bactéries. Les quatre colonnes ont été remplies avec 0,55 L de milieu M63Y (3 g.L ) et ensemencées par la

souche NH50.

-1


198


garnissage anneaux de Raschig

plaque en inox percée

pompe

coton cardé

Niveau maximal deliquide

robinet

tuyau bulles d’air

Figure 43 : Schéma d’une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac

L’extrémité du tuyau arrivant en haut de colonne ne plonge pas dans le liquide. Nous avons branché la

pompe de manière à faire « buller » de l’air dans les colonnes deux heures par jour, Streptomyces étant un

genre bactérien strictement aérobie. La pompe fonctionne en sens inverse pour réaliser les prélèvements.

Après 21 jours de croissance bactérienne, le chrome (VI) a été ajouté jusqu’à obtenir une concentration de

0,3 mM. Nous avons choisi de travailler à des concentrations faibles en chrome au début de l’expérience

pour ne pas trop perturber le métabolisme de synthèse des bactéries. Le pH dans les 4 colonnes est resté

quasiment stable pendant toute la durée de l’expérience soit 67 jours (pH de 7,2 à 6,7 en fin d’expérience).

Le suivi de la concentration en chrome (VI) montre que les 4 colonnes réduisent le chrome de la même

manière. La totalité de celui-ci a disparu en 10 jours. A cette date, nous avons de nouveau ajouté du

chrome (VI) dans les 4 colonnes et doublé la concentration initiale. Après réduction du chrome (VI) en

8 jours, nous avons porté la concentration en Cr(VI) à 3,5 mM environ dans les 4 colonnes et ajouté

0,1 mM de Cu dans la colonne 3. Nous remarquons que la vitesse de réduction dans les quatre colonnes

est toujours similaire (environ 73 % de réduction en 13 jours) comme l’indique la Figure 44.

2+


199


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 jours

abs 540 nm

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

colonne 1

colonne 2

colonne 3

colonne 4

mM de chrome (VI)

ajout Cr(VI)

ajout Cr(VI) + ajout Cu2+ (0,1 mM) dans la colonne 3

Figure 44 : Evolution de la concentration en Cr(VI) dans les 4 colonnes. (colonne 1 : bidim, colonnes

2 et 3 : colliers d’anneaux de Raschig et colonne 4 : anneaux de Raschig en vrac)

Nous avons ajouté du cuivre dans la colonne 3 et nous avons comparé la vitesse de réduction par

rapport à la colonne 2 (même garnissage). Si l’on observe la Figure 44, on remarque qu’il n’y a pas de

différence significative entre la colonne 2 et 3. On peut cependant noter que le chrome (VI) a été réduit

totalement dans la colonne 3 en 39 jours contre 46 jours dans la colonne 2.

Chacune des 4 colonnes a permis de réduire environ 35 mg de chrome au total en 46 jours au

maximum (39 jours pour la meilleure efficacité colonne 3). Les trois types de garnissage testés permettent

un bon développement bactérien et une adhésion des cellules. Après l’expérience, les anneaux de Raschig

et le bidim ont une coloration vert-bleu qui correspond au chrome (III) qui a précipité à la surface des

bactéries fixées sur les supports (Figure 45). Nous avions observé, lors de l’étude en culture pure, qu’après

réduction du Cr(VI) les culots cellulaires de NH50 avait une coloration bleu-vert ceci suggérant fortement

que le Cr(III) puisse précipité à la surface des cellules. Ces essais en colonnes permettent d’envisager un

traitement d’effluent liquide contaminé avec du chrome (VI), cet effluent pouvant être le lixiviat d’un sol

pollué. Le chrome réduit précipite sur les parois cellulaires et après immobilisation, il peut être récupéré en

retirant le garnissage de la colonne. Il convient de faire croître au préalable les cellules dans un

environnement non pollué afin d’obtenir une quantité de cellules vivantes importante. Il faut, avant

d’utiliser de fortes concentrations en chrome, adapter les cellules à la présence de chrome (VI) afin qu’elles

commencent à synthétiser les molécules actives, puis enfin, appliquer des concentrations plus

conséquentes en Cr(VI). L’ajout du cuivre peut être envisagé mais à la concentration utilisée il peut être


200


déjà toxique. En effet, lors de l’étude en culture pure, l’ajout de cuivre à la concentration de 0,1 mM dès le

début de la culture empêchait le développement des mycéliums (§ II 2.3 page 127). Les molécules actives

ne pourront pas être renouvelées par la souche bactérienne si celle-ci meurt. Néanmoins il faudrait tester

la capacité de ces cellules à synthétiser les molécules actives en présence de différentes concentrations en

cuivre. Il est possible que dans les conditions présentes dans les colonnes (cellules qui ont adhéré sur un

support solide), le niveau de toxicité du cuivre soit plus faible.

Figure 45 : Aspect des anneaux de Raschig : à gauche avant utilisation et à droite, après 46 jours en

présence de Streptomyces thermocarboxydus NH50 et de Cr(VI) réduit en Cr(III) dans la colonne 2.


201

CONCLUSION ET PERSPECTIVES


Le sol étudié dans ce travail, pollué essentiellement avec des ions chromate a été l’objet d’une étude

pour évaluer la faisabilité d’un traitement biologique pour réduire le chrome (VI) et l’immobiliser.

L’isolement de la souche responsable de la réduction du Cr(VI) a permis de mieux comprendre les

mécanismes de réduction propre à cette souche bactérienne. La souche réductrice est un Streptomyces

thermocarboxydus, genre bactérien vivant généralement dans les sols.

Dans un premier temps, l’étude de la résistance au chrome a montré que la souche Streptomyces

thermocarboxydus NH50 présentait un degré de résistance au chrome (VI) plus élevé que celui d’autres

souches du même genre bactérien. Nous avons tout d’abord vérifié que le phénotype résistant au Cr(VI)

n’était pas dû à la mutation du système de transport du sulfate. La présence d’un plasmide (appelé pLN01)

d’environ 35-40 kb dans la souche NH50, absent chez les autres souches de Streptomyces étudiées, permet

d’envisager que le gène (ou les gènes) responsable(s) du phénotype Chr (résistant au chrome) soi(en)t

localisé(s) sur l’ADN extra-chromosomique. Les expériences réalisées pour vérifier cette hypothèse ne

nous ont pas permis de conclure quant à la participation ou non du plasmide pLN01. Le phénotype Chr

(sensible au Cr(VI)) de clones obtenus par mutagenèse par insertion d’un transposon est associé à une

concatémérisation du plasmide pLN01. Nous ne connaissons pas la relation existant entre ces deux

phénomènes. Il est donc possible d’envisager que des séquences présentes sur le plasmide participent au

phénotype de résistance au Cr(VI).

R

S

L’étude en culture pure de la réduction du Cr(VI) par la souche bactérienne a montré que la souche

NH50 réduit plus rapidement (2 fois plus vite) le chrome contenu en solution en présence de glycérol (3

g.L soit 83 mM de carbone) qu’en présence de glucose (10 g.L soit 333 mM de carbone). Des analyses

par rayons X (EXAFS et XANES) ont aussi permis de vérifier, en travaillant sur des culots bactériens de

la souche de Streptomyces thermocarboxydus, que la disparition du chrome (VI) dans les milieux était bien liée à

la réduction de la forme hexavalente en forme trivalente (Desjardin et al., 2002).

-1 -1


202


Si l’on sépare les cellules du surnageant de culture après une quinzaine de jours de culture, les

surnageants permettent de réduire le chrome (VI) (présent 1 mM) en 48 h maximum alors qu’un délai

d’une semaine est nécessaire lorsque l’on incube les cellules entières récupérées dans un milieu contenant

du chrome pour voir apparaître de nouveau le phénomène de réduction. Les cellules produisent et

sécrètent une ou des molécules capables de réduire le chrome. La synthèse de ces molécules est augmentée

lorsque les cellules sont incubées en présence de chrome. Et la vitesse de réduction du chrome est

accélérée lorsque l’on ajoute du cuivre cuivrique. Le cuivre agit directement au niveau de la réaction de

réduction du chrome (VI) et non pas au niveau de la synthèse des molécules actives. En effet, si l’on

ajoute le cuivre (0,1 mM) au début de l’incubation de la souche de Streptomyces thermocarboxydus, aucune

cellule ne se développe. Le cuivre est toxique à cette concentration. En revanche, une fois les molécules

réductrices de chrome produites, excrétées, et récupérées dans le surnageant, le cuivre Cu permet de

réduire le chrome (1 mM) en 24 heures à 30°C alors que sans Cu ajouté, 2 à 3 jours sont nécessaires. 2+

Une fois sous forme trivalente, le chrome peut vraisemblablement s’adsorber sur les membranes

cellulaires (couleur bleu-vert des mycéliums) et précipiter dans le milieu. Toutes les bactéries non sulfato-

réductrices décrites dans la littérature ayant une activité chromate réductase réduisent le Cr(VI) grâce à des

enzymes. Seules les bactéries sulfato-réductrices sont connues pour réduire le chrome (VI) de façon

indirecte. Streptomyces thermocarboxydus NH50, qui a été isolé d’un sol pollué au chrome, réduit le Cr(VI),

non pas grâce à des enzymes, mais à une ou plusieurs molécules de faibles poids moléculaires contenant

deux groupements carboxyliques et plusieurs groupements alcools. Il existe chez les eucaryotes et chez

certains procaryotes, des molécules réductrices de faible poids moléculaire qui pourraient être le donneur

d’électrons permettant la réduction du chrome (VI) en chrome (III). Une des molécules les plus connues

est le gluthation (γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine) qui possède un groupement SH très réactif.

Ce groupement SH possède une affinité particulière pour le cuivre Cu qui le rend encore plus réactif.

Il est donc possible que la molécule produite par la souche NH50 possède un groupement thiol, ce qui

expliquerait l’augmentation de la vitesse de réduction du chrome lorsque l’on incube les surnageants de

culture en présence de CuCl ou de CuSO . Chez les Actinomycètes, l’ordre bactérien auquel appartient les

Streptomyces, il existe une molécule appelée mycothiol [2-(N-acétylcystéinyl)amido-2-deoxy-α-D-

glucopyranosyl-(1→1)-myo-inositol] (Newton et al,. 1996) qui jouerait un rôle similaire au glutathion. Cette

molécule contient un groupement thiol et plusieurs fonctions OH portées par des dérivés des oses. Elle a

été extraite la première fois de la souche Streptomyces sp. AJ9463 sous forme de disulfure. Cette molécule est

récupérée après lyse cellulaire ce qui suggère qu’elle ne soit pas exportée en grande quantité dans le milieu

de culture. Compte tenu du fait que la molécule réduisant le Cr(VI) produite par la souche Streptomyces

thermocarboxydus NH50 est localisée dans le surnageant de culture, il est possible que la molécule présente

des similarités structurelles mais soit différente. Par exemple les groupements carboxyliques eux aussi très

réactifs vis-à-vis du cuivre, détectés au nombre de deux d’après les spectres RMN du carbone, sont

2+

2 4

2+


203


absents de la molécule de mycothiol.

-2

2+

Les premières expériences en milieu dispersé (suspension de sol en batch) ont montré que la flore

endogène contenue dans le sol réduisait davantage le chrome (VI) en conditions aérobies qu’en absence

d’oxygène. L’activité réductrice de chrome de la ou des espèce(s) microbienne(s) contenue(s) dans le sol

est exprimée en présence d’oxygène. Cette observation a permis d’exclure l’intervention de bactéries

sulfato-réductrices dans ce phénomène dans les conditions testées. Les expériences de réduction du

chrome (VI) contenu dans le sol en batch ont montré qu’il est possible de stimuler la réduction du chrome

par la flore endogène en présence d’oxygène à condition d’apporter des nutriments et du carbone sous

forme de glucose.

L’ajout d’un inoculum enrichi de Streptomyces thermocarboxydus NH50 à du sol en milieu dispersé agité

ou en microcosmes (statique) permet d’augmenter très légèrement la vitesse de réduction (à condition que

ce soit sous forme de mycélium et non pas de spores). Cependant, travailler avec du matériel biologique

vivant présente quelques désavantages. La présence de sol pollué impose des conditions qui peuvent être

défavorables au développement et au métabolisme de la souche apportée. En fonction du degré de

pollution en chrome, mais aussi en fonction d’autres substances qui peuvent être toxiques elles aussi, la

réduction du chrome peut être beaucoup moins efficace.

De bons rendements de réduction du chrome ont pu être obtenus en microcosmes et en lysimètres

mais en ajoutant une quantité de glucose considérable. La part de la réduction abiotique est alors

relativement grande et l’intérêt économique assez faible. On pourrait envisager d’apporter une source de

carbone moins onéreuse telle que la mélasse.

Les surnageants actifs peuvent être lyophilisés à froid (-55°C) à 10 bars. Cette lyophilisation permet

de les concentrer en les solubilisant dans un volume 10 fois plus petit. La lyophilisation et la concentration

des surnageants permettent de conserver les propriétés du surnageant et présentent l’avantage de

permettre la réduction du chrome à des concentrations initiales en chromates (10 mM) plus importantes

que celles imposées en cultures pures (1 mM). Le cuivre a toujours le même effet positif sur la réduction

du Cr(VI). Le fractionnement des molécules présentes dans les surnageants a permis d’exclure l’hypothèse

d’une réduction enzymatique. En effet, les molécules responsables de la réduction du chrome ont une

masse moléculaire inférieure à 1000 Daltons. L’analyse du spectre RMN du carbone 13 de cette fraction a

montré l’existence de petites molécules présentant des caractéristiques semblables aux acides aminés

(liaison C-N, groupements COOH, liaison alcane) et aux sucres. Nous avions remarqué que le NADH

avec du cuivre Cu pouvait aussi réduire le Cr(VI) en solution. L’analyse par RMN du carbone des

fractions de surnageants, présentant une activité chromate réductase, a montré que les résonances

présentes ne correspondaient pas aux résonances du noyau adénosine présent dans le NADH.


204


L’utilisation de surnageants de cultures présente l’avantage de ne pas faire appel à des micro-

organismes vivants, ce qui permet de s’affranchir du problème de toxicité du chrome et des autres

substances pouvant perturber le développement cellulaire voire le rendre impossible. Le deuxième

avantage des surnageants est que sous forme lyophilisée et concentrée, il est possible de réduire des

quantités plus importantes de chrome tout en travaillant avec des ratios liquide/solide de l’ordre de 1/1.

Ces surnageants peuvent être obtenus en optimisant les conditions de cultures plus facilement maîtrisables

en cultures pures qu’en présence de sol. Nous avons d’ailleurs montré que la présence de glycérol et de

Cr(VI) permettait d’obtenir un surnageant de culture actif. L’avantage de travailler avec du glycérol (3 g.L

soit 83 mM de carbone) est d’apporter beaucoup moins de carbone organique que lorsque l’on ajoute du

glucose (10 g.L soit 333 mM de carbone). Ceci contribue à ne pas avoir une concentration en COT trop

importante.

-1

La teneur du sol en cuivre Cu2+ peut aussi être un paramètre important à considérer. En effet, si le sol

en contient suffisamment et qu’on lui applique un surnageant lyophilisé, la réduction sera maximale.

Il faudrait en revanche envisager d’ajouter du cuivre cuivrique dans certains sols pollués qui en seraient

dépouvus pour augmenter la vitesse de réduction. Si l’on envisage de récupérer le chrome (VI) contenu

dans un sol par lavage, on peut utiliser la propriété des cultures de Streptomyces thermocarboxydus pour le

réduire. Si les concentrations ne sont pas trop importantes (< à 1 mM de Cr(VI) puisque au-delà de cette

concentration, les mycéliums de NH50 ont des difficultés à se développer en culture pure), on pourrait

apporter la souche bactérienne sous forme de mycélium et lui laisser produire les molécules actives en

apportant une source de carbone. Si par contre les concentrations sont trop importantes, il serait possible

d’ajouter à la solution de lavage du sol du surnageant lyophilisé et éventuellement du cuivre Cu . 2+

L’étude de la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 permet d’envisager d’utiliser de préférence

les surnageants de culture de celle-ci, concentrés afin de réduire le chrome (VI) présent dans un sol. Ces

surnageants permettent de réduire le chrome dans des conditions qui seraient incompatibles avec une

activité microbienne optimale et avec des volumes de liquide raisonnables. Ces surnageants pourraient

aussi être utilisés pour réduire le chrome (VI) en solution. Il serait intéressant de produire ces surnageants

en quantités importantes. L’avantage du genre Streptomyces est que cette bactérie est déjà largement utilisée

pour la production industrielle d’antibiotiques. Il est possible qu’une fraction des déchets produits pendant

le procédé de fabrication des antibiotiques soit utilisable pour réduire le chrome (VI) et donc valorisée.

Les expériences réalisées en colonnes contenant un garnissage permettant la fixation des bactéries

permet d’envisager l’utilisation de la souche NH50 pour traiter des lixiviats d’un sol pollué (ou d’autres

effluents) contenant du Cr(VI). Chirwa et Wang (1997) avaient réalisé le même type d’expériences avec

Pseudomonas fluorescens LB300 qui développe aussi un biofilm sur un support solide. Le chrome réduit était,

d’après les auteurs, essentiellement retrouvé dans la phase liquide. Les Streptomyces et les Pseudomonas

-1


205


appartiennent à deux groupes de bactéries bien différents : les bactéries à Gram positif et à Gram négatif

respectivement. Il est possible que la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50, compte tenu de la

présence de peptidoglycannes sur sa paroi cellulaire présente une capacité à fixer le Cr(III) supérieure à

celle de Pseudomonas fluorescens LB300. Des expériences complémentaires devront être réalisées afin de

déterminer la capacité maximale de fixation du chrome réduit sur les membranes de la souche NH50. Ce

paramètre serait intéressant à évaluer pour envisager un procédé d’immobilisation sur la biomasse d’une

partie du chrome (III) contenu dans une solution après traitement par réduction du chrome (VI).

A partir des résultats obtenus au cours de cette étude sur la bio-réduction du Cr(VI), nous pouvons

proposer 2 approches pour traiter un sol pollué par des ions chromate.

Avant de détailler les différentes approches, il convient de rappeler qu’une pollution au Cr(VI) est une

pollution très « mobile ». En effet, les chromates sont très solubles dans l’eau. Si le traitement du sol pollué

au Cr(VI) n’est pas envisageable « immédiatement » , il faut protéger le sol des intempéries pour éviter que

les chromates ne soient entraînés par l’eau de ruissellement ou d’infiltration. De plus, les 3 approches que

nous allons développer ci-après impliquent l’utilisation d’une phase liquide aqueuse. Par conséquent, avant

de traiter un sol, il faut « l’isoler » physiquement de l’écosystème environnant (par excavation par

exemple). Le traitement du sol peut être réalisé sur site, ce qui est économiquement intéressant puisqu’il

n’est pas nécessaire de déplacer le sol vers le site de traitement.

Les différentes approches que nous proposons sont les suivantes :

On peut envisager de réaliser des cultures de la souche NH50 en présence de glycérol et avec de

faibles concentrations en Cr(VI) (issu du sol lui-même) pour être dans les conditions optimales

d’obtention des molécules réductrices d’intérêt. Ces cultures pourraient être appliquées sur le sol pollué

confiné (biopile type « compostage »). Il ne nous apparaît pas nécessaire de séparer le surnageant des

cellules puisque la souche ne présente pas de caractère pathogène et qu’elle n’a pas été modifiée

génétiquement. S’il est possible de disposer de cultures lyophilisées, la quantité de phase liquide apportée

sur le sol sera moindre ce qui peut présenter l’avantage de réduire la taille de la zone où le procédé est mis

en œuvre. Il faudra bien sûr comparer le coût de la lyophilisation à celui de la mise en place des structures

de traitement. Dans ce procédé, le chrome serait immobilisé dans le sol.

On peut aussi envisager d’extraire le Cr(VI) contenu dans le sol en lavant celui-ci avec de l’eau en

utilisant des procédés similaires à celui des lysimètres. Une fois le lixiviat récupéré, on peut appliquer soit

une culture de la souche NH50 contenant les molécules réductrices, soit faire circuler ce lixiviat dans des

colonnes contenant un garnissage colonisé par la souche NH50. Si le lixiviat présente une toxicité trop

importante (présence de fortes concentrations de chromates et autres polluants) pour permettre la


206


synthèse des molécules réductrices, la première proposition sera privilégiée. On peut éventuellement

envisager d’ajouter du cuivre Cu (si le sol pollué n’en apporte pas suffisamment) pour permettre une

réduction du Cr(VI) plus rapide. L’avantage de ce procédé est que les cultures auront été réalisées avec du

glycérol ce qui permet de ne pas trop augmenter la COT du lixiviat. Un autre paramètre intéressant est que

le glycérol peut réduire photochimiquement le Cr(VI). En effet, les fonctions alcools du glycérol peuvent

réduire, grâce à la lumière naturelle et les UVA (320-400 nm), le Cr(VI) en Cr(III). Une récente étude

(Yurkow et al., 2002) a montré que cette réduction pouvait avoir lieu à pH neutre mais surtout à pH acide.

En réalisant la réduction du Cr(VI) en bio-réacteur placé à la lumière naturelle, on pourrait combiner

réduction bactérienne et photo-réduction. Le chrome (III) formé par réduction se retrouvera soit en

solution, soit adsorbé sur la biomasse. En fonction des objectifs de traitement, il faudra envisager de

récupérer le Cr(III) en solution et fixé sur la biomasse. La précipitation du chrome (III) sur la biomasse

ayant colonisé le garnissage d’une colonne pose le problème de la gestion de ces garnissages après

réduction.

2+


207

ANNEXES

ANNEXES


208

ANNEXES

1.Les Streptomyces

Nous présenterons dans cette partie la bactérie du genre Streptomyces car la souche bactérienne isolée au

laboratoire et responsable de la réduction du chrome (VI) appartient à ce genre très particulier.

1.1. Caractéristiques du genre Streptomyces

1.1.1. Généralités

Les Streptomyces ont pour niche écologique le sol où ils jouent un rôle important dans la décomposition

de différents bio-polymères et dans la minéralisation de la matière organique. Ces bactéries saprophytes

produisent diverses enzymes extracellulaires impliquées dans la dégradation de nombreuses

macromolécules issues des plantes et des animaux (chitine, pectine, amidon, kératine, élastine, etc…). Ce

sont des eubactéries de l’ordre des Actinomycétales (Figure 46). Cette sous-division des bactéries à Gram

positif est caractérisée notamment par leur haut pourcentage de bases guanine (G) et cytosine (C) dans

leur génome. Généralement, le pourcentage G+C chez ces bactéries est de 72 % contre 50 % chez

Escherichia coli. Les Streptomyces sont les Actinomycètes les mieux connus. Ils sont très étudiés pour leur

propriété à synthétiser des antibiotiques (streptomycine, kanamycine, chloramphénicol...), des

antifongiques (amphotéricine, candicine...), des antitumoraux (mitomycine, actinomycine...), des

antiparasitaires (hygromycine, salinomycine...), des antiviraux (Ara-C, tunicamycine), des insecticides

(avermectine, milbémycine) et des herbicides (bialphos, phosphinothricine).


209

ANNEXES

Actinomycétales

Nocar diaceae

Ther momonospor aceae

Act inobacter iaceae

Streptomycetaceae

Act inoplanaceae

ORDRE

FAMILLE

Int r aspor angium

Streptomyces

Nor cadioides

Spor ichthya

St r eptover t icullium

GENRE

ESPECE

gr iseusalbuscoelicolorlividans ambofaciens

thermocarboxydus

aut r es

SOUCHE

NH50AT37

Figure 46 : Classification des Streptomyces

1.1.2. Cycle de différentiation cellulaire

Les Streptomyces se distinguent des autres bactéries par leur cycle de différentiation. Très souvent, on

considère qu’une colonie bactérienne est un ensemble de bactéries toutes identiques entre elles (puisque

qu’elles dérivent par scissiparité d’un clone isolé). Dans le cas des Streptomyces, on observe des colonies

formées de cellules qui n’ont pas la même morphologie. Elles sont pourtant issues du même clone initial.

Cette particularité est le résultat d’une différenciation morphologique par étapes successives (Figure 47).

La germination d’une spore, sur milieu solide, donne d’abord naissance à un mycélium basal. Celui-ci

« s’incruste » dans le milieu de croissance par action d’enzymes hydrolytiques synthétisées par les cellules.

Ensuite, selon les souches et les conditions environnementales, on observe le développement d’un

mycélium aérien. Les hyphes qui le composent peuvent être de forme variable selon les souches (droite,

spiralée, branchée...). C’est à ce stade que certaines colonies synthétisent les pigments dont la couleur et

l’intensité varient selon les souches et le milieu de culture solide. Les hyphes, contenant plusieurs copies de

l’ADN génomique, donnent naissance à une cinquantaine de spores haploïdes après septation régulière.

Ce développement sous forme de mycélium ressemble beaucoup à celui de certains champignons d’où le

suffixe « -myces ».


210

ANNEXES

Mycélium basal

Figure 47 : Cycle de différenciation des Streptomyces sur milieu so

Source : http://www.streptomyces.u-psud.fr/

1.2. Génétique des Streptomyces

1.2.1. Le génome

Le génome est très riche en bases guanine (G) et cytosine (C). Cette richesse

laisser présager un contenu protéique chez les Streptomyces différent qualitativemen

bactéries. En effet, pour la synthèse d’une protéine, un gène est d’abord trans

RiboNucléique) messager (ARNm) par l’ARN polymérase, puis cet ARNm est t

ribosomes, ensemble complexe de protéines et d’ARN ribosomiaux. Ces ribosome

place de l’ARN de transfert (ARNt) qui porte un acide aminé. La reconnaissance en

de transfert se fait par un système de codon / anticodon. Les bases A (adénine), U

composent l’ARNm peuvent s’appareiller avec ces mêmes bases qui composent l’AR

U et G toujours avec C. A un codon UUA, est associé un anticodon AAU sur l’A

aminé leucine. Si le génome est riche en G et C, on peut penser que les protéin

différemment de celles d’autres micro-organismes. Si l’on reprend l’exemple du

rarement rencontré dans le génome de Streptomyces. Mais les protéines contiennent

autant de leucine que les protéines d’autres origines bactériennes. Ceci est dû à la dé

génétique. Pour un acide aminé, plusieurs codons lui sont associés. Pour avoir un r

protéine, il faut rencontré sur l’ARNm UUA ou UUG. La base située en troisième

n’est pas forcément déterminante pour définir un acide aminé et chez les Strep

d’avantage UUG sur l’ARNm pour coder une leucine que UUA. La composition

protéines n’est donc pas affectée du fait de la dégénérescence du code génétique (Wri


Mycélium aérien

lide.

en G et C aurait pu

t de celui des autres

crit en ARN (Acide

raduit au niveau des

s assurent la mise en

tre l’ARNm et l’ARN

(uracile), G et C, qui

Nt : A toujours avec

RNt qui porte l’acide

es seront composées

codon UUA, il est

proportionnellement

générescence du code

ésidu leucyl dans une

position des codons

tomyces, on rencontre

en acides aminés des

ght et Bibb, 1992).

211

ANNEXES

La molécule d’ADN est linéaire (Lin et al., 1993) ce qui est assez rare dans le règne bactérien. Sa taille

est estimée à 8000 kilobases (kb) soit environ deux fois la taille du génome d’Escherichia coli. Une hypothèse

rendant compte de la grande taille de leur génome est que ces bactéries ont pour habitat naturel le sol dont

les conditions environnementales sont changeantes (température, humidité, nutriments, autres

organismes...) favorisant au cours de l’évolution l’acquisition de nouvelles fonctions. La réplication

démarre au site oriC, situé approximativement au milieu du chromosome, et se propage de façon

bidirectionnelle. Les extrémités du chromosome sont composées de séquences inversées répétées,

appelées TIR pour Terminal Inverted Repeat. La taille de ces séquences est variable et peut atteindre

jusqu’à 840 kb (Fischer et al., 1998). Les extrémités des bras du chromosome de Streptomyces sont instables

car sujettes à des réarrangements chromosomiques importants (délétion d’une partie d’un bras

chromosomique et duplication de l’autre bras). Cette grande instabilité génétique peut s’observer, par

exemple, par la présence sur milieu solide de quelques colonies déficientes dans le processus de

pigmentation, de formation du mycélium aérien ou de sporulation. La plupart de ces mutations sont

associées à des délétions pouvant atteindre jusqu’à 2 Mb chez Streptomyces ambofaciens (Leblond et Decaris,

1994).

1.2.2. Les plasmides

Les Streptomyces peuvent contenir de l’information génétique extrachromosomique. Il s’agit de

molécules d’ADN appelées plasmides. L’information supplémentaire portée par ces molécules peut coder

pour la production d’antibiotiques (Hopwood, 1978) ou pour un système de résistance à des métaux

lourds comme le mercure par exemple (Ravel et al., 1998). Les plasmides peuvent être circulaires. Ces

plasmides dits « ccc » (pour covalently closed circular) sont en multicopie dans la cellule (jusqu’à 300)

(Bibb et al., 1981). Il est assez rare dans ce cas que le plasmide soit perdu au cours de la division des

cellules sauf si bien sûr on ne maintient pas la pression de sélection. Les plasmides dont le nombre de

copies est plus faible sont plus instables. Les mécanismes régissant la réplication et la partition dans les

cellules en division sont encore assez mal connus. Il existe aussi chez les Streptomyces des plasmides linéaires

qui peuvent être très grands (plus de 300 kb). Ceux-ci possèdent à leurs extrémités des protéines liées de

façon covalente (Bao et Cohen, 2001). Ces plasmides peuvent être transmis à d’autres bactéries par

conjugaison (Ravel et al. 1998).


212

ANNEXES

Pour conclure, nous pouvons dire que les Streptomyces sont des bactéries très particulières. Leur

morphologie et leur cycle de différenciation font penser à une moisissure. Dans certains dictionnaires, les

Streptomyces sont définis, non pas en tant que bactérie mais comme des moisissures du sol. Ce genre

bactérien semble être à la frontière entre le monde procaryote et eucaryote. Ces bactéries ne possèdent pas

de noyau mais peuvent posséder plusieurs copies de l’ADN génomique au stade hyphes avant septation.

Le chromosome est linéaire comme chez les eucaryotes et très grand. Il y a en effet plus de gènes (environ

8000) dans le génome de Streptomyces que dans celui de la levure Saccharomyces cerevisiae (environ 6000).

Enfin, une colonie sur milieu solide est un ensemble de cellules avec des morphologies et des

métabolismes différents qui ressemble davantage à un organisme pluricellulaire.

2.Alignement multiple des 7 séquences des membres de la famille

CHR

Voir Figure 48 page suivante


213

ANNEXES

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 ....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|

consensus 1 MSLLQLFMLFLKLGLLGFGGPPAIIAYMREEVVNEKKWISEDEFNNGLALANVIPGPIATQIAAYLGYKLGGILGAILAGVAFILPSFLAMIALFWAYVHVGFL-PAVKGMFYGVQPAVI 119 R. metallidurans 21 YTLRQLVMYFLRLGTLGFGGPVALAGYMHRDLVEAKQWITDADYKEGLALAQLAPGPLAAQLAIYLGYVHYRIVGATLVGVAFVLPSFLMVLALGWAYVRFGGL-TWMQSVFYGVGAAVI 139 Synechoccus 14 YSLKQLTQYFLKLGALGFGGPIALVGYMHRDLVEERQWVSEAEYQEGLTLAQVAPGPLAAQLSFYLGYVHYGFLGSALVGLAFVLPSFLIVVALGWAYTLYGGL-NWMQAVFYGVGAAVI 132 P. aeruginosa 26 MSYPQLFARFLKFGLLAWGGPVAQIDMLRRELVDEERWISSKRFNKLLAVMQVLPGPEAHEICVHLGIRAKGRLGGVLAGLGFMLPGFLLMFALSWLYFQIEFVgTALGAAFLGVQAAVI 145 Synechocystis 24 QRLQELAYLFLRLGLFSFGGPAAHTAMMEEEVVRRQQWLSHEKFLDLIGVTNLIPGPNSTELAIHLGYERGKWAGLIIGGVAFILPAMVVVWLLAIAYVHYQSV-PAVGHMLYGIQPMII 142 B. subtilis 1 MISIYLFMAFFIANLLGYGGGPASIPLMFEEVVNRYSWLSNDQFSNMLALANALPGPIATKIAAYVGYSAGGWPGFLIALIATVVPSALALIVLLRIIQRFRQS-PVIKGMTLSVQPVIA 119 B. subtilis 4 HPYRDMTAAMVRTGILGFGGGPSVIPLIRHEAVNKYKWIDDDEFGEILAIANALPGPIATKMAAYLGFKLKGTLGAIVAILAHILPTCLAMVGLFAAVNVLSHS-AIVAGMIGAVTPVIA 122 Methanococcus 21 PSALNIFMSFLKLGMVAFGGP-TAIAYVREMVVDEKKWMDEKSFNNGVALAQIIPGASVMQVAAYVGFYLRGIVGAFAAFMAYALPAFLIMLFLTIIYMHVKSL-PKTVSIFEALRIIVV 138 Borrelia 1 MILINLFITFLKIGLLNFGGGNGIAAIINNEIINNKHWITKEEFVNMITISRITPGPIATNIATYVGMKTAGIAGAIIATVALITAPIIIMIIILLILHKIGFL-NYCLENLKPIIVALW 119 Borrelia 53 YEILDLFLLVFKTTTLTIGGGLIIISELKKIFVKKRKIISEDDFNKILATSNVIPGVTAINFVFLVGRKFGGFPCALLLVVAGILPSIIAIIMVFLYLKLVPDS-IHVKKFLEGAKISSI 171 130 140 150 160 170 % d’identité % d’homologie (avec séquence consensus) ....*....|....*....|....*....|....*....|....*....|....*... consensus 120 IIIAIAALKFGKKAIKNIGWVWLILLVIIAAIFKTKFFINPLLLIFIALLLGVFITPK 177 R. metallidurans 140 GIIAISAYKLTKKSVGNDKLLWFIYLVLVAVTVITESEVAWLFLAAGVLVWFWRAPPK 197 51 68 Synechoccus 133 GIIAISAYKLTRKTVGTSWLLWSIYLVNAATTIVTESERVELILGSGALVLLVKFPPK 190 48 62 P. aeruginosa 146 ALIVRAVHRIG-EHILLDRWLWVIAIVCALAAIGRVDFWITLPAGGLVYALLVLNHRA 202 45 62 Synechocystis 143 PLIGQALWKLGRKALKNPLTIGAAVLVMVGTAWGKP-EILLLLLAGLALVLIQIGRGR 199 44 63 B. subtilis 120 VMMLILTWQIGADGIKAIGWVQSIVITGISLLAMTKFKMHPAFLIIAAFLYGGLVIPY 177 44 59 B. subtilis 123 VMLGIMAYEFGQKALKGFGWVTGILFFIIAFIGLQTLQINPGLVIIIFLAYGAFHFKL 180 49 64 Methanococcus 139 SLAANGTLNFSKKNIRTIGDVFLLLISALLFILKFSPFIVIFVSIFIGFLMYRRDITK 196 47 66 Borrelia 120 IITIIILLENTYLKIENNKTELLKTLAIVGINFFILFFYNKISPALVIILSGFFYTLI 177 37 51 Borrelia 172 IIMITVVLKFSKKMLNDSIIKWTICFLVIFAIFKLKIKISYILLIFFLVYTFKYITIK 229 39 53

Figure 48 : Alignement multiple des 7 séquences des membres de la famille CHR. Pour les souches de R. metallidurans, de P. aeruginosa, de Synechoccus sp, de

Synechocystis sp et de Methanococcus, il s’agit de la séquence du premier domaine. Alignement réalisé par BLAST Conserved Domaine Browser. En noir, les zones

présentant le plus d’homologies. Les pourcentages d’identité et d’homologie avec la séquence consensus ont été calculés en comparant les séquences par BLAST

matrice BLOSUM62

ANNEXES

3.Résonances (ppm) des atomes de carbone de différentes

molécules. Liste fournie par S. Cortes du laboratoire de

Résonance Magnétique en Biologie Moléculaire CEA Grenoble.

3-hydroxy-2-butyrate 19.1 3-hydroxy-2-butyrate 25.4 3-hydroxy-2-butyrate 73.9 3-hydroxy-2-butyrate 182 Acétaldéhyde 30.7 Acétaldéhyde 199.7 Acétate 24.4 Acétate 182.2 Acétohydroxybutyrate 8 Acétohydroxybutyrate 28.3 Acétohydroxybutyrate 87.3 Acétohydroxybutyrate 176.3 Acétone 19.4 Acétone 24.5 Acétone 30.6 Acétone 73.1 Acétone 206 Acétone 211.2 Adénosine 61.8 Adénosine 70.8 Adénosine 76.3 Adénosine 86 Adénosine 88.1 Adénosine 119.4 Adénosine 140.1 Adénosine 149.1 Adénosine 152.4 Adénosine 156.1

Alanine 51.5 Alanine 176.6 Aminocyclopropane 12.9 Aminocyclopropane 36.4 Aminocyclopropane 176.7 Arginine 24.7 Arginine 28.5 Arginine 41.4

Arginine 157.7 Arginine 175.4 Asparagine 35.4 Asparagine 52.2 Asparagine 174.2 Asparagine 175.4 Aspartate 37.4 Aspartate 53.1

Aspartate 178.3 ATP-4 62.2 ATP-4 70.9 ATP-4 73.3 ATP-4 84.4 ATP-4 88.1 ATP-4 118.8 ATP-4 140.4

ATP-4 153.3 ATP-4 155.6 Bétaïne 54 Bétaïne 66.9 Bétaïne 169.8 Cadavérine 23.4 Cadavérine 27.1 Cadavérine 40.2

Choline 56.5 Choline 68.3 Chorogénate 37.3 Chorogénate 37.4 Chorogénate 70.1 Chorogénate 71.5 Chorogénate 72.3 Chorogénate 75.9

Chorogénate 115.2 Chorogénate 116 Chorogénate 117 Chorogénate 123.5 Chorogénate 127.6 Chorogénate 145.1 Chorogénate 147 Chorogénate 148

Alanine 16.7

Arginine 55.3

Aspartate 175

ATP-4 149.1

Choline 54.7

Chorogénate 101.1

Chorogénate 169.4 Chorogénate 178.3 Citrate 45 Citrate 76 Citrate 179 Citrate 182.1 Citrulline 25.6 Citrulline 28.4 Citrulline 40 Citrulline 55.3


215

ANNEXES

Citrulline 162.2 Citrulline 175.3 Cystathionine 27.9 Cystathionine 31.1 Cystathionine 33.1 Cystathionine 54.7 Cystéine 25 Cystéine 55.6 Cystéine 171.5 Ethanol 17.6 Ethanol 58.3 Ethanolamine 42.3 Ethanolamine 58.6 Ethanolamine –P 41.6 Ethanolamine –P 61.1 Fructose 6-P 63.6 Fructose 6-P 65.1 Fructose 6-P 75.3 Fructose 6-P 76.1 Fructose 6-P 80.7 Fructose 64.7 Fructose 68.4 Fructose 70.1 Fructose 70.5 Fructose 99.1 Fumarate 136.6 Fumarate 175.9 Glucose 6-P 63.7 Glucose 6-P 70 Glucose 6-P 71.9 Glucose 6-P 72.5 Glucose 6-P 73.3 Glucose 6-P 75.2 Glucose 6-P 76.2 Glucose 6-P 93 Glucose 6-P 96.9 Galactose 61.9 Galactose 62.1 Galactose 69.3 Galactose 70.1 Galactose 70.2 Galactose 71.3 Galactose 72.9 Galactose 75.9 Galactose 93.2 Galactose 97.3 Glucose 61.6 Glucose 70.4 Glucose 72.3 Glucose 74.9 Glucose 76.5 Glucose 76.7 Glucose 92.8 Glucose 96.7 Glutamate 27.8

Glutamate 34.2 Glutamate 55.6 Glutamate 175.3 Glutamate 181.9 Glutamine 27 Glutamine 31.6 Glutamine 55.1 Glutamine 178.6 Glutathione pH 5.5 27.2 Glutathione pH 5.5 32.2 Glutathione pH 5.5 39.7 Glutathione pH 5.5 44.3 Glutathione pH 5.5 53.5 Glutathione pH 5.5 55.1 Glutathione pH 5.5 172.5 Glutathione pH 5.5 174.7 Glutathione pH 5.5 175.8 Glutathione pH 5.5 176.8 Glycéraldéhyde 63.4 Glycéraldéhyde 75.5 Glycéraldéhyde 91.2 Glycérol 63.2 Glycérol 72.9 Glycine 42.4 Glycine 173.3 Histidine 28.4 Histidine 55.4 Histidine 118 Histidine 131.7 Histidine 136.7 Histidine 174.4 Inositol 72 Inositol 73.1 Inositol 73.3 Inositol 75.2 Isoleucine 11.5 Isoleucine 15.5 Isoleucine 25.2 Isoleucine 36.7 Isoleucine 60.5 Isoleucine 175 Lactate 21 Lactate 69.3 Lactate 182.3 Leucine 21.7 Leucine 22.8 Leucine 24.9 Leucine 40.7 Leucine 54.4 Leucine 176.4 Lysine 22.2 Lysine 27.3 Lysine 30.7 Lysine 40.1 Lysine 55.4


216

ANNEXES

Lysine 175.4 Mannitol 63.9 Mannitol 70 Mannitol 71.7 Méthionine 14.7 Méthionine 29.6 Méthionine 30.5 Méthionine 54.8 Méthionine 175.1 Ornithine 23.5 Ornithine 28.2 Ornithine 39.8 Ornithine 54.5 Ornithine 174.9 Phénylalanine 37.2 Phénylalanine 57 Phénylalanine 128.5 Phénylalanine 129.9 Phénylalanine 130.1 Phénylalanine 135.9 Phénylalanine 174.7 Proline 24.5 Proline 29.7 Proline 47 Proline 62.1 Proline 175.5 Pyruvate 27.2 Pyruvate 170 Pyruvate 205.8 Ribose 6-P 71 Ribose 6-P 64.6 Ribose 6-P 65.4 Ribose 6-P 71.5 Ribose 6-P 76.1 Ribose 6-P 82.5 Ribose 6-P 83.2 Ribose 6-P 97 Ribose 6-P 101.9 Sérine 57.3 Sérine 61.1 Sérine 173.2 Thréonine 20.2 Thréonine 61.3 Thréonine 66.8 Thréonine 173.7 Tryptophane 27.2 Tryptophane 56 Tryptophane 108.3 Tryptophane 112.8 Tryptophane 119.2 Tryptophane 120.2 Tryptophane 122.9 Tryptophane 126 Tryptophane 127.4 Tryptophane 137.2

Tryptophane 175.3 Tyrosine 36.3 Tyrosine 57 Tyrosine 116.7 Tyrosine 127.5 Tyrosine 131.5 Tyrosine 155.7 Tyrosine 174.9 Valine 17.4 Valine 18.8 Valine 29.9 Valine 61.3 Valine 175.1 Xylose 61 Xylose 66 Xylose 70 Xylose 70.2 Xylose 72.3 Xylose 73.6 Xylose 74.8 Xylose 76.6 Xylose 93 Xylose 97.


217

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Abou-Jaoude, A., Pascal, M.C., and Chippaux, M. Formate-nitrite reduction in Escherichia coli K12.

Identification of components involved in the electron transfer. Eur. J. Biochem., 1979, vol. 95, n°2, pp 315-

321.

Acar, Y. B., Gale, R. J., Alshawabkeh, A. N., Marks, R. E., Puppala, S., Bricka, M., and Parker, R.

Electrokinetic remediation : Basics and technology status. Journal of Hazardous Materials, 1995, vol. 40, n°2,

pp 117-137.

Alloway, B. J. Soil processes and the behavior of heavy metals. In : Alloway, B. J. Ed, Heavy metals in

soil. Glasgow : Wiley , 1995, 368 p.

Alvarez, A. H., Moreno-Sanchez, R., and Cervantes, C. Chromate efflux by means of the ChrA

chromate resistance protein from Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., 1999, vol. 181, n°23, pp 7398-7400.

Anderson, R. A., Chen, N., Bryden, N.A., Polansky, M. M., Cheng, N., Chi, J., and Feng, J.

Elevated intakes of supplemental chromium improve glucose and insulin variables in individuals with type

2 diabetes. Diabetes, 1997, vol. 46, pp 1786-1791.

Bao, K. and Cohen, S. N. Terminal proteins essential for the replication of linear plasmids and

chromosomes in Streptomyces. Genes Dev., 2001, vol 15, n° 12, pp 1518-1527.

Barthet, L. Bioimmobilisation des métaux lourds dans les sols. Etude de faisabilité et évaluation des

performances sur un sol pollué par du Cr(VI). DEA Sciences et Techniques du Déchet. LAEPSI, INSA

de Lyon, 2000, 61 p.

Bartlett, R. J. and Kimble, J. M. Behavior of chromium in soils : II. Hexavalent forms. J. Environ. Qual,

1976, vol. 5, n°4, pp 383-386.

Bibb, M. J., Ward, J. M., Kieser, T., Cohen, S. N., and Hopwood, D. A. Excision of chromosomal

DNA sequences from Streptomyces coelicolor forms a novel family of plasmids detectable in Streptomyces

lividans. Mol. Gen. Genet., 1981, vol. 184, n°2, pp 230-240.


218


Bopp, L. H. and Ehrlich, H. L. Chromate resistance and reduction in Pseudomonas fluorescens strain

LB300. Archives of Microbiology, 1988, vol. 150, pp 426-431.

Brown, M. R. and Williams, P. The influence of environment on envelope properties affecting survival

of bacteria in infections. Annu. Rev. Microbiol., 1985, vol. 39, pp 527-556.

Buerge, I. J. and Hug, S. L. Kinetics and pH dependence of chromium (VI) reduction by iron (II).

Environmental Science and Technology, 1997, vol. 31, pp 1426-1432.

Campos, J., Martinez-Pacheco, M., and Cervantes, C. Hexavalent-chromium reduction by a

chromate-resistant Bacillus sp. strain. Antonie Van Leeuwenhoek, 1995, vol. 68, n°3, pp 203-208.

Cary, E. E. Chromium in air, soils and natural waters. In : Langard, S., Ed. Biological and Environmental

Aspects of Chromium. Amsterdam : Elsevier Biomedical Press, 1982, pp 48-64.

Cervantes, C., Ohtake, H., Chu, L., Misra, T.K., and Silver, S. Cloning, nucleotide sequence, and

expression of the chromate resistance determinant of Pseudomonas aeruginosa plasmid pUM505. J. Bacteriol.,

1990, vol. 172, n°1, pp 287-291.

Cervantes, C. and Silver, S. Plasmid chromate resistance and chromate reduction. Plasmid, 1992, vol. 27,

n°1, pp 65-71.

Cervantes, C., Campos-Garcia, J., Devars, S., Gutierrez-Corona, F., Loza-Tavera, H., Torres-

Guzman, J. C., and Moreno-Sanchez, R. Interactions of chromium with microorganisms and plants.

FEMS Microbiol. Rev., 2001, vol. 25, n°3, pp 335-347.

Chirwa, E. M. N. and Wang, Y. T. Chromium(VI) reduction by Pseudomonas fluorescens LB300 in fixed-

film bioreactor. Journal of Environmental Engineering, 1997, vol. 123, n°8, pp 760-766.

Chirwa, E. M. N. and Wang, Y. T. Simultaneous chromium(VI) reduction and phenol degradation in

an anaerobic consortium of bacteria. Water Research, 2000, vol. 34, n°8, pp 2376-2384.

Chung, C. T., Niemela, S. L. , and Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli :

transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1989, vol.

86, n°7, pp 2172-2175.


219


Clarke, P. H. and Ornston, L. N. Metabolic pathway and regulation. In Clarcke, P. H., Richmond, M.

H., Eds. Genetics and Biochemistry of Pseudomonas. London : Wiley Intersciences, 1975, pp 91-261.

Das, S. and Chandra, A. L. Chromate reduction in Streptomyces. Experientia, 1990, vol. 46, pp 731-733.

Davis, C. M. and Vincent, J. Chromium oligopeptide activates insulin receptor tyrosine kinase activity.

Biochemistry, 1997, vol. 36, pp 4382-4385.

Desjardin, V., Bayard, R., Huck, N., Manceau, A., and Gourdon, R. Effect of microbial activity on

the mobility of chromium in soils. Waste Management, 2002, vol. 22, pp 195-200.

Deverel, S. J. and Millard, S. P. Distribution and mobility of selenium and other trace elements in

shallow ground water of the Western San Joaquin Valley, California. Environmental. Science and Technology,

1988, vol. 22, pp 697-702.

Dhakephalkar, P. K., Bhide, J. V., and Paknikar, K. M. Plasmid mediated chromate resistance and

reduction in Pseumonas mendocina MCM B-180. Biotechnology Letters, 1996, vol. 18, n°10, pp 1119-1122.

Eary, L. E. and Rai, D. Kinetics of chromate reduction by ferrous iron derived from hematite and

biotite at 25°C. American Journal of Sciences, 1989, vol. 289, pp 180-213.

Fischer, G., Wenner, T., Decaris, B., and Leblond, P. Chromosomal arm replacement generates a

high level of intraspecific polymorphism in the terminal inverted repeats of the linear chromosomal DNA

of Streptomyces ambofaciens. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1998, vol. 95, n°24, pp 14296-14301.

Garbisu, C., Alkorta, I., Llama, M. J., and Serra, J. L. Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis.

Biodegradation., 1998, vol. 9, n°2, pp 133-141.

Gendrault, S. Réduction du chrome hexavalent par Streptomyces thermocarboxydus dans un sol pollué, DEA

Sciences et Techniques du Déchet. LAEPSI, INSA de Lyon, 2000, 61 p.

Govindaraju, K. Compilation of working values and sample description for 170 international reference

samples of mainly silicate rocks and minerals. In : Govindaraju, K., Ed. Special issue of Geostandards

Newsletter. Paris : International Working Group (IWG) of the Association nationale de la recherche

technique 1984, vol. 8, pagination multiple.


220


Gvozdyak, I., Mogilevich, N. F., Rylskii, A. F., and Grishchenko, N. I. Reduction of hexavalent

chromium by collection strains of bacteria. Mikrobiologiya, 1986, vol. 55, pp 962-965 .

Hopwood, D. A. Extrachromosomally determined antibiotic production. Annu. Rev. Microbiol., 1978,

vol. 32, pp 373-392.

Hopwood, D. A., Bibb, M. J., Chater, K. F., Kieser, T., Bruton, C. J., Kieser, H. M., Lydiate, D. J.,

Smith, C. P., Ward, J. M., and Schrempf, H. Genetic manipulation of Streptomyces : A laboratory

manual. Norwich : John Innes Foundation, 1985, 356 p.

Horitsu, H., Futo, S., Miyazawa, Y., Ogai, S., and Kawai, K. Enzymatic reduction of hexavalent

chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1. Agric. Biol. Chem., 1987, vol. 51, 9,

pp 2417 -2420.

Huck, N. Etude de la bioréduction du chrome hexavalent en chrome trivalent dans un sol pollué. DEA

Sciences et Technique du Déchet. LAEPSI, INSA de Lyon, 1997, 51 p.

Hug, S. L., Laubscher, H. U. , and James, B. R. Iron (III) catalyzed photochemical reduction of

chromium (VI) by oxalate and citrate in aqueous solutions. Environmental Science and Technology, 1997,

vol. 31, n°1, pp 160-170.

Ishibashi, Y., Cervantes, C., and Silver, S. Chromium reduction in Pseudomonas putida. Appl. Environ.

Microbiol., 1990, vol. 56, n°7, pp 2268-2270.

James, B. R. and Bartlett, R. J. Behavior of chromium in soils : VII. Hexavalent forms. J. Environ. Qual,

1983, vol. 12, n°2, pp 177-181.

Ji, G. and Silver, S. Regulation and expression of the arsenic resistance operon from Staphylococcus aureus

plasmid pI258. J. Bacteriol., 1992, vol. 174, n°11, pp 3684-3694.

Kaiwar, S. P. and Rao, C. P. In vitro reduction of Cr(VI) by low molecular weight biomimetic

components: a comparative study using UV-Vis spectroscopy. Chem Biol. Interact., 1995, vol. 95, n°1-2, pp

89-96.

Kinashi, H., Shimaji, M., and Sakai, A. Giant linear plasmids in Streptomyces which code for antibiotic

biosynthesis genes. Nature, 1987, vol. 328, n°6129, pp 454-456.


221


Kleber, R. J. and Helz, G. R. Indirect photoreduction of aqueous chromium (VI). Environmental Science

and Technology, 1992, vol. 26, pp 307-312.

Komori, K., Wang, P. C., Toda, K., and Ohtake, H. Factors affecting chromate reduction in

Enterobacter cloacae HO1. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, vol. 31, pp 567-570.

Kvasnikov, E. I., Kliushnikova, T. M., Kasatkina, T. P., Kiprianova, E. A., and Boiko, O. I.

Resistance of bacteria of the genus Pseudomonas to hexavalent chromium compounds and the capacity for

their reduction. Mikrobiol. Zh., 1988, vol. 50, n°6, pp 24-27.

Kvasnikov, E. I., Kliusnikova, T. M., Kasatkina, T. P., Stepaniuk, V. V., and Kuberskaia, S. L.

Bacteria reducing chromium in nature and in effluents of industrial plants. Mikrobiologiia, 1988, vol. 57,

n°4, pp 680-685.

Le Faou, A., Rajagopal, B. S., Daniels, L., and Fauque, G. Thiosulfate, polythionates and elemental

sulfur assimilation and reduction in the bacterial world. FEMS Microbiol. Rev., 1990, vol. 6, n°4, pp 351-

381.

Le Hecho, I., Tellier, S., and Astruc, M. Industrial site soils contaminated with arsenic or chromium :

Evaluation of the electrokinetic method. Environmental Technology, 1998, vol. 19, pp 1095-1102.

Lebedeva, E. V. and Lyalikova, N. N. Reduction of crocoïte by Pseudomonas chomatophilia sp. nov.

Mikrobiologiya, 1979, vol. 48, pp 517-522.

Leblond, P. and Decaris, B. New insights into the genetic instability of Streptomyces. FEMS Microbiol.

Lett., 1994, vol. 123, n°3, pp 225 -232.

Lide, D. R. CRC Handbook of Physics and Chemistry, 82 ed. Bocarabon : CRC Press, 2001, pagination

multiple. ISBN 0849304822.

nd

Lin, Y. S., Kieser, H. M., Hopwood, D. A., and Chen, C. W. The chromosomal DNA of Streptomyces

lividans 66 is linear. Mol Microbiol, 1993, vol. 10, n°5, pp 923-933.

Llovera, S., Bonet, R., Simon-Pujol, M., and Congregado, F. Chromate reduction by resting cells of

Agrobacterium radiobacter EPS-916. Appl. Environ. Microbiol., 1993, vol. 59, pp 3516-3518.


222


Losi, M. E., Amrhein, C., and Frankenberger Jr, W. T. Factors affecting chemical and biological

reduction of hexavalent chromium in soil. Environmental Toxicology and Chemistry, 1994, vol. 13, n°11, pp

1727-1735.

Losi, M. E., Amrhein, C., and Frankenberger Jr, W. T. Environmental Biochemistry of Chromium.

Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 1994, vol. 136, pp 91-121.

Lovley, D. R. and Phillips, E. J. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c cytochrome.

Appl. Environ. Microbiol, 1994, vol. 60, n°2, pp 726-728. 3

Lydiate, D. J., Mendez, C., Kieser, H.M., and Hopwood, D.A. Mutation and cloning of clustered

Streptomyces genes essential for sulphate metabolism. Mol Gen Genet, 1988, vol. 211, pp 415-423.

Lytle, C., Lytle, F. W., Yang, N., Qian, J. H., Hansen, D., Zayed, A., and Terry, N. Reduction of

Cr(VI) to Cr(III) by wetland plants : potential for in-situ metal detoxification. Environmental Science and

Technology, 1998, vol. 32, pp 3087-3093.

Marzluf, G. A. Genetic and metabolic controls for sulfate metabolism in Neurospora crassa: isolation and

study of chromate-resistant and sulfate transport- negative mutants. J. Bacteriol., 1970, vol. 102, n°3,

pp 716-721.

McLean, J. and Beveridge, T. J. Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site

contaminated with chromated copper arsenate. Appl. Environ. Microbiol., 2001, vol. 67, n°3, pp 1076-1084.

McLean, J. S., Beveridge, T. J., and Phipps, D. Isolation and characterization of a chromium-reducing

bacterium from a chromated copper arsenate-contaminated site. Environ. Microbiol., 2000, vol. 2, n°6, pp

611-619.

Mertz, W. Chromium in human nutrition : a review. J. Nutr., 1993, vol. 123, pp 626-633.

Michel, C., Chardin, B., and Bruschi, M. Bioremediation des métaux lourds par les bactéries sulfato-

réductrices. Sciences et Techniques, 2000, vol. 17, pp 1-4.

Michel, C., Brugna, M., Aubert, C., Bernadac, A., and Bruschi, M. Enzymatic reduction of

chromate: comparative studies using sulfate- reducing bacteria. Key role of polyheme cytochromes c and

hydrogenases. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, vol. 55, n°1, pp 95-100.


223


Moura, J. J., LeGall, J., and Xavier, A. V. Interconversion from 3Fe into 4Fe clusters in the presence of

Desulfovibrio gigas cell extracts. Eur. J. Biochem., 1984, vol. 141, n°2, pp 319-322.

Mullingan, C. N., Yong, R. N., and Gibbs, B. F. An evaluation of technologies for the heavy metal

remediation of dredged sediments. Journal of Hazardous Materials, 2001, vol. 85, n°1-2, pp 145-163.

Myers, C. R., Carstens, B. P., Antholine, W. E., and Myers, J. M. Chromium(VI) reductase activity is

associated with the cytoplasmic membrane of anaerobically grown Shewanella putrefaciens MR-1. J. Appl.

Microbiol, 2000, vol. 88, n°1, pp 98 -106.

Newton, G. L., Arnold, K., Price, M. S., Sherrill, C., Delcardayre, S. B., Aharonowitz, Y., Cohen,

G., Davies, J., Fahey, R. C., and Davis, C. Distribution of thiols in microorganisms: mycothiol is a

major thiol in most actinomycetes. J. Bacteriol., 1996, vol. 178, n°7, pp 1990-1995.

Nieboer, E. and Jusys, A. A. Biologic chemistry of chromium. In : Nriagu, J. O., Nieboer, E. Eds.

Chomium in the Natural and human environments. NY : Wiley (Advances in Environmental Sciences and

Technology vol. 20), 1988, pp 21-81.

Nies, A., Nies, D. H., and Silver, S. Nucleotide sequence and expression of a plasmid-encoded

chromate resistance determinant from Alcaligenes eutrophus. J. Biol. Chem, 1990, vol. 265, n°10, pp 5648-

5653.

Nies, D. H., Koch, S., Wachi, S., Peitzsch, N., and Saier, M. H., Jr. CHR, a novel family of

prokaryotic proton motive force-driven transporters probably containing chromate/sulfate antiporters.

J. Bacteriol., 1998, vol. 180, n°21, pp 5799-5802.

Norris, G., Al-Dhahir, Z., Birnstingl, J., Plant, S. J., Cui, S., and Mayell, P. A case study of the

management and remediation of soil contaminated with polychlorinated biphenyls. Engineering Geology,

1999, vol. 53, n°2, pp 177-185.

Ohtake, H., Komori, K., Cervantes, C., and Toda, K. Chromate-resistance in a chromate-reducing

strain of Enterobacter cloacae. FEMS Microbiol. Lett., 1990, vol. 55, n°1-2, pp 85-88.

Ota, N., Galsworthy, P. R., and Pardee, A. B. Genetics of sulfate transport by Salmonella typhimurium. J.

Bacteriol., 1971, vol. 105, n°3, pp 1053-1062.


224


Palmer and Wittbrodt. Processes affecting the remediation of hexavalent sites. Environmental Health

Perspectives, 1991, 92, pp 25-40.

Park, C. H., Keyhan, M., Wielinga, B., Fendorf, S., and Matin, A. Purification to homogeneity and

characterization of a novel Pseudomonas putida chromate reductase. Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol. 66,

n°5, pp 1788-1795.

Pascal, P. Combinaison du chrome avec l'oxygène. In : Pascal, P., Chrome, complexes du chrome,

Molybdène-/ Nouveau Traité de Chimie Minérale, Tome XIV, Paris : Masson, 1959, pp 167-310.

Patterson, R. R., Fendorf, S., and Fendorf, M. Reduction of hexavalent chromium by amorphous iron

sufide. Environmental Science and Technology, 1997, vol. 31, n°7, pp 2039-2044.

Peitzsch, N., Eberz, G., and Nies, D. H. Alcaligenes eutrophus as a bacterial chromate sensor. Appl.

Environ. Microbiol, 1998, vol. 64, n°2, pp 453-458.

Pepi, M. and Baldi, F. Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in

yeasts from industrial wastes. Biometals, 1992, vol. 5, n°3, pp 179-185.

Pettine, M., Camusso, M., Martinotti, W., Marchetti, R., Passino, R., and Queirazza, G. Soluble

and particulate metals in the Po River: factors affecting concentrations and partitioning. The Science of the

Total Environment, 1994, vol. 145, n°3, pp 243-265.

Pettine, M., D'Ottone, L., Campanella, L., Millero, F. J., and Passino, R. The reduction of

chromium by iron (II) in aqueous solutions. Geochimica Cosmochimica Acta, 1998, vol. 62, n°9, pp 1509-1519.

Radovic, S. Etude de la biolixiviation des métaux lourds et de la bioréduction du Cr(VI) en Cr(III) dans

un sol pollué. DEA Siences et Technique du Déchet, LAEPSI, Ecole Nationale Supérieure des Mines de

St Etienne et INSA de Lyon, 1996, 40 p.

Ramamoorthy, S. and Kushner, D. Binding of mercury and other heavy metals by microbial growth

media. Microb. Ecol., 1975, vol. 2, pp 162-176.

Ravel, J., Schrempf, H., and Hill, R. T. Mercury resistance is encoded by transferable giant linear

plasmids in two chesapeake bay Streptomyces strains. Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol. 64, n°9, pp 3383-

3388.


225


Romanenko, V. I. and Koren'kov, V. W. A pure culture of bacteria utilizing chromates and

bichromates as hydrogen acceptors in growth under anaerobic conditions. Mikrobiologiya, 1977, vol. 46, pp

414-417.

Ross, D. S., Sjogren, R. E., and Bartlett, R. J. Behavior of chromium in soils : IV. Toxicity to micro-

organisms. J. Environ. Qual, 1981, 10, 2, pp 145-148.

Salunkhe, P. B., Dhakephalkar, P. K., and Paknikar, K. M. Bioremediation of hexavalent chromium

in soil microcosms. Biotechnology Letters, 1998, vol. 20, n°8, pp 749-751.

Sedlak, D. L. and Chan, P. G. Reduction of hexavalent chromium by ferrous iron. Geochimica

Cosmochimica Acta, 1997, vol. 61, n°11, pp 2185-2192.

Shen, H. and Wang, Y. T. Characterization of enzymatic reduction of hexavalent chromium by

Escherichia coli ATCC 33456. Appl. Environ. Microbiol, 1993, vol. 59, n°11, p3771-3777.

Shen, H. and Wang, Y. T. Simultaneous chromium reduction and phenol degradation in a coculture of

Escherichia coli ATCC 33456 and Pseudomonas putida DMP-1. Appl. Environ. Microbiol., 1995, vol. 61, n°7, pp

2754-2758.

Silver, S. Bacterial resistances to toxic metal ions-a review. Gene, 1996, vol. 179, n°1, pp 9-19.

Smith, F. W., Hawkesford, M. J., Prosser, I. M., and Clarkson, D. T. Isolation of a cDNA from

Saccharomyces cerevisiae that encodes a high affinity sulphate transporter at the plasma membrane. Mol. Gen.

Genet., 1995, vol. 247, n°6, pp 709-715.

Stoecker, B. J. Chromium In : Ziegler, E. E., Filer, L. J. Eds. Present knowledge in nutrition 7th ed.

Washington : ILSI Press, 1996, 352 p.

Suzuki, T., Miyata, N., Horitsu, H., Kawai, K., Takamizawa, K., Tai, Y., and Okazaki, M.

NAD(P)H-dependent chromium (VI) reductase of Pseudomonas ambigua G-1: a Cr(V) intermediate is

formed during the reduction of Cr(VI) to Cr(III). J. Bacteriol., 1992, vol. 174, n°16, pp 5340-5345.

Tessier, A., Campbell, P., and Bisson, M. Sequential extraction procedure for speciation of particulate

trace metals. Anal. Chem, 1979, vol. 51, n°7, pp 844-851.


226


Turick, C. E., Camp, C. E., and Apel, W. A. Reduction of Cr(6+) to Cr(3+) in a packed-bed

bioreactor. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1997, vol. 63-65, pp 871-877.

Turick, C. E. and Apel, W. A. A bioprocessing strategy that allows for the selection of Cr(VI)-reducing

bacteria from soils. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1997, vol. 18, pp 247-250.

Volff, J. N. and Altenbuchner, J. A new beginning with new ends: linearisation of circular

chromosomes during bacterial evolution. FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 186, n°2, pp 143-150.

Wang, P. C., Mori, T., Toda, K., and Ohtake, H. Membrane-associated chromate reductase activity

from Enterobacter cloacae. J. Bacteriol., 1990, vol. 172, n°3, pp 1670-1672.

Wang, Y. T. and Shen, H. Bacterial reduction of hexavalent chromium. Journal of Industrial Microbiology,

1995, vol. 14, pp 159-163.

Wang, Y. T. and Xiao, C. Factors effecting hexavalent chromium reduction in pure cultures of bacteria.

Water Research, 1995, vol. 29, n°11, pp 2467-2474.

Wright, F. and Bibb, M. J. Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome. Gene, 1992, vol. 113, n°1,

pp 55-65.

Yurkow, E. J., Hong, J., Min, S., Wang, S. Photochemical reduction of hexavalent chromium in

glycerol-containing solutions. Environmental Pollution, 2002, vol. 117, pp 1-3.

Zhang, C., Liu, S., Logan, J., Mazumder, R., and Phelps, T. J. Enhancement of Fe(III), Co(III), and

Cr(VI) reduction at elevated temperatures and by a thermophilic bacterium. Applied Biochemistry and

Biotechnology, 1996, vol. 57-58, pp 923-932.


227

LISTES DES FIGURES

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Mécanisme de résistance aux ions CrO par mutation du système de transport du sulfate........47 2-4

Figure 2 : Mécanismes de résistance aux ions CrO par réduction et par la protéine ChrA chez Ralstonia

metallidurans .........................................................................................................................................................51

2-4

Figure 3 : Cycle du soufre chez les bactéries (d’après Le Faou et al., 1990) ......................................................53

Figure 4 : Couplage entre la réaction de l’hydrogénase et la réaction du sulfite chez Desulfovibrio gigas

(d’après Moura et al., 1984) .............................................................................................................................55

Figure 5 : Boîte de culture cellulaire contenant le surnageant SCr après lyophilisation...................................88

Figure 6 : Schéma d’une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac ..................................................92

Figure 7 : Aspect de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu R5 après 4 et 8 jours d’incubation à

30°C.....................................................................................................................................................................97

Figure 8 : Coloration du milieu M63 glycérol contenant initialement 1 mM de Cr(VI) : à gauche : témoin

abiotique et à droite : après 15 jours de culture de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 (après

réduction du Cr(VI)) .........................................................................................................................................98

Figure 9 : Antibiogrammes de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu NE après 5 jours. .............. 101

Figure 10: Electrophorèse en champ pulsé de la souche S. thermocarboxydus NH50. Programme : 6 V/cm,

20 s-40 s pendant 20 h. (-, sans traitement à la pronase ; +, traitement à la pronase). ....................... 102

Figure 11 : Principe de la conjugaison entre bactéries. Hypothèse : NH50 posséderait le gène de la

résistance au chrome sur le plasmide pLN01. ........................................................................................... 111

Figure 13 : PFGE de Streptomyces thermocarboxydus NH50, de Streptomyces lividans TK24 et des clones 8 et 10

obtenus après conjugaison entre NH50 et TK24. .................................................................................... 114


228

LISTES DES FIGURES

Figure 14 : Plasmide circulaire pSIT151 et séquences intégrées dans l’ADN cible après induction de la

transposase avec aacI : gène de résistance à la gentamycine ; aphII : gène de résistance à la

kanamycine ; tsr : gène de résistance au thiostrepton ; EcoRI, XhoI et PstI sont des sites de restriction..

........................................................................................................................................................................... 115

Figure 15 : Principe de la mutagenèse au hasard avec le plasmide pSIT151 dans la souche NH50. .......... 117

Figure 16 : Gel de PFGE agarose 0,9 %, programme 40-160 s pendant 20 h de l’ADN + de Streptomyces

thermocarboxydus NH50, des dérivés TI Chr et de la souche Streptomyces lividans TK24....................... 118 S

Figure 17 : gel de PFGE avec l’ADN non digéré du phage lambda et de TI1. ............................................. 119

Figure 18 : Effet de la taille de l’inoculum (concentrations initiales en spores.mL dans le milieu) sur la

réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 en présence de glycérol 3

g.L ou de glucose à 10 g.L . Après 4 et 6 jours d’incubation à 30°C sous agitation 120 rpm en

milieu minéral M63 avec 1 mM de chrome (VI) de concentration initiale. .......................................... 125

-1

-1 -1

Figure 19 : Cinétique de bio-réduction du chrome (VI) en culture pure de Streptomyces thermocarboxydus

NH50 inoculé sous la forme de spores à 4.10 spores.L (milieu nutritif M63, [glc] = 10 g.L ou [Y]

= 3 g.L , 30°C, obscurité, [Cr(VI)] = 50 mg.L , 18 jours d’incubation). ............................................ 126

6 -1 i

-1 i -1

Figure 19 : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par des surnageants de culture de S. thermocarboxydus

NH50 avec ou sans cuivre. SCr : pourcentage de réduction par le surnageant de culture de NH50

après 24 heures, SCr + Cu : surnageant de culture de NH50 + 20 µM de Cu après 24 h, culot

cellulaire : culot cellulaire de NH50 après 7 jours et M63Y + 20 µM de Cu après 7 jours (témoin

abiotique). Concentration initiale en chrome : 1mM................................................................................ 130

2+

2+

Figure 20 : Réduction du Cr(VI) en fonction de la concentration en Cu par un surnageant SCr provenant

d’une culture de 10 jours de S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63Y à 1 mM de Cr(VI).............. 131

2+

Figure 22 : Comparaison des valeurs expérimentales de vitesses de réduction du chrome en fonction de la

concentration initiale en Cr(VI). .................................................................................................................. 136

-1 i

2+

Figure 21 : Représentation de Lineweaver-Burk : 1/v = f(1/[Cr(VI)], avec v vitesse de réduction du

chrome (36 premières heures) à différentes concentrations initiales en Cr(VI) (1, 2, 3 et 4 mM) .... 135


229

LISTES DES FIGURES


pendant 90 minutes avec ou sans Cu . [Cr(VI)] = 0,8 mM ................................................................ 139 2+


pendant 20 heures avec ou sans Cu . [Cr(VI)] = 0,8 mM (la réduction est complète à 100 et

500 µM de Cu avec ou sans protéinase K).............................................................................................. 139

2+

2+

Figure 25 : Précipitation du surnageant S à l’éthanol.......................................................................................... 141

Figure 26 : Spectres RMN du C : A : de la fraction F du surnageant S ; B : du milieu M63Y avec une

référence éthanol ; C : de la fraction F du surnageant SCr avec une référence éthanol. ............... 152

13

1000

Figure 27 : Agrandissements du spectre RMN du C du carbone de la fraction F du surnageant SCr153 13

Figure 29 : Réduction du Cr(VI) dans des suspensions de sols pollués dans différentes conditions (eau ou

M63 avec ou sans glucose 10 g.L (glc) ou glycérol 3 g.L (Y)), 2,5 g de sol dans 100 mL de milieu,

incubation à 30°C, agitation orbitale 120 rpm........................................................................................... 159

-1 -1

Figure 30 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore endogène en condition anaérobie en

milieu M63. Influence de la source de carbone organique. (30°C, 10 g de sol dans 100 mL de milieu)

........................................................................................................................................................................... 161

Figure 31 : Effet de l’enrichissement en flore endogène sur l’évolution de la concentration en chrome dans

les essais contenant 2,5 g de sol (pollution initiale environ 1000 mg.kg ) pour 100 mL de milieu

minéral liquide M63 glucose (10 g.L )........................................................................................................ 164

-1

Figure 32 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la réduction du Cr(VI) en suspension

de sol sans enrichissement (L/S = 10, température d’incubation : 30°C) ............................................ 165

Figure 33 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la réduction du Cr(VI) en suspension

de sol avec enrichissement (NH50 sous forme de spores) (L/S = 10, température d’incubation :

30°C)................................................................................................................................................................. 165

ini

ini

1000

1000

Figure 29 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore endogène en condition aérobie en

milieu M63. Influence de la source de carbone organique. (30°C, 10 g de sol dans 100 mL de milieu)

........................................................................................................................................................................... 161

-1


230

LISTES DES FIGURES

Figure 34 :Bio-réduction du chrome (VI) par Pseudomonas fluorescens LB 300 en culture pure en milieu M63

à 30°C. Influence de la source de carbone (glucose.10 g.L ou glycérol à 3 g.L soit respectivement

333 et 83 mM de carbone) ........................................................................................................................... 170

-1

Figure 35 : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par ajout de la souche Streptomyces

thermocarboxydus NH50 sous forme de spores (10 spores.mL , 30°C).................................................. 172 7

Figure 36 : Suivi de la concentration en Cr(VI) en solution en fonction du temps en microcosmes : 1 g de

sol (apportant 1,8 mg de Cr(VI)) incubé à 30°C avec 400 ou 800 µL de surnageants S ou SCr

concentrés 10 fois. En pointillé figurent les témoins réalisés avec 1 g de sol et le milieu de culture

stérile concentré 10 fois................................................................................................................................. 182

Figure 37 : Désorption du Cu à 30°C contenu dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d’eau

déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec renouvellement de la phase liquide toutes les 30

minutes............................................................................................................................................................. 183

2+

Figure 39 : Schéma d’un lysimètre avec circulation en boucle fermée............................................................. 188

Figure 40 : Aspect du sol : à gauche dans le lysimètre 1A (eau permutée), à droite dans le lysimètre 1B

(ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de 100/5/1/0,75) ..... 189

Figure 41 : Évolution de la concentration en chrome (VI) en solution dans les réacteurs des lysimètres 1A

(eau permutée) et 1B (ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de

100/5/1/0,75)................................................................................................................................................. 190

Figure 43 : Schéma d’une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac............................................. 199

Figure 44 : Evolution de la concentration en Cr(VI) dans les 4 colonnes. (colonne 1 : bidim, colonnes 2 et

3 : colliers d’anneaux de Raschig et colonne 4 : anneaux de Raschig en vrac) ..................................... 200

-1

-1

Figure 38 : Désorption du Cr(VI) à 30°C contenu dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d’eau

déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec renouvellement de la phase liquide toutes les 30

minutes............................................................................................................................................................. 183

Figure 42 : Suivi des concentrations en Cr(VI) dans la solution contenue dans les réacteurs des lysimètres

2A (flore endogène +NH50) et 2B (flore endogène) ............................................................................... 192


231

LISTES DES FIGURES

Figure 45 : Aspect des anneaux de Raschig : à gauche avant utilisation et à droite, après 46 jours en

présence de Streptomyces thermocarboxydus NH50 et de Cr(VI) réduit en Cr(III) dans la colonne 2. ... 201

Figure 46 : Classification des Streptomyces .............................................................................................................. 210

Figure 47 : Cycle de différenciation des Streptomyces sur milieu solide. Source : http://www.streptomyces.u-

psud.fr/ ............................................................................................................................................................ 211

Figure 48 : Alignement multiple des 7 séquences des membres de la famille CHR. Pour les souches de R.

metallidurans, de P. aeruginosa, de Synechoccus sp, de Synechocystis sp et de Methanococcus, il s’agit de la

séquence du premier domaine. Alignement réalisé par BLAST Conserved Domaine Browser. En

noir, les zones présentant le plus d’homologies. Les pourcentages d’identité et d’homologie avec la

séquence consensus ont été calculés en comparant les séquences par BLAST matrice BLOSUM62

........................................................................................................................................................................... 214


232

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Concentration moyennes en chrome dans différents minéraux (d’après Govindaraju, 1984) ...16

Tableau II : Doses létales du chrome (VI) pour différentes espèces animales. (DL) chez l’Homme, DL

chez le rat et concentrations létales CL chez les organismes aquatiques) .............................................27 50

50

Tableau III : Répartition géographique des sites pollués recensés en France en novembre 2000. ................29

Tableau IV: Les 10 principaux polluants des sites pollués répertoriés par le Ministère de l’Aménagement

du Territoire et de l’Environnement (novembre 2000)...............................................................................30

Tableau V : Valeurs limites de concentration en métaux dans un sol agricole destiné à l’épandage de boues

de station d’épuration (mg.kg de matières sèches).....................................................................................31 -1

Tableau VI : Répartition géographique des sites pollués au chrome recensés en novembre 2000................39

Tableau VII : Les 9 sites pollués au chrome classés « libres d’accès » par le Ministère de l’Aménagement du

Territoire et de l’Environnement, novembre 2000. .....................................................................................40

Tableau VIII : Les protéines de la famille CHR.....................................................................................................50

Tableau IX : Réduction du Cr(VI) par différentes bactéries. (D’après Wang et Chen, 1995) ........................56

Tableau X : Bactéries réduisant les chromates de manière enzymatique en condition anaérobie..................58

Tableau XI : Bactéries réduisant les chromates de manière directe en condition aérobie...............................60

Tableau XII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas ambigua G-1............................61

Tableau XIII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas putida MK1...........................62

Tableau XIV : Comparaison des bilans énergétiques selon que Cr(VI) ou O2 sont utilisés comme

accepteurs d’électrons (d’après Shen et Wang, 1995) ..................................................................................65

Tableau XV : Types d’inhibitions réversibles. ........................................................................................................66


233

LISTE DES TABLEAUX

Tableau XVI : Quantité de métaux lourds dans le sol exprimée mg.kg de matière sèche (Radovic, 1996).

Extraction séquentielle (procédure de Tessier (1979)). ...............................................................................74

-1

Tableau XVII : Antibiogramme de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50......................................... 100

Tableau XVIII : Diamètres (cm) des zones d’inhibition et de ralentissement de la croissance de différentes

souches de Streptomyces sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µL de Cr(VI) 1 M (sous forme

de K2CrO ) après 7 jours à 30°C. ................................................................................................................ 103

Tableau XIX : Concentration létale 50 (CL50) de Cr(VI) (apporté sous forme de K CrO ) pour 4 souches

de Streptomyces sur milieu solide LB.............................................................................................................. 104 2 4

Tableau XX : Diamètre (cm) de la zone d’inhibition de la croissance de différentes souches de Streptomyces

sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µL de Cd (sous forme de CdCl ) et Cu (sous

forme de CuCl ) après 7 jours à 30°C......................................................................................................... 106 2 2+

2

Tableau XXI : Détermination de la valeur de la concentration en chrome (VI) pour la sélection des

conjugants. Nombre de colonies en fonction de la concentration en chrome (VI) dans le milieu LB

........................................................................................................................................................................... 111

2+ 2+ 2+

2 2 2 2 2

4

Tableau XXIII : Effet du Cu et du Cu à la concentration de 0,1 mM ajoutés dans des cultures de 3

jours de Streptomyces thermocarboxydus NH50, S. lividans TK24 et S. cœlicolor (milieu M63Y, 30°C). Le

Cr(VI) est ajouté en même temps que le cuivre à la concentration de 1 mM. ..................................... 128

2+ +

4

2+

Tableau XXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI), en présence de Ni , Cd ou de Cu de cultures de

S. thermocarboxydus NH50 après 3 jours d’incubation à 30°C en milieu M63Y. Les cations métalliques

sont ajoutés sous forme de NiCl 6H O, CdCl H O et CuCl 2H O à la concentration de 0,1 mM.

Le chrome est ajouté sous forme de K CrO à la concentration de 1 mM. ......................................... 128 2

2

Tableau XXIV : Vitesses de réduction du Cr(VI) observées pendant les 36 premières heures dans le

surnageant SCr avec différentes concentration en Cu .......................................................................... 133 2+

Tableau XXV : Influence de la présence au préalable de Cr(VI) dans la culture. Pourcentage de réduction

du Cr(VI) par les surnageants S et SCr en présence de 20 µM de Cu à 30°C. .................................. 133 2+

Tableau XXVI : Pourcentage de réduction par le surnageant SCr après 24 heures à différentes

températures.................................................................................................................................................... 137


234

LISTE DES TABLEAUX

Tableau XXVII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 jours à 30°C par les surnageants S et S

de S. lividans TK24 et S. thermocarboxydus NH50 en fonction de la présence de 0,1 mM de cuivre Cu

sous forme de CuCl avec concentration initiale en Cr(VI) de 1 mM. Les surnageants S sont

complémentés par 0,2 mM de NADH en tant que donneur d’électrons.............................................. 142

p

2+

2 p

Tableau XXVIII : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) à la concentration initiale de 1 mM dans

l’eau et dans les milieux M63 et M63Y avec ajout éventuel de 2 mM de NADH et/ou 0,1 mM de

Cu .................................................................................................................................................................. 143 2+

Tableau XXIX : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) en 24 heures à 30°C en présence des

différents minéraux présents dans le milieu M63 en présence de 2 mM de NADH et/ou de 0,1 mM

de CuCl , concentration initiale en Cr(VI) = 1 mM ................................................................................. 144

Tableau XXX : Pourcentage de réduction du chrome (VI) (à la concentration initiale de 1 mM) par un

surnageant de culture avant lyophilisation et après lyophilisation à –55°C avec ou sans cuivre Cu à

la concentration de 0,1 mM après 1, 3 et 9 jours d’incubation à 37°C. ................................................. 145

2+

2+

Tableau XXXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les fractions R , F , R , F des

surnageants S et SCr lyophilisés et concentrés dix fois en 10 à température ambiante. ..................... 147 3000 1000

Tableau XXXIII : Intensités et fréquences auxquelles résonnent les carbones des molécules présentes dans

la fraction F du surnageant SCr. ............................................................................................................. 155 1000

2

Tableau XXXI : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les surnageants concentrés 10 fois et non

concentrés après lyophilisation avec ou sans Cu à la concentration initiale de 0,1 mM.

Concentration initiale en Cr(VI) = 10 mM ................................................................................................ 146

3000 1000

Tableau XXXIV : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore

endogène en condition aérobie après 21 jours d’incubation à 30°C en suspension de sol (milieu M63,

glucose à 10 g.L-1, ratio L/S = 100 mL pour 10 g de sol). ..................................................................... 167

Tableau XXXV : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore

endogène enrichie en condition aérobie après 3 jours d’incubation à 30°C (100 mL de milieu M63,

glucose 10 g.L ).............................................................................................................................................. 168 -1

Tableau XXXVI : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol par Pseudomonas fluorescens LB300 en 21

jours d’incubation à 30°C.............................................................................................................................. 171


235

LISTE DES TABLEAUX

Tableau XXXVII : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par Streptomyces

thermocarboxydus NH50 sous forme de spores ou de mycélium en 16 jours à 30°C. ............................ 173

Tableau XXXVIII :Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d’incubation à 30°C en

microcosmes (10 g de sol apportant 3 mg de Cr(VI) et 3 mL de milieu liquide) avec un rapport

massique C/N/P/ Cr(VI) de 100/8/0,5/1,25)......................................................................................... 176

Tableau XL : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d’incubation à 30°C en

microcosmes (5 g de sol apportant 5 mg de Cr(VI) et 3 mL de milieu M63 à 7,5 g.L de glucose avec

S. thermocarboxydus NH50 et P. fluorescens LB300 avec un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de

100/14/103/55,5 ........................................................................................................................................... 178

-1

Tableau XLI : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 semaines d’incubation à 30°C en

microcosmes (2,5 g de sol non stérile apportant 4,5 mg de Cr(VI) et 25 mL de surnageants de culture

de S. thermocarboxydus NH50, de milieu M63 (rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/15)

ou d’eau............................................................................................................................................................ 180

Tableau XLII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en solution par SCr et SCr et M63 Y concentrés

10 fois en présence de cuivre Cu en 24 heures à 30°C. ........................................................................ 181 2+

Tableau XLIII : Bilan des essais en lysimètre 3A, 3B, 3C et 3D après 3 mois de traitement. 3 kg de sol

([Cr total] = 4900 mg.kg et [Cr(VI)] = 2300 mg.kg de sol sec), 3 litres de milieu nutritif

recirculé en boucle fermée à température ambiante. ................................................................................ 195 ini -1 ini -1

Tableau XLV : Ecotoxicité du sol pollué avant et après traitement sur les semences d’orge (Hordeum

vulgare) et de cresson (Lepidium sativum) - Méthode ISO 11 269-2 ......................................................... 197

Tableau XLVI : Ecotoxicité du percolat du sol pollué avant et après traitement (obtenu par percolation

d’eau permutée sur une colonne de sol avec un ratio L/S cumulé de 2,0) ........................................... 197


236

FOLIO ADMINISTRATIF

THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

NOM : DESJARDIN DATE de SOUTENANCE : 28 juin 2002 (avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant) Prénoms : Valérie TITRE : Réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée à partir d’un sol pollué NATURE : Doctorat Numéro d'ordre : 02 ISAL 0030 Formation doctorale : SCIENCES ET TECHNIQUES DU DECHET Ecole Doctorale : CHIMIE de LYON (Chimie, Procédés, Environnement) Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE : RESUME :

A partir d’un sol, provenant d’un site de l’agglomération lyonnaise pollué par des ions chromate, une nouvelle souche bactérienne, capable de réduire le Cr(VI) a été isolée. Cette souche a été identifiée comme appartenant au genre Streptomyces et à l’espèce thermocarboxydus. Elle a été appelée NH50.

L’objectif de ce travail a été de caractériser cette souche bactérienne afin de déterminer d’une part si les mécanismes de résistance Cr(VI) et de réduction du Cr(VI) étaient similaires à ceux décrits chez d’autres bactéries présentant les mêmes phénotypes et d’autre part si l’on pouvait envisager de l’utiliser dans un procédé de traitement biologique.

Les résultats obtenus ont montré que Streptomyces thermocarboxydus NH50 possède un niveau de résistance aux ions chromate supérieur à celui d’autres Streptomyces étudiés. La présence d’un plasmide linéaire, qui est absent chez les autres souches étudiées, suggère que le ou les gènes responsables de la résistance au Cr(VI) soient localisés sur l’ADN extra-chromosomique. Les différentes expériences de conjugaison et de mutagenèse n’ont pas permis de démontrer ni d’exclure la participation du plasmide, en tant que support génétique, dans le phénomène de résistance au chrome. L’étude de la réduction du Cr(VI) en culture pure par la souche NH50 a montré que l’activité chromate réductase est localisée dans les surnageants de culture. Il s’agit de molécules de faible masse moléculaire (< 1000 Daltons). D’après les spectres RMN du 13C, la (ou les) molécule(s) réductrices possède(nt) deux fonctions carboxyliques et plusieurs fonctions hydroxyles. L’application de surnageants lyophilisés et concentrés dix fois sur du sol pollué (ratio massique Liquide/Solide = 1) a permis de réduire tout le chrome (VI) présent (pollution initiale d’environ 2000 mg.kg-1) en une quinzaine de jours.

En conclusion, cette étude permet d’envisager l’utilisation des surnageants de culture de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 dans un procédé de dépollution qui présenterait l’avantage de pouvoir s’affranchir des problèmes de toxicité des polluants présents qui peuvent compromettre l’efficacité des traitements biologiques basés sur l’utilisation de cellules vivantes.

MOTS-CLES :

Bio-réduction, Chrome, Streptomyces, Mobilité, Toxicité, Traitement, Sol Pollué.

Laboratoire (s) de recherches :

LAEPSI, Laboratoire d’Analyse Environnementale des Procédés et des Systèmes Industriels UMG-CI, Unité de Microbiologie et de Génétique - Composante INSA Directeurs de thèse:

R. GOURDON (Professeur à l’INSA de Lyon) P. LEJEUNE (Professeur à l’INSA de Lyon)

Président de jury : Composition du jury : Docteur R. BAYARD Docteur J. COVES (Rapporteur) Docteur I. IGNATIADIS (Rapporteur) Professeur P. LEBLOND Professeur P. LEJEUNE

Professeur R. GOURDON