Upload
vutu
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Marion Bouchecareilh INSERM U1053 Bordeaux
3ème journée Filfoie, 16 Novembre 2017, Paris
Recherche des facteurs génétiques en cause dans les hépatopathies associées au déficit en Alpha 1-Antitrypsine
Surface Cellulaire
! Glycoprotéine de 52 kDa
! Produite et sécrétée principalement par les hépatocytes
! Inhibiteur général des sérine-protéases
! Activité essentielle au niveau des poumons - Dégradation de l’élastine composante clé de la matrice extracellulaire des alvéoles
! Production hépatique cruciale pour maintenir:
- Balance de protéases/antiprotéases - Intégrité des poumons
Golgi
Noyau
V
V
V
Réticulum Endoplasmique
(RE)
1AT
1AT
Alpha 1-Antitrypsine (1AT)
V
V
V
1AT Wild-type Absence de
sécrétion: Emphysème
Z-1AT 1AT
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
- Formation et accumulation d’agrégats
V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
- Formation et accumulation d’agrégats
V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
- Formation et accumulation d’agrégats
V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
- Formation et accumulation d’agrégats
- Cirrhose (≈ 8% des patients ZZ)
V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Cirrhose
toxic
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)
! Absence de trafic et de sécrétion
! Mutant Z (E342K):
- le plus sévère et le plus commun
-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342
- Formation et accumulation d’agrégats
- Cirrhose (≈ 8% des patients ZZ)
- Cause beaucoup plus fréquente de maladie du foie chez les adultes V
V
V
1AT Wild-type
Z-1AT
Z-1AT 1AT
Absence de sécrétion:
Emphysème
Cirrhose
toxic
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)
! Variabilité considérable dans la survenue et la sévérité des dommages hépatiques associés au déficit en 1AT
! Impossibilité de prédire quelles sont les personnes à risque de développer des dommages au foie
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD) et foie
Quels sont les facteurs génétiques associés au déficit en 1AT et impliqués dans les dommages
hépatiques?
! Variabilité considérable dans la survenue et la sévérité des dommages hépatiques associés au déficit en 1AT
! Impossibilité de prédire quelles sont les personnes à risque de développer des dommages au foie
Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD) et foie
Crible génétique
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
Gènes validés: cibles thérapeutiques
biomarqueurs
Séquençage d’Exome ADN de fratries
(Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)
Approche Expérimentale
Crible génétique
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
Gènes validés: cibles thérapeutiques
biomarqueurs
Séquençage d’Exome
Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/
POLYGEN (≈150 patients, informations et échantillons biologiques)
ADN de fratries (Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)
Approche Expérimentale
Séquençage d’Exome
Crible génétique
Identification de gènes candidats
Herp
HRD1
Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/
POLYGEN
Collaboration Gitler Lab (Standford, CA, USA)
Approche Expérimentale
Protéines Mal-conformées
HRD1 Herp
ERAD:Endoplasmic Reticulum Associated Degradation
Voie de signalisation: ERAD
Modèles cellulaires du déficit en 1AT Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
ER
1AT
Secreted
Golgi
Nucleus
1AT
Z-AAT
Z-AAT
Cell Surface
Z-1AT 1AT
Validation des gènes candidats
Modèles cellulaires du déficit en 1AT Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
ER
1AT
Secreted
Golgi
1AT
Z-1AT
Z-1AT
Cell Surface
Z-1AT 1AT
Validation des gènes candidats
Nucleus
-HRD1
Z-1AT 1AT
-HRD1
1
Cel
l Via
bilit
y
siRNA: HRD1 Scr
15000
30000
45000
0
*
WT-1AT
Z-1AT
Modèles cellulaires du déficit en 1AT Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
L’extinction d’HRD1 diminue la viabilité des cellules exprimant
le mutant Z
Validation des gènes candidats
Herp
Z-1AT Z-1AT
Herp R50H
Modèles cellulaires du déficit en 1AT Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
Validation des gènes candidats
Herp
Z-1AT Z-1AT
Herp R50H
Modèles cellulaires du déficit en 1AT
*
0
50
100
pcDNA Herp R50H pcDNA Herp R50H 0
50
100
Num
ber o
f cel
ls (%
)
Le variant Herp R50H diminue la prolifération et la viabilité cellulaires
Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Validation dans cellules humaines
Validation des gènes candidats
Z-1A
T Scr HRD1 Herp
Hsp90
siRNA:
0
2,5
5
scr si hdr1 si herp Scr HRD1 Herp 0
5
2.5
Rel
ativ
e Z-
1AT
prot
ein
*
*
*
*
Immature (I): Forme du RE Mature (Mat): Forme post-RE
Mat I
siRNA:
L’extinction de Herp et HRD1 augmente la forme immature du mutant Z-1AT
Validation des gènes candidats
Z-1A
T Scr HRD1 Herp
Hsp90
siRNA:
0
2,5
5
scr si hdr1 si herp Scr HRD1 Herp 0
5
2.5
Rel
ativ
e Z-
1AT
prot
ein
*
*
*
*
Immature (I): Forme du RE Mature (Mat): Forme post-RE
Mat I
siRNA:
Z-1AT
GAPDH
Insoluble Soluble
siRNA:
L’extinction de Herp et HRD1 augmente la formation des agrégats du mutant Z-1AT
L’extinction de Herp et HRD1 augmente la forme immature du mutant Z-1AT
Validation des gènes candidats
Les agrégats seuls du mutant Z-1AT n’activent pas l’UPR
Herp
Hsp90
Bip
WT-1AT - - + + Tun
Z-1AT WT-AAT Z-AAT
Déficit en 1AT et Unfolded Protein Response
Les cellules exprimant le mutant Z-1AT présentent une hyperactivation de l’UPR
WT-1AT - - + + Tunicamycine
Z-1AT WT-1AT Z-1AT
Herp
Hsp90
Bip
Déficit en 1AT et Unfolded Protein Response
Les cellules exprimant le mutant Z présentent une hyperactivation à l’UPR suite à l’extinction d’HDR1 et de Herp
Une dérégulation de l’ERAD induit la mort cellulaire via une hyperactivation de l’UPR
Scr HRD1 Herp Z-1AT WT-1AT
Tun
0
0,5
1
1,5
2
2,5
scr si hrd1
0
0,5
1
1,5
2
scr si hrd1 0
0.5
1.0
2.0
2.5
1.5
0
0.5
1.0
2.0
1.5
Scr siHRD1 Scr siHRD1
* *
WT-1AT
Z-1AT
NS *H
erp
expr
essi
on
(fold
cha
nge)
BIP
exp
ress
ion
(fo
ld c
hang
e)
Herp
Hsp90
Bip
Scr HRD1 Herp Tun Scr HRD1 Herp Tun
siRNA:
siRNA: Z-1AT
Scr HRD1 Tun
WT-1AT
Hsp90
siRNA: siRNA:
Z-1AT 1AT
Mesure de l’UPR: Marqueurs BiP et Herp
Déficit en 1AT et Unfolded Protein Response
HFE rs1799945 C187G H63D
Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/POLYGEN
ADN de fratries
Séquençage Exome Analyse Bionformatique
Collaboration Gitler Lab (Standford, CA, USA)
(Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)
Identification de gènes candidats
Crible génétique/Séquençage d’Exome
Identification de gènes candidats
Pipeline expérimental: Séquençage d’Exome
Surface Cellulaire
Golgi
Noyau
RE
HFE H63D
Hémochromatose: Maladie génétique
associée à des hépatopathies
HFE H63D
- Les patients déficitaires en 1AT et porteurs de la mutation HFE-H63D développent une cirrhose plus précocement.
HFE H63D induit une activation des caspases et réduit la proliferation cellulaire et ceci est associé avec une activation prolongée de l’UPR
Liu et al 2011
HFE et 1ATD
0
20
40
60
80
100
120
scr hrd1 herp IB3 M scr+H63D
IB3 M si hrd1
+H63D
IB3 M si herpud +H63D
0
60
100
Num
ber o
f cel
ls (%
)
20 40
80
120 WT-1AT
Z-1AT
* *
Scr siHRD1 siHerp siRNA: Scr siHRD1 siHerp
*
*
+ HFE-H63D
Z-1AT 1AT
L’expression HFE H63D associé à un défaut de l’ERAD diminue la prolifération et la viabilité des cellules du mutant Z
HFE H63D et 1ATD
Variants Herp R50H et HFE H63D : facteurs génétiques impliqués dans la progression des dommages au foie associés à l’1ATD.
HFE H63D et 1ATD
Cohorte DEFI-ALPHA
Séquençage Exome Analyse Bioinformatique
Validation and caractérisation
… To be continued
Biomarqueurs?
Conclusion et Perspectives
Cohorte DEFI-ALPHA
Séquençage Exome Analyse Bioinformatique
Validation and caractérisation
… To be continued
Biomarqueurs?
Conclusion et Perspectives
Autres sous-groupes de patients?
Autre maladies rares
pédiatriques du foie
(Mucoviscidose, Wilson…)?
Inhibiteurs de l’UPR comme
thérapeutique?
Conclusion et Perspectives
Association de la microdissection laser à la spectrométrie de masse
Quels sont les modificateurs associés aux maladies rares pédiatriques du foie?
(Bordeaux, France)
Perspectives
Alpha 1-Antitrypsine
Mucoviscidose
Maladie de Wilson
Atrésie des voies Biliaires
Foie sain
Pr. A. Lachaux Pr S. Collardeau-
Frachon
Perspectives
Alpha 1-Antitrypsine
Mucoviscidose
Maladie de Wilson
Atrésie des voies Biliaires
Conclusion et Perspectives
Alpha 1-Antitrypsine
Mucoviscidose
Maladie de Wilson
Atrésie des voies Biliaires
Identification de cibles candidates
Validation échantillons biologiques et cellules
humaines
cibles thérapeutiques biomarqueurs
Perspectives
A plus long terme…
Equipe Dr. Moreau (BaRITOn – U1053) Violaine Moreau Frédéric Saltel Paulette Bioulac Anne-Aurélie Raymond Sylvaine Di Tommaso
Equipe Pr. Cullin Christophe Cullin Christelle Marchal Hélène Vignaud
Equipe Pr. Lachaux Abdelouahed Belmalih Sophie Collardeau-Frachon Philippe Joly Alain Lachaux Lioara Restier
Equipe Pr. Arveiler Benoit Arveiler Patricia Maurin
Gitler Lab Julien Couthouis
Remerciements
Cellular tools
Genomic screen
Identification of candidates genes
Transformation with Z-AAT
Humanortholog
Gene DescripBon
YNL330C/RPD3HistonedeacetylaseHDAC2
YNL041C/COG6ComponentofOligomericCOG6GolgiComplex6
YPL180W/TCO89SubunitofTORC1mTORC1
YDR116C/MRPL1MitochondrialribosomalMRLP1
YOL013C/HRD1UbiquiBn-proteinligaseHRD1
Genomic screen
Outils cellulaires
Genomic screen
Identification of candidates genes
Genomic screen
Empty Vector Wild type AAT
Z-AAT
Expression Not Induced
Expressioninduced
HRD1∆
BY4247
Empty Vector Wild type AAT
Z-AAT
0
15000
30000
45000
mTOR RpTOR HD2 HRD1 COG6 MRLP1 NT Mg nontraité
1 WT-AAT Z-AAT
#
Cel
l Via
bilit
y - Candidates Genes - Candidates Genes
Validation of Candidates genes
mTOR RpTOR HD2 HRD1 COG6 MRLP1 Scr
15000
30000
45000
0