BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 521

BBA 65127

RECHERCHE D'UNE ACTIVITI~ ENZYMATIQUE DANS

LES HYDROLYSATS DE TRYPSINE

JEAN CHEVALLIER, YVETTE JACQUOT-ARMAND ET J E A N N I N E YON

Laboratoire de Biologie Fhysico-Chimique, Facult~ des Sciences, Orsay, Seine-et-Oise (France)

(Re~u le 28 juillet, 1964)

SUMMARY

Research of some enzymatic activity in the hydrolysis products of trypsin

Some previous studies have seemed to prove the evidence of an active peptide occurring from trypsin (EC 3.4-4.4) hydrolysate. It had been obtained either by peptic hydrolysis of acetyltrypsinogen or by tryptic autolysis.

In the present paper, the different experiments are tried again and discussed. With both methods, the enzymatic activity finally obtained is related with the presence of unhydrolysed trypsin in the active fraction. Spectral analysis of this fraction shows that an important part of the enzyme is denatured.

INTRODUCTION

Le centre actif des enzymes hydrolytiques repr6sente une pattie relativement restreinte de la mol6cule; toutefois des modifications m~me discr~tes du reste de la prot6ine peuvent entralner la disparition de l'activit6 catalytique. Le r61e de la super- structure de la mol6cule d'enzyme pose donc un important probl~me pour la com- pr6hension du m6canisme de la catalyse enzymatique.

De nombreux auteurs ont cherch6 A obtenir des fragments d'enzymes hydroly- tiques poss6dant encore une activit6. Quelques r6sultats positifs ont 6t6 d6crits. On peut citer les travaux de SMITH 1 sur la papaine (EC 3.4.4.io), ceux de PERLMANN 2 sur la pepsine (EC 3.4.4.1) et la trypsine (EC 3-4.4.4)-

Plusieurs auteurs ont dit avoir obtenu des peptides actifs A partir de la trypsine par diff6rentes m6thodes. On doit citer les exp6riences de VISWANATHA ET LIENER 8-5. Ces exp6riences tendent A prouver qu'apr~s hydrolyse pepsique de l'ac6tyltrypsino- g~ne, 50% de l'activit6 trypsique (amidasique et est6rasique) est retrouv6e darts un peptide de poids mol6culaire 6gal/t 6000 environ. Les auteurs attribuent au peptide une sp6cificit6 plus large qu'A la trypsine initiale; ils trouvent une activit6 chymo- trypsique correspondant ~ un 6quivalent de 5 % de chymotrypsine (EC 3.4.4.5) dans le milieu.

D'autres auteurs, BRESLER et co1. ~, MOSOLOV ET LOGINOVA 7, semblaient avoir obtenu des peptides actifs A partir d'autolysats de trypsine tL des pH variant entre 8.0 et 9.15.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1964) 521-528

522 J. CHEVALLIER, Y. JACQUOT-ARMAND, J. YON

Ces r6sultats paraissaient discutables et ont 6t6 mis en doute par quelques auteurs, en particulier par DESNUELLE 8. Compte tenu de l'int6r~t que peut pr6senter l'isole- ment d 'un peptide actif/~ partir d 'un hydrolysat de trypsine pour l'6tude cin6tique et pour l'analyse du m6canisme d'action de cet enzyme, nous avons repris ces travaux.

Dans ce but, nous avons recherch6, en respectant les conditions exp6rimentales de ces pr6c6dents auteurs, ~ retrouver des peptides actifs soit par hydrolyse trypsique de l'ac6tyltrypsinog~ne soit par autolyse de la trypsine.

MATI~RIEL ET M]~THODES

L'acdtyltrypsinog~ne s'obtient ~ partir du trypsinog~ne (Worthington I fois crist., 50% MgSO4) trait6 par CH3CO2Na ~ 0.5 de saturation suivant la technique d6crite par VISWANATHA ET LIENER 5.

I1 est soumis ~t une prot6olyse sous l'action de la pepsine (Worthington i fois crist.

sans sel) ~ pH 3.4, /~ 20° pendant 59 h. Les prot6ines sont ensuite pr6cipit6es par (NH4)2SO 4 ~ 0.3 de saturation, dissoutes

dans un tampon borate 0.005 M e t dialys6es contre ce tampon avant la chromato-

graphie sur DEAE-cellulose. La trypsine (cristallis6e de novo sans sel ou Worthington) est dialys6e exhaustive-

ment contre HC1 o.oi N Nos solutions de trypsine ont toujours 6t6 purifi6es, an moment de l'emploi, en pr6cipitant par NaC1 I M, toute fraction d~natur6e 9.

L'autolyse est faite en milieu tampon borate ~ pH 8 ou 9 et ~ 37 ° ou 38° suivant les auteurs *,7 pendant 2 h. L'autolyse est bloqu6e ~ 4 ° en r6tablissant le pH/~ 2.5 par addition de HC1 o.I N. La s6paration des prot6ines de l 'autolysat s'effectue sur

Sephadex. Fractionnement. Colonne DEAE-cellulose, dimensions: d = 1.2 cm, h = 33 cm,

6quilibr6e avec le tampon borate 0.005 M ; d6bit -- 9 ml/h. L'61ution est faite ~ 4 ° par applications successives : a) tampon borate 0.05 M ~ pH 8 ; b) tampon borate o.oi M + NaC1 0.02 M, pH 8; c) tampon phosphate 0.02 M + NaC1 o.i M, pH 6.8.

Colonne Sephadex G-25 out G-5 o. Dimensions: d = 2. 7 cm; h = 45 cm; d6bit = 5 ° ml/h, 6quilibr6e avec tampon glycocolle-HCl 0.05 N, pH 2.5.

Elution au moyen d'un collecteur de fractions LKB 6quip6 avec un siphon

distribuant 2. 9 ml par tube ~ 4 °. Dosage des protdines effectu6 par spectrophotom6trie en mesurant l 'absorption

/~ 280 m# et en appliquant pour les fractions obtenues le m6me coefficient (I/e = 0.63) que pour la trypsine initiale. On admet que la proportion des groupes tyrosine, tryp- tophane est sensiblement la mSme dans routes ces prot6ines.

Aetivitd enzymatique mesur~e par m6thode potentiom6trique avec pH m&tre E IL en milieu NaC1 o.I M, pH 8 et ~ 37 °, le pH est r6tabli par l'addition de NaOH

o.I N (microseringue Agla). Les substrats utilis6s pour le dosage de l'activit6 trypsique sont le benzoyl-L-

arginine 6thyl ester ou le paratolu~ne sulfonyl-L-arginine m6thyl ester 5 fois plus sensible. Dans les deux cas la concentration employ6e est IO - 3 M .

Le substrat utilis6 pour doser l'activit6 ehymotrypsique est l'ac6tyl tyrosine

m6thyl ester, ~ la concentration de IO -3 M. L'activit6 sp6cifiqne est toujours exprim6e en #1 de NaOH o.i N/rain par /,g

de prot6ine.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1964) 52I-528

H Y D R O L Y S A T S D E T R Y P S I N E 5 2 3

Les ultracentrifugations analytiques sont toutes effectu6es A 20 °, A la vitesse de 59 780 tours/min avec une ceUule A fronti~re pr6t'orm6e en milieu glycocoUe-HC1 0.05 N + NaC1 o.I M, pH 2.5 tampon contre lequel l'6chantillon est dialys6 au pr~- alable.

Les spectres de diffdrence d'absorption sont obtenus au moyen du spectrophoto- m~tre enregistreur Cary 15 (soft directement, soft A l'6chelle I/IO) en prenant comme r6f6rence une solution de trypsine initiale. Les deux 6chantillons A comparer sont amen6s A la m~me densft6 optique au maximum d'absorption. La ligne de base (z&o sur l'6chelle des ordonn6es) est trac6e clans ces conditions et l 'absorption est suivie dans route la zone des longueurs d'onde int&essantes.

R ~ S U L T A T S

Etude des produits d'hydrolyse pepsique de l'acdtyltrypsinogdne

En appliquant strictement la m6thode d6crfte par LIENER ET VISWANATHA 4 nous avons effectivement obtenu par dernier fractionnement chromatographique sur le DEAE-cellulose, une prot6ine pr6sentant une activit6 enzymatique, mais nos r6sultats diff6rent quantitativement de ceux de ces auteurs. Dans nos exp&iences la fraction active (FH) ne correspond qu'~ 1.75 % des prot6ines de l 'hydrolysat total. Son activft6 trypsique intrins~que est r6dufte A 1.5 % de celle de la trypsine inftiale, tandis que son activit6 chymotrypsique est augment6e 40 lois (Tableau I). Signalons que de

T A B L E A U I

ACTIVITIES ENZYMATIQUES DE LA TRYPSINE ET DES PRODUITS FRACTIONN]~S APR~S HYDROLYSE PEPSIQUE ( F H ) ET AUTOLYSE (Fa) ET (FA) DE LA TRYPSINE

A c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e e x p r i r n 6 e en /21 N a O H o . i N c o n s o m m 6 e p a r m i n p a r / 2 g d e t r y p s i n e .

Substra~ Trypsine FH Fa FA

B e n z o y l - L - a r g i n i n e 6 t h y l e s t e r 2 .5 5 3 .71 • i o - 2 - - - - P a r a t o l u ~ n e s u l f o n y l - L - a r g i n i n e m d t h y l e s t e r 11. 7 17 .o • IO-* 13.6 " IO--* 1.2 A c d t y l t y r o s i n e m d t h y l e s t e r 1-37" lO-4 54.5 • lO -4 1 .35" lO -4 - -

grandes variations du rendement prot6ique apr~s l'hydrolyse pepsique de l'ac6tyl- trypsinog~ne, avaient 6t6 not6es par WONG 10 qui sugg~re une d6naturation plus ou moins grande du zymog~ne par l'ac6tylation.

Sur le diagramme d'ultracentrifugation de cette fraction active on observe un seul pic asym6trique dont le coefficient moyen de s6dimentation est : 2.5 ; cette valeur est tr~s semblable A celle de la trypsine native.

t~tude des produits d'autolyse de la trypsine

En pratiquant l'autolyse de la t~-psine comme d6crit plus haut, et passage de l 'autolysat sur le Sephadex G-25 pr6conis6 par MOSOLOV et al. ~ nous avons pu isoler dans la premiere fraction 61u6e un produit (Fa) de faible activit6 enzymatique.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1964) 5 2 1 - 5 2 8

524 J. CHEVALLIER, Y. JACQUOT-ARMAND, J. YON

L'ac t iv i t6 t ryps ique re t rouv6e n 'es t que 1.16% de l ' ac t iv i t6 de la t ryps ine init iale, t and i s que l ' ac t iv i t6 chymot ryps ique reste inchang6e (Tableau I). Si l 'on compare le m a x i m u m d ' ac t iv i t6 et le m a x i m u m d ' abso rp t ion ~ 280 m/~ de cet te fract ion, il y a un d fca lage dans les volumes d'61ution.

L 'h f t f rog6n6i t6 de la f ract ion F a se re t rouve ~ l ' u l t r acen t r i fuga t ion ana ly t ique

t 70° Fig. i. Ultracentrifugation de la prot6ine active (Fa) d'un autolysat de trypsine 61u6 sur Sepba-

dex G-25. Tampon glycocolle-HC1 0.05 N, NaC1 o.~ M, pH 2.5. c = 3.6 mg/ml.

sur le d i a g r a m m e (Fig. i ) , le pic est a sym6t r ique avec comme va leur un coefficient moyen de 1. 4.

En u t i l i san t le Sephadex G-25 pour le f rac t ionnement des p rodui t s d ' au to lyse on pouva i t c ra indre une mauva i se s6para t ion ent re des prot6ines don t le poids mol6culaire s '6 tage ent re 24 ooo et 600o pa r exemple. C'est ce qui nous a amen6s ~t remplacer le Sephadex G-25 par le G-5o. Le f rac t ionnement se fai t dans les m~mes condit ions.

"/.5!

0.5

0.3

0.1

aclivit6 trypstque OO28q~ J

50 ¢00 Tube

Fig. 2. Passage d'un autolysat de trypsine sur colonne de Sephadex G-5 o. Trait plein =: absorption k 280 m/z. Trait pointill6 == activit6 trypsique mesur6e sur paratolu6ne sulfonyl-L-arginine m6thyl

ester (exprim6e en #1 NaOH o.i N consomm6e par min par/~g prot6ine).

Biochim. Biophys. dcta, 92 (1964) 521-528

HYDROLYSATS DE TRYPSINE 525

En testant cette colonne G-5o avec de la trypsine native, on a trouv6 un volume d'61ution 6gal ~ 141 ml, alors que le volume d'61ution d'une myoglobine (poids mol6culaire 16 ooo) sur cette m~me colonne 6tait de 156 ml. Voici le r6sultat du fractionnement de l 'autolysat de trypsine:

Par tant d'une prise d'autolysat correspondant ~ 144 mg de prot6ine, nous avons

~o0 o 6'0 o 5 5 ° 55o

Fig. 3. U l t r acen t r i fuga t ion de la prot~ine act ive (FA) d ' u n a u t o l y s a t de t ryps ine 6lu~ sur Sepha- dex G-5o. T a m p o n glycocolle-HC1 o.oo 5 N, NaC1 o.i M, p H 2.5. c -- 2.8 mg/ml .

61u6 successivement 3 fractions sur le Sephadex G-5o avec un rendement prot6ique de 85%.

La premiere fraction (FA) est la seule active du point de vue enzymatique. Voici les caract6ristiques de cette fraction: a) L'activit6 trypsique, mesur6e uniquement avec ]e paratolu~ne sulfonyl-L-arginine m~thyl ester, est 6gale ~ lO% de l'activit6 initiale (Tableau I). La concentration prot6ique de cette fraction 6tant faible (3 mg

0

- GO"/ / ~

- 0 . 02

- 0 . 03

"0.04

280 J00 ), m H. Fig. 4- Spectre de difference d ' ab so rp t i on ~. 20 ° en t re la t ryps ine na t ive et la f rac t ion act ive

(FA) d ' u n a u t o l y s a t de t ryps ine , c -- o. 5 mg/ml , p H 2.%

Biochim. Biophys. Mcta, 92 (1964) 521-528

526 j . CHEVALLIER, Y. JACQUOT-ARMAND, J. YON

environ) il a 6t6 n6cessaire de r6unir les 61utions act ives homologues de plusieurs passages sur eolonne pour les analyses ult6rieures.

b) Le m a x i m u m d ' ac t iv i t6 et le m a x i m u m d ' abso rp t ion ~ 28o m# cor respondent au mfime volume d '6 lu t ion (Fig. 2) ce qui est caract6r is t ique d 'un p rodu i t homog~ne. De plus le volume d'61ution est 142 ml, le m~me p ra t i que me n t que celui t rouv~ prot6ines sont tr~s semblables 11,12.

&DO

~201

0

~0.02

J

/ I L i i

2 8 0 300

Fig. 5. Spectre de diff6rence d'absorption entre la trypsine & 20 ° et k 43 °. c = 0.77 mg/ml, pH 2.i.

c) A l ' u l t r acen t r i fuga t ion ana ly t ique on ob t ien t un seul pic sym6tr ique (Fig. 3). La va leur du coefficient de s6dimenta t ion est de s = 2.75 pour une concent ra t ion prot~ique de 2.8 mg par ml, va leur tr~s voisine de celle obtenue pour la t ryps ine

o na t ive s 2o,w = 2.55.

/

- 0 . 1

- 0 . 2

- 0 . 3

t h

270 290 X m].L

Fig. 6. Spectre de diff6rence d 'absorp t ion entre la t rypsine nat ive et la fraction inactive, recueillie en fin d'~lution, d ' un au to lysa t de trypsine, c = o. 5 mg/ml, p H 2.5.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1964) 521-528

HYDROLXrSATS DE TRYPSINE 527

Les r6sultats pr6c6dents semblent prouver qu'on a retrouv6 apr~s autolyse de la trypsine une portion de ceUe-ci non attaqu6e. Mais il reste ~ expliquer la perte im- portante (90%) de l'activit6 trypsique intrins~que. Nous l'avons tent6 par l'6tude des spectres de diff6rence d'absorption entre la trypsine initiale et les fractions re- cueillies apr~s autolyse de cette derni~re.

La Fig. 4 compare ~ 20 ° la trypsine native et la fraction FA qui nous int6resse. La courbe obtenue pr6sente certaines analogies avec celles observ6es dans l'6tude du traitement thermique de la trypsine. Nous donnons ~ titre comparatif un de ces spectres (Fig. 5) emprunt6 ~ un travail effectu6 par D'ALBIS la dans notre laboratoire.

Dans les deux cas, on observe un spectre de diff6rence dfi au d6masquage des groupes chromophores tyrosine et tryptophane. Le spectre de d~naturation que nous obtenons peut donc 6tre dfl au traitement subi par la trypsine au cours de l'autolyse.

Par contre, dans le cas de la fraction inactive, 61u6e au volume de 342 ml, le spectre de diff6rence n'est pas du tout comparable (Fig. 6), il montre un seul maximum et correspond vraisemblablement ~ tousles peptides lib6r6s par l'autolyse.

CONCLUSION

L'ensemble de cette 6tude montre que le fraction enzymatiquement active obtenue soit par hydrolyse pepsique de l'ac6tyltrypsinog~ne, soit par autolyse de la trypsine n'est autre que l'enzyme non hydrolys6 mats partiellement d6natur6.

En effet il semble que l'on recueille apr~s autolyse de la trypsine, des peptides inactifs et une faible quantit6 de produit actif. L'6tude de cette derni~re fraction pratiqu6e aussi bien par la technique du tamis mol6culaire que par ultracentrifugation analytique montre que son poids mol6culaire est du m~me ordre que celui de la trypsine.

L'activit6 des peptides d6cel6e par les auteurs est due vraisemblablement ~ la pr6sence de trypsine dans les fractions recueillies.

L'analyse de la fraction active par spectrophotom6trie de diff6rence permet de pr6ciser que la trypsine non hydrolys6e qui est recueillie en fin d'exp6rience, est partieUement d6natur6e ce qui rend compte de la faible activit6 catalytique de la fraction correspondante.

Le changement de structure secondaire et tertiaire subi par l'enzyme au voisinage de la tyrosine et du tryptophane rappelle celui qui r6sulte du traitement thermique de la trypsine.

L'alt6ration de la structure primaire de la trypsine, tout au moins celle qui r6sulte d'une hydrolyse par la pepsine ou par la trypsine elle-m~me, semble conduire

l'inactivation complete de l'enzyme.

RESUM]~

Diff~rents auteurs avaient d~crit l'obtention de peptides actifs t~ partir d'hydrolysats de trypsine, soit par hydrolyse pepsique de l'ac~tyltrypsinog~ne, soit par autolyse de la trypsine.

Ces diverses exp6riences sont reprises et discut6es dans le present travail. Quelle que soit la m6thode utilis~e, l'activit~ enzymatique obtenue en fin d'exp~rience semble li6e ~ la pr6sence de trypsine non hydrolys6e. L'analyse spectrale de la fraction active correspondante montre qu'une partie importante de l'enzyme a 6t6 d6natur6e.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1964) 521-528

5 2 8 J. CHEVALLIER, Y. JACQUOT-ARMAND, J. YON

B I B L I O G R A P H I E

1 R. L. HILL EX E. L. SMITH, Biochim. Biophys. Acta, 19 ( t956) 376. G. E . PERLMANN, Nature, 173 (I954) 4 o6-

a T. VISWANATHA, R. C. WONG ET I. E . LIENER, Biochim. Biophys. Acta, 29 {1998) 174. 4 l . E . LIENER ET T. VISWANATHA, Biochim. Biophys. Acta, 36 (1959) 250. a T. VlSWANATHA EX I. E . LIENER, Biochim. Biophys. Acta, 37 (196o) 389. 6 S. BRESLER, M. CHAMPAGNE ET S. FRENKEL, J. Chim. Phys., 59 2 (~962) 18o. 7 V. V. ~IOSOLOV ET 1VII. D. LOGINOVA, Dokl..4kad. Nauk SSSR, I 46 ( I962) 12o9. 8 p . DESNUELLE, in P. D. BOYER, H. LARDY AND K. MYRB)~CK, The Enzymes, Vol. 4, Aca~demic

Press , N e w Y o r k , t96o , p. 119. 'J J . YON, Biochim. Biophys. Acta, 3 I (1959) 7 i .

10 R. C. WONC,, Thkse, U n i v e r s i t y of M i n n e s o t a , 1962. 11 M. IWATSUBO ET dk. CURDEL, Compl. Rend., r956 ( t903) 5224. 12 p. ANDREWS, Biochem. J., 91 (1904) 222. is A. D'ALBIS, Compl. Rend., 259 (1964) I819.

Biochim. Biophys. Acta, 92 (1904) 921 92~