BIOCHIMIE, 1975, 57, 833-835. Supp lemen t ~ "Biochimie "" Tome 57 - no 8 1975

Redistribution des facteurs d'initiation et d'dlongation avec l'imbibition du b16.

B e r n a d e t t e QUINTARD et R a y m o n d JULIEN ~ . Laboratoire de Biochimie , U.E.R. des Sciences, 123, rue A lber t Thomas , 87100 Limoges.

(2~-1-1975).

INTRODUCTION.

II est c la i rement dtabli que les embryons vdg~taux quiescents possbdent, dans un ~tat pr~form~, tons les ~ldments du syst6me de t raduet ion des messages g~nd- tiques. En effet, bien que le syst6me soit toujours inaetif in vivo, diff~rents auteurs out d~montrd pour plusieurs organismes dont le bl6, son efficience dans la synth~se des prot~ines in vi tro [1, 2, 3, 4, 5].

De plus, la conversion massive, d~s le d~but de l ' imbibi t ion et en l 'absence de toute t ranscr ipt ion, des monosomes en polysomes, a ~galement conduit cer- rains h dmettre l 'hypoth~se de l 'existence de RNA messagers naturels , pr~form~s eux-aussi , bypoth6se conflrm~e par la suite, no t amment pour les embryons de bl~ [6].

Cependant, l '~tat r~el du syst~me, in vivo, est encore real connu. Le present t ravail se propose d 'examiner si la fo rmat ion de polysomes d~s les premi6res phases de l ' imbibi t ion s 'accompagne d'une redis t r ibut ion des facteurs de l ' in i t ia t ion et de l 'dlongation entre la frac- t ion soluble et la f ract ion r ibosomique.

MATERIEL ET METHODES.

Germe : les embryons de b16 proviennent d 'une mi- noterie de la Haute Vienne. Ils sont tri6s mauuel le- ment avant d'6tre utilis~s. Les imbibi t ions sont r6ali- s6es par un simple contact avec un papier filtre gorg6 d'eau, en atmosph6re saturante, h l 'obscurit6 et h 30oC.

Ribosomes : pr6par6s h par t i r de germes /~ divers stades de l ' imbibi t ion, solon un proc6d6 inspir6 de celui utilis6 par Golinska et Legocki [7], ils sont fina- lement lav6s 12 heures h 2°C, par une solut ion tam- ponn~e Tris-HC1, pH 8,5 50 mM, acetate de magnes ium 5 mM, 2-mercapto6tbanol 2 mM, contenant du cblorure de potass ium 1,5 M, puis s6diment~s et conserv6s dans la solution pr6cfdente ajust6e h 50 mM en KC1 et 20 p. cent de glyc~rol.

~C-Met - tRNA, ~ C - P h d - t R N A : ces deux molecules r6sul tent de l ' aminoacyla t iou des tRNAI ~et [8] et tRNAPh6 pr~par6s par une double chromatographie sur BD-cellulose du tRNA global du germe de b16 [9, 10, 11]. Les Met-tRNA-ligases et Ph6-tRNA-ligases pu- rifi6es, l ient les deux aminoaeides (14C-Met et 14C-Phi) fournis par le CEA, h leur tRNA homologue, pour un pH op t imum de 8,6 et pour des rappor ts Mg2+/ATP opt ima de 1 et 1,5 respect ivement .

Facteurs d ' in i t ia t ion et d'dlongation : ils proviennent des f ract ions cellnlaires soluble et r ibosomique.

(~ A qui toute correspondance dolt ~tre adress~e.

Fraction soluble.

- - Ini t ia t ion.

Les prot~ines (5 g) du surnageant de 150000 g (50 ml) obtenu lors de la prepara t ion des r ibosomes sont d~pos~es sur unc coloune de DEAE-cellulose (1,6 X 15 cm) ~quilibr~e avec la m~me solution Tris- HC1 10 raM, pH 8,05, acetate de magnes ium 5 mM, KC1 100 mM, 2-mercapto6thanol 5 raM. Le volume mor t 6liming, on recueille 12 ml d 'une solut ion contenant les factcurs de l ' ini t ia t ion. Elle est conserv~e h --20°C h la concentrat ion de 13 mg/ml .

- - Elongation.

Les facteurs EF 1 et EF 2 par t ie l lement purifi~s sont prdpar~s suivant des mdthodes tr6s proehes de eelles utilis~es par Legoc:ki [7, 12] : pr6cipitat ion des pro- tdines du surnageant par (NH4)2SOo 65 p. cent, filtra- t ion sur S6phadex G 150, chromatographie sur hydro- xyapati te.

Fract ion r ibosomique .

La solution r~cup~r~e h la suite du lavage des r ibo- somes, subit une dialyse afin de r amener h 100 mM son contenu en KC1. Les prot~ines qu'elle cont ient (5-10 mg/ml) sont test~es quant h leur eapaeit~ h cata- lyser soit la fo rmat ion des complexes d ' in i t ia t ion soit eeux d'dlongation.

F o r m a t i o n du eomplexe 1~C-Met-tRNA~-ribosome.

L'activit6 ini t iatr ice des prot6ines non retenues par la DEAE-cellulose, ainsi que eelle des prot6ines pro- venant du lavage des r ibosomes eat estim6e par u n e

m~thode ut i l i sant le proc6d6 de fi l tration sur ni t ra te de cellulose de Nirenberg et Leder [13]. Les cpm non sp~cifiques sont d6duits de la radioactivit6 14C-Met- tRNAI li~e aux ribosomes. T o u s l e s tests sont rdalis~s dans le mil ieu suivant (0,1 ml final) : Tris-HC1, 1,25 !~mol., acdtate de magnesium 0,125 umol., KC1 1,75 :~mol., 2-mereapto~thanol 0,075 ~mol., GTP 0,03 ~mol., poly AUG 10 .~g, 14C-Met-tRNA~ Iet 8,2 pmol. (1 pmol. = 111 dpm), r ibosomes 80 ,l~g, facteurs ~ h 65 ~tg. L ' incubat ion dure 10 mn h 30°C. La rSaction est arr~t~e par addi t ion de 2,5 ml d 'une solut ion tamponnde Tris-HC1 10 mM, pH 7,7, acdtate de magne- sium 10 mM, KC1 80 raM. Les complexes f o r m , s sont retenus sur des filtres 0,45 1~. La radioactivit6 est estim6e par scint i l la t ion l iquide (4 g omnifluor par litre) avec un rendement de 60 p. cent.

F o r m a t i o n du complexe ~ C - P h d - t R N A - r i b o s o m e .

Elle est r6alis~e dans les condi t ions d~crites par Tvardowski et Legocki [12]. La mesure de l 'activit6 de EF 1 et EF 2 est estim~e par la d~terminat ion du hombre de p moles de 14C-Ph~-tRNA transforms sous la d6pendance de poly U dans un mater ie l pr~cipitable par l 'acide tr ichlorac~tique chaud.

834 B. Quin tard et R. Jul ien.

U n te s t (0,1 ml ) c o n t i e n t 10 ~tg de EF 1 e t 10 I~g de E F 2, a i n s i q u e 12 p m o l e s de ~4C-Phd- tRNA (1 p m o l e : 555 d p m ) .

R E S U L T A T S .

La s y n t h ~ s e p r o t 6 i q u e d6bu te d a n s les ce l lu l e s des e m b r y o n s de b16 c o m m e d a n s les ce l lu les b a c t 6 r i e n n e s p a r la f o r m a t i o n d ' u n c o m p l e x e e n t r e les r i b o s o m e s , le c o d o n i n i t i a t e u r AUG d u RNA m e s s a g e r et le m6- t h i o n y l - t R N A i [9, 14, 15]. Des p r o t 6 i n e s p a r t i c n l i ~ r e s , t r6s i n c o m p l ~ t e m e n t ident i f i6es , p a r t i c i p e n t sp6c i f i que - mer i t it la r 6 a l i s a t i o n d u c o m p l e x e d ' i n i t i a t i o n qni , s a n s el les , ne se f o r m e pas . P a r e i l l e m e n t , l ' 61onga t ion des c h a l n e s p e p t i d i q u e s in i t i6es ndcess i t c la p r6sence de d e u x a u t r e s f a c t e u r s p r o t 6 i q u e s (EF 1, E F 2) F u n c o n t r S l a n t ]a f i xa t ion de l ' a m i n o - a c y l - t R N A a n s i te r i b o s o m i q u e accep teu r , l ' a u t r e l a t r a n s l o c a t i o n .

La l o c a l i s a t i o n c e l l u l a i r e de ces d i v e r s e s p r o t 6 i q ues , c 'es t -&-dire l e u r a s s o c i a t i o n o u n o n avee los r i b o s o m e s , d 6 p e n d de l ' ac t iv i t6 m 6 t a b o l i q n e g6n6ra le de la ce l lu le , et en p r e m i e r l ieu , de la t r a n s c r i p t i o n et de la t r a - d u c t i o n des ARN m e s s a g e r s . Chez les bac t~ r i e s e t les a n i m a u x , l a p l u p a r t des t r a v a u x c o n s a c r 6 s it l ' 6 tude des f a c t e u r s de l ' i n i t i a t i o n et de l ' ~ l o n g a t i o n F o n t 6f~ it p a r t i r de ce l lu les , e n p h a s e e x p o n c n t i e l l e de c ro i s - sance , ou p o u r le m o t h s e n c r o i s s a n c e ac t ive . De ce fa i t , l es f a c t e u r s p ro¢6iques s o n t s o u v e n t i sol6s it p a r t i r de p r 6 p a r a t i o n s r i b o s o m i q u e s .

F "KC I"

z

0

17) E ~2C

z =.

40

DUREE D'IMBIBITION (h} Fro. 1. - - Transfert des facteurs de l'initiation.

A - - ~ F r a c t i o n KC1. ~ - - / ~ S u r n a g e a n t 150 000 g. La f r a c t i o n KC1 c o n t i e n t les p r o t 6 i n e s i n i t i a t r i c e s

r6cup6r6es lo rs d u l a v a g e des r i b o s o m e s . L ' ac t iv i t6 i n i t i a t r i c e des p r o t 6 i n e s des d e u x f r a c t i o n s s ' e s t i m e p a r l e u r a p t i t u d e it c a t a l y s e r la f o r m a t i o n d ' u n c o m - p l exe r i b o s o m e - M e t - t R N A ~ - c o d o n AUG ( e x p r i m 6 e en p m o l e s de ~4C-Met-tRNA~ li6es a n x r i b o s o m e s p a r m g de p r o t 6 i n e s f ac to r i e l l e s ) .

Chez les v ~ g 6 t a u x a u c o n t r a i r e , les s e u l s t r a v a u x eonsac r~s it ces p r o t ~ i n e s F o n t 6t6 s u r des e m b r y o n s de b16 q u i e s c e n t s , et s e u l e la f r a c t i o n c y t o p l a s m i q u e s o l u b l e a p e r m i s l ' o b t e n t i o n des f a c t e u r s .

On s a i t c e p e n d a n t , q u e l o r s q u ' i l s s o n t s o u m i s it l ' i m b i b i t i o n , les e m b r y o n s q u i e s c e n t s (secs) s o n t r a p t - d e m e n t le si6ge d ' u n a c c r o i s s e m e n t s ign i f i ca t i f de F i n - c o r p o r a t i o n des a m i n o - a c i d e s d a n s les p r o t 6 i n e s e t que

cet a c c r o i s s e m e n t p e n t ~tre, h b a s s e t e m p 6 r a t u r e , d issoc i~ de l ' en t r6e d a n s les ce l lu l e s des m o l 6 c u l e s d ' e a n [1~6] •

T o u s ces f a i t s c o n d u i s e n t it p e n s e r que b i c n que la p 6 n 6 t r a t i o n de l ' e a u ne so i t p a s v 6 r i t a b l e m e n t l 'dvdne- mer i t qu i d6c l enche la s y n t h ~ s e p ro t4 iqne , l ' i m b i b i t i o n des c m b r y o n s r6a l i s6e d a n s des c o n d i t i o n s f a v o r a b l e s (obscuri tY, 30°C) do i t p o u v o i r p e r m e t t r e de v6rif ier si la s y n t h 6 s e des p r o t 6 i n e s qu i en rdsu l t e d6pend d ' u n e r e d i s t r i b u t i o n des f a c t e u r s de l ' i n i t i a t i o n e t de l ' d lon - ga t ion .

E f f ec t i vemen t , l ' i m b i b i t i o n des e m b r y o n s de b16 s ' a c c o m p a g n e d ' u n v 6 r i t a b l e t r a n s f e r t des p r o t ~ i n e s i n i t i a t r i c e s de la f r a c t i o n s o l u b l e ve r s les r i b o s o m e s

Z 6 ~u

E ~ - 4 .

o 3 .

2.

o E 1. Q.

F soluble

DUREE D'IMBIBITION(h)

Fro. 2. - - Transfert des factcurs de l'~longation. A - - A F r a c t i o n KC1. / ~ - - ~ S u r n a g e a n t 150000 g. La f r a c t i o n KC1 c o n t i e n t les f a c t e u r s EF 1 et EF 2

d6croch~s des r i b o s o m e s p a r la s o l u t i o n sa l ine . L ' a c t i - vi t6 des f a c t e u r s EF 1 et EF 2 de la f r a c t i o n KC1 et du s u r n a g e a n t s ' e s t i m e p a r l e u r a p t i t u d e it p o l y m 6 - r i s e r la p h 6 n y l a l a n i n e (pmo le s de 14-Ph6-p, o l y m ~ r i - s6cs p a r m g de p r o t 6 i n e s fac to r ie l !es ) , en p r e s e n c e de r i b o s o m e s et s o u s la d i r e c t i o n de po ly U.

(fig. 1). A la f in de la p r e m i e r e p h a s e de l ' i m b i b i t i o n , d ' u n e dur~e de 6 h e u r e s , la p r e s q u e to t a l i t~ des fac- t e u r s de l ' i n i t i a t i o n p r e s e n t s dar ts les c e l l u l e s se t r o u v e assoc i~e it l a f r a c t i o n r i b o s o m i q u e . I n v e r s e m e n t , l ' ac t iv i t~ i n i t i a t r i e e de la f r a c t i o n s o l u b l e d~cro i t fo r - t e m e n t . Un d ~ p l a c e m e n t i d e n t i q u e se p r o d u i t ~gale- m e n t p o u r les f a c t e u r s p ro t~ iques de l ' ~ l o n g a t i o n (fig. 2), m a t s son a m p l i t u d e a p p a r a i t b e a u c o u p m o i n s i m p o r t a n t e que p r ~ c ~ d e m m e n t . De t o u t e ~vidence , les p r o t ~ i n e s a s s u r a n t ]e m ~ c a n i s m e de l ' ~ l o n g a t i o n des c h a i n e s p ro t~ iques ne c o n s t i t u e p a s u n f a c t e u r l i m i - t a n t de l ' a m p l i t u d e de l a s y n t h ~ s e p ro t~ ique it l ' i m b i - b i t i on . I1 e s t p a r c o n t r e p o s s i b l e que ce so i t le cas p o u r les p r o t 6 i n e s c o n t r b l a n t l ' i n i t i a t i o n . D a n s cet te h y p o - th6se , la t r a d u c t i o n des RNA m e s s a g e r s p r ~ f o r m ~ s qu i e s t a s s u r ~ e a u c o u r s de cet te p h a s e , d e v r a i t c o n d u i r e it la f o r m a t i o n de p r o t 6 i n e s i n d i s p e n s a b l e s a u b o n f o n c t i o n n e m e n t d u s y s t ~ m e de t r a d u c t i o n l u i - m 6 m e , et p a r c o n s 6 q u e n t a u d 6 v e l o p p e m e n t de l ' e m b r y o n . Cct te h y p o t h ~ s e es t en c o u r s de v6r i f ica t ion . P u i s q u e p a r u n e s i m p l e i m b i b i t i o n , on p e u t d6p lace r les fac- t e u r s de l ' i n i t i a t i o n de la f r a c t i o n s o l u b l e v e r s la f r ac -

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 6-7.

Redistribution des [acteurs IF et EF. 835

t ion r ibosomique, ce t ra i tement consti lue un ~lSment technique avantageux dans l ' i solement de ces prot$ines

par t i r des embryons v~g~taux. D'autant qu'il est possible, en redess~chant les embryons d~j~ imbibes, de bloquer le proccssus au stade d~sir~.

Remerciemenls.

Nous remercions M ~]e M. Mouricout, Ing~nieur, de son excellente assistance technique.

BIBLIOGRAPHIE.

1. Marcus, A., Luginbill, B. ~ Feeley, J. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 59, 1243.

2. Marcus, A. (19.70) J. Biol. Chem., 245, 955. 3. Marcus, A. (1970) J. Biol. Chem., 245, 962. 4. Seal, S. N., Bewley, J. D. ~ Marcus, A. (1972) J.

Biol. Chem., 247, 2592. 5. Efron, O. ~ Marcus, A. (1973) Virology, 53, 343.

6. Weeks, D. P. & Marcus, A. (1971) Biocbim. Biophys. Acta, 232, 671.

7. Golinska, B. a Legoeki, A. B. (1973) Biochim. Bio- phys. Acla, 324, 156.

8. Marcus, A., Weeks, D. P., Leis, J. P. & Keller, E. B. (1970) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S., 67, 1681.

9. Leis, J. P. & Keller, E. B. (1970) Biochem. Biophys. Res. Com., 40, 416.

10. Tarrago, A., Monasterio, O. & Allende, J. 6. (1970) Biochem. Biophys. Res. Com., 41, 765.

11. Ghosl~ K., Ghosh, H. P., Simsek, M. & Rajbhandary , U. L. (1974) J. Biol. Chem., 249, 4720.

12. Twardorwski, T. & Legocki, A. B. (1973) Biochim. Biophys. Acta, 324, 171.

13. Nirenberg, M. ~ Leder, P. (1964) Science, 145, 1399. 14. Weeks, D. P., Verma, D. P. S., Seal, S. N. & Marcus,

A. (1972) Nature, 236, 167. 15. Ghosh, K., Grishko, A. • Ghosh, H. P. (1971) Bio-

chem. Biophys. Res. Com., 42, 462. 16. Marcus, A., Feeley, J. ,t Volcani, T. (1966) Plant.

Physiol., 41, 1167.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 6-~.