European J. Biochem. 8 (1969) 426-434

Regulation des alcool-deshydrogenases chez Saccharomyces cerevisiae

B. ROCHE et E. AZOWLAY

Laboratoire de Chimie Bacterienne du Centre National de la Recherche Scientifique, Marseille

( R e p le 18 octobre 1968/16 janvier 1969)

Cell free preparation of a strain of Sacchurmyces cerevisiae “adapted” to hydrocarbons catalyse the dehydrogenation of higher alcohols in the presence of NAD. Before the activity could be studied, it was necessary to develop a method for assaying it in heterogeneous media.

The dehydrogenation of higher alcohols by these crude extracts in the presence of NAD is significant only when the alcohol emulsions are stabilized with Tween 80. We have shown using emulsions of varying fineness, that the affinity of the responsible enzyme for its substrates in- creases with diminishing particle size. The Knls for 1-octanol emulsified into particles 2,l p and 0,l p. in diameter are of the order of 1,8 x M, respectively. The enzyme is distinct from the classical ethanol dehydrogenase. It differs essentially in substrate specificity, in substrate affinity, in its insensivity to cyanide and azide and in temperature sensitivity. The two activities in a mixture can be distinguished by their kinetics at heat inactivation a t 51”. The enzyme described here has Merent properties from those of the oxidative alcohol dehydrogenase studied by Schrimpfessel and Wiame. Therehisnthus a heterogeneity of alcohol dehydrogenases in this yeast.

Our assay which differentiates between two alcohol dehydrogenases synthesized by S. m e - visiae (ethanol dehydrogenase and octanol dehydrogenase) made it possible to determine enzyme levels as a function of culture conditions. It was demonstrated that both oxygen and substrates exert a regulatory effect. The octanol dehydrogenase is subject to a glucose effect and the ethanol dehydrogenase is absent from cells grown on n-tetradecane.

Interest in the use of hydrocarbons lies essentially in their effect on ethanol dehydrogenase and in the selection of “adapted” cells which permit a study of octanol dehydrogenase.

M and 0 , 4 ~

L’utilisation des hydrocarbures comme substrat de croissance chez Saccharmnyces cerevisiae permet d’obtenir des souches a accoutumBes o [l] aux hydro- carbures. Ces souches donnent des prkparations acellulaires qui catalysent la dBshydrogBnation des alcools sup6rieurs en presence de NAD. La dBgrada- tion des hydrocarbures paraffiniques Zi haut poids mol6culaire chez ces micro-organismes conduit Zi une sBrie d’intermBdiaires mBtaboliques dont l’alcool primaire [2]. L’oxydation de cet alcool est catalys6e par une alcool-dBshydrog6nase et la question qui peut se poser B propos de cette activitB est de savoir si elle n’est pas, en fait, la rBsultante de l’action de l’@thanol-d6shydrog&nase. Toutefois, il convient de noter qu’B 1’6gard des alcools B nombre d’atomes de carbone sup6rieur zt dix, I’activitB sp6cifique de l’Bthanol-d6shydrog6nase est pratiquement nulle, bien qu’A 1’6gard de l’octanol elle soit encore suffisam- ment significative [3]. De plus, selon Schimpfessel[4], lea cellules de S. cerevisiae synth6tisent 2 alcool- dBshydrogt5nases distinctes, 1’6thanol-d6shydro- genase classique ou alcool-dBshydrog6nase fermen- tative et une alcool-d6shydrogBnase oxydative.

Enzymee. Alcool : NAD oxydo-r6ductase (EC 1.1.1.1).

L’existence dans les cellules de levures d’un nouvel enzyme, semble indiquer que, physiologiquement, en presence d’oxygkne, l’oxydation des alcools est catalysBe par l’alcool-dBshydrogBnase oxydative alors que l’BthanoLdBshydrog6nase classique catalyse la reaction reversible de reduction de l’ac6taldBhyde en Bthanol.

Ce qui d’emblke pose le probleme du sen9 (( bio- logiquement efficace D des alcool-d6shydrog6nases de levure. Wiame [5] avait d6jZi tent6 de repondre A cette question et les rBsultats partiels obtenus l’ont amen6 B sugg6rer gue l’enzyme, induit chez les levures en l’absence de glucose, est d86rent de 116thanol-d6shydrog6nase classique.

Nous nous proposons donc, au cours de ce travail, d’6tudier l’activit6 alcool : NAD oxydo-r6ductase (octanol-deshydrogknase) mise en Bvidence dans les preparations acellulaires de S. cerevisiae cultivBe B partir de n-t6trad6cane, afin de la mieux comparer B 1‘6thanol-d6shydrog6nase classique et it l‘alcool- deshydrogbnase oxydative mise en Bvidence chez la levure par Schimpfessel [48].

De plus, la possibilite qui nous est offerte de 1’6tudier en l’absence de toute activite Bthanol-

Vo1.8, No.S,1989 B. ROCHE et E. AZOULAY 427

deshydrogenase nous permettra de preciser la regulation de cette enzyme et de verifier si, r6elle- ment le mecanisme d’oxydation de l’alcool en presence d’oxyghe se dissocie de celui, mieux connu, de la fermentation du glucose.

MATBRIEL ET MBTHODES Organisme

Souche de S. cerevisiae de boulangerie, qui nous a BM aimablement confide par la SociBte de Biologie et Synthhse de Marseille. Cet organisme est design6 dans notre memoire sous le terme de 8. cerevisiae Q St. Louis)). Cultiv6 dans des conditions normales, c’est-&-dire sur glucose, il constitue la souche tori- gine )) qui est capable de s’adapter aux hydrocarbures. Mais, apr&s plusieurs passages sur milieux contenant des hydrocarbures, il y a (i accoutumance )) & ce sub- strat e t les cl8nes isol6s, a p r h repiquages, constituent la souche (( accoutumee H.

Milieux de cultures Nous avons employ6 le milieu mineral de base:

NH,Cl, 2,5g; KH,PO,, 7 g ; Na,HPO,, 7,2g; MgSO, 7H,O, 0,2 g; NaCl, 0, l g; eau distillee, 1 litre. A ce milieu, nous avons ajoutk de l’extrait de levure (Difco yeaat mtruct), 1 g/l, e t une source de carbone constitude suivant les cas par du glucose (concentration finale, 2 g/l) de 1’6thanol (de 6 zi 10 ml/l) ou par un hydrocarbure paraffinique (BDH) finement Bmulsionnd. Ces cultures sont mises t i incuber b 32” sous agitation vigoureuse ou sous vide.

Prkparation des extraits acellulairm Apr&s lavage dans une solution de NaCl B 0,9O/,,

les levures sont remises en suspension dans du tampon phosphates 50 mM b pH 6,O et les densites micro- biennes, exprimCes en poids sec, sont determinees par opacimbtrie b 450 mp en se r6fCrant B une courbe d’ktalonnage. La preparation des extraits enzyma- tiques est rhaliske b partir de ces suspensions cellu- laires refroidies B 0” et soumises 8- un traitement dans une cellule de pression French pressure cell prealable- ment refroidie. Les preparations ainsi obtenues sont soumises a une centrifugation de 10000 tours/min pendant 20 min. Le surnageant de cette centrifugation constitue l’extrait brut.

L’azote proteique a kt6 dos6 dans les extraits par semi-micro-kjeldahl.

Tests d’activite‘ Activite‘ Ltthanol-d&hydrogknase. Elle est d6ter-

minee B partir de la reduction du NAD en presence d’ethanol et d’extrait enzymatique et observee spectrophotometriquement A 340 m p & 23”, avec des systkmes de 3 ml contenant : extrait enzymatique (de 1 B 1,5 mg d’azote prothique); du NAD 7 mM (0,3 ml); ethanol 3 M (0,l ml); tampon pyrophos-

phate 200 mM, pH 8,5 (1 ml). Etudide dans ces conditions, cette activite est exprimbe en nmoles de NAD reduit par minute e t par mg d’azote proteique et calculee B partir de l’accroissement de la densite optique entre les 15e et 45e sec apr& l’introduction du co-enzyme.

Actiwite’ octanol-dhhydroqe‘mnase. Elle est deter- minee comme la prec6dente b partir de la reduction du NAD en presence d’extrait enzymatique et de 1-octanol (13O/,) en Bmulsion dans de l‘eau distillee contenant du Tween 80 0,5 o/o. Ces emulsions sont prbpar6es par traitement sonique (Sonifier 20 KC) jusqu’h l’obtention de particules homogenes dans une proportion aussi &levee que possible. Cette homogeneit6 est contrblee au microscope et la di- mension moyenne des particules est determinee dans une cellule de Malassez. Au cours de nos essais, nous avons utilisB des Bmulsions contenant plus de goo/ , de particules de diamhtre moyen 6galb 1 p.

A h d‘etudier l’hfluence du degre d’6mulsScation sup l’activit6 enzymatique, ces Bmulsions de 1-octanol ont Bt6 prepardes de deux manieres WBrentes avec des melanges contenant 39 v01-~/, d’alcool dans de l’eau distillee, additionne de Tween 80 B 0,5O/,. Dans le premier cas, la preparation est Bmulsifiee durant 10min & tempbratwe ordinaire dans un homo- gbndiseur B hblice, et dans le second cas, le melange est soumis B l’action d’un generateur de sons (Sonifier 20 KC). Ces emulsions sont ensuite centrifugees dans des godets horizontaux & 6000 tours/min, pendant 15 min et le liquide median comprenant les particules les plus fines est separh. L’homogBnBitB de ces emulsions est v6rifiee au microscope optique et les dimensions des particules, determinees dans une cellule de Malassez. Le diamhtre moyen des particules de 1-octanol obtenues par traitement sonique des melanges est de 0,3 p, et de 2, l p pour les particules d’dmulsions prBparkes b l’homog6nBiseur. AU cours de nos mesures d’activith enzymatique, la quantite de 1-octanol dans nos systkmes a BtB calculbe de fagon zi obtenir une molarit6 de 0,l M identique A, celle qui est obtenue avec l’bthanol.

Activitb aldLhyde-rLductases. Elles sont deter- minees zi partir de l’oxydation du NADH et ob- servees spectrophotometriquement & 340 mp A, 23“ sous atornosphere d’azote avec des systkmes de 3 ml comprenant : l’extrait enzymatique, du NADH 70 mM (0,3 ml) une solution d’acetaldbhyde 1 M ou une emulsion d’octaldehyde I M dans de l’eau distillee contenant 0,5°/0 de Tween 80 (0’05 ml) suivant l’enzyme Btudie, du tampon phosphates 1 M, pH 7,2 (1 rnl).

R~SULTATS EXPI~RIMENTAUX Mise en dvidence de Z’activitd octanol-dAshydroq6naEte

Les extraits bruts de cellules de S. cerevisiae souche 6 accoutumee H cultivees sup n-tetradbcane, sont capables d’oxyder l’octanol en presence de

428 R6gulation des alcool-dbshydrog6nneses chez Sacchurontyces c e r e v i s k European J. Biochem.

NAD. Ces mbmes preparations ne peuvent oxyder l’bthanol qu’h des vitesses trks faibles et txks nette- ment inferieures 8, celles qui ont 6t6 mesurees avec la souche (( origine 8 cultivee en presence de glucose. L’activite deshydrogenasique de ces extraits a Bt6 dkterminees 8, partir de la reduction du NAD (Fig. 1) et la determination de cette activitd n’est significative que pour les emulsions de 1-octanol dans de l’eau

I / I I

\ \ \ -\

\\ \

I OO i 2 -3 4 5 6 7 6 9 Ib

Minutes

Fig.1. Mesure des activitb enzyntatipues dea extraits brute (I mg d’azote protkique) de levuree oultivkea sur n-tktrdhzne. (I) r6duction du NAD, 7 mM (0.3 ml) dans des eyet&mes experimentaux contenant : tampon pyrophosphate 200 mM (pH 8,6), 6mulsion de 1-octanol (concentration finale 100mM). (111), s y s t h e identique ne contenant pas d’alcool. (11). oxydation du NADH, 10 mM (0,3 ml) en presence d’une Bmulsion d‘octaldbhyde (concentration finale 100 mM) et de tampon phosphates 1 M (pH 7,2). (IV), systhme identique

sans aldehyde

distillee contenant du Tween 80. Dans ces conditions, la reduction du NAD, bien qu’importante, n’est jamais lin6aire en fonction du temps. L’activite alcool-deshydroghase, mesuree dans lea premihres secondes est Bgale A 600 unit& (nmoles de NAD reduit par min et par mg d’azote protdique). En presence d’ethanol l’activitd est Bgale h 100 unit&, ce qui represente environ le 1/6 de l’activite sur 1 -0ctanol. Ce comportement eat exactement dans le rapport inverse de celui qui a B t B Btudi8 avec 1’Btha- nol-deshydrogenase cristallisee de levure.

Avec des extraits bruts, l’activite enzymatique responsable de la d6shydrogBnation du 1-octanol eat proportionnelle h la concentration en protdines, elle

est nulle lorsque ces extraits ont Bt6 prealablement maintenus h une temphature de 100” pendant lOmin, elle est enfin sp6cifique du NAD et en aucun cas le NADP ne peut remplacer ce co-enzyme.

En remplagant le 1 -octanol par l’octaldehyde dans lea systdmes experimentaux, nous n’avons jamais mis en Bvidence d’activitd octaldehyde-deshydrogenase. I1 eat probable que ces activites enzymatiques, de nature mitochondriale, sont soit denaturees, soit Bliminees au cours de preparations enzymatiques et des centrifugations A grande vitesse.

Nous avons donc mesure lea vitesses d‘oxydation de l’octanol en presence du NAD h pH 8,5 et lea vitesses de reduction de l’octaldehyde en presence de NADH, 8, pH 7,2 (Fig. 1 courbe 11). Ces determina- tions permettent d’etablir que les extraits acellulaires Btudih catalysent A la fois la reaction d’oxydation du 1-octanol et la reduction de l’octaldehyde.

L’oxydation du NADH, en presence d‘extrait enzymatique et d’octaldehyde est toujours pr6cedee par une phase de latence d’environ 2 8, 3 min difficile- ment interpretable. La vitesse de cette reaction Bgale 8, 1200 unites eat d’abord constante en fonction du temps et diminue jusqu’h s’annuler lorsqu’il ne reste plus que 30 O/,, du NADH, dans le systAme, c’est-&-dire 8, l’equilibre.

Ztude cingtique & 2‘oxyohtion du I-octanot La reduction du NAD par le 1-octanol, en presence

de preparations enzymatiques de 8. cerevisiae cultivee sup hydrocarbures, est directement liee au degre d’6mulsification du compose insoluble dans l’eau. Lea solutions de 1-octanol non Bmulsi66ee ou de 1-octanol pur, ne permettent aucune rMuction mkme en pr6- sence de concentrations importantes d‘extrait enzy- matique. Dana une premikre approximation, ce ph6- nomhne semble presenter de nombreuses analogies avec celui qui a Bti5 signal6 par Azoulay et Heyde- man [6] au cours de leur etude de l’heptanol-d8s- hydrogenase de Pseudomonas aeruginosa cultivee sur hydrocarbures.

L‘activitd octanol-d6ahydrogbnase fournit un exemple inthessant de catalyse se deroulant en milieu het6roghne. Par r6f6rence aux travaux de Benzonana et Desnuelle[7], nous avons pens6 que la vitesse initiale de dBshydrog6nation de I’alcool octylique est fonction du degre d‘6mulsification du substrat. La vitesse de cette reaction est propor- tionnelle au nombre de molecules du complex pri- maire enzyme-substrat, capable, aprhs dissociation, de liberer lea produits de la reaction 8, un rythme d6termjne. En milieu h6throgkne, le substrat se presente sous forme de particules et cette vitesse de reaction dependra donc de la dimension de ces particules dam le milieu liquide. Nous avons donc prepare 2 emulsions de 1-octanol de concentration identique mais preparhs dans des conditions dif-

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7 -

6 -

5 -

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f6rentes; nous avons v6rifie la stabilite de cea Bmul- sions et leur homogen6it6 comme il a 6td pdcedem- ment indique et avons determine les 2 parametres cin6tiques (Vmm et K,) de la reaction d’oxydation du 1-octanol A partir de la repdsentation graphique de Lineweaver-Burk (Fig. 2). Lea representations pour ces 2 types d‘6mulsions, contenant chacune des particules de diamhtre Werent (2,l p et 0,3 p) sont lin6aires.

Cette lin6arit6, qui est m e condition prdalable pour les calculs de K,, est parfaite lorsque les Bmulsions sont homoghnes. Le remplacement c o m e

-30 -20 -0 0 10 20 30 1/[ 1-cdmal] (mM-‘)

Fig.2. Influence de lo concentration d du degr.5 de dbper&n dzc 1-&no1 mr la vitease initiale d’oxydution de ce substrat par des extraits acellulairea de S. cerevisiae cdtivle en alrobiose sur n-t9rad&ne. Repdwntation graphique suivant la mhthode de Lineweaver-Burk. Le 1-octanol est introduit dam les aysthmea enzymatiques 8ous forme d’bmulsions prbparhee par traitement : (I), 8. l’homoghnbiseur (particules

de diambtre 2,1 p); (11), par sonicetion (pasticules de diemetre 0,3 p)

Bmulsifiant du Tween 80 par le polyvinyl-pyrrolidone, le desoxycholate ou le dodecyl-sulfate de sodium entraine souvent une inhibition de l’activitd d6s- hydrogbnasique, et, dans les meilleurs cas, une ab- sence de linearit4 dans les reprksentations graphiques.

Le Vm,, est identique pour les 2 emulsions, ce qui est normal puisqu’une quantite identique d’ex- trait enzymatique a 6t6 utilisee dans les deux cas. I1 n’en est pas de m6me pour 1es K , , et ces valeurs, diffbrentes des constantes de Michaelia montrent , comme pour la lipase pancrdatique, que dans le cas particulier de substrats Bmulsi66s, la concentration du substrat ne peut pas &re seule retenue. En effet la vitesse initiale de la reaction de d6shydrogenation eat d’autant plus grande que le substrat est plus finement 6mulsi6e: pour des particules de diametre 6gal A 2,l p, le K m est 6gal B 1 , 8 ~ l O - ~ M. Cette valeur est de 0,4x lo3 M pour des particules de 0 3 p.

Dans 1’8tat actuel de nos experiences, nous n’avons aucune id& quant B. la relation mathemati- que qui existe entre la vitesse de reaction et le degre d’6mulsion du fait que nos experiences n’ont pas 6t6 rthlis6es avec des preparations pures. Nous pouvons simplement dire que l’affinit4 de l’enzyme pour son substrat est directement liee A son degr6 de dispersion et ceci explique pourquoi nous n’avons obtenu d’ac- tivites significatives que lorsque nous introduisions dans nos systhmes des emulsions d‘alcool.

Propi&& gddra1e-s En fonction du pH, cette activit6 prksente un

optimum entre pH 8 et 9 en tampon %is 60 mM. Nous n’avons constate aucune activation ni inhibition en remplapant le tampon Tris par du tampon pyro- phosphate de sodium. De m6me, il ne semble pas que, pour des molerites Wkrentes, nous obtenions des variations notables. En fonction de la temp6rature, l’enzyme peut &re considere comme thermolabile : l’incubation L 40” pendant 15 min, entraine une perte d’activit6 de 600/,, et le m6me temps d’incubation A 60” inactive l’enzyme de plus de 800/,. En relation directe avec ce phthomhe, nous avons constat6 que lea extraits enzymatiques perdent prks de la moiti6 de leur activit4 d6shydrog6nasique par simple con- servation B 0” pendant 24 heures et sont totalement inactifs apres 48 heures. La congelation n’ameliore pas cette conservation. Par ultracentrifugation B 170000xg pendant 2 heures dans une Spinco mo- dele L (rotor SW39L), l’activit6 alcool-d6shydro- g6nase est entierement recup6r&e dans le surnageant, et le culot de centrifugation, lave dans un tampon phosphates 60 mM L pH 6,O et centrifuge de nouveau dans les m6mes conditions, ne donne absolument aucune activit6 enzymatique. Nous pouvons donc conclure que I’activit4 alcool-d6shydrogenase 6tudi6e est de nature u soluble *. Cependant, nous ne pouvons pas dire dans 1’6tat de nos experiences si cette ac- tiviih est de nature mitochondriale ou non, du fait m6me des conditions de preparations de ces extraits.

& d e comparative de l’octanol-d&hydrogt%me et de l’Lthanol-dRshydrogdnme

Inhibiteurs L’activite &hanol-d6shydrog6nase mesur6e avec

lea extraits de S. cereviske cultiv6e sur glucose en anaerobiose et l’activite octanol-d6shydrog6nase determin6e avec des extraita de cellules de ce m6me organisme cultivee sup tRtrad6cane en ahrobiose, sont toutes deux fortement inhibbes par HgCI, et l’iodo- acetate de sodium et A un degd moindre par 1’0-ph6- nantroline. Les differences essentielles portent sur l’insensibilit6 de l’octanoLd6shydrog6nase au KCN et au NaN, (10 mM), alors que l’ethanol-deshydro- g6nase est inhibee A plus de 800/,. A l’egard des

430 RBgulation dea alcool-d6shydrogbnctses chez Samhromyces cerevisiae European J. Biochem.

Tableau 1. Influence de different5 inhibiteurs aur l’activiti aleool-dthhydrogknuse des extraits acellulairea de S. cerevisiae

cultivke sur gluwse en anuirobiose et sur tktradkcane en atobiose

Lee activitbs Bthanol-dBshydrogBnaae et octanol-dkshydro- gBnase ont ktb respectivement dBterminbs en prhsence

d’hthanol et d’6mulsions d‘octanol

Inhibition

dbshydrogbnase dBshydrogBnaee

Inhlblteurs (10 mY) Bthanol- octanol-

% Iodoacbtate de sodium 52 o-~h6nanthroline 33 Hidroxylamine KCN NaN,

FeC1, ZnC1,

HgC1, CUCl,

29 84,5 89

100 40 18 9

‘1. 76 41 65 995 4

88 82 65 18

Y

tiques lui a permis d’avancer l’hypothkse suivant laquelle il existerait une autre alcool-d6shydrog6nase, diffdrente de 1’6thanol-ddshydrog6nase et qui serait synthetisee en presence d’ethanol. Sur la base de ces travaux, en appliquant notre methode de d6termina- tion des activiiAs enzymatiques A 1’Qgard des alcools superieurs, nous avons compare les vitesses d’oxy- dation de plusieurs alcools en prhence de NAD et d’extraits enzymatiques provenant de cellules cul- t i des soit sur n-tetradecane soit sur glucose (Fig.3). Les dsultats illustres par cette figure appellent quel- ques remarques :

a) l’alcool-d6shydrogenase des extraits bruts de cellules cultivees sur glucose se comportent exacte- ment comme 1’BthanoLdBshydrogBnase cristallisee: l’activite enzymatique diminue en fonction du nombre d’atomes de carbone contenus dans la molecule d’alcool oxyde ;

b) les extraits bruts de cellules cultivees sur n-tetradecane, riches en activite octanol-dkshydro- ghase, catalysent l’oxydation des alcools B des vitesses croissantes avec le nombre d’atomes de carbone contenus dans la molecule pour 6tre maxi- mum B 1’6gard du 1-octanol. En presence d’ethanol, 1’activiM enzymatique est Bgale B ZOO/,, de celle qui est mesurf% en presence de 1-octanol.

On peut donc conclure que ces deux enzymes diffkrent essentiellement par leur specificit6 B 1’6gard du substrat. I1 convient de noter gue toutes les deux ne catalysent pas la reduction des pyridines nucl6o- tides en presence d’alcools primaires, secondaires, tertiaires ou cycliques diffdrents des alcools aliphati- ques B chaine droite.

AlcoOlS

Fig. 3. Activitk alwol-d&hydrogthae b 1’6gard des diffirents alcools, des extraits acellulaires de S. cerevisiae cuEtivCe soit en airobiose sur n-tktradkcane (en pointillt?) soit en anatrobiose

sur glucose (en noir)

metaux, I’inhibition est dans l’ordre decroissant suivant : Hg++ > Cu++ > Fe+++ > Zn++ (Tableau I).

Ces donnees sont en accord avec les dbterminations de Wallenfels et Sund [S]. Cependant, l’octanol- dBshydrog6nas.e y est environ deux fois plus sensible. Ces deux enzymes sont inhibbs par les chelaburs des groupement-SH et dans le cas de l’iodoa&ate, pr6- sentent exactement le m6me phenomhe de levee d‘in- hibition par addition B concentration determinee de NAD et d’alcool.

Sp6cificite B 1’6gard du substrat Wiame [6] dans un recent mbmoire, a montr6

que les extraits acellulaires de 8. cerewisim cultivee sur ethanol, catalysent l’oxydation du 1-octanol. L’etude comparative des vitesses d’oxydation de dif- fbrents alcools avec diverses preparations enzyma-

Cinetiques d’inactivation thermique Contrairement A 1’6thanol-d6shydrogenase, 1’0~-

tanoLdkshydrog6nase est sensible A la chaleur. La comparaison des cinetiques d’inactivation thermique de ces deux enzymes dans des extraits bruts de S. cerevisiae sauvage ou 6 accoutumee n cultivde dans differentes conditions est illustr6 par la Fig.4. La temperature de 51” a Bt6 choisie car l’enzyme cristal- lisee est trbs faiblement inhibee A cette temperature aprks 30 min d’incubation. En comparant les cineti- ques d’inactivation de l’enzyme cristallisee avec celles des extraits bruts provenant de cellules cultivees sur hydrocarbures, nous constatom une trks nette difference.

Ce comportement est identique en presence d’kthanol et de 1-octanol, compte tenu des W6rences d’activit6 specifique B 1’6gard de ces deux substrats. La m6me etude, realisee sur des extraits acellulaires de S. cereviskae cultivee sur glucose en l’absence d’oxygkne montre que, dans ce cas precis, les cineti- ques d’inactivation thermique sont absolument identiques.

Val. 8, No. 3.1960 B. ROCHE et E. AZOULAY 431

Cette diffkrence de comportement B 1’8gard de la temp6rature permet de savoir si les deux activites existent simultanbment dans une m6me preparation acellulaire et de determiner avec m e bonne approxi- mation la proportion d’octanol-dbshydrogdmse dans un melange enzymatique. En effet, si l’on considhre les pourcentages d’inactivation thermique mesures en presence de 1-octanol, aprhs 30 min d‘incubation

1 0 5 i Q 1 5 m 2 5 3 0

Temps de chauffage (min)

Fig. 4. Cidtique d’inactivation thermique dea extraits d l u - hires de s. cerevisiae cultivie en airobioee sur n-t&rade‘cam (traits pointillks) (0, m) ou en anakrobiose Bur glucose (traits pleins) (0, 0) . Les melanges contenant lea prbparations enzymatiques (1 mg d‘azote proGique) sont incubes B 51”. Les activitks alcool-d6shydrogbnases sont dbterminees B regard de l’ethanol (I, 11) et du 1-octanol (111, IV). Courbes Gmoins correspondent B l’Bthanol-d6shydrogbnase cristallish

(V et VI)

des extraits enzymatiques A 61”, nous voyons qu’ils sont respectivement Bgaux B 40°/0 dans le cas de 1’6thanol-deshydrogenase et 9501, pour l’octanol- d6shydrogenase. Par consequent, toute prkparation presentant une cindtique d’inactivation thermique dktermin6e en presence #ethanol ou de 1-octanol, situee dans I’intervalle de ces deux courbes est en fait un melange des deux activitds.

Affinite des 2 alcool-deshydrogenases B 1’6gard de leurs substrats

Les constantes d’affinite de ces enzymes B 1’8gard de leurs substrats (alcool ou aldehyde) donnent des indications precieuses sur leur fonction physiologique. Nous avons determine pour ces deux preparations les K , et Vmax B 1’6gard de 1’6thanol,l’acdtald6hyde, l’octanol et l’octaldehyde, et dans ces deux derniers cas, en prenant des precautions sur lesquelles nous avons d6jB insiste, en particulier le degre d’emulsifica- tion. Les valeurs de ces constantes sont consign& dans le Tableau 2.

En ce qui concerne l’ac6taldehyde, la determina- tion de cette valeur est importante puisque Wiame [5] , Galzy et Slonimski [9] considhrent que la veritable fonction physiologique de cette enzyme est d‘Ctre une ald6hyde-reductase. Effectivement, nous avons constatA que l’afhit6 de l’dthanol-ddshydrogenase est plus g r a d e pour l’acdtaldehyde que pour 1’6thanol et ces resultats se retrouvent pour l’enzyme cristal- lise. Par contre, il n’existe pratiquement aucune M6rence dans les valeurs des K , determinbes pour les deux preparations A l’egard du NAD.

En conclusion, l’octanol-d6shydrog&nase se dis- tingue de l’ethanol-deshydrogenase et les differences portent sur des propriBMs essentielles de ces deux enzymes (Tableau 3).

I1 convient cependant de souligner que, contraire- ment aux donnkes d’Ebisuzaki et Baron [lo], notre enzyme est incapable de catalyser l’oxydation de l’acide cinnamylique. De plus, son comportement B

Tableau 2. Affinith dea alwol-d&hydroge‘naaes p m r leurs substrate VmaX: les vitesses maximum sont exprimbes en nmoles de NAD reduit par min et par mg d’azote prothique. Lea activitks alcool-dbshydmg6naaenaeee A l’bgard de l’octanol sont determinh avec des emulsions d’octanol pdparbes (a) par traitement

B l’homogbnbiseur, (b) par traitement sonique

fithano1 Adtaldhhyde 1-octanol OctaldWde NAD

de croissanee K, v,, K.. VmSX Km VmU Km V- 9, Substrat carbon6

31 m Bi M m Glucose audrobic

(bthanol-dbshydro-

TBtradbcane abrobie (octanol-d&hydro- g8nase) 1 , 0 ~ 1 0 - ~ 268 50 x ~ O - ~ 1115 (a) 1,s x ~ O - ~ 960 0 , 6 ~ 1 0 - ~ 2380 2 xlO-‘

gbnase) 2,6x10-* 36000 1,i x1W3 431 77 x 10--3 - - - 2,s x 10-4

(b) 0,40 x . , - Ethanol-deshydrogenaw

cristallisbe (Sinma) 1.3 x - 0 . 2 5 ~ 10-3 - - - - - i ,7 x 10-4

432 RBgulation des dcool-dBshydrogBnaaea chez S d r o m y c e a cereviaide European J. Biochem.

Tableau 3. Prophit& enzymatiques des extraits acelluhires de S. cerevisiae cultivie sur glucose en annProbiose r?t m r te‘trade‘cane en akrobiose

Substrat 12 thanol-d8shydrog6nase Octanol-dBshydrogBnase

K m (N-1 Bthanol 2,5 X ~ O - ~ M 10 x ~ O - ~ M

Km (N-) Bthanol

1-octanol Rapport des activiths 1 -0ctanol 0,77 x M

N 6,3

0’4 x 10-3 M 0,15

pH optimum 8 3 8,3 fitat soluble soluble Inactivation thermique (20 min B 51”) KCN inhibiteur aucune action NaN, inhibiteur aucune action Conservation bonne 8.0” totalement inactive

inhibition de 35 8. 4001, inhibition de 90 B 960/,

ap&s 24 h ti 0”

1’6gard de la temp6rature est totalement dif€&ent de celui de l’enzyme Btudi6e par Schimpfessel [4]. Mais nos donn6es 6tablissent, comme l’ont d6jA fait ces auteurs, I’existence d’une h6terog6n6it4 de l’alcool- d6shydrog6nase chez la levure.

Formation des deux enzymes en fonction des conditions de culture

Pour d6terminer la presence des deux alcool- d6shydroghases, Bthanol-dBshydrog6nase ou octanol- d&hydroghase, nous avons mesure les activit6s de dbhydrog6nation A 1’6gard de l‘6thanol et du l-octa- nol. Le rapport des activitks A 1’6gard de ces 2 sub- strats nous permet de savoir s i nos pr6parations contiennent l’une ou l’autre enzyme ou un m6lange des deux. Ainsi l’activit6 de l‘&hanol-d6shydrog8nase cristallisde mesuree en presence de I-octanol reprd- sente 150/,, de celle mesuree en presence d’ethanol. Nous avons complet6 cette d6termination par des mesures de pourcentage d’inhibition par inactivation thermique en traitant simultan6ment ces mi3mes preparations A une temperature de 81” pendant 30min. Nous pouvons considerer qu’aprks un tel traitement thermique, la totalit4 de l’octanol- deahydrog6nase est inactivh et dans la plupart des cas nous avons aussi cornpar6 lea cindtiques d’inacti- vation thermique.

(33s criGres de ddtermination nous ont permis d’6tablir que l’octanol-d6sh ydrogenase est synthetisde en presence d’hydrocarbures et que 1’8thanol- dtkhydrog6nase de cette souche de S. cerevisiae eat specifiquement induite en presence de glucose.

Activitds enzymatiques des p d p r a t i o n s de S. cere- visiae (( origineo. Cultivees en anaerobiose sur glucose, les cellules de la souche (( origines ont une activit6 specifique ethanol-d6shydrogenase de l’ordre de 20000 unites (Tableau4) et un taux d’octanol- dbshydroghase nul. Le passage de l’anakrobiose A l’athobiose entraine simultanement une baisse d’ac- tivit6 Bthanol-dBshydrog6nase d’environ trois fois,

Tableau 4. Activite‘s aleool-dbhydroge‘nase des extraits acellu- hires de S . cerevisiae, souche ccorigines

Les activites speciflques sont exprimbes en nmoles de NAD reduit par min et par mg d’azote protkique en presence soit

de solution d’6thanol 3 M soit d‘6mulsion de 1-octanol

activitks spec10qucs

de croissance Bthanol i-octnnol &t1lanol/ 1-octanol

Activitb speciflque Rapport des Substrat carbon6

Glucose ana6robie 20 000 2 300 9’0

exponentielle 8300 1300 6 J

Bouillon peptonk 1600 1100 194

Ethanol 560 280 2,o Acetate de sodium 1600 690 2 3

Glucose drobie

phase de ralentisse- } ment 3 700 1600 2’3

l’octanol-d6shydrog6nnase restant par ailleurs nulle. Ce r6sultat est confirm6 par les cinbtiques d‘inactiva- tion thermique mesurhs sur ces preparations acellulaires.

Lorsque les cellules cultiv6es en aerobiose en presence de glucose sont recueillies en phase de ralentissement de la croissance, l’activit6 Bthanol- dbhydrogdnase mesur6e avec leura pdparations acellulaires est plus faible. L’examen des cinetiques d’inactivation thermique (Fig. 5 ) et des rapports d’activiMs sp6cSques Bthanoll 1-octanol (Tableau 4) dbtermin6s avec des pr6parations permettent de mettre en bvidence une activit6 octanol-dbshydro- gknase.

Lemoigne [i l l a montre, dans un article ancien, que les croissances sur glucose s’accompagnent toujours d’une faible diauxie correspondant B l’utili- sation de l’t5thanol lorsque tout le glucose a Bt$ Bpuis6. En transposant cette observation A que nous venons de dhcrire, nous pouvons supposer gue, lorsque le glucose est m6tabolis6, l’alcool accumule au oours

Vol. 8, No. 3, lees B. Rocma et E. AZOULAY 433

d.. I I I I

t \

? 0 3 5 10 15 20 25 30

1

~ e m p s de chauffage (mid

Fig. 5. Cine‘tiquea d’imtivation thermique (51’) dea extraits acellulairw de S . cerevisiae, cultivie en airabiaee BUT glucose. Extreits de cellules rkcolbks (I) en phase exponentielle de croiseance, (11) en phase de ralentissement, (111) en phaae exponentielle et remises B incuber sur kthanol. L.a cowbe superieure en trait plein correspond 8, l76thtmo1-d6shydro-

g b s e cristallid

de la dkgradation du glucose est son tour oxydB en induisant l’octanol-dkshydrogenase. L’enzyme mise en Bvidence dans les cultures en phase de ralentisse- ment illustrerait ce phenomkne.

Cette interpretation concorde avec les r6sultats expBrimentaux obtenus avec des extraits de cellules cultivhes sur glucose, recolt6es en phase exponentielle de croissance, lavBes pour Bliminer le substrat et mises ti incuber sur Bthanol. Les cindtiques d’in- activation thermique de l’alcool-d6shydrogBnaae d6terminBes avec ces extraits donnent des pentes plus grandes que celles mesurkes avec l’6thanol- d6shydrogknase cristallisb (Fig. 5).

Les rBsultats consign& dans le Tableau4 in- diquent que l’kthanol- et l’octanol-dBshydrogBnaees sont toutes deux prBsentes B un niveau faible lorsque les cellules se developpent aux dBpens des amino- acides. Le passage sur Bthanol entraine un accroisse- ment de l’activitk octanol-dBshydrog6nase qui se manifeste par une sensibilit6 plus grande A la tem- pkrature. Enfin, les prBparations acellulaires de cul- tures sur ac6tate de sodium possedent une teneur en ethanol-d6shydroghnase faible, une activitB spBcSque B 1’Bgard de l’octanol6levb et un rapport d‘activith Bthanolloctanol trks voisin de celui qui a B t B mesur6 pour les cellules cultivbs sur Bthanol.

Tableau 5. Activith alwal-dhhydroghe dw extraits d l u - laires de S . cerevisiae, sowhe caccoutumb$

Les activitbs spbciliques sont exprimbes en nmoles de NAD rkduit par min et par mg d‘azote prothique soit en presence

de solution d’bthanol 3 M soit d’bmulsion de 1 -ocho l

Actlvith sdcifloue Rapport dm ~= activltee Substrat carbon6 speciflques

de croiseance Bthanol 1-oCtanOl &,hsnol/ 1-octsnol

Tbtradbcane exponentielle 90 660 0,16

Ethanol 420 2340 0,17 phase } de ralentissement 17 80 0,zo

Adtate de sodium 18 90 0,20 Bouillon peptonb 24 94 0,25 Glucose abrobie 06 104 0,60

Activit4.s enzymatiques d u pdparat im de S. cere- visiae uaccoutum’e,. Les activiMs apecifiques B 1’6gard de l’Bthano1 et du 1-octanol des extraits de cellules cultivBes sur n-t6tradBcane et r6coltees en phase ex- ponentielle de croissance sont consignBes dans le Tableau 5. Le rapport des activites spBcifiques Bthanolll-octanol, est Bgal A 0,16. Le niveau en- zymatique de l’octanol-d6shydrogBnase calcul6 en unites pour ces extraits est toujours nettement plus faible que le niveau de l’hthanol-dkshydrogknase dBtermin6 pour les cellules cultiv6es en presence de glucose. Le niveau de l’enzyme en fonction du temps de culture diminue pour devenir 7 fois plus faible lorsque les cellules sont recueillies en phase de ralentis- sement.

Nous avons cherch6 ti savoir si l’inducteur de l’octanol-dkshydrogbnase est rkellement un alcool (Bthanol ou dBriv6 mBtabolique de la dhgradation de l’hydrocarbure). Pour verifier une telle hypothese les cellules ont 6tB cultivBes sur n-tktradkcane, re- cueillies et remises B incuber sur Bthanol pendant une gBnBration. Les activites sp6cXques octanol- dhhydrogknase ddterminkes sur les extraits prepares A partir de ces cellules donnent des valeurs quatre fob plus grandes que celles qui ont 6M calcul6es avec des cellules cultiv6es sur n-thtrad6cane. La mQme expdrience n’a pu &re rtMis6e avec les alcools supBrieurs, puisque ces levures ne se developpent pas sur ces substrata.

I1 convient de souligner que les cellules de S. cere- visiae u accoutumh u n’ont pratiquement pas d’ac- tivite ethanol-deshydrogknase lorsqu’elles sont cul- tiv6es sur glucose, et que leur d6veloppement en anadrobiose est trbs faible. ul’accoutumance)) aux hydrocarbures entraine donc simultanhment une disparition de l‘ethanol-d6shydrogBnase fermentative et une incapaciM A fermenter le glucose.

Influence de I‘oxygkne. L’addition du n-Gtradkcane A des cultures aBrobies de S. cerevisiae sur glucose n’entrahe aucune variation dea taux d’activit.6

434 B. ROCHE et E. AZOULAY: mgulation des alcool-d6shydrog&naees chez Saccharomyces cerevhke European J. Biocheni.

6thanol-dkshydroghase si cette addition est rdalishe en phase exponentielle de croissance et cette obser- vation montre gue l’hydrocarbure ajoug dans ces conditions ne modifie pas le taux de synthhse de l’BthanoLd8shydrog6nase. Par contre, le passage du glucose B l’hydrocarbure pour les cellules cultivees s u r glucose en presence d’oxyghne conduit, B une synthese de l’octanol-d6shydrogdnase, ce qui se manifeste dans les preparations enzymatiques par un accroissement d’activitk B l’bgard du 1-octanol.

L’addition de n-tktraddcane dans une culture anaerobic de S. cerevisiae ccorigine, sur glucose ne provoque aucun arr& de la croissance. De plus en l’absence d’oxyghne I’hydrocarbure n’a aucune in- fluence sur la synthhse de l’octanoLd6shydrog6nase. Son influence n’est d6terminante en tant qu’inducteur de cette enzyme qu’en prksence d’oxyghne et en l’ab- sence de glucose.

DISCUSSION

Nos resultats exp6rimentaux dtablissent l’exis- tence chez S. cerevisiae, d’une alcool-d6shydrog6nase (octanol-d6shydrog6nase) Wbrente de 1’6thanol- deshydrogthase fermentative.

La determination du niveau des deux alcool- deshydrogenases presentes chez ces levures en fonc- tion des conditions de culture permettent de constater la &partition totale de toute activitA octanol-d6s- hydrogenase dans lea cellules cultivBes sur glucose en anaerobiose et en aerobiose : cette activite apparait A un trhs faible niveau pour lea cellules recueillies en phase de ralentissement et elle est accrue lorsque Yon introduit en m6me temps de l’ethanol.

L’adaptation aux hydrocarbures et bien plus Ql’accoutumance~ 21, ces substrats entrainent simul- tanement la disparition chez ces levures de l’activit6 ethanol-dBshydrog6nase. Le n-t6trad6cane et 1’6thanol constituent les meilleurs inducteurs de l’octanol- d6shydrog&nase, cependant cette induction n’est possible qu’en presence d’oxyghe. I1 resulte donc de nos observations gue la synthese des alcool- dBshydrog6nasea de S. cerevisiae est soumise B un double niveau de regulation dii Q la fois B l’oxyghe et aux substrats de ces d6shydrog6nases. I1 convient de noter que les etudes de regulation tentees sur ces enzymes ont donne peu de rbsultats du fait que les

auteurs ont toujours At6 amen& & utiliser comme substrats, le glucose ou sea d6rivds metaboliques et, par suite, de l’interfhrence des metabolismes fermen- taires et respiratoires, il s’avhrait tr&s delicat de determiner exactement le niveau de chacun de ces enzymes. L’intbr6t de l’utilisation des hydrocarbures reside essentiellement dans leur action sur l’activit6 ethanol-dBshydrogBnase, action que nous ne pouvons totalement expliquer dans 1’6tat actuel de nos ex- p6riences. I1 est trhs possible par analogie avec les observations dkcrites par Galzy [I21 que nos uac- coutumantsu soient en realit6 des mutants de S. cere- V i S i a e .

Enfin l’existence chez la levure de deux alcool- deshydrogenases decoule probablement de la presence chez cet organisme, de 2 voies metaboliques ayant m e &ape en commun. I1 nous appartient bien entendu, apres purification, de verifier si l’enzyme que nous avons mise en evidence chez S. cerevisiae aaccoutumeeu aux hydrocarbures est difY6rente de celle ddcouverte par Ebisuzaki et confirmee par Schimpfessel.

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