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Réponses : cinétique enzymatique

Ces réponses ne sont pas des corrigés types : elles sont des indications pour formuler desréponses correctes.

Enoncé 1

La radioactivité d'un échantillon d'iode 131, mesurée pendant 27 jours, évolue ainsi :

jours 0 1 2 3 5 7

dpm 7190 6540 6000 5500 4640 3900

jours 9 12 15 19 23 27

dpm 3300 2550 1970 1400 1000 700

- Déterminer l'ordre de la réaction de décroissance de radioactivité.

- Calculer le temps de demi-vie de l'iode 131

Le nombre de dpm (désintégration par minute) est proportionnel à la concentration de l'iode

131 présent dans l'échantillon. Cette réaction n'est pas d'ordre zéro (à vue d'œil pas de

proportionnalité entre dpm et jour), regardons ce que donne l'hypothèse d'une réaction du

premier ordre, pour une telle réaction nous avons :

Ln R

R= - kt où R est le nombre de dpm à l'instant 0

00

, traçons Ln

RR

= f(t)0

jours 1 2 3 5 7 9

Ln(R/R0) -0,096 -0,182 -0,269 -0,439 -0,613 -0,780

jours 12 15 19 23 27

Ln(R/R0) -1,038 -1,296 -1,638 -1,974 -2,331

Le graphe est une droite : nous sommes donc en présence d'une réaction d'ordre 1.

L'équation de celle-ci est : Ln R

R= - 0,0857(t) - 0,0109

0

*, puisque nous avons laissé le

temps en jours, la pente de la droite est en jour-1.

Le temps de demie-vie est : t = Ln(2)

0,0857 =

0,6930,0857

= 8,086 jours1/2

• droite de régression linéaire calculée avec Excel, voir en annexe

• vous pouvez utiliser du papier millimitré, votre calculette ou encore un serveur Web, voir

par exemple : http://michelcomeau.tripod.com/webpublic/javapage/reg/reg.htm


Régression linéaire avec Excel

y = -0,0857x - 0,0109

R2 = 1

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0 1 0 2 0 3 0

t

Ln(R/Ro)

Enoncé 2

La vitesse initiale d'une réaction enzymatique est mesurée en fonction de la concentration

totale (ou initiale) de substrat (grande devant la concentration d'enzyme) et les résultats sont

les suivants :

[S]0 (mM) 0,5 1 2 3 10

v (µM/min) 50 75 100 112,5 136,4

- Quelle est l'ordre de la réaction par rapport au substrat

- Sachant que la valeur de KM est égale à 1mM, commentez le graphe précédent

- Pensez-vous que l'on puisse déterminer correctement VM et KM dans ces conditions, si

non dans quelles conditions referiez-vous l'expérience ?

Traçons le graphe Ln(v = f Ln([S] )0) ( )

Ln(v) -14 -13,5 -13,3 -13,18 -12,9

Ln [S]0( ) -7,6 -6,9 -6,2 -5,8 -4,6

v = k[S] Ln(v) = Ln(k) + nLn([S] )0n

0⇒Le graphe n'étant point une droite, cela signifie que l'ordre de la réaction n'est pas constant et

varie avec la concentration du substrat.

Nous remarquons que pour des concentrations faibles de substrat, l'ordre tend vers 1 alors que

pour les fortes concentrations de substrat l'ordre tend vers 0.


-5-6-7-8

-13

-14

-12

XX

X

X

X

Ln(v)

Ln([S] )0

Sachant que la valeur de KM est égale à 1mM, la détermination des constantes cinétiques à

l'aide de cette expérience laissera à désirer, en effet une seule valeur de la concentration du

substrat remplit les conditions [S]0 >> KM. Il conviendrait de choisir pour les valeurs de

[S]0 , un intervalle de 10 à 10 M-4 -1 qui permettrait non seulement de déterminer les

constantes cinétiques, mais aussi de voir que l'enzyme a un comportement Michaëlien sur une

large plage de valeurs de [S]0 .

Enoncé 3

L'hydrolyse enzymatique d'un substrat est suivie par la mesure de l'augmentation

d'absorbance due à la libération du produit de la réaction en fonction du temps :

t (s) 24 48 72 96 120 168 240 450 600

D.O. 0,41 0,74 1 1,2 1,37 1,6 1,8 2 2

- Déterminer l'ordre de la réaction et la constante de vitesse.

La valeur de la densité optique pour les temps 450 et 600 est constante, cela signifie que la

réaction est terminée. La concentration de produit est proportionnelle à la densité optique : la

concentration de substrat sera proportionnelle à [(valeur maximale D.O) - (D.O.)]. Au temps

t=0, la concentration de substrat est proportionnelle à la valeur maximale de la densité

optique.: [A] = Ct(DO - DO) et [A] = Ct(DO)max 0


Apparemment, la réaction n'est pas d'ordre zéro, regardons ce que donne l'hypothèse d'une

réaction du premier ordre, pour une telle réaction nous avons :

Ln D.O. - D.O.

D.O.= - kt 0

0

, traçons le graphe Ln

D.O. - D.O.D.O.

0

0

= Ln(r) = f(t)

t (s) 24 48 72 96 120 168 240

Ln(r) -0,223 -0,462 -0,693 -0,916 -1,155 -1,609 -2,302

Régression linéaire Excel

y = -0,0096x + 0,0022

R2 = 1

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 5 0 100 150 200 250 300

t

Ln(A/Ao)

Le graphe est une droite de pente 9,6 10 (s )-3 -1 :

La réaction est d'ordre 1 par rapport au substrat et la constante de vitesse est 9,6 10 (s )-3 -1

Enoncé 4Connaissant les valeurs des constantes cinétiques VM et KM d'un enzyme, calculez les

valeurs de la vitesse initiale (au centième près) en fonction de VM pour des valeurs de [S]0

comprises dans l'intervalle [ KM/100 … 1000KM]. Nous supposerons que la condition

[S]0>> [E]0 est toujours satisfaite.

Discutez l'intervalle des valeurs de [S]0 pour une bonne détermination des constantes

cinétiques VM et KM d'un enzyme.


Comparez ces résultats avec ceux obtenus pour ([ES]/[E] ) = f K /[S]T M( ) dans les mêmes

conditions expérimentales.

Calculons v à l'aide de la relation de Briggs-Haldane : v = V [S]

K + [S] M 0

M 0

[S]0 / KM 1/100 1/10 0,2 0,5 1

v ( VM ) 0,01 0,01 0,16 0,33 0,5

[S]0 / KM 2 5 10 100 1000

v ( VM ) 0,66 0,83 0,90 0,99 1

L'intervalle donné dans l'énoncé [KM/100 … 1000KM] pour les valeurs de [S]0est un bon

intervalle pour déterminer correctement les valeurs de VM et KM puisque l'intégralité de la

variation de v est balayée.

L'équilibre de dissociation du complexe ES est :

ES E + S K

Le système d'équation s'écrit :

(a) K =[E][S][ES]

(b) [ES] + [E] = [E]

(c) [ES] + [S] = [S]T

T

en remplaçant [E] dans l'équation (a) à l'aide de l'équation (b), nous obtenons :

[ES][E]

= [S]

K +[S]T et utilisant l'équation (c) en sachant que [S]0>> [E]0, donc

[S] [S] = [S]T 0≅ , et si nous supposons que l'étape limitante est la formation du complexe

( K = KM), nous obtenons : [ES][E]

= [S]

K +[S]0

0

M 0

la courbe v = f K /[S]M 0( ) a exactement la même forme que la courbe

([ES]/[E] ) = f K /[S]T M 0( )


Enoncé 5

L'étude de la déphosphorylation d'un substrat par un enzyme, expérience réalisée à

température constante et pH donné et concentration d'ATP grande devant la concentration

d'enzyme, donne les résultats suivants : vitesse initiale et concentration totale de substrat

[ATP] µM 7,5 12,5 20,1 32,5 62,5

v (µM/s) 0,067 0,095 0,12 0,15 0,185

- Calculer les constantes cinétiques de l'enzyme pour ce substrat.

Traçons la représentation de Lineweaver-Burk 1v

= f 1

[S]0

(on note [S] à la place de [S]0 )

1 /[ATP] M-1 13,3 104 8 104 4,9 104 3 104 1,6 104

1/v (s/M) 14,9 106 10,5 106 8,3 106 6,6 106 5,4 106

Régression Excel

y = 80,492x + 4E+06

R2 = 0,9994

0,0E+00

2,0E+06

4,0E+06

6,0E+06

8,0E+06

1,0E+07

1,2E+07

1,4E+07

1,6E+07

0,0E+00 4,0E+04 8,0E+04 1,2E+05 1,6E+05

1 /S

1 / v

L'équation de la droite est : 1v

= 80,51

[S] + 4106

Pour 1

[S]= 0, nous avons v=VM et pour

1v

= 0, nous avons [S] = KM


Avec l'équation de la droite de régression linéaire, nous trouvons :

V =1

410= 2,5 10 MsM 6

-7 -1 = 0,25 µM s-1

et 0 = 80-1

K + 410

M

6, d'où K = 2 10 MM-5 = 20 µM

Enoncé 6

La purification d'un enzyme à partir d'un extrait brut d'activité enzymatique 10000 U.E. pour

25 g de protéines totales, est conduite en deux étapes :

1) une chromatographie de tamisage moléculaire dont les fractions de 5ml ont les

caractéristiques suivantes : n° fraction, activité enzymatique par ml de la fraction,

concentration en protéines de la fraction (mg/ml)

fraction n° 1 2 3 4 5 6 7

U.E./ml 4 37 328 1256 216 280 250

mg/ml 420 540 480 570 420 280 250

2) les fractions 3,4 et 5 sont rassemblées et sont soumises à une chromatographie échangeuse

d'ions dont les fractions de 5ml ont les caractéristiques suivantes

fraction n° 1 2 3 4 5 6

U.E./ml 1 3 8 1320 12 3

Seule la fraction n° 4 est conservée : sa densité optique à 280 nm, mesurée dans une cuve de

chemin optique de 1cm, est de 0,740. Le coefficient d'extinction molaire de la protéine de

masse molaire 70000 est εM280 -1 -1=115 (M cm ). On supposera que la fraction 4 est pure.

- Déterminer le rendement global de la purification et le rendement pour chaque étape ainsi

que le facteur (ou taux) de purification global et pour chaque étape.

- le facteur de rendement est le rapport de l'activité de l'échantillon recueilli à la sortie de

la colonne à l'activité chargée sur la colonne, exprimé en %

- le facteur de purification est le rapport de l'activité spécifique de l'échantillon recueilli à

la sortie de la colonne à l'activité spécifique chargée sur la colonne


Concentration de la fraction 4 : 0,740115

= 6,4 10 M -3 , ou encore 0,450g/ml, ce qui donne pour

5ml une quantité d'enzyme de 2,25 g

Protéine (g) U.E. Rendement A.S Facteur purif.

Extrait 25 10000 400

Chromato 1 7,35 9000 90 1224 3,06

Chromato 2 2,25 6600 73,3 2933 2,39

Le rendement global (extrait -> fraction 4 de la deuxième chromatographie) est de 66 % et

le facteur de purification global est de 7,33.

Enoncé 7

Une préparation enzymatique pure de 10 ml à une concentration de 0,1mg/ml hydrolyse en

10 minutes 0,712g d'un substrat de masse molaire 342. L'enzyme a une masse molaire de

135000 :

- l'expérience a été faite à une concentration de substrat grande devant la concentration de

l'enzyme et grande devant la constante de Michaëlis, pouvez-vous calculer la constante

catalytique ou "turn over" de l'enzyme pour ce substrat ?

L'activité de l'enzyme est : 0,712342

110

exprimée en (moles de substrat hydrolysé / min), son

activité spécifique est : 0,712342

x1

10 1 /

10135000

-3

exprimée en (moles de substrat hydrolysé

/ min, par mole d'enzyme) donc en (min-1). Lorsque l'expérience est conduite dans desconditions où [S] >> [E] et [S] >> K0 0 0 M , cette activité spécifique (molaire) de l'enzyme est

aussi la constante catalytique :

k = 2,81 10 (min ) = 468 (s )cat4 -1 -1

Enoncé 8

L'étude d'un enzyme vis à vis d'un de ses substrats, à température donnée, pH constant, etc..

donne les résultats suivant pour la vitesse initiale en fonction de la concentration initiale du

substrat, toujours très grande devant la concentration de l'enzyme :

[S]0 (M) 4 10-6 6 10-6 8 10-6 1 10-5 2 10-5 1 10-4

v (mM/min) 15 44 85 125 222 250

- Pouvez-vous calculer les constantes cinétiques de cet enzyme pour ce substrat ?


Traçons une représentation de Lineweaver-Burk 1v

= f 1

[S]0

(on notera [S] à la place de

[S]0 )

1/[S] (1/M) 2,5 105 1,66 105 1,25 105 1 105 5 105 1 104

1/v

(min/µM)

0,066 0,023 0,012 0,008 0,0045 0,004

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,E+00 5,E+04 1,E+05 2,E+05 2,E+05 3,E+05 3,E+05

1 / [S]

1 / v

(min / µM)

(1/M)

Le graphe de Lineweaver-Burk n'est pas une droite, le mécanisme de l'enzyme n'est pas un

schéma réactionnel de type Michaëlien. Les constantes cinétiques ne peuvent être

déterminées dans le cadre du modèle de Michaëlis-Menten.

Regardons ce que donne une représentation Ln(v) = f(Ln([S]) :


Nous avons bien une cinétique d'ordre zéro pour les hautes concentrations de substrat, mais

nous remarquons que pour les faibles concentrations de substrat nous avons une cinétique

d'ordre moyen 2,3, (4 points dans l'intervalle de concentration [10 ...10-6 -5M] ce qui nous

indique que nous nous ne sommes pas dans le cas d'un modèle Michaëlien. Dans ce dernier

cas, l'ordre pour les faibles concentrations ne dépasse pas la valeur de 1. Comparez la courbe

avec celle de l'énoncé 2.

Vous verrez dans la 3ème année de Licence de tels exemples et comment ceux-ci sont

modélisés.

Enoncé 9

Cet exercice est une anticipation sur les cours de la troisième année de Licence …

Soit le schéma réactionnel suivant où nous avons une compétition entre un substrat et un

inhibiteur pour la fixation à un enzyme:


E + S ES E + P k 1

k -1

k 2+I

EI

K I

- Trouver une relation similaire à celle de Briigs-Haldane en posant les hypothèses ad hoc

pour simplifier le système d'équations à résoudre.

Faisons les mêmes hypothèses que dans le modèle de Briggs-Haldane :

1) les mesures de cinétique seront toujours faites pour des concentrations de produit très

faible : c'est la mesure de la vitesse initiale ( vi)

2) la concentration totale du substrat [S]0est grande (>>) devant celle de l'enzyme [E]0 idem

pour celle de l'inhibiteur [I]0>> [E]0

3) le système réactionnel est dans un état stationnaire

Le système d'équations s'écrit :

(a) v = k [ES]

(b) 0 = d[ES]

dt = k [E][S] - (k +k )[ES]

(c) [S] = [S] + [ES] + [P]

(d) [E] = [E] + [ES] + [EI]

(e) [I] = [I] + [EI]

(f) K = [E][I][EI]

constante de dissociation

2

1 -1 2

0

0

0

I

calculons [E] à l'aide de l'équation (d) où [EI] a été remplacé à l'aide de l'équation (f)

[E] = [E] + [ES] + [E][I]K0

I ou encore [E] = [E] - [ES]

KK +[I]0

I

I( )

d'où en remplaçant dans (b) et en utilisant les hypothèses (1) et (2) :

k [E] [S]K

K +[I] = k [S]

KK +[I]

+ k +k

k [ES]1 0 0

I

I 01 0

I

I 0

-1 2

1

d'où en posant K =k +k

kM-1 2

1 , on obtient [ES] =

[E] [S]

K 1+[I]K

+ [S]

0 0

M0

I0

, et en remplaçant

[ES] dans l'équation (a) :


v =k [E] [S]

K 1+[I]K

+ [S]

2 0 0

M0

I0

, si [S] , v k [E] = k [E] = V0 2 0 cat 0 M→ ∞ → , et en posant :

K = K 1+[I]KMapp M

0

I

, constante apparente de Michaëlis en présence d'un inhibiteur de

concentration [I]0, on obtient une équation analogue à celle de Briggs-Haldane :

v =V [S]

K + [S]M 0

Mapp 0

Pour une concentration d'inhibiteur définie, la vitesse initiale en fonction de la concentration

initiale de substrat suit une cinétique Michaëlienne (les autres paramètres étant constant).

v = V [S]

K + [S]

1v

=K + [S]

V [S]

1v

=K

V1

[S] +

1V

M 0

Mapp 0

Mapp 0

M 0

Mapp

M 0 M⇒ ⇒

Dans une représentation de Lineweaver-Burk, nous obtenons un faisceau de droites

concourantes au point v= VM , chacune pour une concentration fixe d'inhibiteur. Chacune de

ces droites coupe l'axe des 1/[S]0au point 1/KMapp = 1

1+[I]K

1

K0

I

M

Mapp-1 / K

1 / VM

1 / v

1 / [S]0

[I] 0,3 [I]0,2 [I] 0,1

Ce modèle est le modèle d'inhibition compétitive, vous verrez d'autres type de compétition,

ainsi que d'autres représentations graphiques


Annexe : régression linéaire avec le logiciel Excel

Prenons l'exemple du problème 1 : Ln R

R= f(t)

0

1) Saisissez vos résultats dans deux colonnes dont la première ligne , t dans la colonne A et

Ln R

R0

dans la colonne B. Vous avez pu bien sûr obtenir Ln

RR0

à l'aide d'un calcul dans

Excel.

2) Sélectionnez les deux colonnes et utilisez l'assistant graphique

3) L'assistant graphique vous propose dans une fenêtre deux onglets :

- Types standard – Types personnalisés : choisissez dans les types standard Nuages de

points

- Cliquez sur le bouton Fin, le nuage de points apparaît dans une fenêtre

4) En cliquant sur un des points du graphe avec le bouton droit de la souris, un menu

contextuel apparaît, sélectionnez l'item Ajouter une courbe de tendance

(vous pouvez aller aussi dans le menu Graphique lorsque le nuage de points est au premier

plan et sélectionner l'item Ajouter une courbe de tendance)

5) Une fenêtre s'ouvre avec :

- Onglet Type : choisir Linéaire

- Onglet Options : cochez les deux boutons

- Afficher l'équation sur le graphique

- Afficher le coefficient de détermination sur le graphique

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