BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 239

R E S T A U R A T I O N DE LA SYNTHt~SE D ' E N Z Y M E S APRlkS

I N H I B I T I O N PAR L ' A Z A G U A N I N E

H. C H A N T R E N N E ET S. D E V R E U X

Laboratoire de Chimie biologique, Facultd des Sciences, Universitd de Bruxelles (Belgique)

(Re~u le 23 Novembre , 1959)

S U M M A R Y

Restoration of enzyme synthesis after inhibition by a~aguanine

Azaguanine inhibits protein synthesis almost completely. The inhibition can be released by guanosine.

The later guanosine is added, the more imperfect becomes the restoration of protein synthesis.

The damages caused by azaguanine affect more severely the formation of certain enzymes than that of others.

I t is concluded that azaguanine interferes with the activity of substances which are involved in the control of specificity in protein synthesis.

INTRODUCTION

La 8-azaguanine inhibe fortement toute synth~se de prot6ines chez Bacillus cereus1-! La guanosine peut lever l'inhibition si elle est ajout6e assez t6t apr~s l'analogue. Nous avons not6 bri~vement ailleursS, e que la synth~se de la p6nicillinase se r6tablit beaucoup plus tardivement que celle de l'ensemble des substances prot6iques.

On trouvera ci-dessous des donn6es nouvelles sur le comportement de deux enzymes, la p6nicillinase et la catalase, lorsque la synth~se des prot6ines se r6tablit sous Faction de la guanosine chez des bact6ries intoxiqu6es par la 8-azaguanine.

MATI~RIEL ET MI~THODES

Bact~rie

Bacillus cereus: Souche produisant la p6nicillinase comme enzyme constitutif. Ce mutant fut isol6 d'une souche de B. cereus NCTC 569 selon KOGUT et al. 7.

Dosage de la p~nicillinase

Adaptation de la m6thode de PERRET 8. La synth~se de l 'enzyme 6tait arr6t6e par addition de o.I ml d'une solution alcoolique o.oi M de 8-hydroxyquinol6ine I ml de suspension bact6rienne. Un volume convenable (50 ou IOO/zl) de la suspension 6tait m61ang6 k 5 ml d'une solution de p6nicilline dans un tampon de phosphate

pH 6. 5 maintenu en thermostat ~ 3 o°. Des 6chantillons 6taient pr61ev6s au cours du temps et m61ang6s ~ 2 ml de la solution d'iode. L'exc~s d'iode 6tait titr6 IO min

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plus tard ~ l'aide de thiosulfate. Sous cette forme, la m6thode est tr~s pr6cise; la r~action ob~it ~ une cin6tique d'ordre z~ro. Unit~ d'activit6 calcul~e selon PERREa 8.

Dosage de la catalase

Des prises de 2 ml de suspension bact6rienne 6taient refroidies dans un bain de glace, centrifug6es £ froid, et le milieu 6tait rejet6. Les bact6ries 6talent ensuite lav6es plusieurs fois puis remises en suspension dans 2 ml de tampon de phosphate 0.02 M pH 7.0 et expos6es pendant 60 sec aux ultrasons dans un bain de glace (appareil MSE-Mullard, 20 kc). Des essais syst6matiques avaient montr6 que la catalase est compl~tement accessible ~t son substrat apr~s un tel traitement. L'activit6 des suspensions 6tait ensuite d6termin6e selon YON EULER ET JOSEPHSON 9. Les chiffres indiqu6s repr6sentent les valeurs de la constante de vitesse de la r6action

k : I/train loglo ao/at

obtenues quand I ml de suspension 6tait m61ang6 h 20 ml d'une solution 7" 1°-4 M de H~O~ dans un tampon de phosphate IO -~ M, pH 7.0 maintenu dans un bain de glace fondante.

Autres techniques et conditions exp~rimentales: Voir publications ant6rieures 3, 4

R]~SULTATS EXPI~RIMENTAUX

R~tablissement de la synth~se des prot~ines et des enzymes

Si de l'azaguanine est ajout6e ~t raison de 36 Fg/ml ~t une suspension de B. cereus (0.3 mg/ml) en croissance exponentielle, il faut environ IO min pour que l'inhibition

E

E

750

500

250

[14C] PHF..NYLALAN!IN E ~ o ioc

/i///,o<

PENICILLINASE

l °

o ~ 30

/

0 60 Q 3oo mi. 6 6o ' ' 30o mio

Fig. I. Restauration de la synth~se de pdnicillinase et de celle des prot6ines. Une suspension de B. cereus en croissance exponentielle dans un hydrolysat de cas~ine (2o mg/ml) contenant 0.o8 #lC de L-~ilC]ph~nylalanine/ml est divis6e en cinq parties ~gales et agit6e en thermostat ~ 3 o°. De l'azaguanine est ajout6e (36/ig/ml) ~l chaque fiole au temps o. On ajoute de la guanosine (I 35/~g/ml) aux diff6rentes suspensions bact6riennes, respectivement o, 3o, 45 et 60 min plus tard. La derni~re ne re~oit pas de guanosine.

a. IlC incorpor6 dans les prot6ines (coups/min/ml suspension). b, P6niciIlinase constitutive (unit6s/ml).

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AZAGUANINE ET SYNTHI~SE D'ENZYMES 241

de la synth~se des prot6ines s'exprime pleinement, dans les conditions de nos exp6- riences ~-4. Tout effet de l'inhibiteur peut ~tre emp6ch6 par l'addition simultan6e de guanosine (135/~g/ml).

La Fig. Ia montre comment se r6tablit la synth6se des substances prot6iques lorsqu'on ajoute la guanosine 30, 45 ou 6o rain apr~s l'azaguanine.

I1 est clair que la formation de prot6ines reprend rapidement une allure ~ peu prbs normale si on ajoute la guanosine jusqu'k 30 rain aprbs l'inhibiteur. Mais si la guanosine est ajout6e plus tard, la synth6se de substances prot6iques se r6tablit d 'autant plus lentement que le nucl6oside normal est ajout6 plus tard.

Dans cette exp6rience, la synth6se de substances prot6iques a 6t6 mesur6e par la quantit6 de L-ph6nylalanine incorpor6e dans le pr6cipit6 trichlorac6tique 4. Des r6sultats tout k fait semblables ont 6t6 obtenus en dosant les prot6ines selon LOWRY et al. 1°.

La Fig. Ib indique comment la synth~se de p6nicillinase constitutive s'est r6tablie dans la m~me exp6rience. On remarquera que lorsque la guanosine 6tait ajout6e 45 ou 6o rain apr6s l'azaguanine, la synth6se de la p6nicillinase n'avait gu6re repris k un moment off la synthbse de substances prot6iques s'6tait bien r6tablie et se pour- suivait d6jk presqu'k la vitesse normale. Le dommage caus6 par l'azaguanine k la synthbse de la p6nieillinase est donc plus s6v~re et plus difficile k r6parer que le dommage caus6 k la synth6se des substances prot6iques en g6n6ral, et il s'accentue rapidement quand l'action de l'azaguanine se prolonge.

Tousles enzymes ne se comportent cependant pas comme la pdnicillinase. Dans l'exp6rience dont les r6sultats sont rassembl6s dans la Fig. 2, nous avons 6tudi6

c ~ :

u_

~,~ ~oo'

1000"

500"

0

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o o o 0/// • 250 / //

# J..-" j ,

go ,~o ;~o 2~o z6o z6o m,o

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8 30

20

Fig. 2, Res taura t ion de la synth~se de pdnicillinase, de catalase e t des substances prot6iques. Une suspension de B. cereus en croissance exponentiel le dans un milieu con tenan t de l ' hydro lysa t de cas6ine (2o mg/ml) et o.o8 pC de L-[14C]ph~nylalanine/ml, est par tag6e en deux volumes ~gaux et agit6e en t he rmos t a t A 3 o°. A l 'une des suspensions bactdriennes, qui ser t de tdmoin (points blancs) on a joute 36 #g d 'azaguanine e t 135 Pg de guanosine s imut tandment au t e m p s o. A l ' au t re (points noirs) on a joute l 'azaguanine au t e m p s o e t la guanosine 45 rain plus tard. O, O , 14C

ineorpor6 darts les prot6ines ; &, Ak, P6nicillinase fortune ; V, ~r, Catalase form6e.

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simultan@ment le r6tablissement de la synth~se de la catalase, de la p6nicillinase, et des prot6ines en g@n@ral (incorporation de L-[l¢C]ph@nylalanine) dans une mSme suspension de B. cereus. La guanosine fut ajout@e 45 rain apr~s l'azaguanine. Les @chelles d'ordonn@es ont @t@ ajust@es de fa~on k faire coincider au mieux les courbes correspondant au t@moin.

Comme dans l'exp@rience pr@c@dente, la synth@se de p@niciUinase s'est r@tablie plus tardivement et plus p@niblement que celle des substances prot6iques en g6n@ral. La synth~se de la catalase, au contraire, a repris presqu'en m6me temps que l'incor- poration de la ph@nylalanine. La Fig. 3 donne d'ailleurs une autre repr6sentation des m~mes r6sultats: l'accroissement des enzymes y est exprim@ en fonction de l'augmen-

30"

5 6 o ,o& ' ' 1500 [w'C] P.heny oon ne irnp/mln

Fig. 3. Taux diff6rentie] de synth@se. Autre expression des r@sultats de l 'exp6rience de la Fig. 2. La quantit@ de p@nieillinase ou de catalase produite est exprim@e en fonction de la quantit@ de I4C incorpor6 pendant le re@me temps. Points blancs, (t@moin) azaguanine et guanosine ajout@es s imultan6ment; points noirs, guanosine ajout@e 45 min apr@s l 'azaguanine. &, • : P@nicillinase.

V, • : Catalase.

tation des substances prot@iques ('4C de L-ph@nylalanine incorpor@). On voit bien que la synth@se de p@nicillinase reste bloqu6e pendant que des quantit6s tr@s consid6rables de prot6ines se forment. Au contraire, la production de catalase reprend tr~s peu de temps apr~s l'incorporation de ph6nylalanine, et le taux diff6rentiel de synth~se de cet enzyme est alors nettement plus @lev@ que dans le t6moin.

Expulsion de l' azaguanine des acides ribonucl~iques

Les travaux de LATSNITZKI, I~{ATTHEWS ET SMITH l l - la , MANDEL 14 e t MARKHAM 15

ont 6tabli que les purines normales ou leurs d6riv@s provoquent rexpulsion de l'aza- guanine pr6alablement incorpor@e dans I'ARN.

La Fig. 4 montre qu'en effet une grande pattie de l'azaguanine est expuls@e assez rapidement lorsqu'on ajoute de la guanosine. Mais il semble bien qu'une fraction tr~s notable de l'azaguanine soit fix@e irr@versiblement, ou qu'elle ne soit d@plac6e que tr@s lentement par la guanosine.

On notera que la quantit6 d'azaguanine fix@e, tant irr6versiblement que d'une

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fa~on moins d6finitive, est d 'autant plus grande qu'il s'6coule plus de temps entre l'addition de l'azaguanine et celle de la guanosine.

DISCUSSION

5

N ~ <._C

L'inhibition g6n6rale de la synth~se des prot6ines par l'azaguanine s'exprime com- pl~tement en io min I, 4. L'azaguanine se substitue donc probablement k la guanine dans un m6tabolite qui se renouvelle rapidementL ~ et dont la synth~se des prot6ines d6pend. Le r6tablissement rapide et complet des syntheses prot6iques par la guanosine lorsque celle-ci est ajout6e peu de temps apr~s l'analogue confirme cette mani~re de

1000

b00

60 120 180 240 300 3~0 m]n

AZAGUANINE ET SYNTH]~SE D'ENZYMES 243

Fig. 4. Expulsion de l 'azaguanine des acides nucMiques en pr6sence de guanosine. Une suspension de B. cereus en croissance exponentielle est partag6e en quatre parties dgales dans des fioles qui sont agit6es en thermosta t ~ 3 o°. Au temps o, de la 8-[2-14C]azaguanine (4/zC/mg) est ajout6e raison de 36 #g/ml ~ chaque fiole. La premibre fiole ne recevra aucune autre addition (points blancs). Aux autres, on ajoute 135/*g de guanosine respectivement 15, 3 ° et 6o min apr~s l 'azaguanine. Les points exp6rimentaux indiquent la quanti t6 totale de [14C]azaguanine contenue dans les

acides nucl6iques d 'un ml de suspension.

volt. La premiere substance importante affect6e par l'azaguanine pourrait ~tre par exemple l'acide guanosinetriphosphorique 14 ou bien un ARN ~ grande activit6 m6ta- bolique 1, 4.

Nos r6sultats indiquent qu'~ c6t~ de cette premiere action inhibitrice qui atteint la synth~se de toutes les prot6ines, des 16sions plus profondes et plus lentes k gu6rir apparaissent lorsque l'action de l'azaguanine se prolonge; ces 16sions secondaires n'affectent pas uniform6ment la synth~se de toutes les prot6ines. I1 faut en conclure que l'incorporation prolong6e, ou abondante, d'azaguanine d6t6riore certaines sub- stances dont la sp6cificit6 des syntheses d6pend.

I1 est raisonnable de penser que ces substances sont des acides ribonucl6iques. L'accumulation progressive d'une fraction d'ARN dont l'azaguanine ne peut plus ~tre expuls6e par la guanosine (Fig. 4) pourrait 6tre en relation avec l'irr6versibilit6 croissante des dommages caus6s par l'azaguanine. I1 faut noter toutefois que de tr~s faibles quantit6s d'azaguanine s'incorporent dans les acides d6soxyribonucl6iques,

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et qu'on ne peut donc pas exclure 5. prfsent que les 16sions secondaires se trouvent au niveau de ceux-ci.

n y a plusieurs ann6es, CREASER 16, 17 avait observ6 que l 'azaguanine inhibe la synth~se induite de fl-galactosidase chez un Staphylocoque sans inhiber la formation d'un syst~me d'enzymes constitutifs, la glucozymase, ni celle de catalase constitutive. Ces r6sultats avaient fait croire que la synth~se induite d 'enzymes serait sensible 5. l 'azaguanine tandis que la formation des enzymes constitutifs ne le serait pas. Cette interpr6tation doit 6tre abandonn~e. En effet, la p6nicillinase induite dans la souche de B. cereus NCTC 56 9 se comporte exactement comme la p6nicillinase constitutive du mutant qui en d6rive et avec lequel ont 6t6 effectu6es toutes les exp6riences dont les r6sultats sont rapport~s ci-dessus. Par contre, la synth~se de la pfnicillinase con- stitutive est beaucoup plus profond6ment affect6e que celle d'un autre enzyme, la catalase. L'effet diff6rentiel que nous observons ne tient donc pas au caract6re adap- tatif ou constitutif des enzymes mais bien plut6t 5, certaines particularit~s des protfiines elles-mSmes ou des syst~mes qui r6gissent sp~cifiquement leur formation.

Les observations de CREASER 16, 17 montraient d'ailleurs tr~s bien que chez S. aureus

l 'azaguanine peut inhiber s6lectivement la synth~se de certains enzymes sans affecter la synth~se des autres. HEYES 18 a de mSme observ6 que l 'analogue inhibe partielle- ment la synth~se des prot6ines dans des racines de pois, et que le degr6 d'inhibition n'est pas le mSme pour les quatre enzymes 6tudi6s.

Chez B. cereus, on ne distingue gu~re d'effet diff6rentiel de l 'azaguanine au moment off l'inhibition s'fitablit: celle-ci est d'embl6e tr~s forte et elle atteint la synth~se de toutes les prot6ines. Toutefois nous avions d6jk remarqu6 4 que la synth~se de la p6ni- cillinase peut ~tre supprimfe compl~tement dans des conditions oft l'inhibition de l 'incorporation de ph6nylalanine dans les substances prot~,iques n'est pas totale. Mais c'est au cours de la restauration des syntheses qu'on distingue le plus net tement des diff6rences entre les enzymes (voir aussi CREASER17).

La raison pour laquelle certains enzymes sont plus profondfment atteints que d'autres n'est pas fividente. I1 est possible que les centres organisateurs de certaines prot6ines soient endommag6s plus rapidement ou plus s~v~rement que d'autres. On peut penser aussi que toutes les prot6ines form6es pendant la phase de restauration sont anormales, mais que l 'anomalie commune peut ~tre ou non fatale 5. l 'activit6 enzymatique, selon qu'elle affecte une partie essentielle de l 'enzyme ou une r6gion moins importante. Deux analogues de l'uracile, la 2-thiouracile 19 et la 5-fluorouracile 2° produisent des effets de cette sorte chez E. coli. C'est peut-6tre en d6r6glant le m6ca- nisme de s61ection des acides amin6s que ces analogues, ainsi que l'azaguanine, perturbent la synth~se des enzymes 2°, 21

On remarquera enfin (Fig. 3) que le taux difffrentiel de synth~se de la catalase est plus 61ev6 pendant la phase de restauration que pendant la croissance normale. A moins que la formation de catalase ne soit stimulfe spfcifiquement ou que l 'enzyme form6 ne soit plus actif que la catalase normale, cela indique que la synth~se de l'ensemble des substances protfiques - - qu'elles soient parfaites ou non - - n'est pas encore r~tablie au moment oh la formation de catalase est pleinement restaur6e.

La synth~se des prot6ines ne se r6tablit donc pas en bloc sous l 'action de la guanosine. La restauration est progressive et les syntheses restent d6r~gl6es pendant plusieurs heures. L'assortiment des prot6ines form6es pendant cette p6riode est anormal; les prot6ines le sont peut-~tre aussi.

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BIBLIOGRAPHIE

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Biochim. Biophys. Ada. 47 (1960) 239-245

SPECTROPHOTOMETRICAL INVESTIGATIONS ON ENZYME SYSTEMS

IN LIVING OBJECTS

V. SPECTRAL TRANSMISSION OF YEAST SUSPENSIONS

H. LUNDEGARDH

Pendngby (Sweden)

(Received November 13th, 1959)

SUMMARY

Quantitative determination of enzymes in living material postulates a reliable re- production of the shape of spectral bands and of a linear relation between extinction and number of molecules per unit volume. These conditions are approximately fulfilled at a medium density of a yeast suspension. Considerable deviations from linearity are observed at high densities, and to some extent also in very diluted suspensions. It is claimed that these deviations are in the former case caused by a partial total shading of the ingoing light and in the latter case by a rising percentage of light which does not pass through the interior of the cells. The bearing of these phenomen a on the apparent “flattening” of spectra of living material is discussed. The pronounced effect of salts is referred to their influence on the respiration and hence on the quantity of light absorbing material.

Biochim. Biophys. Acta, 41 (1960) 245-251