Revue de processus Juin 2016

Service Imagerie et service de microscopie électronique

Plan

• Bilan horaire d’exploitation • Evolutions équipements / achats sytèmes • Contrôle qualité fluorophores • Systèmes récents, rappels • CAO • OMERO • Formations • Résultats enquête satisfaction

Nbr. d’heures de réservation par système

STED: 350h 7MP: 147h 510NLO: 109h LSM 780: 1293h Spinning Disk: 958h 510 META: 524h Apo Z1: 784h Apo M2: 682 ObserverZ1 Apo2: 204h Colibri: 510h Axioplan 2 Imaging: 198h

Evolution des équipements Sur la station AxioObserverZ1 Colobri en salle 6031

• (juillet 2016) Upgrade Logiciel Zen 2 / PC

• (septembre 2016) Definit Focus2 : optimisation du maintien de focus -Module placé sous la tourelle des objectifs, utilise une diode IR pour détecter la distance objectif-fond du support. -Vitesse de repositionnement 50ms. -Double stratégie Focus avec l’Autofocus (sur l’échantillon) -2 Objectifs : 10x/0,3 Plan Neofluar et 63x/1,4 Oil Dic Plan Apochromat.

Nouvel équipement sur plateforme

• Resultats du sondage pour achat confocal https://fr.surveymonkey.com/results/SM-3YSZNYZS/

• Appel à échantillons pour le 18/07 tests sur équipement Zeiss

• Transfert PALM équipe Pierre François Lenne sur plateforme

• Kit transparisation sur Light sheet , objectif 5 x et cuves pour 5 x et 20 x

https://fr.surveymonkey.com/results/SM-3YSZNYZS/https://fr.surveymonkey.com/results/SM-3YSZNYZS/https://fr.surveymonkey.com/results/SM-3YSZNYZS/

Contrôle qualité Fluorophores

milieux de montage utilisés

temps de conservation des échantillons

Pré-contrôle des échantillons

Stat sur les incidents qui ont lieu sur les anticorps secondaires couplés

Cross

Réception lots mesure spectrale et

intensité nominale de fluorescence

• Contrôle en amont

Enregistrement des vérifications dans BD

fluorophores

• Données consultables

Chaque lame a une traçabilité du lot

utilisé , cycle de vie de la lame et du

fluorophore

• Liaison avec OMERO

Traçabilité des lots de fluorophores

Super-résolution et imagerie par feuillet de lumière

• STED leica SP8 • PALM , équipe Lenne • Light Sheet Zeiss Z1

Super-Resolution at the IBDM : STED

P. Mangeol, human small intestin, Alexa 538

• Spatial depletion of the emitted fluorescence with stimulated emission Resolution up to 50 nm from 200 nm

• Depletion lasers : 592 and 660 nm

• 3D STED : 50 nm in xy or 100 nm in xy and z

• Only a small fraction of marker visible at a given time: • Organics dyes with buffer control (dSTORM)

OR

• Photo-activatable protein (PALM)

• 3D localization with cylindrical lens

• Molecule clustering and counting, single particle tracking

Super-Resolution at the IBDM : PALM / dSTORM

Truong et al, 2013

• Single molecule localization with uncertainty up to 20 nm

𝜎 ≈𝑠

𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑠≈ 30 𝑝𝑛

E-cadherin – esoFP, drosophilia noctum

Light-Sheet Z1 pipeline Sample

preration

Image acquisition

Data transfert

Image reconstruction

Image visualisation

Le faire à façon, un atout de la plateforme

• Impression 3 D • Portique CNC • Quelques exemples de réalisation

10 mm

24°

12°

Etoiles démoulées

Pièce imprimée

Imprimante 3D Fichier CAO

Durbec Lecuit

Prud’homme

Le Bivic

IMPRESSION 3D

Lamelle 20 x 20 x 0,16

Filament

Boite de Pétri Ø35

Prud’homme

Le Bivic

USINAGE 3D

Lenne, DSLM

Base de données Omero • Bilan depuis son lancement • Upgrade en version 5.2. 2 , client à upgrader • La base de donnée est interrogeable par ImageJ et FIJI • Formation Omero intégrée lors de la formation sur

microscope • Incitation à utiliser OMERO • Si utilisation par accès externe à IBDM, Client Web à

mettre en place • Toute la métrologie est accessible sur Omero • Contrôle qualité des lots de fluorophores accessible sur

Omero en lien avec l’image qui utilise le marqueur

Formations de la plateforme

• Super résolution (PALM/STED) 2016 • Feuille de lumière ( Rémy/Claire Chardes) 2016 • ImageJ/FIJI • Omero • CAO / Impression 3 D 2016 • Video-microscopie/ apotome/ Confocal… • Encadrement 2 Master 1 informatique et 1 IUT

mesure physique

Résultat sondage satisfaction plateforme

• https://fr.surveymonkey.com/results/SM-WDRG88JT/

https://fr.surveymonkey.com/results/SM-WDRG88JT/https://fr.surveymonkey.com/results/SM-WDRG88JT/

Hygiène et sécurité

Essuyer les objectifs

Jeter les papiers DANS la poubelle

Fermer les flacons d’huile

Electron Microscopy Service

- By training : We train you to use the machine you need and we give you the expertise we

had in EM to succeed. - By project : We make all the sample preparation and we help you to take the picture you

need. You can decide to be train at each step in order to perform by yourself the experiment. - By collaboration : We make all the project and give you picture / interpretation of the picture

etc.

How the Electron microscopy service work ?

First of all : By a meeting to understand your scientific question

After this meeting, we define a list of one or more experiment to go

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

Park B et al J. neuroscience 2011

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

Localize a protein of interest

Rival et al Embo Rep 2011

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

View the morphology of bacteria / virus / macromolecule

Localize a protein of interest

With the courtesy of Fuduche Maxime

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

View 3 D view of a sample ( Z is very thin around 200 nm)

View the morphology of bacteria / virus / macromolecule

Localize a protein of interest

With the courtesy of Rival Thomas

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

View 3 D view of a sample ( Z is very thin around 200 nm)

View the morphology of bacteria / virus / macromolecule

Localize a protein of interest

Realize correlative experiment

With the courtesy of Brezun

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

View 3 D view of a sample ( Z is very thin around 200 nm)

View the morphology of bacteria / virus / macromolecule

Localize a protein of interest

Realize correlative experiment

Surface morphology with MEB With the courtesy of JP Chauvin

In what we can help ? Determine the morphology of a sample in cellular / subcellular term

View 3 D view of a sample ( Z is very thin around 200 nm)

View the morphology of bacteria / virus / macromolecule

Localize a protein of interest

Realize correlative experiment

Surface morphology with MEB

How electron microscopy is difficult ? Time Morphology 4 days Immunolocalization 7 days Negative staining 30 min for each sample Electron tomography 4 days for sample + 2 days for acquisition + 1 weeks for segmentation Correlative microscopy 2 weeks to 3 years project

Do not hesitate to be train and learn new skills : All can be learn in less than 1 month except correlative microscopy

In case we can develop new technics

To do that, we have equipements Microscopes Cryo preparation Sectionning

An overview of electron microscopy service

In 2015 40 projects In 2016 : in 6 months 18 projects

In 2015 : 21 IBDM projects 19 Other insitute projects In 2016 : 8 IBDM projects 10 Other insitute projects MET Tecnai G2 MET morgagni MEB Leica S 440 U

3 hours for a reservation 575 Hours on a year

3 hours for a reservation 389 Hours on a year

3 hours for a reservation 15 Hours on a year

3 hours for a reservation 433 Hours on a year On the 2 ultramicrotomes

New technics for new answers

We try to develop new technics to answer new scientific questions as : Correlative microscopy on biopsy

Kerreman et al J Cell sci 2016

New technics for new answers

We try to develop new technics to answer new scientific questions as : Correlative microscopy on biopsy Cryomicroscopy

Rouillet JCB 2008

New technics for new answers

We try to develop new technics to answer new scientific questions as : Correlative microscopy on biopsy Cryomicroscopy Serial Block Face With new microscope coming end of 2016

Gatan website

New technics for new answers

We try to develop new technics to answer new scientific questions as : Correlative microscopy on biopsy Cryomicroscopy Serial Block Face With new microscope coming end of 2016

Revue de processus Juin 2016PlanDiapositive numéro 3Evolution des équipementsNouvel équipement sur plateformeContrôle qualité FluorophoresDiapositive numéro 7Diapositive numéro 8Super-résolution et imagerie par feuillet de lumièreDiapositive numéro 10Diapositive numéro 11Light-Sheet Z1 pipelineLe faire à façon, un atout de la plateforme Diapositive numéro 14Diapositive numéro 15Base de données OmeroFormations �de la plateformeRésultat sondage �satisfaction plateforme Hygiène et sécurité Diapositive numéro 21Diapositive numéro 22Diapositive numéro 23Diapositive numéro 24Diapositive numéro 25Diapositive numéro 26Diapositive numéro 27Diapositive numéro 28Diapositive numéro 29Diapositive numéro 30Diapositive numéro 31Diapositive numéro 32Diapositive numéro 33Diapositive numéro 34Diapositive numéro 35