Rôle de la PTOX dans la tolérance au stress lumineux chez ... · PDF filela membrane du thylakoïde, en interaction avec la chaine de transport photosynthétique (circulation des

Rapport de stage 1ère année de Master Environnement

Spécialité Ecologie, Biodiversité, Evolution (EBE)

Valérie GUITTET

Soutenance : 7-8 juin 2010

Rôle de la PTOX dans la tolérance au stress lumineux

chez les plantes alpines

Etude d’écotypes alpins chez Arabidopsis thaliana

Laboratoire Ecologie Systématique Evolution (Université Paris-XI)

Ecophysiologie Végétale

Durée du stage : 15 février - 28 mars 2010 Responsable de stage : Peter Streb

Année universitaire : 2009-2010

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Sommaire

Remerciements p3 Introduction p4 I. Matériels et méthodes p6 1.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne p6

1.1. a. Description de la technique de mesure de la fluorescence et des paramètres associés

1.1. b. Description du matériel utilisé

1.1. c. Description du protocole expérimental

1.2. Calcul de l’ETR (electron transport rate) p13 1.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot p13 II. Résultats p15 2.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne : calculs des qP et NPQ p15

2.1. a. Quenching photochimique qP

2.1. b. Quenching non-photochimique NPQ

2.2. Calcul de l’ETR (electron transport rate) p19 2.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot p21 III. Discussion p22 Conclusion p29 Bibliographie p30 Annexes p32 Abstract / Résumé p36

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Remerciements

Je remercie tout d’abord mon responsable de stage Mr Peter Streb, pour m’avoir intégré à son

équipe, pour toute l’aide et le temps qu’il m’a consacré au cours du stage.

Je remercie également Constance Laureau, thésarde à l’ESE, pour toutes les réponses qu’elle m’a

apportée et sans qui je n’aurai pu réaliser les Western Blots.

Enfin je remercie toutes les personnes qui ont pu contribuer de près ou de loin au bon déroulement

de ce stage.

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Introduction

Que se soit en conditions naturelles ou en culture, les plantes sont fréquemment exposées à

des conditions environnementales défavorables à l’origine d’un stress. Le stress est communément

défini comme un facteur environnemental ne permettant pas le développement optimal de la plante,

comme par exemple une forte lumière (stress abiotique). Les conditions environnementales

stressantes jouent un rôle majeur en déterminant comment le sol et le climat limitent la distribution

des espèces.

Les plantes alpines poussent à de hautes altitudes, elles sont ainsi exposées à des conditions

environnementales extrêmes, notamment de fortes intensités lumineuses et des températures

variables (faibles ou fortes). De plus, la saison de croissance des plantes herbacées alpines est très

courte (deux ou trois mois), elles ont donc besoin d’un système d’assimilation du carbone très

efficace (Streb et al, 1997 ; Streb et al, 2005). De nombreuses études ont montré que la

photosynthèse des plantes alpines était bien adaptée à ces conditions climatiques de haute altitude :

large optimum de température permettant l’assimilation efficace du carbone et maintien de la

photosynthèse sous de fortes radiations lumineuses.

Les plantes sont acclimatées à utiliser l’énergie absorbée si le flux quantique reçu est

similaire à celui de leur condition de croissance. A la lumière, selon le flux quantique absorbé, la

protéine D1 du photosystème II (PSII) est dégradée en permanence et resynthétisée à la même

vitesse. Si la lumière reçue est trop forte, c’est-à-dire si le flux quantique reçu excède la capacité

photosynthétique de la plante, l’inactivation peut excéder la réparation et la plante risque la

photoinhibition du PSII (diminution du rendement quantique induit par la lumière). L’exposition à

de fortes radiations lumineuses, associée à d’autres conditions de stress (une faible température par

exemple), induit la formation d’oxygène réactif (ROS : reactive oxygen species) à l’origine du

stress oxydant. L’oxygène réactif est formé en permanence dans les membranes, mais en grande

quantité, il peut être dangereux pour la plante. Les ROS sont généralement formés en conditions

réductrices (accumulation des électrons dans la chaine de transport), par réduction de O2 (transfert

d’un électron) en ion superoxyde O2-, à l’origine de destructions membranaires. De plus, O2

- peut

réagir (réaction de Haber Weiss) pour former des ions hydroxyles HO- très dangereux pour la plante

(destructions cellulaires). L’oxygène singulet (réaction de la chlorophylle avec l’oxygène) est

également très réactif. La production de ROS peut affecter la synthèse de protéines, et notamment la

protéine D1 du PSII. Une faible température associée au stress oxydant ralentit les réactions

enzymatiques et par conséquent le renouvellement de la protéine D1. Ainsi, les conditions

défavorables de haute altitude (forte lumière, faible température) peuvent induire la photoinhibition

du PSII chez des plantes non-acclimatées (Streb et al, 1997). De plus, une forte température peut

altérer la fluidité des membranes thylakoïdiennes et inhiber le transport d’électrons lors de la

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photosynthèse (Yordanov et al, 1986 ; Schreiber & Berry, 1977). Les plantes ont développé de

nombreux systèmes de protection leur permettant d’éliminer cet oxygène réactif ou d’empêcher sa

production. L’enzyme superoxyde dismutase (SOD), associée aux enzymes ascorbate peroxydase

(APX) et glutathion peroxydase (GPX), est impliquée dans la détoxification des ions superoxydes

O2- par production d’H2O dans les chloroplastes (système antioxydant) (Foyer et al, 1994). La

quantité d’antioxydants dans les plantes alpines augmente avec l’altitude (Wildi & Lütz, 1996). Le

cycle des xanthophylles permet de dissiper l’énergie en excès sous forme de chaleur (Demming-

Adam & Adam, 1993). La photorespiration peut consommer jusqu’à 30% des électrons résultant de

la réaction primaire de la photosynthèse. Elle permet ainsi d’éviter une sur-réduction de la chaine de

transport photosynthétique à l’origine de la production de ROS (Heber et al, 1996). La quantité de

caroténoïdes dans les thylakoïdes augmente dans des plantes acclimatées, suggérant que les

caroténoïdes sont impliqués dans les mécanismes de photo-protection des plantes (Tallon & Quiles,

2007). Enfin, la protéine PTOX (plastid terminal oxidase), aussi connu sous le nom d’IMMUTANS,

serait impliquée dans la protection des plantes contre le stress oxydant, en prévenant une sur-

réduction du pool de plastoquinones dans les chloroplastes. Elle serait capable de transférer les

électrons de la plastoquinone à l’oxygène, immédiatement transformé en H2O dans le stroma, sans

générer d’espèces oxygènes réactives (Streb et al, 2005). Située du côté stroma de la membrane

thylakoïdienne, elle jouerait ainsi le rôle d’accepteur alternatif d’électrons. Cette enzyme, associée à

la NADH DH (NADH Déshydrogénase) est impliquée dans la chlororespiration (Quiles, 2006).

Bennoun (1982) définit la chlororespiration comme une chaine de transport d’électrons située dans

la membrane du thylakoïde, en interaction avec la chaine de transport photosynthétique (circulation

des électrons entre PSII et PSI) et impliquant l’oxydation non-photochimique des plastoquinones.

Cependant, la PTOX est une protéine mineure dans de nombreuses espèces de plantes déjà étudiées

et sa capacité à consommer les électrons en excès parait être faible (Peltier & Cournac, 2002). Cette

enzyme est pourtant très abondante chez Ranunculus glacialis, une plante alpine de haute altitude,

dont la quantité excède celles de nombreuses autres plantes, notamment des feuilles de tomates

transgéniques sur-exprimant la PTOX. De plus, la quantité de PTOX chez R. glacialis diminue

fortement lors d’une désacclimatation (22°C à faible lumière pendant trois semaines), suggérant

qu’elle tient un rôle important dans la protection contre la lumière forte. Enfin, l’abondance de la

PTOX chez Geum montanum, une autre plante alpine, est corrélée avec l’altitude (Streb et al,

2005). La PTOX serait de ce fait une protéine importante dans l’adaptation des plantes alpines aux

conditions environnementales difficiles induisant un stress oxydant. Cependant, aucun test n’est

actuellement disponible pour quantifier le rôle de la PTOX comme accepteur alternatif d’électrons.

Le but du stage est de développer une méthode, basée sur la fluorescence chlorophyllienne, afin de

mettre en évidence le rôle de la PTOX chez les plantes alpines.

6

I. Matériels et méthodes

1.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne

1.1. a. Description de la technique de mesure de la fluorescence et des paramètres associés

L’énergie lumineuse absorbée par la chlorophylle d’une feuille peut être utilisée de trois

façons différentes. Elle peut être utilisée pour réaliser la photosynthèse (photochimie), l’énergie en

excès peut être dissipée sous forme de chaleur ou réémise sous forme de lumière (fluorescence

chlorophyllienne). Cependant, la quantité de lumière absorbée ré-émise sous forme de fluorescence

est très faible : seulement 1 à 3% de la lumière totale absorbée. Cela représente donc un rendement

de fluorescence (énergie émise par fluorescence / énergie absorbée par le PSII) très faible.

Ces trois processus sont en compétition, du fait que si l’efficacité de l’un d’eux augmente,

celle des deux autres diminue. Ainsi, en mesurant le rendement de la fluorescence chlorophyllienne,

on peut obtenir des informations concernant la photochimie et la libération de chaleur (Maxwell &

Johnson, 2000).

Figure 1 : Les trois voies d’utilisation de l’énergie

La lumière bleue excite la chlorophylle vers un niveau énergétique S2, et la lumière rouge vers un

niveau S1. Lorsqu’un électron retombe du niveau S1, cela entraine une libération d’énergie qui peut

être utilisée par trois processus : photosynthèse, fluorescence et émission de chaleur.

Technique de mesure de l’émission de fluorescence de la chlorophylle d’une feuille : (Cornic, 2007)

Figure 2 : schéma du dispositif

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Trois sources lumineuses sont produites :

- une lumière modulée ou lumière analytique (lambda < 680nm) émise par une LED. Il lui

correspond une fluorescence modulée qui est amplifiée. Cette lumière analytique de flux

quantique constant et très faible permet de mesurer la fluorescence Fo.

- une lumière actinique (lumière solaire ou toute autre source lumineuse susceptible d’activer

la photosynthèse) produisant une émission de fluorescence par la feuille, non amplifiée. La

lumière actinique modifie l’état redox de QA (et donc l’état d’ouverture des centres PSII),

qui résulte d’une part de l’afflux d’électrons par les antennes (réactions amonts) et d’autre

part de l’utilisation de ces électrons pour l’assimilation du CO2 et de l’O2, etc. (réactions

avales).

- une source de lumière sursaturante (flash lumineux) : environ 8000 – 10.000 µmol

photons/m2/s, qui provoque la fermeture des centres PSII. Quand tous les centres sont

fermés, la fluorescence est maximale (Fm).

Variation de la fluorescence en fonction du temps sur une feuille intacte (Cornic, 2007) :

La variabilité de la fluorescence est due principalement au PSII. En effet, au niveau du PSI,

le quenching photochimique (qP) est toujours maximal. La fluorescence est donc faible et ne varie

pas. La raison de cette faible fluorescence est que le PSI trouve toujours un accepteur d’électrons :

même si NADP+ n’est pas libre ou que le transport cyclique est bloqué, le PSI peut transférer les

électrons à l’oxygène. Au niveau du PSII, la fluorescence dépend de l’état redox du pool de

plastoquinones et en particulier de QA. Elle dépend également du gradient de protons.

La feuille est maintenue à l’obscurité 30 minutes environ avant d’être éclairée par une

lumière modulée (LM) de très faible intensité. La fluorescence atteint un niveau minimal Fo (les QA

sont oxydées au maximum et tous les centres PSII sont ouverts). La feuille reçoit ensuite un flash de

lumière sursaturante (LSS), qui provoque la fermeture des centres PSII (QA réduites brutalement au

maximum) qui ne peuvent plus faire de photochimie. La fluorescence atteint un niveau maximal

Fm. Puis QA donne ses électrons à QB et l’émission de fluorescence diminue (oxydation de QA).

La lumière actinique (LA < LSS) provoque la fermeture de quelques centres PSII (réduction

partielle des QA) ainsi qu’une augmentation de l’émission de fluorescence jusqu’à un niveau Fp

puis Fs (valeur stationnaire correspondant à la réoxydation des QA). En effet, la photosynthèse est

induite à la lumière et donc les électrons sont consommés. Lorsqu’un flash de lumière sursaturante

est donnée, on atteint le niveau de fluorescence Fm’ (fluorescence maximale à la lumière).

L’augmentation de la fluorescence lors du flash est proportionnelle au nombre de QA oxydées

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pouvant être réduites. La différence entre Fm et Fm’ (avec Fm > Fm’) est proportionnelle à

l’énergie émise sous la forme de chaleur, qui dépend du gradient de protons. Lorsque la lumière

actinique est éteinte, on atteint un niveau Fo’. Le niveau Fo est récupéré si la feuille est maintenue à

l’obscurité. Le schéma ci-dessous représente les variations de fluorescence d’une feuille selon les

traitements lumineux décrits précédemment.

Figure 3 : Variation de la fluorescence en fonction du temps sur une feuille intacte

La fluorescence sera supprimée par deux phénomènes : le quenching non-photochimique

(émission d’énergie sous forme de chaleur) et le quenching photochimique (lié au nombre de QA

oxydées pouvant être réduites en réalisant la photosynthèse).

- le quenching photochimique qP :

Il correspond à une estimation de la capacité du PSII à atténuer la fluorescence en réalisant la

photochimie. Cette capacité est liée à la concentration de centres ouverts susceptibles d’accepter les

électrons, donc liée à l’état redox de QA. Si la photosynthèse est maximale, la fluorescence ainsi que

l’émission de chaleur sont minimales. On appelle cette suppression quenching photochimique.

Le quenching photochimique se calcule selon la formule suivante : qP = Fq’ / Fv’

Fq’ correspond à la différence entre Fm’ (fluorescence maximale d’une feuille adaptée à la lumière)

et F’ (fluorescence émise par une feuille recevant une lumière actinique). Fv’ correspond à la

différence entre Fm’ et Fo’ (fluorescence minimale d’une feuille adaptée à la lumière).

- le quenching non-photochimique qN ou NPQ :

NPQ estime la capacité du PSII à supprimer la fluorescence en diminuant l’énergie d’excitation par

perte de chaleur. Tous changements dans les mesures de NPQ indiquent un changement dans

l’efficacité de la dissipation thermique. En général, une augmentation de NPQ est le résultat de la

mise en place de mécanismes de protection de la feuille contre des dommages pouvant être induits

par une forte lumière par exemple.

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NPQ peut être décomposé en trois paramètres :

- qE (quenching énergétique) : est associé au transport de protons vers le lumen sous lumière

forte et donc régule le niveau d’excitation du PSII

- qI (quenching par la photoinhibition) : résulte de la photoinhibition du PSII

- qT (quenching associé aux états de transition) : résulte de la phosphorylation des complexes

recevant la lumière associés au PSII

Généralement, sur des plantes non-stressées exposées à une lumière modérée à saturante, qE est le

paramètre principal.

Afin de diminuer l’énergie lumineuse absorbée en excès, la plante est capable de dissiper

cette énergie sous forme de chaleur. Ce mécanisme met en jeu le cycle des xanthophylles, la

protéine PsbS associée au PSII ainsi qu’une enzyme présente dans le lumen du thylakoïde : la

violaxanthine dé-époxidase (VDE) (cf Fig. 4).

Une forte intensité lumineuse induit un flux électronique important entre PSII et PSI, ce qui

provoque l’acidification du lumen (accumulation de protons H+ transportés depuis le stroma vers le

lumen par le pool de PQ). Il en résulte l’activation de la VDE qui se fixe à la membrane du

thylakoïde et convertit la violaxanthine en zéaxanthine, induisant la protonation de PsbS (cf Fig. 4

et 5). Ceci provoque un changement conformationnel des antennes liées au PSII, la quantité de

chaleur émise par le PsbS augmente, et qE augmente. Lorsque l’intensité lumineuse diminue, la

déprotonation de PsbS et la reconversion de la zéaxanthine en violaxanthine provoque une

diminution de qE.

C’est ce que l’on appelle le quenching non-photochimique (la photochimie n’intervient pas

dans cette extinction puisque la lumière sursaturante ferme tous les centres). La diminution de Fm’

à la lumière (Fm’< Fm) est due à l’augmentation de la dissipation de chaleur.

Figure 4 : organisation du PSII et son rôle dans la dissipation de l’énergie en excès par émission de

chaleur

10

Figure 5 : cycle des xanthophylles

Le quenching non-photochimique se calcule de la façon suivante : NPQ = (Fm-Fm’) / Fm’.

1.1. b. Description du matériel utilisé

- Arabidopsis thaliana : un écotype contrôle Col0 et deux écotypes alpins Jo et J3E

- DBMIB (2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone) et DCMU (3-(3,4-

dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) : inhibiteurs du transport des électrons au niveau de la

chaine photosynthétique (voir principe des inhibiteurs en page 12)

- Mini-PAM (pulse amplitude modulated fluorometre) relié à une source lumineuse

- Un enregistreur (LINSEIS) L70 25 11

Figure 6 : Matériel utilisé pour les mesures de fluorescence chlorophyllienne

Mini -PAM

Source lumineuse

Enregistreur

11

1.1. c. Description du protocole expérimental

Après acclimatation à l’obscurité pendant 30 minutes, une feuille d’Arabidopsis thaliana est placée

sur la trajectoire du faisceau lumineux, associée à une bande de papier filtre imbibée d’eau distillée

pour éviter son desséchement.

Figure 7 : Détails du dispositif

La feuille est soumise à différentes intensités lumineuses successives (10, 50, 100, 250

µmol/m2/s), chacune des séries lumineuses étant séparée par une minute d’obscurité. Un flash de

lumière sursaturante est également programmé pour émettre toutes les 5minutes. Le mini-PAM

enregistre les variations de fluorescence émises par la feuille, retransmises ensuite à l’enregistreur

qui fournit un enregistrement papier de ces variations. A partir de cet enregistrement papier seront

relevées les différentes valeurs nécessaires aux calculs du qP et du NPQ.

La feuille subit ensuite un traitement au DBMIB (immersion dans une solution de DBMIB

25 µM et passage sous vide). Les séries lumineuses sont répétées de la même façon que

précédemment.

La feuille subit pour finir un traitement au DCMU (immersion dans une solution de DCMU

50 µM et passage sous vide, puis incubation 10 min (écotype Col0) ou 20 min (écotypes alpins Jo et

J3E)) et les mêmes séries lumineuses sont répétées.

L’objectif étant de montrer l’activité de la protéine PTOX dans des feuilles d’A. thaliana, les

différentes intensités lumineuses ainsi que les concentrations en inhibiteurs ont été choisi de façon à

ne pas entrainer la destruction du PSII (lumière trop forte, concentration trop élevée en inhibiteurs).

En effet, si le PSII est détruit, les flux électroniques circulant dans la chaine de transport seront

inexistants, et aucune observation concernant la protéine PTOX ne pourra être faite sur les

différents écotypes. Le but est de moduler l’activité photosynthétique sans entrainer la destruction

du PSII.

12

Principe des inhibiteurs DBMIB et DCMU :

Le DBMIB et le DCMU sont des inhibiteurs qui agissent au niveau de la chaine de transport

photosynthétique des électrons. Ils sont utilisés dans le même objectif : bloquer le transport des

électrons du PSII vers le PSI, et par conséquent induire la réduction des quinones du PSII. Leur site

d’action est cependant différent : le DBMIB se fixe sur le Cytochrome b6f à la place de la

plastoquinone ; le DCMU (herbicide, nom commercial : diuron) se fixe par contre directement sur

le PSII à la place de QB, ce qui induit la réduction de toutes les QA (accumulation des électrons qui

ne sont plus utilisés dans la chaine de transport). La fluorescence est alors maximale. La

photosynthèse en présence de DCMU est nulle, l’énergie est donc entièrement émise sous forme de

chaleur et de fluorescence.

L’utilisation de ces deux inhibiteurs permettra d’apporter des réponses d’une part concernant

la fonctionnalité de la protéine PTOX et d’autre part sur son rôle dans le maintien du flux

électronique en PSII et PSI permettant la réalisation de la photosynthèse.

Figure 8 : Chaine de transport des électrons entre PSII et PSI

Localisation de la PTOX et des cibles du DBMIB et du DCMU

Les différents résultats obtenus par fluorescence chlorophyllienne (qP et NPQ pour les trois

écotypes et pour chaque traitement : témoin, DBMIB, DCMU) seront analysés par des tests

statistiques de comparaison de moyennes (critère de test t : Student).

DCMU

DBMIB

13

1.2. Calcul de l’ETR (electron transport rate)

Comme nous l’avons vu précédemment, les inhibiteurs utilisés ont pour objectif de bloquer le

transport des électrons au sein de la chaine de transport. Nous allons donc quantifier ce transport

électronique au sein de feuilles non traitées (témoins) et de feuilles traitées au DBMIB et au

DCMU.

L’ETR se calcule de la manière suivante : ETR = ФPSII * PFD * a * (0,5) avec :

- ФPSII : mesure la proportion de lumière absorbée par la chlorophylle associée au PSII et qui

sera utilisée dans la photochimie, et plus particulièrement dans la réduction de QA (=

efficacité du PSII) ;

- PFD * a : lumière absorbée (µmol photon/m2/s) sachant que PFD (Photon Flux Density)

correspond à l’intensité lumineuse reçue par la feuille (10, 50, 100 et 250 µmol/m2/s) et que

a est calculé de la manière suivante : (100% - % T - % R)/100 (avec %T : % lumière reçue

par la feuille et %R : % lumière réfléchie par la feuille) ;

- 0,5 : facteur tenant compte de la répartition de l’énergie entre le PSII et le PSI.

Mesure de ФPSII :

Les résultats obtenus par fluorescence chlorophyllienne (cf chapitre 1.1. Mesure de fluorescence

chlorophyllienne) sont réutilisés ici puisque ФPSII correspond au ratio Fm’ / Fq’ (paramètres

décrits précédemment).

Mesure de a :

Les paramètres T et R s’obtiennent par le biais de la spectrophotométrie. Une feuille par écotype est

soumise à un rayon lumineux. La quantité de lumière transmise et réfléchie par la feuille est

calculée automatiquement pour chaque longueur d’onde entre 400 et 700 nm (300 valeurs par

prise). Il suffit par la suite de calculer la moyenne des %T et %R entre 400 et 700 nm pour chaque

écotype, puis de faire le calcul (100% - %T - %R)/100 pour obtenir les trois valeurs de a.

Les résultats obtenus seront également traités par des tests statistiques de comparaison de moyennes

(critère de test t : Student).

1.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot

L’objectif est de quantifier la protéine PTOX présente dans les trois écotypes d’A. thaliana, et de

déterminer si des conditions de stress (faible ou forte température, forte lumière) peuvent entrainer

des modifications dans la quantité de cette protéine.

14

Des feuilles d’Arabidopsis thaliana (écotype Col0 et écotypes alpins Jo et J3E) ont subi au

préalable différents traitements de lumière ou de température : pour chaque écotype, quatre

traitements différents sont réalisés :

- aucun traitement : feuilles témoins (lumière reçue : 80 µmol/m2/s)

- exposition à une plus forte lumière (120 µmol/m2/s) pour Col0 uniquement

- traitement à faible température (4°C, lumière reçue : 100 µmol/m2/s) pendant 5 jours

- traitement à forte température (33°C, lumière reçue : 100 µmol/m2/s) pendant 4 jours

Les feuilles prélevées sont immédiatement congelées dans de l’azote liquide.

Méthode d’extraction protéique par Western Blot :

Les principales étapes sont les suivantes :

1. Préparation des échantillons : les feuilles préalablement congelées sont broyées dans l’azote

liquide, et le broyat est suspendu dans des solutions tampon. Les protéines membranaires

sont séparées des protéines solubles par centrifugations successives.

2. Electrophorèse : Les protéines migrent successivement dans un gel de concentration à 3%

de polyacrylamide (0,1% SDS), puis dans un gel de séparation à 13% (0,1% SDS). Dans le

champ électrique, les protéines sont donc séparées en fonction de leur masse et non en

fonction de leur charge électrique.

3. Transfert sur membrane de nitrocellulose : Les protéines sont électrotransférées sur une

membrane de nitrocellulose dans un appareil de transfert Biorad.

4. Immunodétection : Incubation en présence d’anticorps primaires anti-PTOX, puis

d’anticorps secondaires anti-Ig de lapin.

5. Révélation sur films photographiques : Dans une chambre noire, la membrane est mise à

incuber dans une solution de révélation (kit de chimioluminescence). Un film

photographique est ensuite placé au niveau de la membrane, mais le contact direct est évité à

l’aide d’un film plastique inséré entre les deux. Après un court instant, on réalise le

développement du film photographique.

Le détail des cinq étapes est disponible en Annexe 1.

15

II. Résultats :

2.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne : calculs des qP et NPQ

Pour chaque écotype d’A. thaliana, 4 à 6 répétitions sont effectuées. Les résultats obtenus sont

traités sous le logiciel Excel. La moyenne des valeurs de qP et NPQ obtenues pour chaque intensité

lumineuse (10, 50, 100, 250 µmol/m2/s) est calculée.

2.1. a. Quenching photochimique qP

Graphique n° 1 : écotype Col0 (6 répétitions)

Graphique n° 2 : écotype alpin Jo (5 répétitions)

Valeurs de qP selon la lumière reçue par une feuill e d'A. thaliana (écotype alpin Jo)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

10 50 100 250

Intensités lumineuses (µmol/m2/s)

Uni

tés

rela

tives

Feuille témoin

Avec DBMIB 25µMsans incubation

Avec DCMU 50µM20min d'incubation

Valeurs de qP selon la lumière reçue par une feuill e d'A. thaliana (écotype Col0)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

10 50 100 250


Uni

tés

rela

tives

Feuille témoin

Avec DBMIB 25µM sansincubation

Avec DCMU 50µM 10 mind'incubation

16

Graphique n° 3 : écotype alpin J3E (4 répétitions)

On remarque que les valeurs de qP diminuent avec l’intensité lumineuse reçue par la feuille,

quels que soient l’écotype et le traitement (témoin, DBMIB ou DCMU). On remarque également

qu’après traitement au DBMIB, l’écotype Col0 comparé aux écotypes alpins Jo et J3E ne répond

pas de la même façon. Les valeurs de qP chez Col0 paraissent beaucoup plus faibles par rapport aux

valeurs du témoin, alors que chez les deux écotypes alpins, les valeurs de qP semblent être assez

similaires au témoin. Concernant le DCMU, la réponse de la plante est semblable chez les trois

écotypes. Le quenching photochimique est fortement inhibé dès l’exposition de la feuille à une

source lumineuse, et finit par être nul à la fin de l’expérience.

Des tests statistiques basés sur des comparaisons de moyennes sont réalisés afin d’établir la

significativité de telles différences entre les écotypes. Concernant l’écotype Col0, les valeurs de qP

après traitement au DBMIB et après traitement au DCMU sont significativement différentes au

seuil de 5% des valeurs témoins, quelle que soit l’intensité lumineuse à laquelle la feuille traitée est

soumise (Pc < 0,05) (cf Tableaux 1 et 2 Annexe 2).

Pour l’écotype alpin Jo, des résultats similaires sont trouvés lors du traitement au DCMU :

différence significative de valeurs moyennes de qP entre les feuilles traitées au DCMU et les

feuilles témoin au seuil de 5%, quelle que soit l’intensité lumineuse (Pc < 0,05) (cf Tableau 4

Annexe 2). Par contre, les valeurs moyennes de qP entre les feuilles témoin et les feuilles traitées au

DBMIB pour chaque intensité lumineuse ne sont pas significativement différentes au seuil de 5%

(Pc > 0,05) (cf Tableau 3 Annexe 2).

Valeurs de qP selon la lumière reçue par une feuill e d'A. thaliana (écotype alpin J3E)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

10 50 100 250


Uni

tés

rela

tives

Feuille témoin


Avec DCMU 50µM20min incubation

17

Chez l’écotype alpin J3E, malgré des résultats graphiques similaires à l’écotype alpin Jo qui

nous poussent à conclure de la même façon, seule les données obtenues sous faible lumière

(10µmol/m2/s) permettent de conclure qu’il n’y a pas de différence significative entre la feuille

témoin et la feuille traitée au DBMIB, au seuil de 5% (Pc = 0,759 > 0,05). Pour les trois autres

valeurs correspondant aux intensités lumineuses suivantes, les tests statistiques réalisés indiquent

une différence significative au seuil de 5% entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB (Pc

< 0,05) (cf Tableau 5 Annexe 2). Concernant le traitement au DCMU, il existe une différence

significative entre la feuille témoin et la feuille traitée au seuil de 5% (Pc < 0,05) (cf Tableau 6

Annexe 2).

2.1. b. Quenching non-photochimique NPQ



Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuil le d' A. thaliana (écotype alpin Jo)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

10 50 100 250


Uni

tés

rela

tives

Feuille témoin


Avec DCMU 50µM 20mind'incubation

Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuil le d' A. thaliana (écotype Col0)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

10 50 100 250


Uni

tés

rela

tives Feuille témoin



18


Quel que soit l’écotype ou le type de traitement considéré, on remarque que les valeurs de

NPQ augmentent avec la quantité de lumière reçue par la feuille, avec une nette augmentation à 250

µmol/m2/s. Les valeurs de NPQ mesurées à 10, 50 et 100 µmol/m2/s sont très faibles et donc

considérées comme étant négligeables. On ne s’attachera donc qu’aux résultats obtenus à 250

µmol/m2/s.

Chez Col0, la différence observable entre la feuille témoin et la feuille traitée soit au

DBMIB, soit au DCMU est significative au seuil de 5% (Pc = 0,038 < 0,05 et Pc = 0,002 < 0,05

respectivement). Le quenching non-photochimique est donc plus important dans une feuille non

traitée aux inhibiteurs.

Chez l’écotype alpin Jo au contraire, il n’existe aucune différence significative au seuil de

5% entre la feuille témoin et celle traitée au DBMIB (Pc = 0,97 > 0,05). Par contre, concernant le

traitement au DCMU, la différence de NPQ par rapport au témoin est significative au seuil de 5%

(Pc = 0,0097 < 0,05).

Concernant le deuxième écotype alpin J3E, les résultats obtenus sont similaires à Jo. Aucune

différence de NPQ n’est observée entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB (Pc = 0,49 >

0,05). Enfin, entre la feuille témoin et la feuille traitée au DCMU, il existe une différence

significative au seuil de 5% (Pc = 0,014 < 0,05).

Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuil le d' A. thaliana (écotype alpin J3E)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

10 50 100 250Intensités lumineuses (µmol/m2/s)

Uni

tés

rela

tives

Feuille témoin



19

2.2. Calcul de l’ETR (electron transport rate)



Valeurs de l'ETR (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d' A. thaliana (écotype alpin Jo)

05

10

1520253035

404550

10 50 100 250


ET

R (

J)

Feuille témoin



Valeurs de l'ETR (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d' A. thaliana (écotype Col0)

0

5

10

15

20

25

30

35

10 50 100 250


ET

R (

J)

Feuille témoin



20


Dans le cas des feuilles témoin (quel que soit l’écotype), la quantité d’électrons transportés

augmente avec la quantité de lumière reçue par la feuille. Plus la lumière reçue est forte (et donc

plus l’énergie reçue est importante), plus la quantité d’électrons qui transitent dans la chaine de

transport entre PSII et PSI est élevée. On remarque une différence entre l’écotype Col0 d’une part,

et les écotypes alpins Jo et J3E d’autre part. La quantité d’électrons transportée est similaire chez

les deux écotypes alpins et elle est également plus importante par rapport à Col0. Le flux

électronique est donc facilité chez les écotypes alpins en comparaison à Col0.

Lors du traitement au DBMIB, la quantité d’électrons transportés chez Col0 par rapport au

témoin est significativement plus faible au seuil de 5% (Pc < 0,05). Au contraire, les flux

électroniques entre PSII et PSI ne sont pas significativement différents du témoin chez Jo au seuil

de 5% (Pc > 0,05). Concernant J3E, les résultats graphiques laissent croire à des résultats similaires

à l’écotype Jo. Pourtant, d’après les tests statistiques réalisés, la quantité d’électrons transportés

entre PSII et PSI chez la feuille témoin et la feuille traitée est significativement différente au seuil

de 5% (Pc < 0,05).

Dans le cas du traitement au DCMU par contre, les valeurs d’ETR sont très proches de 0

voire même totalement nulles chez les trois écotypes. Le transport des électrons est bloqué. Les

tests statistiques réalisés montrent pour les trois écotypes une différence significative des valeurs

d’ETR entre la feuille témoin et la feuille traitée au seuil de 5% (Pc < 0,05).

Valeurs de l'ETR (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d' A. thaliana (écotype alpin J3E)

0

510

15

2025

30

35

4045

50

10 50 100 250


ET

R (

J)

Feuille témoin



21

2.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot

Figure 9 : Résultats obtenus après révélation sur films photographiques

- Col0, Col0 1, Col0 2, Jo1, Jo2, Jo3, J3E1, J3E2 : feuilles témoins (lumière reçue : 80 µmol/m2/s)

- Col04 1, Col04 2, Col04 3, Jo4 2, Jo4 3, J3E4 1, J3E4 2, J3E4 3 : traitement à faible température

(4°C, lumière reçue : 100 µmol/m2/s) pendant 5 jours

- Col033 1, Col033 2, Col033 3, Jo33 1, Jo33 2, Jo33 3, J3E33 1, J3E33 2, J3E33 3 : traitement à

forte température (33°C, lumière reçue : 100 µmol/m2/s) pendant 4 jours

- Col01+, Col02+ : exposition à forte lumière (120 µmol/m2/s) pour Col0 uniquement

Deux signaux à 33KDa et 38KDa correspondent à la protéine PTOX. Chez les deux écotypes alpins

témoins Jo et J3E, le signal à 33KDa parait plus fort par rapport à Col0 (visible sur le film n°4).

Aucune différence de signal n’est observée après traitement à forte lumière chez Col0 (Col0+ sur

film n°4). De même, aucune différence de signal n’est observée après traitement à 4°C chez les trois

écotypes (films n°1, 2 et 3). Par contre, après traitement à 33°C, le signal à 33KDa parait plus faible

chez Col0 et Jo (films n°1 et 2). Chez J3E, le signal est tellement fort qu’on ne voit pas de

différence (film n°3).

38 KDa

33 KDa

22

III. Discussion

La variation des valeurs de qP (quenching photochimique), NPQ (quenching non-

photochimique) et ETR (electron transport rate) selon l’écotype considéré, selon l’intensité

lumineuse reçue par la feuille et enfin selon le traitement (témoin, DBMIB ou DCMU) sont à mettre

en relation puisque ces trois paramètres dépendent notamment du flux électronique circulant au

niveau de la chaine de transport photosynthétique. On observe d’une manière globale que les

valeurs de qP (quenching photochimique) diminuent avec l’augmentation de l’intensité lumineuse

reçue par la feuille, contrairement aux valeurs de NPQ et d’ETR qui augmentent (quels que soient

l’écotype et le type de traitement). Rappelons que ces valeurs sont obtenues lors de flash lumineux

saturant, et que l’augmentation de la fluorescence lors de ce flash nous renseigne sur le nombre de

QA oxydées pouvant être réduites. L’augmentation de l’intensité lumineuse reçue par la feuille est à

l’origine d’une quantité plus importante d’énergie arrivant au niveau du PSII. Une quantité plus

importante d’électrons devra donc transiter par le PSII via le pool de plastoquinones (réduction des

QA) afin de réaliser la photosynthèse.

Comment expliquer une diminution du quenching photochimique avec l’augmentation de la

quantité de lumière reçue par la feuille ? Une faible intensité lumineuse sera à l’origine d’un faible

flux d’électrons au niveau du PSII, entrainant la réduction et la réoxydation rapide de QA,

rapidement disponible à nouveau pour réaliser la photosynthèse. Lors d’un flash lumineux saturant,

les électrons en excès seront facilement pris en charge par les QA alors à l’état oxydé (PSII ouvert).

La valeur de qP est donc élevée puisque la disponibilité des QA pour les électrons a permis d’éviter

la fluorescence en réalisant la photosynthèse. De fortes intensités lumineuses seront au contraire à

l’origine d’un fort flux électronique au niveau du PSII. QA est donc rapidement réduite, ce qui

provoque la fermeture du PSII. Lors d’un flash lumineux saturant, le nombre de QA alors oxydées et

disponibles pour prendre en charge les électrons est faible. La photosynthèse au niveau du PSII

n’est plus réalisable, et l’énergie doit donc être consommée d’une autre façon. Par conséquent

l’émission de fluorescence augmente. Les valeurs de qP diminuent avec l’intensité lumineuse,

puisque de plus en plus d’électrons s’accumulent dans les membranes et donc de moins en moins de

QA sont à l’état oxydé. Le système perd progressivement sa capacité à éviter la fluorescence par

photochimie. Le risque pour la plante est l’accumulation d’électrons dans les membranes, à

l’origine de la formation d’oxygène réactif. Ces ROS (espèces d’oxygène réactif), lorsqu’ils

s’accumulent dans les membranes, peuvent provoquer un stress oxydant aux conséquences néfastes

pour la plante : dégradation des membranes, des pigments, destruction de la protéine D1 du PSII

ayant pour conséquence la photoinhibition (inactivation de la photosynthèse sous lumière forte).

23

La diminution de qP avec l’intensité lumineuse est observable chez les trois écotypes

témoins d’A. thaliana étudiés. Cependant, chez les deux écotypes alpins témoins, cette diminution

des valeurs de qP avec l’augmentation de la lumière reçue par la feuille semble être moins

importante que chez l’écotype Col0 (environ deux fois moins entre 10 et 250 µmol/m2/s). Les

écotypes alpins semblent subir moins fortement l’arrivée en excès d’électrons au niveau du PSII.

Les flux électroniques sont probablement plus importants chez ces écotypes.

Chez les feuilles témoins, les valeurs d’ETR (et donc le nombre d’électrons qui transitent

dans la chaine de transport) augmentent avec la quantité de lumière reçue par la feuille. En effet, la

lumière reçue est transmise à la feuille sous forme d’énergie, se traduisant par un flux électronique.

Plus la quantité de lumière reçue sera importante, plus la quantité d’électrons circulant dans les

membranes sera élevée. Ces résultats sont à mettre en relation avec le quenching photochimique

décrit précédemment. Contrairement aux valeurs d’ETR, les valeurs moyennes de qP chutaient avec

l’augmentation de l’intensité lumineuse reçue par la feuille. Plus le flux électronique est important

(ETR élevé), plus la quantité de QA oxydées diminue et donc plus les valeurs de qP diminuent.

On observe également que les valeurs d’ETR calculées dans les feuilles témoins sont plus élevées

chez les deux écotypes alpins Jo et J3E par rapport à Col0 (d’un facteur 1,5 environ), et qu’elles

sont comparables entre elles. Ces écotypes seraient capables de transporter un flux électronique plus

important lors de la photosynthèse, qui serait alors plus efficace dans des conditions

environnementales difficiles.

D’après les mesures de NPQ effectuées sur les trois écotypes, la quantité d’énergie libérée

sous forme de chaleur est très faible sous lumière faible à moyenne et donc considérée comme

négligeable. En effet, la quantité d’électrons transférés est faible, et par conséquent le gradient de

proton reste faible. L’énergie est utilisée pour la photosynthèse, et l’émission de chaleur (et de

fluorescence) reste faible. Avec l’augmentation de la quantité de lumière reçue par la feuille (250

µmol/m2/s), la quantité d’énergie libérée sous forme de chaleur augmente. En effet, plus la quantité

d’électrons qui transitent dans la chaine de transport est importante, plus la quantité de protons

transportés dans le lumen via le pool de plastoquinones sera importante. Rappelons que

l’acidification du lumen provoque la connexion de la violaxanthine dé-époxidase (VDE) à la

membrane du thylakoïde, aboutissant à une libération de chaleur par la protéine PsbS. Ainsi, des

valeurs élevées de NPQ indiquent que l’énergie est émise en grande partie sous forme de chaleur (et

plus faiblement sous forme de fluorescence, car rappelons que seuls 1 à 3% de l’énergie peuvent

être émis sous cette forme). Le gradient des protons est important. Ainsi, la libération d’énergie

sous forme de chaleur permet à la feuille de supporter de fortes lumières sans subir de dommages

physiologiques.

24

Après traitement au DBMIB, la réponse des plantes varie selon l’écotype considéré. Chez

Col0, après traitement au DBMIB, les valeurs de qP obtenues aux différentes intensités lumineuses

sont significativement plus faibles que celles de la feuille témoin (d’un facteur 2 voire 3).

Rappelons que le DBMIB est un inhibiteur agissant au niveau de la chaine de transport

photosynthétique des électrons. Il bloque le transport des électrons du PSII vers le PSI en se fixant

sur le Cytochrome b6f à la place de la plastoquinone, entrainant la réduction des QA. De ce fait, la

photosynthèse n’est plus réalisable. Les valeurs de qP sont faibles (QA réduites) et la fluorescence

augmente afin de libérer l’énergie en excès. Ces valeurs de qP sont d’autant plus faibles que la

quantité de lumière (et donc d’énergie) absorbée par la feuille est importante. En effet, le nombre de

QA oxydées diminuent progressivement puisque la quantité d’électrons à prendre en charge

augmente, réduisant les QA encore disponibles. Cependant, le quenching photochimique n’est pas

nul, indiquant que des QA sont encore à l’état oxydé. Le but de l’expérience étant de moduler l’état

redox des QA en évitant d’induire la destruction du PSII, la concentration en DBMIB a été calculée

de façon à permettre un faible flux électronique au niveau de la chaine de transport. Ainsi, on peut

supposer que tous les sites accepteurs au niveau des Cytochromes b6f contenus dans les membranes

ne sont pas occupés par l’inhibiteur. Un faible flux d’électrons pourrait circuler, expliquant des

valeurs de qP faibles en présence de l’inhibiteur, mais pas nulles.

Chez l’écotype alpin Jo, contrairement à Col0, après traitement au DBMIB les valeurs de qP

obtenues sous différentes intensités lumineuses ne sont pas significativement différentes de celles

de la feuille témoin. Cela signifie que les électrons ne se sont pas accumulés au niveau du pool de

plastoquinones, malgré le blocage du site accepteur au niveau du Cytochrome b6f. Le flux

électronique est donc maintenu chez Jo, contrairement à Col0. La réoxydation des QA est alors

permise, d’où des valeurs de qP élevées (QA oxydées) et similaires à celles du témoin. Pourtant, ces

électrons n’ont pas pu être consommés par voie photochimique puisque la photosynthèse est

bloquée au niveau du Cytochrome b6f. Une autre voie de consommation des électrons doit donc

exister, et se situer avant le Cytochrome b6f dans la chaine de transport des électrons.

En ce qui concerne l’écotype alpin J3E, les résultats graphiques obtenus sont similaires à Jo,

avec apparemment très peu de différence de qP entre les feuilles témoins et les feuilles traitées au

DBMIB, suggérant que les flux électroniques entre PSII et PSI sont maintenus. Tout comme Jo,

chez J3E un accepteur alternatif permettrait le maintien du flux électronique au niveau de la chaine

de transport, évitant l’accumulation d’électrons et la formation de ROS. Pourtant, chez J3E les tests

statistiques montrent une différence significative entre les valeurs moyennes de qP des feuilles

témoins et traitées, remettant en question l’hypothèse précédente. En raison du faible nombre de

répétitions disponibles, les résultats statistiques sont cependant à interpréter avec précaution. Il

aurait été intéressant de faire d’avantage de répétitions afin d’avoir à traiter un plus grand nombre

25

de données, pouvant ainsi réduire les écarts dus aux aléas des expérimentations (âge de la plante,

pénétration de l’inhibiteur, etc.).

Concernant les valeurs d’ETR, après ajout de DBMIB, de même que lors du calcul de qP, la

réponse des feuilles varie selon l’écotype considéré. Chez Col0, l’ajout de DBMIB provoque une

réduction significative du flux d’électrons dans les membranes. Au contraire, chez l’écotype alpin

Jo, les valeurs d’ETR témoin et après ajout de DBMIB ne sont pas significativement différentes au

seuil de 5%, indiquant que le flux électronique chez les feuilles traitées est très similaire à celui des

feuilles témoins. Dans le cas de J3E, on pourrait conclure de la même façon que Jo au vue des

résultats graphiques. Les tests statistiques indiquent pourtant une différence significative des flux

entre les deux feuilles (témoin et traitée). Cependant, la faible robustesse des tests statistiques,

comme il a été expliqué précédemment, pourrait expliquer de tels résultats statistiques.

Chez l’écotype alpin Jo, le flux électronique entre PSII et PSI est donc maintenu malgré le

blocage du transport électronique au niveau du Cytochrome b6f (pas de diminution des valeurs de

qP et d’ETR), contrairement à l’écotype contrôle Col0. L’hypothèse est qu’un système alternatif

jouant le rôle d’accepteur d’électrons serait présent au niveau de la chaine de transport

photosynthétique, et situé avant le Cytochrome b6f. Cet accepteur alternatif serait la protéine

PTOX. Elle permettrait d’éviter l’accumulation d’électrons dans les membranes (pouvant être à

l’origine de stress oxydants). Elle serait capable d’accepter les électrons de la plastoquinone pour

réduire l’oxygène, transformé immédiatement en H2O, évitant ainsi la production excessive de

ROS.

O2 H2O

PTOX PSII e - Cyt b6f PQH2

Figure n° 10 : rôle de la PTOX dans la chaine de transport des électrons

Chez Col0, la PTOX n’est probablement pas fonctionnelle (ou très peu) puisque en présence

du DBMIB les électrons non consommés en raison du blocage de la photosynthèse se sont

accumulés. Les flux électroniques au niveau de la chaine de transport ont été fortement perturbés,

comme en témoigne la forte réduction des QA (faibles valeurs de qP) et la réduction des flux

électroniques (réduction de l’ETR). La non-fonctionnalité de la PTOX chez Col0 pourrait en réalité

26

s’expliquer par le fait que cette protéine est présente en plus faible quantité par rapport aux écotypes

alpins (d’après les résultats du Western Blot). Il s’agirait dans ce cas non plus d’une question de

fonctionnalité mais de quantité.

On ne peut pas conclure à la fonctionnalité de cette protéine chez J3E malgré des résultats

graphiques qui, à première vue, nous amenaient à valider cette hypothèse (non confirmée

statistiquement). De plus nombreuses répétitions seraient nécessaires afin de confirmer ou

d’infirmer un éventuel rôle de la PTOX chez cet écotype alpin.

Chez Col 0, après ajout de DBMIB, la quantité de chaleur libérée par la feuille (NPQ)

diminue de façon très significative à 250 µmol/m2/s (environ de moitié). Ce résultat n’est cependant

pas surprenant. En effet, le DBMIB empêche le transfert des électrons du PSII vers le Cytochrome

b6f. Par conséquent, le gradient de protons diminue, l’acidification du lumen est de ce fait moins

importante et la libération d’énergie diminue. Chez les écotypes alpins Jo et J3E par contre, aucune

différence significative n’est observée entre les feuilles témoins et celles traitées au DBMIB. Le

gradient de protons serait ainsi maintenu à un niveau équivalent au témoin. Ceci implique que le

flux d’électrons soit maintenu, non pas par le biais de la chaine de transport (qui est bloquée) mais

par l’intermédiaire d’un accepteur alternatif d’électrons tel que la protéine PTOX. Ces résultats sont

en accord avec les précédentes conclusions concernant les écotypes alpins, et plus particulièrement

Jo. En effet, jusqu’à présent, les tests statistiques effectués sur J3E étaient contraires aux résultats

attendus. Les résultats obtenus pour le quenching non-photochimique confirment donc la possible

implication de la protéine PTOX comme accepteur alternatif d’électrons chez Jo, et remettent en

question la non-significativité des résultats obtenus pour J3E jusqu’à présent et qui ne nous

permettaient pas de conclure de façon similaire.

Les résultats obtenus avec le DCMU sont similaires pour les trois écotypes. Dans les trois

cas, les différences de valeurs de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée sont significatives.

Rappelons que le DCMU, en se fixant directement sur le PSII à la place de QB, induit la réduction

de toutes les QA (accumulation des électrons qui ne sont plus transmis dans la chaine de transport).

La photosynthèse en présence de DCMU est donc nulle, l’énergie est alors entièrement émise sous

forme de chaleur et de fluorescence qui est maximale. Les valeurs de qP sont donc très faibles,

voire même nulles sous les plus fortes intensités lumineuses (QA réduites en quasi-totalité voire en

totalité). Dans ce cas là, la PTOX est inefficace puisque l’action de l’inhibiteur se situe en amont.

Après traitement au DCMU, les flux électroniques au sein de la chaine de transport sont

considérés comme étant nuls (ETR très proche ou égale à 0) chez les trois écotypes. Les électrons

sont bloqués au niveau du PSII et ne peuvent plus circuler jusqu’au PSI. La PTOX étant située en

27

aval du PSII, elle ne peut agir sur les flux électroniques. Ceci est en accord avec les précédentes

observations concernant le quenching photochimique.

L’ajout de DCMU, bloquant le transfert électronique au niveau du PSII, aurait dû provoquer

un arrêt de l’émission de chaleur chez les trois écotypes, par blocage de la circulation des protons

entre le stroma et le lumen. Pourtant, les valeurs de NPQ mesurées à 250 µmol/m2/s ne sont pas

nulles (bien que peu élevées). La PTOX étant ici inefficace, l’hypothèse envisageable est que les

sites de fixation du DCMU n’ont pas tous été occupés, permettant le passage d’une petite quantité

d’électrons et expliquant le faible gradient de protons (ce qui est très probable puisque la

concentration en DCMU a été choisi afin de ne pas provoquer la destruction du PSII).

Ces résultats nous permettent de vérifier deux éléments : d’une part la capacité de

pénétration des inhibiteurs au sein des structures membranaires et leur fixation sur les sites

spécifiques. En effet, le fait qu’il n’y ait visiblement pas d’impact du DBMIB sur le flux

électronique chez Jo et J3E (non vérifié statistiquement chez J3E) aurait pu s’expliquer par une

absence de pénétration de l’inhibiteur dans la feuille. Ceci n’est très probablement pas le cas

puisque dans des conditions similaires (mise sous vide et incubation quelques dizaines de minutes)

le DCMU a par contre un effet sur le flux électronique, en bloquant le flux au niveau du PSII chez

les trois écotypes. Ceci apporte la preuve d’une bonne pénétration des inhibiteurs et de leur fixation

sur les sites spécifiques. De plus, des expériences complémentaires effectuées en parallèle dans le

laboratoire ont montré qu’en présence de DBMIB, la réoxydation du PSI est moins rapide comparée

au témoin mais plus rapide qu’en présence de DCMU (résultats non communiqués). Cela indique

que non seulement le DBMIB a bien bloqué le transport d’électrons au niveau réducteur du

Cytochrome b6f, mais aussi que l'hypothèse d'un flux cyclique d'électrons entre le Cytochrome b6f

et le PSI n'est pas à exclure. Ce flux cyclique est probablement mis en place autour du PSI afin de

permettre l’élimination des électrons par formation de NADPH.

Et d’autre part ces résultats renforcent l’hypothèse selon laquelle la protéine PTOX serait

impliquée en tant qu’accepteur alternatif chez l’écotype alpin Jo (et probablement chez J3E). En

effet, le fait de bloquer le flux électronique d’abord en aval (Cyt b6f, DBMIB) puis en amont (PSII,

DCMU) de la PTOX permet d’établir une preuve que la PTOX agit effectivement comme accepteur

d’électrons. Les flux sont maintenus dans le premier cas, alors qu’ils sont inhibés dans le second

cas. Le DCMU a ici un rôle de contrôle. Un autre élément en faveur de cette hypothèse est que, en

présence d’une concentration deux fois plus élevée de DBMIB (50µM au lieu de 25µM) et d’un

temps d’incubation trois fois plus long (60min au lieu de 20min), les résultats obtenus chez

l’écotype alpin Jo sont similaires à ceux obtenus précédemment (résultats non communiqués).

28

Ainsi, les différentes expériences basées sur la fluorescence chlorophyllienne permettent de

mettre en évidence que le flux électronique entre PSII et PSI est favorisé chez les écotypes alpins

contrairement à l’écotype contrôle Col0. Ceci serait lié à la présence d’un accepteur d’électrons

localisé entre le PSII et le Cytochrome b6f, capable de prendre en charge l’excès d’électrons et

d’éviter le stress oxydant (formation de ROS en excès). Cet accepteur serait la protéine PTOX.

Les résultats du Western Blot nous montrent deux signaux correspondant à la protéine

PTOX, à 33KDa et 38KDa. Ces deux formes correspondraient respectivement à la forme mature et

à la forme non-mature de la protéine. La forme non mature (38KDa) contiendrait un peptide de

transfert permettant son adressage au chloroplaste. Une fois passé l’enveloppe chloroplastique, ce

peptide, d’une taille de 5KDa environ, serait éliminé, libérant la forme mature de la protéine (33

KDa). De plus, on remarque que la différence de taille entre la forme non-mature et la forme mature

(5KDa) correspond à la taille de ce peptide. Ceci n’est encore qu’une hypothèse. Des

expérimentations sont actuellement en cours au laboratoire d’Ecophysiologie Végétale (Orsay) afin

de vérifier cette hypothèse. Il s’agit d’isoler des chloroplastes et de les soumettre à l’action d’une

protéinase, afin de voir si la suppression du signal à 38KDa est possible, car on suppose que la

protéine non-mature reste à l’extérieur du chloroplaste. En éliminant l’extérieur du chloroplaste, on

élimine de ce fait la forme non-mature, mais pas la forme mature à l’intérieur du chloroplaste.

Les résultats obtenus chez les deux écotypes alpins Jo et J3E (signal plus fort à 33KDa,

forme mature) montrent que la quantité de protéine PTOX est plus importante dans les écotypes

alpins comparés à Col0. Ces résultats soutiennent l’hypothèse que la PTOX jouerait un rôle chez

ces écotypes en permettant un flux d’électrons plus important au niveau de la chaine de transport

photosynthétique. La non-significativité des résultats de qP et d’ETR chez J3E, ne permettant pas

de conclure à la présence d’une protéine PTOX fonctionnelle, est ainsi fortement remise en question

(tests probablement peu robustes). Les plantes sont soumises à différents traitements de température

et de lumière, l’objectif étant d’observer leur réponse face à un stress. Après traitement à 33°C,

seule la forme mature est apparemment dégradée (signal moins fort à 33KDa par rapport au témoin)

chez Col0 et Jo. Ceci reste pour l’instant inexpliqué, à savoir pourquoi seule la forme mature aurait

été dénaturée à forte température. Après traitement à 4°C, aucune différence avec les feuilles

témoins n’a été observée chez les trois écotypes. Chez les deux écotypes alpins, on pourrait faire

l’hypothèse suivante : qu’ils soient soumis à une faible température dès le début de leur

développement ou seulement à partir d’un stade de développement avancé, cela ne change pas le

fait qu’ils soient aptes à résister à ce type de stress (grande plasticité). D’où un signal à 33KDa de

même intensité que le témoin. Cependant, le fait que l’on trouve des résultats similaires chez

l’écotype Col0 n’est pas en accord avec cette hypothèse, puisque Col0 n’est en principe pas capable

de s’acclimater pour résister à de faibles températures. Les résultats obtenus après traitement à forte

29

lumière ne nous permettent pas non plus de conclure, puisque aucune différence avec le témoin n’a

été observée chez Col0. Ainsi, les différents traitements appliqués sur les trois écotypes (forte et

faible température, forte lumière) ne nous permettent pas de conclure à un éventuel rôle de la PTOX

dans leur capacité d’adaptation à des conditions environnementales contraignantes.

Conclusion

Ainsi, la PTOX jouerait le rôle d’accepteur alternatif d’électrons au sein de la chaine de

transport entre les photosystèmes II et I. Elle permettrait de maintenir un flux électronique entre

PSII et PSI, afin que la photosynthèse ne soit pas saturée à forte lumière, et également d’éviter un

stress oxydant à l’origine de destructions membranaires pouvant conduire à la mort de la plante. La

PTOX n’est cependant fonctionnelle que chez certaines plantes, les plantes alpines notamment

comme on a pu le montrer ici avec les écotypes alpins d’A. thaliana Jo et J3E (par comparaison

avec l’écotype contrôle Col0). Ceci n’a cependant pas été totalement confirmé statistiquement chez

J3E. Il aurait été utile de faire un plus grand nombre de répétitions sur chaque écotype afin de

pouvoir obtenir des résultats statistiques plus robustes. On peut néanmoins faire l’hypothèse que les

plantes alpines poussant dans des environnements de hautes altitudes très contraignants ont

développé des systèmes de protection très efficaces, avec notamment la présence d’une protéine

PTOX fonctionnelle.

Cette protéine n’est pas présente en même quantité chez toutes les plantes alpines. On sait

par exemple qu’elle est abondante chez Ranunculus glacialis, et qu’elle joue un rôle majeur par

rapport aux autres systèmes antioxydants (Streb et al, 2005). Il serait intéressant de faire cette étude

chez les écotypes alpins d’A. thaliana afin de comparer l’efficacité de la PTOX aux autres systèmes

de protection. Enfin, il pourrait être intéressant d’appliquer la méthode utilisée lors du stage sur des

feuilles de R. glacialis afin de confirmer la présence d’une protéine PTOX fonctionnelle chez cette

espèce alpine, malgré de nombreuses propriétés uniques le suggérant : concentration en PTOX bien

plus importante que dans d’autres espèces alpines, d’autres espèces de Ranunculaceae ou encore

dans des feuilles de tomates transgéniques sur-exprimant la PTOX ; découverte d’un ARNm dans

des feuilles matures de R. glacialis ; enfin forte concentration en NADH DH, une enzyme associée

à la PTOX dans la chlororespiration (Streb et al, 2005). Cette méthode pourrait être appliquée à

d’autres espèces de plantes alpines, avec probablement quelques ajustements (retrait de l’épiderme

coriace chez S. alpina par exemple pour favoriser la pénétration des inhibiteurs).

30

Bibliographie

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32

Annexes

Annexe 1 Méthode d’extraction protéique par Western Blot :

1. Préparation des échantillons :

Les feuilles préalablement congelées sont broyées dans l’azote liquide, et le broyat est suspendu

dans 400 µl de solution tampon 1.

Composition de la solution tampon 1 : 27ml de Tris-HCl pH8 100mM, 3g de sucrose, 3ml NaCl

1,5M, 60µl βmercaptoéthanol 0,2% et 30 µl Pefablock 0,5M.

Les échantillons sont placés sous faible agitation à 4°C pendant 15 minutes, puis centrifugés à 4°C

et 15.000 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant contient les protéines solubles. Le culot est

solubilisé dans 400µl de solution tampon 2.

Composition de la solution tampon 2 : 27ml de Tris-HCl pH8 100mM, 3g de sucrose, 60µl

βmercaptoéthanol 0,2%, 3ml de SDS 20% et 300µl de Triton.

Les échantillons sont placés sous centrifugation à 4°C et 15.000 rpm pendant 20 minutes.

Le culot est à nouveau solubilisé dans la solution tampon 2, mis sous agitation puis centrifugation

dans les mêmes conditions que précédemment. Le surnageant contient les protéines membranaires.

2. Electrophorèse :

Les protéines migrent successivement dans un gel de concentration à 3% de polyacrylamide (0,1%

SDS), puis dans un gel de séparation à 13% (0,1% SDS). Dans le champ électrique, les protéines

sont donc séparées en fonction de leur masse et non en fonction de leur charge électrique.

Dans un premier temps, les plaques en verre sont lavées à l’éthanol, et l’étanchéité du système est

vérifiée. Puis le gel de séparation est coulé jusqu’à quelques mm en dessous de la limite du peigne,

suivi de quelques mm d’eau additionnée de SDS (0,5%), ce qui aplanit le gel et l’isole de l’oxygène

de l’air. La prise du gel demande 45 minutes. L’eau de surface est retirée, puis le gel de

concentration est coulé jusqu’aux rebords, et les peignes sont placés immédiatement. La prise dure

également 45 minutes. Les peignes sont ensuite retirés, les puits sont repérés à l’aide d’une marque

sur la plaque en verre, et le système est placé dans la cuve d’électrophorèse remplie de tampon.

Les puits sont chargés avec 20-40µl de protéines additionnées de 50% de tampon de charge

dénaturant SBLU ainsi que de βmercaptoéthanol. Un des puits est chargé avec 3µl de marqueur

protéique Biorad 161-0373. Les protéines migrent sous électrophorèse pendant 1h à 150V dans un

tampon de migration Tris-Glycine-SDS pH 8,5. La migration est terminée quand le colorant est au

bas de la plaque. Les gels sont alors utilisés immédiatement pour le transfert.

33

3. Transfert sur membrane de nitrocellulose :

Les protéines sont électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose dans un appareil de

transfert Biorad. Le gel est placé coté anode, et la membrane coté cathode. Les protéines, entrainées

par le courant électrique, vont sortir du gel et se fixer sur la membrane. Après 1h30 de transfert, les

membranes sont placées dans une solution de saturation contenant du lait écrémé (20mM Tris-HCl

pH7,4 ; 0,9% NaCl ; 5% Lait écrémé ; 0,1% Tween) pendant 45 minutes à température ambiante.

Ainsi, les protéines du lait vont saturer les sites de fixation libres, étape indispensable pour réaliser

par la suite une immunodétection.

4. Immunodétection :

Les membranes sont rincées 3*5min dans du tampon de rinçage (20mM Tris-HCl pH7,4 ; 0,9%

NaCl ; 0,1% Lait écrémé ; 0,1% Tween), puis incubées 1h30 à 2h en présence de l’anticorps

primaire anti-PTOX dilué dans du tampon de rinçage (4ml), sous faible agitation, dans un sachet en

plastique soudé (les bulles d’air sont enlevées régulièrement).

Les membranes sont à nouveau rincées 5*10min dans un tampon de rinçage, puis incubées 45min

en présence de l’anticorps secondaire (2µl par sachet de anti Ig de lapin couplé à la peroxydase

HRP) dilué dans du tampon de rinçage (4ml par sachet). Les membranes sont encore rincées

3*5min dans la solution de rinçage, puis 2*5 min dans une solution de rinçage finale (sans lait et

sans Tween), puis 2*5min dans de l’eau distillée.

5. Révélation sur films photographiques :

Dans une chambre noire, la membrane est mise à incuber dans une solution de révélation (kit de

chimioluminescence). Un film photographique est ensuite placé au niveau de la membrane, mais le

contact direct est évité à l’aide d’un film plastique inséré entre les deux. Après un court instant, on

réalise le développement du film photographique.

34

Annexe 2 Hypothèse nulle Ho : pas de différences significatives entre la feuille témoin et la feuille traitée au seuil de 5%.

Tableau n° 1 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype Col0 : comparaison des valeurs moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB

Tableau n° 2 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype Col0 : comparaison des valeurs moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DCMU


Valeur du critère de test : to

Probabilité critique : Pc

Comparaison au seuil de 5%

Conclusion sur Ho

10 53,998 1,150E-13 Pc < 0,05 rejetée 50 166,246 1,524E-18 Pc < 0,05 rejetée 100 61,734 3,024E-14 Pc < 0,05 rejetée 250 17,322 8,709E-09 Pc < 0,05 rejetée

Tableau n° 3 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype alpin Jo : comparaison des valeurs

moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB





Conclusion sur Ho

10 0,263 0,799 Pc > 0,05 acceptée 50 1,360 0,211 Pc > 0,05 acceptée 100 1,432 0,190 Pc > 0,05 acceptée 250 0,921 0,384 Pc > 0,05 acceptée

Tableau n° 4 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype alpin Jo : comparaison des valeurs moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DCMU





Conclusion sur Ho

10 2,434 0,035 Pc < 0,05 rejetée

50 3,569 0,005 Pc < 0,05 rejetée

100 3,853 0,003 Pc < 0,05 rejetée

250 4,096 0,002 Pc < 0,05 rejetée





Conclusion sur Ho


35

Tableau n° 5 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype alpin J3E : comparaison des

valeurs moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB





Conclusion sur Ho

10 0,321 0,759 Pc > 0,05 acceptée 50 5,715 0,001 Pc < 0,05 rejetée 100 8,325 1,630E-04 Pc < 0,05 rejetée 250 3,913 0,008 Pc < 0,05 rejetée

Tableau n° 6 : résultats des tests statistiques concernant l’écotype alpin J3E : comparaison des valeurs moyennes de qP entre la feuille témoin et la feuille traitée au DCMU





Conclusion sur Ho


36

Abstract

The PTOX protein is localized in the photosynthetic electron transport chain between the

PSII complex and the Cytochrome b6/f complex and can transfer electrons from plastoquinone to

molecular oxygen. In plants exposed to stress conditions like high irradiation and low temperature

as e.g. in alpine plants, the PTOX protein could alleviate photooxidative damage by reducing the

redox state of the photosynthetic electron transport chain. In order to demonstrate the PTOX

activity in vivo in Arabidopsis thaliana ecotypes (Col 0 as control and two alpine ecotypes Jo and

J3E) the reduction state of the PSII electron acceptor QA, the heat emission (NPQ) and the electron

transport rate (ETR) were characterized in leaves before and after blocking the photosynthetic

electron transport at the level of Cytochrome b6/f and at the level of PSII. The results show that

blocking the electron transport at the level of Cytochrome b6/f increase the reduction state of QA,

decrease the NPQ and the ETR at PSII in Col 0 but have only minor effects in the two alpine

varieties. In contrast, blocking the electron transport at the level of PSII blocks the electron

transport in all ecotypes at the same extent. These results suggest the presence of an alternative

electron acceptor between PSII and Cytochrome b6/f in the alpine ecotypes but not in Col 0.

Furthermore, Western Blot analysis shows that the amount of PTOX protein is more important in

two alpine ecotypes than in Col0. In conclusion, the PTOX protein will be functional only in alpine

ecotypes. This protein will be able to maintain an electron flux in photosynthetic transport chain

between PSII and PSI, to realise photosynthesis and to avoid accumulation of electrons originally

oxidative stress.

37

Résumé

La protéine PTOX est localisée au niveau de la chaine photosynthétique de transport

d’électrons entre le photosystème II et le Cytochrome b6f. Elle peut transférer des électrons de la

plastoquinone à l’oxygène moléculaire. Dans les plantes exposées à des conditions de stress telles

qu’une forte lumière ou une faible température, par exemple les plantes alpines, la protéine PTOX

pourrait réduire les dommages oxydants en diminuant l’état redox de la chaine photosynthétique de

transport. Afin de démontrer l’activité de la PTOX in vivo dans des écotypes d’Arabidopsis

thaliana (un écotype contrôle Col0 et deux écotypes alpins Jo et J3E), l’état de réduction de QA (site

accepteur d’électrons au niveau du PSII), l’émission de chaleur (NPQ) et la quantité d’électrons

transportés (ETR) sont mesurés dans les feuilles avant et après le blocage du transport électronique

au niveau du Cytochrome b6f et au niveau du PSII. Les résultats montrent que bloquer le transport

électronique au niveau du Cytochrome b6f provoque une réduction de QA, ainsi qu’une diminution

de NPQ et ETR chez Col0, mais a peu de conséquences sur les écotypes alpins. Au contraire, un

blocage au niveau du PSII empêche le transport électronique entre PSII et PSI chez les trois

écotypes, de façon similaire. Ces résultats suggèrent la présence d’un accepteur alternatif

d’électrons entre le PSII et le Cytochrome b6f dans les écotypes alpins, et pas chez Col0. De plus,

les extractions protéiques par Western Blot montrent que la quantité de protéine PTOX est plus

importante dans les écotypes alpins comparés à Col0. Pour conclure, la protéine PTOX serait

fonctionnelle uniquement chez les écotypes alpins. Elle permettrait de maintenir un flux

électronique au niveau de la chaine de transport entre les photosystèmes II et I, nécessaire à la

réalisation de la photosynthèse et évitant l’accumulation d’électrons à l’origine du stress oxydant.

Documents

Rôle de la PTOX dans la tolérance au stress lumineux chez ... · PDF filela membrane du thylakoïde, en interaction avec la chaine de transport photosynthétique (circulation des