Embed Size (px)
Citation preview
département unité et/ou laboratoire Daniel MASSON – LERPC Roger KANTIN – LER AR Février - 2012 – RST/ODE/LER/LER-PC/LER-AR –12-001
Réseau pesticides Arcachon (REPAR)
Résultat des tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011 Etude financée par le SIBA
2
février 2012
2
Réseau pesticides Arcachon (REPAR)
Résultat des tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011
3
février 2012
SOMMAIRE 1. Rappel des motivations de l’Ifremer au titre de la convention multipartenariale .................................. .........................................................4
2. Les tests utilisés .............................. .........................................................4
3. Localisation des stations de mesures et fréquenc es de prélèvements6
4. Résultats....................................... .............................................................8
4.1. Campagne du 11 mai 2010................................................................................................8 4.2. Campagne du 3 juin 2010..................................................................................................8 4.3. Campagne du 4 octobre 2010 .........................................................................................10 4.4. Campagne du 22 mars 2011 ...........................................................................................11 4.5. Campagne du 4 mai 2011................................................................................................12 4.6. Campagne du 17 mai 2011..............................................................................................13 4.7. Campagnes des 6, 17 et 21 juin 2011 (Leyre).................................................................14 4.8. Campagne du 4 août 2011 (Leyre) ..................................................................................15 4.9. La campagne du 9 novembre 2011 .................................................................................16
5. Discussion :.................................... .........................................................17
6. Prospective : ................................... ........................................................17
7. Bibliographie:.................................. ........................................................18
8. Annexes......................................... ..........................................................18
4
février 2012
1. Rappel des motivations de l’Ifremer au titre de la convention multipartenariale
La convention-cadre, pilotée par le SIBA, précise les modalités d’installation d’un réseau « de recherche, de suivi et d’expertise » sur les substances à caractère phytosanitaire dans le Bassin d’Arcachon – baptisé « REPAR » -, et décrit les contributions de chaque contributeur : SIBA, Agence de l’Eau Adour Garonne, Université de Bordeaux 1, Irstea (Cemagref), Ifremer, et DRAAF / SRAL . Le rôle de l’Ifremer est d’apporter sa connaissance dans ce domaine (suite à des études antérieures) et de réaliser des tests écotoxicologiques. Ces derniers ont essentiellement pour objectif de permettre de caractériser un éventuel impact sur la ressource, ce qui permettra à terme de retenir ou pas ce type de tests, voire de les compléter par d’autres. Le lien avec l’activité conchylicole a été affiché dans la convention – cadre, raison pour laquelle les tests retenus ont été le test « larves d’huîtres » et le test « d’inhibition de croissance phytoplanctonique » à partir de prélèvements d’eau brute. Un protocole a été mis au point (par le LER PC de l’Ifremer à La Tremblade, du fait de la proximité de son écloserie expérimentale).
2. Les tests utilisés
Les tests écotoxicologiques ont pour objectif d’évaluer le stress d’organismes indicateurs soumis à une contamination chimique; les tests retenus dans le cadre de REPAR sont le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique et le test larves d’huîtres. Le test larves d’huîtres est basé sur le pourcentage d’anomalies au stade larvaire « D » de Crassostrea gigas par rapport à un témoin. Ce test mis au point par His et al., (1997) adapté de Woelke (1960) utilise l'huître Crassostrea gigas, espèce présente et élevée sur zone (cf. annexe 1). Le test consiste à induire la ponte de géniteurs préalablement conditionnés en écloserie (lorsque l'on est en dehors des périodes normales de reproduction, soit juillet et août), de la manière la plus naturelle et la moins traumatisante possible pour les animaux. Il s'agit en effet d'obtenir le moins possible de larves malformées dans les lots. La difficulté d'obtenir des géniteurs en état de se reproduire nécessite d’avoir recours à des écloseries. L’échelle de qualité des eaux instaurée par His permet de donner à chacune des eaux testées un degré de pollution selon le pourcentage de malformation larvaire détecté ; ces tests sont effectués dans des conditions expérimentales bien définies et reproductibles. Le « blanc » est testé, et l’efficacité du test est vérifié avec un « toxique de référence » (sulfate de cuivre).
5
février 2012
5
Le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a pour objet de connaître l'effet direct des contaminants à propriétés herbicides sur la capacité photosynthétique des populations (et plus généralement sur la productivité primaire). La réalisation de ce test passe par le choix d’espèces cibles, spécifique des communautés pour chaque saison étudiée ; ces cultures monospécifiques (par exemple Isochrisis galbana) sont ensuite soumises – dans des conditions optimales de température, salinité et nutriments – à la présence d’eau contenant des substances susceptibles de freiner leur croissance. Une estimation quantitative du déficit de croissance de la culture phytoplanctonique mise en présence d’eau susceptible de contenir des substances à caractère herbicide inhibitrices de la production primaire – par rapport à une culture témoin - est effectuée (annexe 2).
Ces deux types de tests écotoxicologiques sont réalisés par l’Ifremer- La Tremblade (D. Masson / Laboratoire Environnement Ressources / Poitou Charentes) à partir d’eau brute.
A terme, des tests écotoxicologiques supplémentaires portant sur un mélange de molécules correspondant à celui retrouvé dans les prélèvements sont également prévus.
6
février 2012
3. Localisation des stations de mesures et fréquences de prélèvements
Les stations suivantes sont échantillonnées de manière régulière à basse mer pour les analyses chimiques, mais seulement une partie d’entre elles (résultats sur les graphiques) ont été prises en compte pour les tests écotoxicologiques. Les points pris en compte dans le réseau REPAR, et pour lesquels des tests écotoxicologiques ont été effectués, sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après :
Tableau 1 : Localisation des stations de prélèvement
Dénomination de la station Localisation
Canal des étangs En dessous de la passerelle, Réserve des prés salés d’Arès – Lège-Cap Ferret
Cires En dessous du pont de la D3
Massurat Exutoire sur la plage, au Nord du port de Fontaine Vieille
Ponteils A la confluence des ruisseaux du Lanton, du Milieu, du Passaduy et du Ponteils, entrée du canal de Graveyron
Leyre En dessous du pont de Lamothe Piquey 44°42’48.16 N ; 1°11’19.30 W Grand Banc 44°39’54.30 N ; 1°13’02.64 W Mapoutchet 44°40’25.94 N ; 1°09’25.21 W
Banc d’Arguin Au niveau du point Ifremer REPHY 44°34’37.87 N ; 1°13’56.17 W
7
février 2012
7
La carte ci-dessous (Figure 1) montre la localisation de ces points :
Figure 1 : Carte montrant la localisation des stations de prélèvement Les prélèvements destinés aux tests écotoxicologiques ont été réalisés aux périodes suivantes (années 2010 et 2011) :
- le 11 mai 2010 - le 3 juin 2010 - le 4 octobre 2010 - le 22 mars 2011 - le 4 mai 2011 - le 17 mai 2011 - le 6 juin 2011 - le 17 juin 2011 - le 21 juin 2011 - le 4 août 2011 - le 9 novembre 2011
8
février 2012
4. Résultats
L’ensemble des tests réalisés depuis la mise en place du réseau REPAR, jusqu’à la fin de l’année 2011, est présenté ci-après. Sont présentés successivement, campagne par campagne, les résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique, puis ceux des tests larves d’huître.
4.1. Campagne du 11 mai 2010 Seul le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a été effectué (Figure 2)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique
Prélèvement du 11 mai 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
T0 Jour1 Jour2 Jour3 Jour4 Jour5
Temps
Nb
de c
ellu
les/
ml
Témoin
Arguin
Grand Banc
Piquey
Mapoutchet
Figure 2 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 11 mai 2010 On constate une légère inhibition de croissance phytoplanctonique pour l’eau prélevée à Grand Banc. La chute de la photosynthèse pour l’eau prélevée à Arguin à J5 est plutôt liée à un épuisement des réserves qu’à un effet herbicide sur la ressource.
4.2. Campagne du 3 juin 2010 Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués : le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique (Figure 3) et le test larves d’huîtres (Figure 4).
9
février 2012
9
Test d''inhibition dec croissance phytoplanctoniqueCampagne du 3 juin 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
T0 T24 T48 T72 T96 T120
Temps
cellu
les/
ml
Arguin
Grand Banc
Piquey
Mapoutchet
Leyre
Figure 3 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 3 juin 2010 L’infléchissement général des courbes de croissance à partir de 72 heures peut être considéré comme lié à la dynamique de croissance (épuisement de la nourriture). Le point Arguin, le plus éloigné des apports terrigènes a été utilisé ici comme témoin et présente la meilleure croissance, suivi du point Grand Banc. Le point Leyre présente la moins bonne croissance. Les points Piquey et Mapoutchet présentent une croissance intermédiaire.
Test larves d'huîtresPrélèvement du 3 juin 2010
0102030405060708090
100
Arguin
Piquey
Map
outch
et
Leyr
e
Points
% m
alfo
rmat
ions
Figure 4 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 3 juin 2010
10
février 2012
10
Les eaux de la Leyre occasionnent – dans les conditions du test – des malformations larvaires pour 100 % de la population, tandis que celles prélevées à Piquey et Mapoutchet présentent un taux de malformation plus faible (de l’ordre de 40%). Les eaux prélevées à Arguin, avec un pourcentage de malformations larvaires inférieur à 20%, peuvent être considérées aussi comme un « témoin ».
4.3. Campagne du 4 octobre 2010
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 5 et 6)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctoniquePrélèvement du 4 octobre 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
T0 jour1 jour2 jour3 jour4 jour5
Temps
Nom
bre
de c
ellu
les
/ml
témoin
Arguin
Mapoutchet
Cires
Leyre
Ponteil
Figure 5 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 4 octobre 2010
On note un très mauvais démarrage de la pousse phytoplanctonique pour le phytoplancton soumis en présence des eaux en provenance de Cires, Leyre et Ponteil, alors que les eaux en provenance d’Arguin ou de Mapoutchet n’occasionnent pas d’inhibition de croissance (la chute à J5 du témoin est due à l’épuisement des réserves)
11
février 2012
11
Test larves d'huîtres Prélèvement du 04/10/2010
0102030405060708090
100
T1 T2
Arguin
Map
outch
et
Cires
Leyr
e
Ponte
il
Points
% m
alfo
rmat
ion
Figure 6 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 4 octobre 2010 Les eaux issues des exutoires (Leyre, Cires, Ponteil) présentent un pourcentage d’anomalies larvaires de 100% et compris entre 40 et 50% pour Mapoutchet et Arguin (Figure 6).
4.4. Campagne du 22 mars 2011
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 7 et 8)
12
février 2012
12
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique Prélèvement du 22 mars 2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
Départ Jour 1 jour2 jour3 jour4 Jour5
Témoin
ARGUIN
MAPOUTCHET
LEYRE
PONTEIL
Can ETANGS
Figure 7 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 22 mars 2011 Malgré une absence de comptage phytoplanctonique à J3 (Impossibilité d’accès à l’écloserie de La Tremblade), on ne note pas d’effet inhibiteur très marquant dans l’inhibition de croissance phytoplanctonique, y compris pour les eaux de la Leyre, des Ponteils et du Canal des Etangs.
Test larves d'huîtres du 22 mars 2011
0
20
40
60
80
100
120
Témoin1 Témoin 2 Leyre 22/03 P onteils 22/03 Canal Etangs22/03
Pou
rcen
tage
mal
form
atio
ns
Figure 8 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 22 mars 2011 On constate de fortes anomalies larvaires pour les exutoires (avec des pourcentages de malformations proches de 100%).
4.5. Campagne du 4 mai 2011
Pour cette campagne, seul le test larves d’huîtres a été effectué (Figure 9)
13
février 2012
13
Test larves d'huîtres du 4/05/2011
0102030405060708090
100
Arguin
Map
outch
et
Leyr
e
Ponte
ils
Canal
Etang
s
Pou
rcen
tage
mal
form
atio
ns
Figure 9 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 4 mai 2011 Les eaux de la Leyre ont présenté, le 4 mai 2011, un pourcentage d’anomalies de l’ordre de 50%, tandis que celles du canal du Ponteil et du canal des Etangs présentaient respectivement des pourcentages d’anomalies larvaires de l’ordre de 80%.
4.6. Campagne du 17 mai 2011
Pour cette campagne, seul le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a été effectué (Figure 10)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique
Prélèvement du 17 mai 2011
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
T0 jour1 jour2 jour3 jour4 jour5
Temps
Nb
de c
ellu
les/
ml Témoin
Arguin
Mapoutchet
Leyre
Ponteils
Etangs
Figure 10 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 17 mai 2011
14
février 2012
14
L’inhibition de croissance phytoplanctonique est plus marquée pour les eaux en provenance des exutoires (environ 600 000 cellules par litre à J3 contre 800 000 dans le témoin). Rappelons que l’infléchissement général des courbes de croissance à partir de 72 heures peut être considéré comme lié à la dynamique de croissance et non à des effets inhibiteurs lié à des produits à caractère herbicide.
4.7. Campagnes des 6, 17 et 21 juin 2011 (Leyre) Lors de ces 3 campagnes, les prélèvements ont été effectués uniquement dans la Leyre, à des époques suivant de faibles épisodes pluvieux.
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 11 et 12)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctoniquePrélèvements des 6, 17 et 21 juin 2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
Dépar
t
Jour
1Jo
ur2
Jour
3Jo
ur4
Jour
5
Temps
Nb
cellu
les/
ml
Témoin
Leyre 6/06/11
Leyre 17/06/11
Leyre 21/06/11
Figure 11 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011 On note pour les 3 prélèvements réalisés dans la Leyre entre le 6 juin et le 21 juin 2011, une moins bonne croissance phytoplanctonique et donc une plus forte inhibition induite par les eaux de cet exutoire : à J3, au maximum de croissance dans les conditions du test (avant que les réserves ne s’épuisent) ; les comptages phytoplanctoniques sont – en cellules/L - respectivement de : 1210000, 1383000, 1654000 contre 1886000 pour le témoin.
15
février 2012
15
Test larves d'huîtresPrélèvements des 6, 17 et 21 juin 2011
0102030405060708090
Témoin1 Témoin2 Leyre 6/06 Leyre17/06 Leyre21/06
Points
% m
alfo
rmat
ions
Figure 12 : Résultats des tests larves d’huîtres pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011 Les pourcentages de malformations larvaires, pour ces prélèvements effectués en juin, sont compris entre 61 et 68% pour les eaux de la Leyre.
4.8. Campagne du 4 août 2011 (Leyre) Elle a porté sur les tests « larves d’huître » sur la Leyre (Figure 13). ils ont été réalisés en triplicat, à partir de trois prélèvements effectués de manière concomitante dans la Leyre : 100% de malformations larvaires ont été observées , un test supplémentaire a été effectué avec un toxique de référence permettent de s’assurer de la validité de ce test. Le pourcentage d’anomalies des témoins (sur eau de mer filtrée), en moyenne, est inférieur à 20%, même si le premier témoin accusait 30% de malformations.
Test larves d'huîtres Prélèvement du 4 août 2011
-20
0
20
40
60
80
100
120
Témoin 1
Témoin 2
Leyre1 Leyre2 Leyre3 Toxic réf
Points
% malformation
04/08/11
16
février 2012
16
Figure 13 : Résultats des tests larves d’huîtres pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011
4.9. La campagne du 9 novembre 2011 Elle n’a porté que sur les tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique (Figure 14)
Inhibition phytoplanctonique 9/11/2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
Départ jour 1 jour 2 jour 3 jour 4 jour 5
Temps
Nb
de c
ellu
les
Témoin
ARGUIN
MAPOUTCHET
PONTEILS
LEYRE
Can ETANGS
Figure 14 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 9 novembre 2011 Les inhibitions de croissance – au bout de 5 jours – sont respectivement de 48 et 41 % pour les Ponteils et la Leyre, de 36% pour le canal des Etangs et Arguin, et de 19% à Mapoutchet, par rapport à la culture témoin.
17
février 2012
17
5. Discussion :
Ces tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011 n’ont pas été systématiquement effectués sur tous les points et pour toutes les campagnes. Ils permettent cependant de dégager un certain nombre de conclusions qui méritent d’être vérifiées de manière plus systématique, notamment au printemps 2012. D’une manière générale, les eaux issues du point « Arguin », le plus éloigné des apports terrigènes, présente la meilleure croissance phytoplanctonique (comportement proche du témoin) et un faible pourcentage d’anomalies larvaires (à l’exception du 4 octobre 2010, où le pourcentage d’anomalies était de l’ordre de 50%). Les eaux issues de la Leyre présentent la moins bonne croissance phytoplanctonique (la plus forte inhibition, pouvant atteindre 60 % d’inhibition de croissance), ainsi que les anomalies larvaires les plus importantes (maximales) : on y retrouve la plupart du temps un pourcentage d’anomalies larvaires de 100 % (à l’exception du 4 mai 2011 et des 3 prélèvements de juin 2011, où ce pourcentage a oscillé entre 50 et 70 %). Les autres exutoires sur lesquels des déterminations ont été faites (Cires, Ponteil, canal des Etangs) ont présenté suivant les saisons des pourcentages d’anomalies larvaires compris entre 100 % (4 octobre 2010, 22 mars 2011) et 70 – 80 % (4 mai 2011). Le Ponteil a présenté, le 4 octobre 2010, un pourcentage d’inhibition de croissance phytoplanctonique de l’ordre de 80%. Dans les autres cas de figure, les pourcentages d’inhibition de croissance phytoplanctonique dans les exutoires étaient presque toujours plus importants que dans le Bassin. Les points mesurés situés dans le Bassin d’Arcachon (Grand Banc, Piquey, Mapoutchet) présentent une croissance phytoplanctonique meilleure qu’au débouché des exutoires et des anomalies larvaires moins marquées.
6. Prospective :
A l’issue de ces observations, plusieurs constations peuvent être effectuées pour la suite de l’étude dans le cadre du réseau :
− Il est souhaitable de poursuivre ces 2 types de tests aux mêmes périodes que 2011, à savoir : mi mars, mi juin, début août,.. en vue d’avoir une échelle de comparaison pour des périodes identiques ;
− La confrontation des résultats issus de ces tests avec les analyses chimiques effectuées par l’Université de Bordeaux (laboratoire EPOC / LPTC) devrait permettre d’apporter des éléments d’explication, notamment pour les secteurs où les plus fort pourcentages de malformations larvaires et les plus fortes inhibitions de croissance phytoplanctonique ont été observés .
18
février 2012
18
− Le résultat de l’enquête effectuée par le SRAL (DRAAF) permettra aussi d’apporter des précisions sur ces résultats, ainsi qu’éventuellement d’élargir la liste des pesticides recherchés ;
− Il est souhaitable aussi que des tests puissent être réalisés sur un mélange (« cocktail ») de molécules mesurées (ou piégées sur des POCIS) – fourni par le LPTC - afin de mettre en évidence un lien potentiel entre réponse écotoxicologique et teneurs en phytosanitaires, aux concentrations trouvées dans le milieu. Une telle approche peut également être effectuée sur quelques molécules (et produits de dégradation) trouvées en forte quantité dans le milieu.
7. Bibliographie:
His, E., Seaman, M.,Beiras,R., A simplification the bivalve embryogenesis and larval development bioassay mathod for water quality assessment. Wat. Res. Vol 31 N) 2, pp 351-355, 1997 Woelke, C.E., 1960 Effects of sulfite waste liquor on the normal development of Pacific oyster (Crassostrea gigas) larvae. Washington state Department Fisheries Research Bulletin, 6.
8. Annexes
19
février 2012
19
Annexe 1 : Déroulement du test « larves d’huîtres » La mise des géniteurs dans l'eau de mer filtrée (0,2 µ) à 28 °C pendant trente minutes suffit théoriquement à déclencher les pontes. Sinon un choc thermique froid à 18 °C pendant trente minutes est pratiqué, et ainsi de suite jusqu'à la ponte. Chaque individu commençant à pondre est isolé dans un local, les produits sexuels étant examinés au microscope. Les spermatozoïdes les plus actifs et les ovules les plus mûrs (forme ronde et non oblongue ou à angles vifs) sont sélectionnés pour la fécondation. Cette dernière s'effectue dans une éprouvette d'un litre, si possible dans les vingt minutes suivant l'émission des ovules (les spermatozoïdes pouvant, eux survivre plusieurs heures). Le nombre d'œufs par mL est estimé par sous échantillonnage durant la fécondation (10 minutes), ce qui permet de calculer le volume nécessaire à six cents œufs par réplicat. Chaque prélèvement d'eau à tester a été au préalable mélangé à deux fois son volume d'eau de mer filtrée (afin de permettre la survie des larves, la salinité étant ajustée si nécessaire au sel marin à 25 %0) et réparti dans cinq acuvettes de 20 ml, afin d'avoir 5 réplicats par échantillons (et une sécurité d'estimation par intervalle confiance).
Photo 1 : Géniteurs en train de pondre Cinq ou dix acuvettes remplies d'eau de mer filtrée à 0.2 µ constituent le lot témoin. Le tout est mis à incuber 24 heures dans l'obscurité. Au bout de 24 heures, les larves ayant atteint le stade "D" sont tuées et fixées au formol.
Le comptage des acuvettes (lots de 100 individus) donne le pourcentage de malformation.
20
février 2012
20
Les résultats du test ne sont valables que si le pourcentage moyen de malformations des témoins est inférieur à 20 %. L’échelle de qualité des eaux instaurée par His permet de donner à chacune des eaux testées un degré de pollution selon le pourcentage de malformation détecté : jusqu’à 25 %, milieu peu pollué, de 25 à 50 %, milieu moyennement pollué, de 50 à 75 %, milieu très pollué et de 75 à 100 %, milieu massivement pollué.
Photo 2. Observation microscopique d’une larve D « normale »
(V. Dupin)
Photo 3. Observation microscopique d’une Larve
D concave (V. Dupin)
Photo 4. Observation microscopique d’une Larve D échancrée
(V. Dupin)
Photo 5. Observation microscopique d’un
embryon "monstrueux" (V. Dupin)
Au delà de 20 % de malformation moyenne sur les témoins, le test n'est pas utilisable (d'où l'intérêt d’avoir des géniteurs de bonne qualité et de processus de ponte non traumatisants). En ce qui concerne les tests réalisés sur les eaux douces (Leyre et autres exutoires) - afin de permettre le développement des larves - les salinités ont tout d’abord été ajustées avec du sel marin à 30 g/l ; puis, dans un second temps, à partir d’octobre 2010, une dilution a été effectuée à partir d’un tiers d’eau douce et de deux tiers d’eau de mer filtrée (les résultats obtenus sont donc par défaut). Les témoins effectués avec du sel ou de l’eau de mer ont montré des « différences minimes ». L'eau de mer utilisée provient de l'écloserie de l’Ifremer de La Tremblade : elle est pompée en Seudre ; elle présente une salinité de 30 à 34 pour mille, décantée dans des bassins de 300 mètres cubes, filtrée au filtre à sable, refiltrée à 2 microns pour alimenter l'écloserie. C’est celle qui est utilisée aussi pour les témoins. Une détermination avec un toxique de référence a également été effectuée.
21
février 2012
21
Annexe 2 : Déroulement du test "Test d'inhibition phytoplanctonique" Le principe du test consiste à développer une culture mono spécifique de phytoplancton mis en présence d'eau prélevée sur cinq jours. Les espèces utilisées ici sont Chætoceros gracilis et Isochrisis galbana, diatomées normalement présentes dans les bassins ostréicoles et cultivées en écloserie.
Photo 6.
Observation microscopiqueIsochrysis galbana (source Ifremer)
Photo 7 Salle de culture du phytoplancton
(F. Aubry) A partir d'une culture mère, les échantillons d'eau filtrée sont ensemencés ; un témoin avec en moyenne 1,5 millions de cellules par litres est effectué ; la salinité est ramenée à 32 ‰ si nécessaire. Un milieu nutritif (Conway) est rajouté dans les fioles préalablement stérilisées et les échantillons en triplicat sont mis en chambre isotherme. Un comptage au microscope sur cellule de Malassez détermine le nombre de cellules par litre. Au bout de 4 jours, l'expérience est interrompue, les cultures témoin ayant normalement atteint leur plateau sur la courbe de croissance.
Photo 8. Mise en culture du phytoplancton
département unité et/ou laboratoire Daniel MASSON – LERPC Roger KANTIN – LER AR Février - 2012 – RST/ODE/LER/LER-PC/LER-AR –12-001
Réseau pesticides Arcachon (REPAR)
Résultat des tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011 Etude financée par le SIBA
2
février 2012
2
Réseau pesticides Arcachon (REPAR)
Résultat des tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011
3
février 2012
SOMMAIRE 1. Rappel des motivations de l’Ifremer au titre de la convention multipartenariale .................................. .........................................................4
2. Les tests utilisés .............................. .........................................................4
3. Localisation des stations de mesures et fréquenc es de prélèvements6
4. Résultats....................................... .............................................................8
4.1. Campagne du 11 mai 2010................................................................................................8 4.2. Campagne du 3 juin 2010..................................................................................................8 4.3. Campagne du 4 octobre 2010 .........................................................................................10 4.4. Campagne du 22 mars 2011 ...........................................................................................11 4.5. Campagne du 4 mai 2011................................................................................................12 4.6. Campagne du 17 mai 2011..............................................................................................13 4.7. Campagnes des 6, 17 et 21 juin 2011 (Leyre).................................................................14 4.8. Campagne du 4 août 2011 (Leyre) ..................................................................................15 4.9. La campagne du 9 novembre 2011 .................................................................................16
5. Discussion :.................................... .........................................................17
6. Prospective : ................................... ........................................................17
7. Bibliographie:.................................. ........................................................18
8. Annexes......................................... ..........................................................18
4
février 2012
1. Rappel des motivations de l’Ifremer au titre de la convention multipartenariale
La convention-cadre, pilotée par le SIBA, précise les modalités d’installation d’un réseau « de recherche, de suivi et d’expertise » sur les substances à caractère phytosanitaire dans le Bassin d’Arcachon – baptisé « REPAR » -, et décrit les contributions de chaque contributeur : SIBA, Agence de l’Eau Adour Garonne, Université de Bordeaux 1, Irstea (Cemagref), Ifremer, et DRAAF / SRAL . Le rôle de l’Ifremer est d’apporter sa connaissance dans ce domaine (suite à des études antérieures) et de réaliser des tests écotoxicologiques. Ces derniers ont essentiellement pour objectif de permettre de caractériser un éventuel impact sur la ressource, ce qui permettra à terme de retenir ou pas ce type de tests, voire de les compléter par d’autres. Le lien avec l’activité conchylicole a été affiché dans la convention – cadre, raison pour laquelle les tests retenus ont été le test « larves d’huîtres » et le test « d’inhibition de croissance phytoplanctonique » à partir de prélèvements d’eau brute. Un protocole a été mis au point (par le LER PC de l’Ifremer à La Tremblade, du fait de la proximité de son écloserie expérimentale).
2. Les tests utilisés
Les tests écotoxicologiques ont pour objectif d’évaluer le stress d’organismes indicateurs soumis à une contamination chimique; les tests retenus dans le cadre de REPAR sont le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique et le test larves d’huîtres. Le test larves d’huîtres est basé sur le pourcentage d’anomalies au stade larvaire « D » de Crassostrea gigas par rapport à un témoin. Ce test mis au point par His et al., (1997) adapté de Woelke (1960) utilise l'huître Crassostrea gigas, espèce présente et élevée sur zone (cf. annexe 1). Le test consiste à induire la ponte de géniteurs préalablement conditionnés en écloserie (lorsque l'on est en dehors des périodes normales de reproduction, soit juillet et août), de la manière la plus naturelle et la moins traumatisante possible pour les animaux. Il s'agit en effet d'obtenir le moins possible de larves malformées dans les lots. La difficulté d'obtenir des géniteurs en état de se reproduire nécessite d’avoir recours à des écloseries. L’échelle de qualité des eaux instaurée par His permet de donner à chacune des eaux testées un degré de pollution selon le pourcentage de malformation larvaire détecté ; ces tests sont effectués dans des conditions expérimentales bien définies et reproductibles. Le « blanc » est testé, et l’efficacité du test est vérifié avec un « toxique de référence » (sulfate de cuivre).
5
février 2012
5
Le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a pour objet de connaître l'effet direct des contaminants à propriétés herbicides sur la capacité photosynthétique des populations (et plus généralement sur la productivité primaire). La réalisation de ce test passe par le choix d’espèces cibles, spécifique des communautés pour chaque saison étudiée ; ces cultures monospécifiques (par exemple Isochrisis galbana) sont ensuite soumises – dans des conditions optimales de température, salinité et nutriments – à la présence d’eau contenant des substances susceptibles de freiner leur croissance. Une estimation quantitative du déficit de croissance de la culture phytoplanctonique mise en présence d’eau susceptible de contenir des substances à caractère herbicide inhibitrices de la production primaire – par rapport à une culture témoin - est effectuée (annexe 2).
Ces deux types de tests écotoxicologiques sont réalisés par l’Ifremer- La Tremblade (D. Masson / Laboratoire Environnement Ressources / Poitou Charentes) à partir d’eau brute.
A terme, des tests écotoxicologiques supplémentaires portant sur un mélange de molécules correspondant à celui retrouvé dans les prélèvements sont également prévus.
6
février 2012
3. Localisation des stations de mesures et fréquences de prélèvements
Les stations suivantes sont échantillonnées de manière régulière à basse mer pour les analyses chimiques, mais seulement une partie d’entre elles (résultats sur les graphiques) ont été prises en compte pour les tests écotoxicologiques. Les points pris en compte dans le réseau REPAR, et pour lesquels des tests écotoxicologiques ont été effectués, sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après :
Tableau 1 : Localisation des stations de prélèvement
Dénomination de la station Localisation
Canal des étangs En dessous de la passerelle, Réserve des prés salés d’Arès – Lège-Cap Ferret
Cires En dessous du pont de la D3
Massurat Exutoire sur la plage, au Nord du port de Fontaine Vieille
Ponteils A la confluence des ruisseaux du Lanton, du Milieu, du Passaduy et du Ponteils, entrée du canal de Graveyron
Leyre En dessous du pont de Lamothe Piquey 44°42’48.16 N ; 1°11’19.30 W Grand Banc 44°39’54.30 N ; 1°13’02.64 W Mapoutchet 44°40’25.94 N ; 1°09’25.21 W
Banc d’Arguin Au niveau du point Ifremer REPHY 44°34’37.87 N ; 1°13’56.17 W
7
février 2012
7
La carte ci-dessous (Figure 1) montre la localisation de ces points :
Figure 1 : Carte montrant la localisation des stations de prélèvement Les prélèvements destinés aux tests écotoxicologiques ont été réalisés aux périodes suivantes (années 2010 et 2011) :
- le 11 mai 2010 - le 3 juin 2010 - le 4 octobre 2010 - le 22 mars 2011 - le 4 mai 2011 - le 17 mai 2011 - le 6 juin 2011 - le 17 juin 2011 - le 21 juin 2011 - le 4 août 2011 - le 9 novembre 2011
8
février 2012
4. Résultats
L’ensemble des tests réalisés depuis la mise en place du réseau REPAR, jusqu’à la fin de l’année 2011, est présenté ci-après. Sont présentés successivement, campagne par campagne, les résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique, puis ceux des tests larves d’huître.
4.1. Campagne du 11 mai 2010 Seul le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a été effectué (Figure 2)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique
Prélèvement du 11 mai 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
T0 Jour1 Jour2 Jour3 Jour4 Jour5
Temps
Nb
de c
ellu
les/
ml
Témoin
Arguin
Grand Banc
Piquey
Mapoutchet
Figure 2 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 11 mai 2010 On constate une légère inhibition de croissance phytoplanctonique pour l’eau prélevée à Grand Banc. La chute de la photosynthèse pour l’eau prélevée à Arguin à J5 est plutôt liée à un épuisement des réserves qu’à un effet herbicide sur la ressource.
4.2. Campagne du 3 juin 2010 Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués : le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique (Figure 3) et le test larves d’huîtres (Figure 4).
9
février 2012
9
Test d''inhibition dec croissance phytoplanctoniqueCampagne du 3 juin 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
T0 T24 T48 T72 T96 T120
Temps
cellu
les/
ml
Arguin
Grand Banc
Piquey
Mapoutchet
Leyre
Figure 3 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 3 juin 2010 L’infléchissement général des courbes de croissance à partir de 72 heures peut être considéré comme lié à la dynamique de croissance (épuisement de la nourriture). Le point Arguin, le plus éloigné des apports terrigènes a été utilisé ici comme témoin et présente la meilleure croissance, suivi du point Grand Banc. Le point Leyre présente la moins bonne croissance. Les points Piquey et Mapoutchet présentent une croissance intermédiaire.
Test larves d'huîtresPrélèvement du 3 juin 2010
0102030405060708090
100
Arguin
Piquey
Map
outch
et
Leyr
e
Points
% m
alfo
rmat
ions
Figure 4 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 3 juin 2010
10
février 2012
10
Les eaux de la Leyre occasionnent – dans les conditions du test – des malformations larvaires pour 100 % de la population, tandis que celles prélevées à Piquey et Mapoutchet présentent un taux de malformation plus faible (de l’ordre de 40%). Les eaux prélevées à Arguin, avec un pourcentage de malformations larvaires inférieur à 20%, peuvent être considérées aussi comme un « témoin ».
4.3. Campagne du 4 octobre 2010
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 5 et 6)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctoniquePrélèvement du 4 octobre 2010
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
T0 jour1 jour2 jour3 jour4 jour5
Temps
Nom
bre
de c
ellu
les
/ml
témoin
Arguin
Mapoutchet
Cires
Leyre
Ponteil
Figure 5 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 4 octobre 2010
On note un très mauvais démarrage de la pousse phytoplanctonique pour le phytoplancton soumis en présence des eaux en provenance de Cires, Leyre et Ponteil, alors que les eaux en provenance d’Arguin ou de Mapoutchet n’occasionnent pas d’inhibition de croissance (la chute à J5 du témoin est due à l’épuisement des réserves)
11
février 2012
11
Test larves d'huîtres Prélèvement du 04/10/2010
0102030405060708090
100
T1 T2
Arguin
Map
outch
et
Cires
Leyr
e
Ponte
il
Points
% m
alfo
rmat
ion
Figure 6 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 4 octobre 2010 Les eaux issues des exutoires (Leyre, Cires, Ponteil) présentent un pourcentage d’anomalies larvaires de 100% et compris entre 40 et 50% pour Mapoutchet et Arguin (Figure 6).
4.4. Campagne du 22 mars 2011
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 7 et 8)
12
février 2012
12
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique Prélèvement du 22 mars 2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
Départ Jour 1 jour2 jour3 jour4 Jour5
Témoin
ARGUIN
MAPOUTCHET
LEYRE
PONTEIL
Can ETANGS
Figure 7 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 22 mars 2011 Malgré une absence de comptage phytoplanctonique à J3 (Impossibilité d’accès à l’écloserie de La Tremblade), on ne note pas d’effet inhibiteur très marquant dans l’inhibition de croissance phytoplanctonique, y compris pour les eaux de la Leyre, des Ponteils et du Canal des Etangs.
Test larves d'huîtres du 22 mars 2011
0
20
40
60
80
100
120
Témoin1 Témoin 2 Leyre 22/03 P onteils 22/03 Canal Etangs22/03
Pou
rcen
tage
mal
form
atio
ns
Figure 8 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 22 mars 2011 On constate de fortes anomalies larvaires pour les exutoires (avec des pourcentages de malformations proches de 100%).
4.5. Campagne du 4 mai 2011
Pour cette campagne, seul le test larves d’huîtres a été effectué (Figure 9)
13
février 2012
13
Test larves d'huîtres du 4/05/2011
0102030405060708090
100
Arguin
Map
outch
et
Leyr
e
Ponte
ils
Canal
Etang
s
Pou
rcen
tage
mal
form
atio
ns
Figure 9 : Résultats des tests larves d’huîtres pour la campagne du 4 mai 2011 Les eaux de la Leyre ont présenté, le 4 mai 2011, un pourcentage d’anomalies de l’ordre de 50%, tandis que celles du canal du Ponteil et du canal des Etangs présentaient respectivement des pourcentages d’anomalies larvaires de l’ordre de 80%.
4.6. Campagne du 17 mai 2011
Pour cette campagne, seul le test d’inhibition de croissance phytoplanctonique a été effectué (Figure 10)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctonique
Prélèvement du 17 mai 2011
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
T0 jour1 jour2 jour3 jour4 jour5
Temps
Nb
de c
ellu
les/
ml Témoin
Arguin
Mapoutchet
Leyre
Ponteils
Etangs
Figure 10 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 17 mai 2011
14
février 2012
14
L’inhibition de croissance phytoplanctonique est plus marquée pour les eaux en provenance des exutoires (environ 600 000 cellules par litre à J3 contre 800 000 dans le témoin). Rappelons que l’infléchissement général des courbes de croissance à partir de 72 heures peut être considéré comme lié à la dynamique de croissance et non à des effets inhibiteurs lié à des produits à caractère herbicide.
4.7. Campagnes des 6, 17 et 21 juin 2011 (Leyre) Lors de ces 3 campagnes, les prélèvements ont été effectués uniquement dans la Leyre, à des époques suivant de faibles épisodes pluvieux.
Les deux tests écotoxicologiques ont été effectués (Figures 11 et 12)
Test d'inhibition de croissance phytoplanctoniquePrélèvements des 6, 17 et 21 juin 2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
Dépar
t
Jour
1Jo
ur2
Jour
3Jo
ur4
Jour
5
Temps
Nb
cellu
les/
ml
Témoin
Leyre 6/06/11
Leyre 17/06/11
Leyre 21/06/11
Figure 11 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011 On note pour les 3 prélèvements réalisés dans la Leyre entre le 6 juin et le 21 juin 2011, une moins bonne croissance phytoplanctonique et donc une plus forte inhibition induite par les eaux de cet exutoire : à J3, au maximum de croissance dans les conditions du test (avant que les réserves ne s’épuisent) ; les comptages phytoplanctoniques sont – en cellules/L - respectivement de : 1210000, 1383000, 1654000 contre 1886000 pour le témoin.
15
février 2012
15
Test larves d'huîtresPrélèvements des 6, 17 et 21 juin 2011
0102030405060708090
Témoin1 Témoin2 Leyre 6/06 Leyre17/06 Leyre21/06
Points
% m
alfo
rmat
ions
Figure 12 : Résultats des tests larves d’huîtres pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011 Les pourcentages de malformations larvaires, pour ces prélèvements effectués en juin, sont compris entre 61 et 68% pour les eaux de la Leyre.
4.8. Campagne du 4 août 2011 (Leyre) Elle a porté sur les tests « larves d’huître » sur la Leyre (Figure 13). ils ont été réalisés en triplicat, à partir de trois prélèvements effectués de manière concomitante dans la Leyre : 100% de malformations larvaires ont été observées , un test supplémentaire a été effectué avec un toxique de référence permettent de s’assurer de la validité de ce test. Le pourcentage d’anomalies des témoins (sur eau de mer filtrée), en moyenne, est inférieur à 20%, même si le premier témoin accusait 30% de malformations.
Test larves d'huîtres Prélèvement du 4 août 2011
-20
0
20
40
60
80
100
120
Témoin 1
Témoin 2
Leyre1 Leyre2 Leyre3 Toxic réf
Points
% malformation
04/08/11
16
février 2012
16
Figure 13 : Résultats des tests larves d’huîtres pour les prélèvements effectués dans la Leyre au mois de juin 2011
4.9. La campagne du 9 novembre 2011 Elle n’a porté que sur les tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique (Figure 14)
Inhibition phytoplanctonique 9/11/2011
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
Départ jour 1 jour 2 jour 3 jour 4 jour 5
Temps
Nb
de c
ellu
les
Témoin
ARGUIN
MAPOUTCHET
PONTEILS
LEYRE
Can ETANGS
Figure 14 : Résultats des tests d’inhibition de croissance phytoplanctonique pour la campagne du 9 novembre 2011 Les inhibitions de croissance – au bout de 5 jours – sont respectivement de 48 et 41 % pour les Ponteils et la Leyre, de 36% pour le canal des Etangs et Arguin, et de 19% à Mapoutchet, par rapport à la culture témoin.
17
février 2012
17
5. Discussion :
Ces tests écotoxicologiques effectués en 2010 et en 2011 n’ont pas été systématiquement effectués sur tous les points et pour toutes les campagnes. Ils permettent cependant de dégager un certain nombre de conclusions qui méritent d’être vérifiées de manière plus systématique, notamment au printemps 2012. D’une manière générale, les eaux issues du point « Arguin », le plus éloigné des apports terrigènes, présente la meilleure croissance phytoplanctonique (comportement proche du témoin) et un faible pourcentage d’anomalies larvaires (à l’exception du 4 octobre 2010, où le pourcentage d’anomalies était de l’ordre de 50%). Les eaux issues de la Leyre présentent la moins bonne croissance phytoplanctonique (la plus forte inhibition, pouvant atteindre 60 % d’inhibition de croissance), ainsi que les anomalies larvaires les plus importantes (maximales) : on y retrouve la plupart du temps un pourcentage d’anomalies larvaires de 100 % (à l’exception du 4 mai 2011 et des 3 prélèvements de juin 2011, où ce pourcentage a oscillé entre 50 et 70 %). Les autres exutoires sur lesquels des déterminations ont été faites (Cires, Ponteil, canal des Etangs) ont présenté suivant les saisons des pourcentages d’anomalies larvaires compris entre 100 % (4 octobre 2010, 22 mars 2011) et 70 – 80 % (4 mai 2011). Le Ponteil a présenté, le 4 octobre 2010, un pourcentage d’inhibition de croissance phytoplanctonique de l’ordre de 80%. Dans les autres cas de figure, les pourcentages d’inhibition de croissance phytoplanctonique dans les exutoires étaient presque toujours plus importants que dans le Bassin. Les points mesurés situés dans le Bassin d’Arcachon (Grand Banc, Piquey, Mapoutchet) présentent une croissance phytoplanctonique meilleure qu’au débouché des exutoires et des anomalies larvaires moins marquées.
6. Prospective :
A l’issue de ces observations, plusieurs constations peuvent être effectuées pour la suite de l’étude dans le cadre du réseau :
− Il est souhaitable de poursuivre ces 2 types de tests aux mêmes périodes que 2011, à savoir : mi mars, mi juin, début août,.. en vue d’avoir une échelle de comparaison pour des périodes identiques ;
− La confrontation des résultats issus de ces tests avec les analyses chimiques effectuées par l’Université de Bordeaux (laboratoire EPOC / LPTC) devrait permettre d’apporter des éléments d’explication, notamment pour les secteurs où les plus fort pourcentages de malformations larvaires et les plus fortes inhibitions de croissance phytoplanctonique ont été observés .
18
février 2012
18
− Le résultat de l’enquête effectuée par le SRAL (DRAAF) permettra aussi d’apporter des précisions sur ces résultats, ainsi qu’éventuellement d’élargir la liste des pesticides recherchés ;
− Il est souhaitable aussi que des tests puissent être réalisés sur un mélange (« cocktail ») de molécules mesurées (ou piégées sur des POCIS) – fourni par le LPTC - afin de mettre en évidence un lien potentiel entre réponse écotoxicologique et teneurs en phytosanitaires, aux concentrations trouvées dans le milieu. Une telle approche peut également être effectuée sur quelques molécules (et produits de dégradation) trouvées en forte quantité dans le milieu.
7. Bibliographie:
His, E., Seaman, M.,Beiras,R., A simplification the bivalve embryogenesis and larval development bioassay mathod for water quality assessment. Wat. Res. Vol 31 N) 2, pp 351-355, 1997 Woelke, C.E., 1960 Effects of sulfite waste liquor on the normal development of Pacific oyster (Crassostrea gigas) larvae. Washington state Department Fisheries Research Bulletin, 6.
8. Annexes
19
février 2012
19
Annexe 1 : Déroulement du test « larves d’huîtres » La mise des géniteurs dans l'eau de mer filtrée (0,2 µ) à 28 °C pendant trente minutes suffit théoriquement à déclencher les pontes. Sinon un choc thermique froid à 18 °C pendant trente minutes est pratiqué, et ainsi de suite jusqu'à la ponte. Chaque individu commençant à pondre est isolé dans un local, les produits sexuels étant examinés au microscope. Les spermatozoïdes les plus actifs et les ovules les plus mûrs (forme ronde et non oblongue ou à angles vifs) sont sélectionnés pour la fécondation. Cette dernière s'effectue dans une éprouvette d'un litre, si possible dans les vingt minutes suivant l'émission des ovules (les spermatozoïdes pouvant, eux survivre plusieurs heures). Le nombre d'œufs par mL est estimé par sous échantillonnage durant la fécondation (10 minutes), ce qui permet de calculer le volume nécessaire à six cents œufs par réplicat. Chaque prélèvement d'eau à tester a été au préalable mélangé à deux fois son volume d'eau de mer filtrée (afin de permettre la survie des larves, la salinité étant ajustée si nécessaire au sel marin à 25 %0) et réparti dans cinq acuvettes de 20 ml, afin d'avoir 5 réplicats par échantillons (et une sécurité d'estimation par intervalle confiance).
Photo 1 : Géniteurs en train de pondre Cinq ou dix acuvettes remplies d'eau de mer filtrée à 0.2 µ constituent le lot témoin. Le tout est mis à incuber 24 heures dans l'obscurité. Au bout de 24 heures, les larves ayant atteint le stade "D" sont tuées et fixées au formol.
Le comptage des acuvettes (lots de 100 individus) donne le pourcentage de malformation.
20
février 2012
20
Les résultats du test ne sont valables que si le pourcentage moyen de malformations des témoins est inférieur à 20 %. L’échelle de qualité des eaux instaurée par His permet de donner à chacune des eaux testées un degré de pollution selon le pourcentage de malformation détecté : jusqu’à 25 %, milieu peu pollué, de 25 à 50 %, milieu moyennement pollué, de 50 à 75 %, milieu très pollué et de 75 à 100 %, milieu massivement pollué.
Photo 2. Observation microscopique d’une larve D « normale »
(V. Dupin)
Photo 3. Observation microscopique d’une Larve
D concave (V. Dupin)
Photo 4. Observation microscopique d’une Larve D échancrée
(V. Dupin)
Photo 5. Observation microscopique d’un
embryon "monstrueux" (V. Dupin)
Au delà de 20 % de malformation moyenne sur les témoins, le test n'est pas utilisable (d'où l'intérêt d’avoir des géniteurs de bonne qualité et de processus de ponte non traumatisants). En ce qui concerne les tests réalisés sur les eaux douces (Leyre et autres exutoires) - afin de permettre le développement des larves - les salinités ont tout d’abord été ajustées avec du sel marin à 30 g/l ; puis, dans un second temps, à partir d’octobre 2010, une dilution a été effectuée à partir d’un tiers d’eau douce et de deux tiers d’eau de mer filtrée (les résultats obtenus sont donc par défaut). Les témoins effectués avec du sel ou de l’eau de mer ont montré des « différences minimes ». L'eau de mer utilisée provient de l'écloserie de l’Ifremer de La Tremblade : elle est pompée en Seudre ; elle présente une salinité de 30 à 34 pour mille, décantée dans des bassins de 300 mètres cubes, filtrée au filtre à sable, refiltrée à 2 microns pour alimenter l'écloserie. C’est celle qui est utilisée aussi pour les témoins. Une détermination avec un toxique de référence a également été effectuée.
21
février 2012
21
Annexe 2 : Déroulement du test "Test d'inhibition phytoplanctonique" Le principe du test consiste à développer une culture mono spécifique de phytoplancton mis en présence d'eau prélevée sur cinq jours. Les espèces utilisées ici sont Chætoceros gracilis et Isochrisis galbana, diatomées normalement présentes dans les bassins ostréicoles et cultivées en écloserie.
Photo 6.
Observation microscopiqueIsochrysis galbana (source Ifremer)
Photo 7 Salle de culture du phytoplancton
(F. Aubry) A partir d'une culture mère, les échantillons d'eau filtrée sont ensemencés ; un témoin avec en moyenne 1,5 millions de cellules par litres est effectué ; la salinité est ramenée à 32 ‰ si nécessaire. Un milieu nutritif (Conway) est rajouté dans les fioles préalablement stérilisées et les échantillons en triplicat sont mis en chambre isotherme. Un comptage au microscope sur cellule de Malassez détermine le nombre de cellules par litre. Au bout de 4 jours, l'expérience est interrompue, les cultures témoin ayant normalement atteint leur plateau sur la courbe de croissance.
Photo 8. Mise en culture du phytoplancton
