7/5/2020

1

STANDART LABDAN

GENOM VIRUS SARS- COV-2

Silvia Tri Widyaningtyas

Pusat Riset Virologi dan Kanker Patobiologi

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

TOPIK

1. Standard Laboratorium Pemeriksaan Covid 19

2. Genom Virus SARS-COV-2 - karakteristiksequence)Evolusi dan persebaran genotipe

7/5/2020

2

PENGUJIAN INFEKSI SARS COV 2

NAAT ANTIGEN ANTIBODI

Nucleic acid amplification test

Penting

menjadi dasar penentuan status

dan tindakan

Hematologi

7/5/2020

3

STANDARD LABORATORIUM

PEMERIKSAAN COVID 19

Laboratorium penelitian (universitas)

Laboratorium klinik

Laboratorium Kesehatan (kementrian)

Standard sama

Hasil yang

dikeluarkan dapat

dipercaya

Aman untuk

operator dan

lingkungan

PERSYARATAN LABORATORIUM

Peralatan

Lab practices

Fasilitas

7/5/2020

4

FASILTAS

Sumber contaminant

pemeriksaan dengan PCR

Bagaimana

mencegah

kontaminasi? Miffin, 2007, DOI: 10.1101/pdb.top14 ·

FASILTAS 3 ROOMS STRATEGY(UNTUK PENGERJAAN BIOLOGI MOLEKULER )

2. Grey RoomEkstraksi RNA,

penyimpanan sampel

1. Clean AreaPenyiapan primer dan probes

Larutkan primer dan probes aliquo

Hindari freezing thawing berlebih

3. Red Area Mesin PCR, analisis PCR,

Positif control (simpan dlm aliquo dan hindari freezing

thawing)

7/5/2020

5

https://www.aphl.org/programs/newborn_screening/Documents/2015_Molecular-Workshop/Molecular-Laboratory-Design-QAQC-Considerations.pdf

FASILITAS RUANG EKSTRAKSI GENOM SARS-COV-2

(1) Personel harus ditraining dan diawasi oleh personel yang sudah berpengalaman

(2) Pembatasan akses masuk lab (3) Perhatian khusus pada benda tajam terkontaminasi(4) Prosedur yang meyebabkan terbentuknya aerosol, harus dikerjakan di BSC.

Untuk SARS-COV-2 BSC kelas 2

https://in.nau.edu/wp-content/uploads/sites/216/2018/10/BSL2_biosafety.png

7/5/2020

6

Biocontainment centrifuge

Autoclave

PERALATAN:

PCR Cabinet

Micropippet

Maintenance dan Kalibrasi

LAB PRACTICES PengumpulanSampel

Penerimaan dan penilaiansample

Pengujian

QA and QC

Pencatatan hasildan manajemen

data

Pelaporan

Pre analitik

Analitik

Post analitik

7/5/2020

7

LAB PRACTICESPre analitik

• Pengumpulan sample

• Penerimaan dan Penilaian sampel

1. Dilakukan oleh Personel terlatih2. Menggunakan (gown, respirator (N95 or

FFP2), pelindung mata (goggle) or wajah(face shield) and sarung tangan .

Pengumpulan sample Saluran nafas atas :- nasofaring- orofaring

Saluran nafas bawah : - sputum- cairan brokoalveolar- aspirasi trachea Viral Transport Medium

- Menjaga viabilitas virus

- Mencegah pertumbuhan bakteri/jamur

- Mengandung pH indicator

Swab

• Tip : terbuat dari

dacron atau nylon

• Batang : plastic atau

aluminium

Spesimen dapat disimpan 2-8°C : 72 jam;

jika pengujian tertunda sampel disimpan

-70°C atau lbh rendah.

LAB PRACTICESPre analitik

• Pengumpulan sample

• Penerimaan dan Penilaian sampel

7/5/2020

8

LAB PRACTICESPre analitik

• Pengumpulan sample

• Penerimaan dan Penilaian sampel

Penerimaan dan Penilaian sampel

Personel training

Personel protective equipment (PPE) melindungi sample dan personel

Dokumentasi :

personel

Data ke komputer/log book

Penyimpanan di lab

LAB PRACTICESPre analitik

• Pengumpulan sample

• Penerimaan dan Penilaian sampel

Penerimaan dan Penilaian sampel

Personel training

Personel protective equipment (PPE) melindungi sample dan personel

Dokumentasi :

personel

Data ke komputer/log book

Penyimpanan di lab

7/5/2020

9

LAB PRACTICESAnalitik • Pengujian

• Quality Control dan Quality Assesment

1. Training untuk personel

2. APD : Gown, goggle/face shield, sarung tangan,

sepatu lab /show cover; bagaimana urutan

menggunakan dan melepaskan APD

3. SOP : standard Operational Procedure

4. Penyimpanan reagen

5. Pembuangan Limbah

6. Pengaturan Personel

7. Verifikasi/validasi kit menggunakan beberapa sampel positif dan

negative (sesuai rekomendasi kit)

• Pengujian

Tip berfilter tip yang kontak

dengan sample dibilas dengan

bleach 5% sebelum dimasukkan ke

dalam tempat pembuangan

Lisis virus dengan buffer

mengandung guanidine thiosianat

dilakukan di dalam BSC

guanidine thiosianat + bleach

(sodium hypoklotir)

gas sianida

7/5/2020

10

LAB PRACTICESAnalitik • Pengujian

• Quality Control dan Quality Assurance

Quality Control dan Quality Assurance

Quality Control

Fokus : produk

Reaktif

Fungsi sistem pengujian

Untuk menemukan‘kekurangan’

Pengujian

Quality Assurance

Fokus : proses

Pro-active

Fungsi Personnel

Mencegah ‘kekurangan’

Audit kualitas

Quality Control :Pengambilan sampel

Isolasi RNA

Amplifikasi

7/5/2020

11

Quality control Kontrol negative ekstraksi : menunjukkan kontaminasi terjadi pada

tahap ekstraksi (VTM atau Air)

Kontrol positif ekstraksi : menunjukkan kualitas Template

(RNA/materi genetic) yang diekstraksi dan control adanya inhibitor

PCR (sampel manusia yang memiliki nilai Ct untuk sel target manusia

(contohnya RNASe P) rendah (25-30)

Kontrol PCR tanpa template (pada tahap PCR ) : menunjukkan

tidak ada kontaminasi pada reagen PCR

Internal control ditambahkan pada reaksi PCR untuk mengetahui

adanya inhibisi PCR pada RNA hsl ekstraksi

Interal control ditambahkan pada sampel untuk control ekstraksi

RNA

Kontrol positif PCR berupa template DNA/RNA sintetik SARS CoV

dlm bentuk fragmen atau genom utuh : mengindikasikan batas deteksi

dan performa assay

Courtesy of Pennsylvania

Department of Health Bureau

of Laboratories/Wikimedia

A microbiologist manually

extracts the coronavirus

SARS-CoV-2 virus particles

(pink dots) on a dying cell.

National Institute of Allergy

and Infectious Diseases, NIH

QUALITY CONTROL

Jika kontrol mengalami kegagalan, misalnya kontrolnegative menjadi positif, maka hasil pengujian tidak valid tes harus diulang, bisa dari aliquotan sampel atausampel baru dari pasien setelah dilakukan analisiskegagalan (misalnya kontaminasi, degradasi, atau reagensudah kadaluwarsa) .

Jika hasil sudah dikeluarkan : pasien harus dipanggilulang dan diberi penjelasan alasan pengambilan ulangsampel.

7/5/2020

12

BOTTLE NECK PEMERIKSAAN COVID 19

Deteksi molekuler virus COVID-19 spesifik untuk COVid 19

Hasil positif mengkonfirmasi deteksi virus.

Hasil negatif tidak selalu berarti tidak ada infeksi virus COVID-19

Kualitas sampel, penanganan, transportasi, dan / atau penyimpananyang buruk (untuk mengontrol hal ini, deteksi kualitatif house keeping gene [misalnya, RNase P dapat dilakukan).

Ekstraksi sampel yang buruk / gagal, adanya penghambat PCR dalamRNA yang diekstraksi (untuk mengendalikan hal ini, kontrol ekstraksidapat digunakan, atau deteksi gen housekeeping dilakukan sepertiyang disebutkan di atas).

Sampel dikumpulkan pada waktu di mana pasien tidak menghasilkanjumlah virus yang cukup, misalnya sangat awal atau sangat terlambatselama infeksi (titik ini sangat relevan karena dinamika keberadaanvirus dalam berbagai jenis sampel belum sepenuhnya ditetapkan.

Mutasi virus dapat memengaruhi sensitivitas deteksi.

QUALITY ASSURANCE TEST COVID-19

MEMBANDINGKAN PEFORMA SUATU LAB DENGAN SUATUKELOMPOK JEJARING LAB PEMERIKSAAN

Rechecking or retesting: sampel yang telah dites oleh suatu lab, di tes ulang oleh lab lain (perbandingan inter-lab)

WHO merekomendasikan penggunaan 5 sampel positif dan 10 sampel negative. Hasil dikonfirmasi oleh lab referens nasional/referral internasional [WHO, 2020a; WHO, 2020b].

Jika hasil pengujian selesai, dan memenuhi syarat, maka lab boleh mengerjakan tes, namun masih berkolaborasi dengan lab reference nasional

7/5/2020

13

LAB PRACTICESPost Analitik • Hasil

• Pelaporan

Hasil

The crossing point or threshold cycle (CT)

LP-log-linear phase of signal generated during the

exponential part of the PCR amplification;

TP-a slowing of the amplification

PP-the plateau phase is reached when there is little or no

increase in fluorescent signal despite continued cycling.

Hubungan Ct dengan Jumlah Virus :

Semakin rendah nilai Ct, semakin tinggi

jumlah virus; dan sebaliknya

INTERPRETASI HASIL PANEL CDC

Jika kontrol positif / internal kontrol (RP) tidak

menukjukkan kurva yang sigmoid, maka hasil tes Invalid

harus dilakukan pengulangan RT PCR

Jika Internal control (RP) negative maka harus dilakukan

pengulangan ekstraksi dan RT PCR dan jika hasil tetap

negative maka perlu dilakukan pengulangan

pengambilan sampel

Positif Covid-19

Inkonklusif

7/5/2020

14

Interpretasi Hasil Panel CDC

Semua Sampel yang menunjukkan hasil ambigu (kurva tidak sigmoid) dilakukan konfirmasi ulang

7/5/2020

15

GENOM VIRUS SARS-COV-2 -

7/5/2020

16

CORONAVIRUS Virus berenvelope

Genom berukuran + 30 kb; merupakan RNA sertat positif

Memiliki Corona/ mahkota pada pengamatan dengan mikroskop electron

Corona = protein Spike

Dapat menginfeksi manusia dan berbagai macam hewan seperti onta, sapi, kucing, dan kelelawar. Walapun jarang terjadi Corona virus dari hewan dapat menular ke manusia seprti SARS, MERS dan SARS CoV 2 (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/summary.html) yang menyebabkan infeksi berat pada manusia

Virus Corona yang menyebakan infeksi ringan-moderat : 229E, NL63, OC43, and HKU1

Struktural Protein

Poliprotein ab

Nonstruktural protein

(NSP)

Protein assesories : ORF 3a, 6,7a,7b, b8b, 9a,11

ion chanel, viral pathogenesis, transmembrane protein,

inaktivasi interferon

Struktur genom

dan fungsi gen

SARS-COV-2

UTR : untranslated

region

7/5/2020

17

7/5/2020

18

SARS-COV-2 MUTATION FREQUENCY IN DIFERENT GEOGRAPHIC AREAS

Virus RNA memiliki rata rata mutase tinggi dibandingkan hostnya (sekitar1.000.000 x)

Kemampuan virus untuk bermutasitergantung pada bbrp factor :

fidelity enzim yang berperan dalam replikasiasam nukleat (RdRp – RNA dependent RNA polymerase)

Mutasi evolusi virus dan variasi genom virus tidak dikenali oleh sistemkekebalan tubuh, berkembangnya virus resisten obat, tidak dapat dideteksi oleh sistem diagnostic molekuler

Pachetti et al. J Transl Med (2020) 18:179

https://doi.org/10.1186/s12967-020-02344-6

https://nextstrain.org/ncov/global https://nextstrain.org/ncov/asia

7/5/2020

19

TERIMAKASIH