262 SNORT COMX~iUNICATION$ VOL. 34 (Z959)

L D H ac t iv i ty was found in peaks i, e, and 3; peak a conta ined less than 1 % of the L D H ac t iv i ty in peak I. The L D H peaks e luted at approx. 0.03, 0.04, and 0.05 M cbI-~ride for all extracts . The recoveries of LDH ac t iv i ty from the columns were 96, 93, and 75 % for whole cornea, epi thel ium-endothel ium, and s t roma, respectively. The purification of L D H ranged from 4- to 9-fold, dependent upon the ex t rac t and peak considered (see Table I).

"When measured in the direction of D P N H oxidized at p H 7.0 and 25 °, the ac t iv i ty of crystal l ine beef-heart L D H is 3o0 ~moles /min/mg protein ~. If it is a s sumed tha t the ac t iv i ty of crystal l ine L D H is doubled b y increasing the t empera tu re from 25 ° to 37 ~, then the column-purif ied corneal L D H would have a b o u t the same ac t iv i t y as crystal l ine heel-heart L D H .

The possibil i ty of contamina t ion of the s t roma b y epithelial and endothel ia l cells and/or fluids does exist. It is not certain tha t the three forms of LDFI found in the s t romal ex t rac t s are nat ive to tha t par t of the cornea, a l though it has been repor ted that rat and rabbi t s t roma do contain L D H act iv i tyL

This inve:~tigation was suppor ted b y research grants f rom the Nat iona l Cancer Inst i - t u t e (CY-343o) and the Nat ional Ins t i tu te of Neurological Diseases and B!indl,ess (B-1375) of the Nat iona l Ins t i tu tes of Heal th , Publ ic Hea l th Service.

~Vernse Cancer Rescard, Laboratory, and Department o/Ophthalmology,

1Vasl, ington University School v/Me,Hdnc, St. Louis. Mo. (U.S.A.)

B L A K E W. 3IO()RE

B E R N A R D WoR'r.~.IA N

1 1-~.. I~.UttLSIAN AND R. A. [~.ESNICK, _']11t. J , Ophlllalu~ol., 46 I I {195~} 47- E . A. IJETERSON AND H . . % . SO]~I-:I~, J , ,'tlJ~. Ch~:~it. Soc., 78 ( I 9 5 6 ] 75~. O. H. LOWRY, N. J . ROSE,ROUGh, A. I. F A n g AXD R, J . RAI':DALL, J . B i o L C h e m . , ' 9 3 ( t 9 5 I) 265.

a O. H. L o w R y , pers<mal c c m m m n i e a t i o n . a O. FI. L o W R y , N. R . R o n ~ T S . * N J ~ J . I . K A P P H A n X , , ] . Biol. Chem., 224 0 9 5 7 } I o 4 7 . R j . B. NEILaXDS, in Methods i~t l,;n<vmologr. Vol , I, A c a d e t n i c P re s s , Inc . , N e w Y o r k , 1955. p. 449.

Rece ived N o v e m b e r 26th, x958

Sur la difference de st~r~osp~ciflcit~ entre |a d6shydrog~nase lactique extra i te de la levure ana~robie et ceile extra i te de la levure a~robie

On sait que l '6quipement enzymat iquc de la levure de boulangerie (Sacaharomyaes cerevisiae) subit des modifications trbs impor tan tes au eours de l ' adap ta t ion respira- toire, c'est-~t-dire au c0urs du passage de la vie ana~robie h la vie adrobie {0 t. ref. r). I1 a ~tfi montr5 r6cemment e qu 'h ces deux condi t ions cor respondent deux lacticodds- hydrogfnases diff~rentes: l 'une, ceUe de ia levure a4robie (enzyme O) est elassique e t a d6jk ~td ~tudi~e par p lus ieurs au teurs s-7, l ' au t re (enzyme N) n 'ava i t pas et~ mise en ~vidence aupa ravan t . EUe se dis t ingue de la premiX, re par un certain nombre de propri6t6s phys icoehimiques et cmfitiques, en particulier, elle ne r6duit pas le cy tochrome c.

voL. 114 (x959) SHORT Co.~.~UN~C.XTU~XS e63

Nous mon t rons ici que ees deux lact icoddshydrogdnases diffC.rent par la st6r6o- sp6cificit6 du subs t r a t : l ' enzyme form6 par la Ievure anadrobie oxyde l 'acide D(--) laet ique tandis que l ' enzyme form¢2 par ia levure it6robie oxyde l ' isom6re L(+) ."

Les sels d ' a m m o n i u m " des aridcs I~- ct L-lactiqucs ont 61~ pr6par6s k par t i r d 'un aeide rac6mique pur , pour analyses, par la m6thode de IRWXE s. La cristall isation fract ionnge du lac ta te de morph ine pe rmet d 'ob ten i r d ' abord le sel de l 'acide D- lact ique que fOR recristallise deux Iois, puis une fract ion rac6mique 61imhl6e, eI des eaux-m6res co r re spondan t au sel de l 'acide c-lactiqm.. Le~ sotution~ des _~ela d ' am- monium sont d6colordes et dg-barrass,J.es de t races de morphine par t r a i t ement au charbon actif. On a trouv~ que le D-lactate ne contenai t pas d ' isombre 1. ; son pouvoi r ro ta to i re sp6eifique bas6 sur ta mesure de la ro ta t ion ~t pH 8. 5 et sur la ddtbrminat ion de la concen t ra t ion par l ' indice de rdfraction ~l pH 6.65 ~'~ est " -',0 -!- 14.6 (solution l a i d 0.3 M). La concen t ra t ion dn L-lactate est mesurde en prdsence de ta L-lacticodds- hydrog(mase dtl mtisele 1° selon PFLEII>I~RI-R I-T DeLhi :ll. Le L-lactate prdpur6 est eontamin6 par du D-lactate ( 6 % ) ; le pouvoi r v~tatoire spt)cifique dg,'tl /t I2.2 (solution o.3 31) correspond, en corr igeant pour ta con tamina t ion , it la va leur • ,.or,

~ 3 D ....

- - I 3 . 9 pour ] ' isom6re L pur. L ' e n z y m e O est ex t ra i t ct purifid par la mdthode de B O E R I Ct a]. 8 ~i. par t i r de la levure cultivde en a6robio~e forc~.e. L ' enzyme N e:~t ex t ra i t et purifi6 k pa r t i r de levure cultiv6E en ana(~rdbiose str icte par la mdthode d6drite pa r ailleurs2,1:"; les act ivi t6s sp6cifiques des prdpara t ions employZ, es sont respect ive- men t 270 et 200 t~moles ferr icyam~re,mg protdine/h. La rdduct ion du fer r ieyanure est suivie au spec t ropho tam6t re Beckman DU, ~t 420 m/~, dans une c u r e de t ra je t op t ique 6gal it i . o cm, k 27" en t ampon phospha t e 0.07 M pH 723" volume" 3 ml.

D e u x t ype s d 'exp~rienees on t 616 faites; r6duct ion du fe r r icyanure en presence d 'un seul isom6re, r6duct ion du fer r icyanurc en prdsencc de m6!anges en propor t ions connues des deux isom6res.

L ' e n z y m e N ne rddui t pas le f e r r i cyanme en prdsence de L-lactate; i ' enzyme O ne le rddui t pas en pr~Ssenee de D-lactate; ce dernier r~tsultat confirme les donndes de BOIHII et al . ~.

La f igure m on t r e le rdsul tat des mesurcs effectuges sur des mdlanges des lac ta tes D e t L. I1 est clair que la spdcificit~3 des deux enzymes esf absolue, et que la diffgrence n 'es t pas due h. la prdsence d ' une rac6mase. La s toechiom6tr ie de la rd:action est, dans les deux ¢as, de d e u x molg¢ules de fe r r icyanure rdduites par moldcule de lac ta te oxyd6e c omme le m o n t r e n t les d6 te rmina t ions su ivantes :

,..~ ~ lr"~'l ' ; ilk'l| "1~ t l |//rl¢ f ~tmole.~)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

i ' ) - t ~ c t a h ' I . [ , l~'~i l~ t ' ,~'C r r |'e V,~' I I Zl *',"

O.3I I N -!-I 4 o . s S i .V _,.06

( ) i t ) 5 ( ) ( ) ~.1+ I I

o .247 0 .708 0 .420 i _ 2O

o .479 1.37

* ~ I o y e n n e de 5 d 6 t e r m i n a t i , m s .

Le lac ta te est done oxyd6 cn p y r u v a t c ; on a pu mon t r e r par ailleurs que la r6action d ' o x y d a t i o n du lac ta te en presence d ' e r z y m e .Vest rdvers6e par le py ruva t e , et qu 'k

* O n s a l t q u a lus ~el~ dt~ l 'aci{le l a c t i q u e , l e x t r t ) g v r e , L( 51 s~mt Idvogx're.s t a n d i s q u e c e u x d e l ' a c i d e D( ) l a c t i q u e s r m t d e x t r o g y r e s : l ' expre .s . s i tm " L I 4 - ) la,ztatL-'" empk~yc?e p a r p l u s i e n r s a u t e u r s p o r t e d o n e uric c o n t r a d i c t i o n i n t e r n e e t d e v r a i t i, t r e a b a n d o n n t : e .

264 SHowr COMML'~maT]ONS VOL. 34 (1959)

* Enzytnt= O @

I

O,8

• Enz,,v me JN

0.4- ~" "- " ' " ~ 0,~

0.2 F " ~ - " * ' - - " - . . . . . . . . . " -0.2 /

i I I f P 4 , ~ t e s L

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®

E,e z~,me O

- - o - - - - t - - -

. . . . . . . - i . . . . . . . . . . . . s . . . . . . J . . . . . . . . . . j . . . . . s . . . . . . . .

106 t2 ~g 100

t:ig, t . ieddm:l i~,n tll. f e r r i c v a n u r e (z .44 /~moles) p a r d e u x md langes it p r o p o r t i o n s ddtermin , :es des :lcide~ lac t iques . T ra i t p l e in : O.28L Hmole L - l ac t a t e + 0.580 t l m o l e 1J-lactate. Tra ic pu in t i l l6 : o.5(~2 itm¢flc I.-[act;ite -f- 0.32o f tmole D- lac ta te . A: la prel~ibre p h a s e d e l a r4ac t ion est amorcde f a r ! '~dditi~m de ! ' e n z y m e ¢). la deuxi~,nte l thase p a r l ' a d d i t i o n de I 'e l lz '¢me .V d a n s ta m d m e Cll~.-e.

l-I: l ' o rd r c d ' a d d i t i u n des enzyme.~ es t layered.

l 'dquilihrc l ac t a t e -py ruva t e en prdsence du mdme enzyme correspondait bien un potrnt ie l voisin de- - -185 mV is

Quel]es sent les causes de la format ion de ees deux enzymes par la mC'me cellule? Le problbme des mduc teurs dolt ~tre envisag6 d 'abord: ou bien la biosynth~se

de la ddshydrogdnase adrobie est induite d i rectement ou indirectement par l'oxygOne moldculaire, ou bien elte est induite par le 1.-lactate landis que eeile de l 'enzyme N e.~t induite par le D-lactate. Le deuxibme eas implique que l 'acide L lactique ne fail par t i t que du mdtabolisme adrobie landis que son isomi, re D ne fait part ie que du mdtaholisme anadrol4e de la levure; le ])-lactate pourrai t provenir de l ' hyd ra t a t i on du m6thylglyoxal sous l ' influence de la glyoxalase I e t du gluta thion,

Le problreme des prdcurseurs doit tcnir compte du fait qu ' au eours de r a d a p t a t i o n respiratoire en absence de croissance, la formation de r e n z y m e O est aecompagn6e de la dispar i t ies progressive de l 'enzyme N. Ceci nous a condui t & envisager t 'hypo- thi,se selon laquelle la ddshydrog(~nase ana6robie servait de prdeurseur it r e n z y m e a~r0bie ~. I_a diffdrenee de stdrdospdeifieit6 rend eette hypothbse moins vraisemblable car il faudrai t que les modifications coneernent non seulement les sites impliqu6s dans la rdduction des accepteurs mais aussl reux impliquds dans la f ixat ion du substra t , Si, ndanmoins, l 'dtude ultdrieure mont ra l t que cette hypoth{,se est exaete, sa portde pour ta comprdhension du ddterminismc de la sp6.cificit6 des enzymes serait d ' a u t a n t plus grande.

On salt depuis plus de 5 ° ans que les divers microorganismes produisent suit r un des isom~:res d~ racide lactique, suit l 'autre, suit un mdlange des deux; la na ture et los proport ions ddpcndent pour certains or~anismes des condit ions du milieu vt,ls.

VOL. 34 (1959) SHORT CO.~tX~t:XWAT.).~-S 265

L 'ana lyse de ces I)hdnombne~ n 'a pas 6t6 effectu~e au niveau enzymat ique , mats ils ont 5t6 interpr6tds ]e plus souvent en postulant une racSmase comme c'est apparem- ment le cas pour Closlri~Hum batylieum TM. Plus r6cemm~:dt, !es observations ont mi.-; en 6vidence des diff6rences dans les r6actions des ~)L- et L-lactates entre les extrai ts b r u t s e t les extraJts purifi6s provenant de E. col# 2 et de Laz:tobacillus ar~ebitzc.sus TM, ~ L'ana lyse enzymat ique n 'a pas 6t6 pouss6e plus loin et les diff6renees peuvent relever soit de la pr6sence d 'une rac6mase, soit de ta pr6sence simultan6e des deux enzymes sp6cifiques pour le L- et ie D-lactate. II serait int6ressant de reprendre l 'otude de ces ph6nom~-nes -b. la lumi~'re des r6sultats apport6s dansqe prdsent travail .

Notons f inalement que I 'emploi des enzymes purifi6s ~ part i r de la levure permet de doser sp6cifiquement et d i rec tement chacun des isomSrcs dans le m61ange rac6mique landis que les microm6thodes employdes jusqu'~t prt;'sent permet ten t sculement le dosage d 'un seul isomSre, l 'es t imat ion de l ' aut re 6rant obtenu par diff6rence ~ part ir des dosages de lac ta te total . Le dosage propos6 ici pour le E lactate est plus sensible et pius pr6cis que le dosage manom6trique2;; le dosage du L-lactate est plus ~c0nomi- que car il ne fail pas appel au DPN. La r6action avec le ferricyav~ure est quan t i t a t ive et ne fait pas intervenir de constantes d'6qnilibre comme dans la m6thode de P F L E I I ) E R E R E T D O S F . t t .

Nous remercions Mr. te Professeur Rzyf : V~'t'R.',ISI-:R ('t 3It'. It, Profc.~.~cur P.,o~¢is EP~.RI:SSI pour l ' int&'& qu'ils ont port6 cons tamment ~ ee travai!.

Laboratoire de, Biologic phyMcochimi~tut: de la l+~toultF des Science.% Instilut d,: b'/ologie pl~ysicoahimique, Paris

Laboratoire de G~;~;.tiquc physiologiquc dtt C.N.I¢.S., Gi/-sur-Yvell¢, S. ct 0. (l"e,tuo~)

F . L .XlgEVRl l -

P. P. SLoNt .~I~ L. N ~s~.[x

t i.~. FPHEC.U-'~,ql FLT I ' . |~, ~LONLMf':,KI, lflt.'~'h]i~l, l~d'~Jph3"s, .Iclt*, t~ C105o) 2_~: 1". [ ' . SI.('tNI.XISKI, Fq'ew,"ed. ,trd l.~t,',r. Cotlg;". H i . vhem. , . k¢ad . I ' t x ~ , .'x't.w %',~rl< (It)Stl). ]~. -='.12.

,t | ) [,. ~I.OX;|~I~iKI |&T V% t, "['$t'S.~,RO~VSKI, CCl)lpl. l~Cltil,, 24(~ (1()5"~) I I I 1. ~1 ~. j . }}.~,.¢L[, } I . l'ltXO.% " E'T I.. ( ; . ZI-.'RFA.~, Hzochcm. .] . , 4~ C~q4~') - '- '0- 4 (S. ~ ] . . \PPLEISY Lz~T 1,L K . . M O R T O N , .Valztle, t 7 3 In(J54) 749 . r, E . I 3 o ~ R L F-. C t T¢)LO, ~1. I.L'ZZATI r:_-f i . . Zl)ml, . t rch , t¢i,:chvm, tite+phySr. 31~ I It).~5) 4S7,

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Re(;u it: lO n0vembre, 1958