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17/04/2013
Rapport technique 1
Optimisation de l’identification des métabolites
d'intérêt dans les microalgues
Surmonter les verrous pour le
développement de cultures de micro algues
à des fins bioénergétiques
2
INDEX PAGE
RESUME ...................................................................................3
1.1 OBJECTIFS ......................................................................................... 3
1.2 POSITIONNEMENT DE L’ETUDE............................................................ 3
1.3 ETAT DE L’ART : CHLORELLA VULGARIS........................................................ 3
1.4 METHODOLOGIE ................................................................................. 7
2 RAPPORT TECHNIQUE.........................................................8
2.1 CARACTERISATION ET POTENTIEL DES MATIERES PREMIERES ............................. 8
2.1.1 ECHANTILLONNAGE ...........................................................................8
2.1.2 METHODES DES CARACTERISATIONS PHYSICO-CHIMIQUES ..............................8
2.1.3 CARACTERISATION DE LA MATIERE ........................................................15
2.2 EXTRACTION .................................................................................... 18
2.2.1 CONDITIONS D’OBTENTION DES DIFFERENTES FRACTIONS.............................18
2.2.1.1 Fractions protéiques ........................................................................18
2.2.1.2 Fractions polyphénoliques et polysaccharidiques .................................18
2.2.2 ANALYSES DES FRACTIONS.................................................................19
2.2.2.1 Teneur en protéines ........................................................................19
2.2.2.2 Teneur en saccharides .....................................................................20
2.2.2.3 Dosage des polyphénols totaux.........................................................25
2.2.2.4 Evaluation de la capacité antiradicalaire .............................................25
2.2.3 CARACTERISTIQUES DES FRACTIONS OBTENUES ........................................26
2.2.3.1 Teneur en protéines ........................................................................26
2.2.3.2 Teneur en monosaccharides neutres..................................................27
2.2.3.3 Teneur en polyphénols.....................................................................28
2.2.3.4 Activité antiradicalaire .....................................................................28
2.3 IDENTIFICATION DES VOIES DE VALORISATION DES FRACTIONS....................... 29
3 PERSPECTIVES DES PROCHAINS MOIS .............................30
RESUME
1.1 OBJECTIFS
Les actions réalisées par le CRT CATAR concernent la caractérisation et
l’identification des fractions issues de la délipidation des microalgues sélectionnées
dans le projet Energreen et de leur potentiel de valorisation. A l’issue de la
caractérisation de ces matières, quelle soit complète ou délipidée, le CRT CATAR
proposera un schéma d’agroraffinerie. Les deux microalgues sont Chlorella vulgaris
et Scenedesmus sp.
1.2 POSITIONNEMENT DE L’ETUDE
L’intervention du CATAR a lieu après l’étape de délipidation effectuée par le
partenaire CENER. Le résidu de microalgues étant appauvri en lipides comporte
encore des composants à valeur ajoutée. La tâche du CATAR inclut la
caractérisation du potentiel chimique du résidu et l’élaboration de voie d’extraction
et de production d’extraits raffinés.
1.3 ETAT DE L’ART : CHLORELLA VULGARIS
Les microalgues, au sens général, se sont avérées être une alternative prometteuse
et une source de biodiesel prolifique pour plusieurs raisons :
- elles ne sont pas en concurrence avec l’utilisation des terres agricoles
- elles sont très efficaces dans la fixation du CO2
- elles présentent un rendement lipidique important
En effet, sous des conditions favorables et contrôlées, le rendement
photosynthétique et celui à l'hectare des microalgues peuvent être jusqu'à trente
fois supérieure aux plantes oléagineuses terrestres comme le colza ou encore le
tournesol. Egalement, les microalgues peuvent produire, pour une même surface
donnée, trente fois plus de protéines que le soja et 50 fois plus que le riz, le blé ou
le maïs1.
1 Soeder C.J., Hegewald E., 1988. Scenedesmus. In Microalgal Biotechnology, Borowitzka and Borowitzka (Eds), Cambridge University Press, 477-483
4
Les microalgues représentent une énorme biodiversité dans laquelle environ 40 000
sont déjà décrites ou analysées 2. Les microalgues sont intéressantes par leur
rendement de conversion de l’énergie solaire nettement supérieur à celui des
cultures terrestres traditionnelles 3,4. On dénombre plusieurs genres de microalgues
(Chlorella, Spirulina, Tetraselmis, Euglena) déjà exploitées commercialement 5,6.
Chlorella vulgaris, l’une des plus connues, est une microalgue eucaryote,
appartenant à la classification scientifique suivante : Domaine : Eucaryote, règne :
Protiste, division : Chlorophyte, classe : Trebouxiophyceae, ordre : Chlorellales,
Genre : Chlorella. Il s’agit d’une microalgue unicellulaire qui grandit dans les eaux
douces et est présente sur terre depuis la période pré-Cambrien, soit plus de 2,5
milliards d’années 7.
Chlorella est la microalgue la plus cultivée au monde. Sa production annuelle est
estimée à 2000 tonnes en matière sèche pour l’année 2009 8. Chlorella est une
source importante de lipides pour la production de biodiesel ; elle peut en effet
contenir jusqu’à 80% (en matière sèche) de lipides totales. Toutefois, les conditions
de cultures (quantité d’azote, lumière, CO2,…), le stress appliqué sur la microalgue,
sont autant de paramètres qui auront des répercussions sur la teneur en lipides,
protéines et sucres 9. Ces conditions environnementales peuvent également avoir
un impact considérable sur la composition, l’épaisseur et donc la rigidité de la paroi
cellulaire de Chlorella vulgaris 10,11. La difficulté de récupération des différentes
2 Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E, Ghirardi M, Posewitz M, Seibert M, Darzins A. Microalgae triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. Plant J 2008;54: 621-639
3 Borowitzka M.A., 1988. Vitamins and fine chemicals from microalgae. In Microalgal Biotechnology, Borowitzka and Borowitzka (Eds), Cambridge University Press, cambridge, 153-196
4 Zhang D.H., Lee Y.K., 1997. Enhanced accumulation of secondary cartenoids in a mutant of green alga, Chlorococcum sp. Journal of Applied. Phycology, 9, 459-463
5 Lee Y.K. 1997. Commercial production of microalgae in the Asia-Pacific rim. Journal of Applied Phycology, 9, 403-411
6 Ogbonna J.C., Tomiyama S., and Tanaka H. 1998. Heterotrophic cultivation of Euglena gracilis Z for efficient production of α-tocopherol. Journal of Applied Phycology, 10, 67-74
7 Ditfurth, HV. 1972. Im Anfang war der Wasserstoff, Deutscher Taschenbuch., 199.
8 Brennan L, Owende P. 2010, Biofuels from microalgae-A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renew Sust Energ Rev;1, 557-577
9 Chisti Y. 2007, Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv;25:294-306
10 Atkinson AW, Gunning, BES, John PCL. Sporopollenin in the cell wall of Chlorella and other algae: Ultrastructure, chemistry, and incorporation of C-acetate, studied in synchronous cultures. Planta 1972;107:1-32.
11 Burczyk J, Hesse M. The ultrastructure of the outer cell wall-layer of Chlorella mutants with and without sporopollenin. Pl Syst Evol 1981;138:121-137.
5
fractions (protéiques, lipidiques, polysaccharidiques…) en seront d’autant plus
délicates et difficiles.
Dans la littérature, la teneur en protéines chez Chlorella vulgaris peut atteindre des
pourcentages compris entre 42 à 58% selon les conditions de cultures employées12.
Près de 20% de ces protéines totales sont localisées au niveau de la paroi cellulaire,
50% sont intracellulaire et 30% à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule algale13.
Dans des conditions optimales, la teneur en lipides peut varier de 5 à 40% de la
matière sèche de la biomasse12. Ces lipides sont principalement sous forme de
glycolipides, de phospholipides, mais aussi d’acides gras libres ou de glycérides14.
Ils sont synthétisés par les chloroplastes et sont localisés dans la paroi cellulaire
ainsi que dans les membranes des organites (chloroplastes, mitochondries, etc …).
Le profil d’acides gras change selon les conditions de culture et selon les
applications recherchées. Par exemple, le profil d’acides gras de Chlorella vulgaris,
sous des conditions de culture dites mixotrophiques, peut accumuler de 60 à 68%
d’acides gras saturés composés des acides palmitique et stéarique, mais aussi
d’acides gras monoinsaturés tels que les acides palmitoléique et oléique ; ce qui
s’avère être un profil favorable pour la production de biodiesel15,16.
Les polysaccharides chez Chlorella vulgaris sont généralement localisés dans les
chloroplastes et sont composés d’amylose et d’amylopectine17. L’un des plus
représentés est le β-1-3 glucane18. Dans des conditions de culture où l’azote est
limité, la teneur en carbohydrates peut varier de 12 à 55% de la matière sèche.
En plus de sa forte valeur énergétique et nutritive, Chlorella vulgaris présente des
constituants ayant un fort intérêt cosmétique et pharmaceutique (antibiotiques,
antiviraux, antitumoraux, vitamines, propriétés antibactériennes, antifongiques ou
antioxydante…). Nous avons le cas de ses pigments qui contiennent d’importantes
12 Becker EW. 1994, Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge University Press, 180-185
13 Berliner MD. 1986, Proteins in Chlorella vulgaris. Microbios; 46, 199-203
14 Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E, Ghirardi M, Posewitz M, Seibert M, Darzins A. 2008, Microalgae triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. Plant J;54: 621-639
15 Zheng H, Yin J, Gao Z, Huang H, Ji X, Dou C. 2011, Disruption of Chlorella vulgaris Cells for the Release of Biodiesel-Producing Lipids: A Comparison of Grinding, Ultrasonication, Bead Milling, Enzymatic Lysis, and Microwaves. Appl Biochem Biotechnol;164:1215-1224
16 Yeh KL, Chang JS. 2012, Effects of cultivation conditions and media composition on cell growth and lipid productivity of indigenous microalga Chlorella vulgaris ESP-31. Bioresource Technol;7:105-120
17 Lee RE. , Phycology. New York: Cambridge University Press, 139-141
18 Lordan S, Paul Ross R, Stanton C., 2011, Marine bioactives as functional food ingredients: potential to reduce the incidence of chronic disease. Mar Drugs;9:1056-1100
6
quantités de caroténoïdes, le plus souvent associés avec la chlorophylle des
thylakoïdes (intervenants dans la photosynthèse). Les minéraux et vitamines sont
également présents et possèdent des propriétés d’intérêt (Tableau 1).
Teneur (g.100g-1)
Microéléments Maruyama et al. 19 Panahi et al. 20
Na N/A N/A
K 1.13 2.15
Ca 0.16 0.27
Mg 0.36 0.44
P N/A 0.96
Macroéléments
Cr N/A tr
Cu N/A 0.19
Zn N/A 0.55
Mn N/A 0.40
Se N/A N/A
I N/A 0.13
Fe 0.20 0.68
Tableau 1 : Profil en minéraux chez Chlorella vulgaris
Chlorella vulgaris possèdent un profil vitaminique varié (Tableau 2). De nombreuses
propriétés bénéfiques de ces constituants ont été découvertes et sont répertoriées,
notamment leur rôle dans les maladies liées au vieillissement (cardiovasculaire,
hypertension, cataracte, diminution des risques d’athérosclérose, stimulation de la
synthèse de collagène pour la peau) 21.
Chlorella vulgaris, tout comme les microalgues en général, sont des réservoirs
d’une quantité impressionnante de molécules aux propriétés et activités biologiques
variées.
19 Maruyama I, Nakao T, Shigeno I, Ando Y, Hirayama K. Application of unicellular
algae Chlorella vulgaris for the mass-culture of marine rotifer Brachionus. Hydrobiologia 1997;358:133-
138
20 Panahi Y, Pishgoo B, Jalalian HR, Mohammadi E, Taghipour HR, Sahebkar A, Abolhasani E.
Investigation of the effects of Chlorella vulgaris as an adjunctive therapy for dylipidemia: Results of a
randomised open-label clinical trial. Nutr Diet 2012;69:13-19
21 Sano T, Kumamoto S, Kamiya N, Okuda M, Tanaka Y. Effect of lipophilic extract of Chlorella vulgaris
on alimentary hyperlipidemia in cholesterol-fed rats. Artery 1988;15: 217-224
7
Teneur (mg.100g-1)
Vitamines Maruyama et al.19 Yeh et al. 16 Panahi et al. 20
B1 (Thiamine) 2.4 N/A 1.5
B2 (Riboflavin) 6.0 N/A 4.8
B3 (Niacin) N/A N/A 23.8
B5 (Pantothenic acid) N/A N/A 1.3
B6 (Pyridoxine) 1.0 N/A 1.7
B7 (Biotin) N/A N/A 191.6
B9 (Folic acid) N/A N/A 26.9
B12 (Cobalamin) Tr N/A 125.9
C (Ascorbic acid) 100.0 39.0 15.6
E (Tocopherol) 20.0 2787.0 N/A
A (Retinol) N/A 13.2 N/A
Tableau 2 : Profil vitaminique chez Chlorella vulgaris
1.4 METHODOLOGIE
Dans cet objectif, les tâches comprennent une étape essentielle de caractérisation
globale du résidu et d’identification du potentiel de valorisation. La seconde phase
mettra en œuvre des technologies d’extraction et de raffinage de la matière de
manière à obtenir des extraits.
La connaissance de la composition chimique de la matière végétale s’articule autour
de la nature des composants majoritaires des algues, c'est-à-dire les fibres
(cellulose et hémicellulose), les protéines, les lipides résiduels, les minéraux, mais
aussi les fractions plus fines et notamment les métabolites secondaires.
Le potentiel de valorisation est lié à l’évaluation des diverses activités chimiques,
biologiques (antioxydante par exemple), qui peut être mené in vitro.
2 RAPPORT TECHNIQUE
2.1 CARACTERISATION ET POTENTIEL DES MATIERES
PREMIERES
2.1.1 Echantillonnage
Dans cette première année de projet, les travaux se sont concentrés sur Chlorella
vulgaris. La seconde année sera consacrée à Scenedesmus sp.
Les échantillons issus de la production Acciona et CENER sont de la biomasse
complète, c'est-à-dire non délipidée, et de la biomasse délipidée provenant d’une
seconde production et ayant subit le procédé de délipidation de CENER (Tableau 3).
Echantillon Caractéristiques Date de
réception Code
Biomasse complète Production NEIKER Septembre 2012 BC
Biomasse délipidée Production Acciona et
délipidée par CENER Février 2013 Bdlip
Extrait lipides 12-302 Production CENER Février 2013 ELi
Tableau 3: Matières premières traitées
2.1.2 Méthodes des caractérisations physico-chimiques
La caractérisation chimique de la matière première comprenait la détermination des
teneurs en matière sèche, en matières minérales, et en extractibles hydrosolubles.
- Le taux de matières minérales est déterminé, selon la norme française NF V 03-
22, après calcination dans un four à 550°C jusqu’à poids constant. Pesé, le résidu
calciné obtenu est une poudre grise, claire et très légère.
9
Notée MM, la teneur en matières minérales est exprimée en pourcentage en masse et
est égale à :
MM =m2 − m0
m1 − m0
× 100
m0 est la tare du creuset (eng) m1 est la masse du creuset et de la prise d’essai avant chauffage (en g) m2 est la masse du creuset et du résidu après chauffage jusqu’à poids constant (en g)
- Les matières sèches sont évaluées selon la norme française NF V 03-903. Elle
correspond à la perte de masse subie par léchantillon après chauffage à l’étuve à
105°C pendant 24h. Notée H, la teneur en eau est exprimée en pourcentage en masse
et est égale à :
H =m1 − m2
m1 − m0
×100
m0 est la tare du creuset (eng) m1 est la masse du creuset et de la prise d’essai avant chauffage (en g) m2 est la masse du creuset et du résidu après chauffage jusqu’à poids constant (en g)
- La teneur en protéines totales contenue dans la matière première algale est
déterminée par la méthode du Kjeldhal (appareil automatique) selon la norme
française NF V 18-100. Cette méthode consiste à transformer, par minéralisation,
l’azote organique contenu dans l’échantillon traité en azote minéral (ammoniaque),
puis en le dosage acido-basique de cet ammoniaque.
La minéralisation de l’échantillon (0,5 à 1 g) est effectuée par l’acide sulfurique
concentré (12,5mL à 95%) en présence de deux pastilles de catalyseur (CuSO4).
Menée à 400°C à l’aide d’un appareil Tecator Digestor 2020, cette minéralisation dure
plus d’une heure. Les produits de la réaction sont alors alcalinisés par une solution de
soude à 40%.
La distillation consiste à former l’ammoniac selon les équations suivantes :
10
Après refroidissement, l’ammoniac produit est estimé de façon automatique par la
distillation à la vapeur à l’aide d’un appareil Tecator Kjeltec 2020.
Afin de déterminer la teneur en azote total de la matière première algale,
l’ammoniaque est ensuite titré par une solution d’acide chlorhydrique à 0,1N grâce au
virage d’un mélange d’indicateurs colorés en solution dans de l’acide borique à 4%, le
vert de bromocrésol et le rouge de méthyle.
Par convention, la teneur en protéines de l’échantillon est alors obtenue en multipliant
la teneur en azote total par un facteur de conversion empirique. Ce coefficient prend
en compte la masse molaire moyenne des acides aminés composant les protéines à
quantifier. Il est fixé à 6,25 dans notre cas.
Notée P, la teneur en protéines est exprimée en pourcentage en masse et est égale
à :
MN est la masse molaire de l’azote (MN = 14,007 g/mol)
C est la concentration de la solution d’acide chlorhydrique (en mol/L)
V0 est le volume utilisé de la solution d’acide chlorhydrique sur un échantillon blanc
(en mL)
V1 est le volume utilisé de la solution d’acide chlorhydrique (en mL)
M est la masse de la prise d’essai (en mg)
- Le taux d’extractibles hydrosolubles de l’échantillon broyé s’obtient dans une
unité d’extraction Tecator Fibertec M1017 (Foss): 1g de biomasse algale lyophilisée
pesée précisément et broyé à 1 mm est placé sur un fritté en pyrex (Foss) de porosité
2 (40 µm à 100 µm) avec 100mL d’eau déminéralisée. L’ensemble est porté à
11
ébullition pendant 1 h. Le résidu est filtré, et la matière sèche du filtrat est évaluée
par pesée. Le teneur en extractibles est exprimée en pourcentage de la matière
première sèche.
- La teneur en constituants pariétaux (hémicellulose, lignines et cellulose) est
estimée par la méthode de Van Soest et Wine22. Basée sur la différence de solubilité
des constituants dans deux type de détergents, cette méthode gravimétrique
s’effectue à partir de la biomasse algale lyophilisée, séchée, délipidée si possible (dans
le cas de biomasse riche en lipides) et réduits sous forme de poudre afin de rendre le
milieu le plus homogène possible (de 1 à 3g de biomasse algale lyophilisée et séchée).
Les réactions d’attaque sur la matière première sont effectuées dans des frittés
spéciaux de porosité 2 et prévus pour s’adapter sur un système Fibertec M2. Ce
dernier est équipé d’un dispositif de chauffage et de reflux permettant de faire
l’ensemble des manipulations sans avoir à transvaser l’échantillon.
Lors de l’attaque NDF (Neutral Detergent Fiber), le détergent neutre utilisé est à base
d’EDTA et solubilise l’ensemble des constituants non pariétaux (protéines, pectines…).
La fraction organique du résidu insoluble représente alors la somme des constituants
suivants : hémicelluloses, lignines et cellulose. Lors de la première attaque ADF (Acid
Detergent Fiber), le détergent acide utilisé est à base de CTAB et d’acide sulfurique
dilué. Il solubilise l’ensemble des composés non pariétaux ainsi que les hémicelluloses.
La fraction organique du résidu insoluble correspondant est donc constituée de
lignines et de cellulose. Une seconde attaque ADF permet ensuite de solubiliser les
lignines. Elle est permise grâce à l’action d’un oxydant puissant, le permanganate de
potassium. Il en résulte alors un nouveau résidu contenant uniquement la cellulose
dans sa fraction organique.
Notées respectivement Hc, Li et C, les teneurs en hémicelluloses, lignines et cellulose
sont exprimées en pourcentage en masse et se déterminent donc selon les deux
schémas de principe suivants (dans notre cas, la teneur en lignine n’est pas
déterminée):
22 Van Soest PJW, R.H. (1967) Use of detergents in the analysis of fibrous feeds. IV.Determination of plant
cell-wall constituents. J Assn Offic Anal Chem 50:55.
12
Matière première→HC + L + C
Attaque NDF et calculation
Matière première→ L + C → C
Attaques ADF et calcination
REALISATION DE L’ATTAQUE NDF
Réalisée à l’aide de l’appareil Fibertec system M-Hot extractor, l’attaque NDF se fait
par ajout à l’échantillon à analyser de 100 mL d’une solution composée de sodium
lauryl sulfate, d’EDTA, de phosphate disodique, de borate de sodium décahydrate et
d’éthylène glycol monoéthyl éther. Après une heure à ébullition, les réactifs sont
éliminés par aspiration et le résidu est abondamment rincé à l’eau bouillante jusqu’à
disparition de la mousse. Puis, il est séché à l’étuve à 103 ± 2°C pendant douze
heures et calciné dans un four à 550°C pendant 3 heures. La pesée du fritté après
séchage et calcination permet la détermination de la teneur globale en constituants
pariétaux :
HC + L + C =m2 − m3
m1 − m0
× 100
m0 est la tare du fritté (en g). m1 est la masse du fritté et de la prise d’essai avant l’attaque NDF (en g). m2 est la masse du fritté et du résidu après l’attaque NDF et séchage (en g). m3 est la masse du fritté et du résidu après calcination (en g). REALISATION DES DEUX ATTAQUES ADF
Également réalisée à l’aide de l’appareil Fibertec system M-Hot extractor, la première
attaque ADF se fait par ajout à l’échantillon à analyser de 100 mL d’une solution
composée de CTAB et d’acide sulfurique dilué. Après une heure à ébullition, les
réactifs sont éliminés par aspiration et le résidu est abondamment rincé à l’eau
bouillante jusqu’à disparition de la mousse. Il est ensuite séché à l’étuve à 103 ± 2°C
pendant douze heures avant de subir une seconde attaque ADF permettant
l’élimination de la lignine . Celle-ci se fait à l’aide de l’appareil Fibertec system M-Cold
extractor par ajout au résidu de 25 mL d’un mélange d’une solution saturée de
permanganate de potassium (50 g/L) et d’une solution tampon composée de nitrate
de fer, de nitrate d’argent, d’acide acétique glacial, d’acétate de potassium et d’alcool
butylique tertiaire (2/1). Après 90 minutes de mise en contact, les réactifs sont
éliminés par aspiration et le résidu est rincé à l’aide d’une solution déminéralisante
faite d’acide oxalique dihydrate, d’éthanol et d’acide chlorhydrique. Une fois l’obtention
de fibres de couleur blanche (rinçage pendant 30 minutes au maximum), deux lavages
à l’éthanol et deux rinçages à l’acétone sont encore nécessaires avant le séchage du
13
résidu cellulosique à l’étuve à 103 ± 2°C pendant douze heures puis sa calcination
dans un four à 550°C pendant 3 heures. La pesée du fritté après chaque séchage et
calcination permet la détermination des teneurs en lignines et cellulose :
L + C =m2 − m4
m1 − m0
×100
C =m3 − m4
m1 − m0
×100soit L =m2 − m3
m1 − m0
×100
m0 est la tare du fritté (en g). m1 est la masse du fritté et de la prise d’essai avant la première attaque ADF (en g). m2 est la masse du fritté et du résidu après la première attaque ADF et séchage (en g). m3 est la masse du fritté et du résidu après la seconde attaque ADF et séchage (en g). m4 est la masse du fritté et du résidu après calcination (en g).
Figure 1: Schéma des attaques chimiques réalisées lors du dosage ADF-NDF
des cellulose, hémicellulose et lignine des matières premières
- La teneur en lipides totales de la biomasse complète algale (BC) et de la
biomasse délipidée (Bdlip) est déterminée par extraction liquide/solide à l’aide d’un
mélange de solvant pouvant être le cyclohexane ou un mélange chloroforme/méthanol
(1/2) 23. 2g de matière première sèche sont ajoutés à 100mL de solvant et laissés
extraire dans un soxhlet à ébullition ou à froid pendant 2h. Le mélange est centrifugé
à 20°C, sous 5000 g et pendant 10 minutes (centrifugeuse Sigma 6K15). L’extrait est
récupéré. Le solvant est ensuite éliminé par évaporation à l’aide d’un évaporateur
rotatif. Les dernières traces de cyclohexane ou de chloroforme/méthanol sont
chassées en plaçant le ballon de l’appareil dans une étuve à 105 ± 2°C jusqu’à poids
constant. L’extrait obtenu est pesé.
23 Bligh,E.G. and Dyer,W.J. 1959. A rapid method for total lipid extraction and purification.
Can.J.Biochem.Physiol. 37:911-917
14
L’extrait lipidique peut être ensuite filtré sous membrane PTFE à 0,45µm et analysé
par chromatographie en phase gazeuse pour la détermination du profil en acides gras
présents dans la matière première. Cette détermination se fait dans un solvant
spécifique, le Méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), après méthylation à l’aide de
trimethylsulfonium hydroxide (TMSH) selon la norme française NF T 60-233. Les
esters méthyliques d’acides gras obtenus lors de la transestérification sont alors
analysés par chromatographie en phase gazeuse (CPG) en utilisant les paramètres :
- Colonne DB FFAP (J&W Scientific), 30m x 0,32mm x 25µm d’épaisseur
- Température du four : maintien à 100°C pendant 1min, puis montée de 100 à
160°C à une vitesse de 10°C par minute, de 160 à 200°C à une vitesse de 1°C
par minute et de 200 à 230°C à une vitesse de 10°C par minute, puis maintien
à 230°C pendant 10min.
- Gaz vecteur : hélium (débit de 1,5mL/min)
- Détecteur FID, 300°C
- Injecteur Split 100, 280°C
L’identification des pics chromatographiques se fait par comparaison avec des
standards commerciaux (Sigma).
- La détermination de la composition en acides aminés de la biomasse algale (BC
et Bdlip) est réalisée selon une méthode standard largement utilisée de Moore and
Stein 24. Les échantillons sont hydrolysés avec de l’acide chlohydrique (HCl) 6N à
105°C pendant 1h. La biomasse hydrolysée est ensuite ajustée à un pH 2,2 à l’aide de
soude (NaOH), puis stabilisée avec un tampon citrate à pH 2,2. La solution finale est
ensuite filtrée à travers une membrane PTFE à 0,45µm afin de supprimer les résidus
solides qui restent dans la solution. L’analyse est effectué à l’aide d’un analyseur
d’acides aminés (Biochrom Ltd 30, Cambridge, UK) équipé d’un système de colonne et
pré-colonne (200mm x 4,6mm) avec des résines échangeuses d’ion sodium. La
séparation des acides aminés est réalisée par élution avec des tampons à différents
pH. Après une réaction avec la ninhydrine, les acides aminés sont détectés à une
longueur d’onde de 570nm, à l’exception de la proline pour laquelle la détection est
effectuée à 440mm.
24 Moore, S., Spackman, D. And Stein, W.H., 1958. Chromatography of amino acids on sulfonated
polystyrene resins. Analytical Chemistry. 30:1185-1190
15
2.1.3 Caractérisation de la matière
La composition chimique des biomasses complète (BC) et délipidée (Bdlip) issues de
Chlorella est donnée dans le Tableau 4.
Méthode
ou
Norme
BC Bdlip
Matières minérales
(Cendres) NF V 03-22 5,46 % ± 0,40 19,32 % ± 0.21
Matière sèche NF V 03-903 95,8 ± 2.3 % 96,00 % ± 0.27
Protéines Totales NF EN 15104 48,81 % 52,64 %
Lipides Totales Chloroforme/Methanol
(1:1) 25,12 ± 1.37% 2,89 ± 0,69%
Fibres Totales Van Soest et Wine 1963) 2,82 ± 0.56% N.D (pas assez
de biomasse)
Tableau 4 : Composition chimique de la biomasse complète (BC) et délipidée
(Bdlip) de Chlorella vulgaris
Le profil d’acides aminés pour 100g de la biomasse délipidée (Bdlip) de Chlorella
vulgaris est donné dans le Tableau 5.
Acides aminés
Biomasse délipidée Bdlip
n=3 (%)
Becker et al. (%)
Maruyama et al. (%)
Aspartic acid 9.84 9.30 9.80
Threonine 5.60 5.30 5.15
Serine 4.52 5.80 4.32
16
Glutamic acid 12.36 13.70 12.66
Glycine 6.50 6.30 6.07
Alanine 8.68 9.40 8.33
Cysteine 0.49 N/A 1.28
Valine 5.56 7.00 6.61
Methionine 2.05 1.30 1.24
Isoleucine 3.90 3.20 4.44
Leucine 8.46 9.5 9.38
Tyrosine 4.52 2.80 3.14
Phenylalanine 5.31 5.50 5.51
Histidine 2.08 2.00 1.97
Lysine 9.46 6.40 6.68
Arginine 5.83 6.90 6.22
Tryptophan N/A N/A 2.30
Proline 4.84 5.00 4.90
Tableau 5 : Pourcentage des acides aminés sur la biomasse délipidée (Bdlip)
comparé à la littérature.
Le profil des acides gras de la biomasse complète (BC) et délipidée (Bdlip) sont
donnés dans le Tableau 6.
Acides gras
Biomasse délipidée (Bdlip) n=3
(%)
Biomasse complete
Cloroforme/MeOH n=3 (%)
Biomasse complete
Cyclohexane n=3 (%)
Tokusoglu et al. 25
(%)
C8:0 Caprylate 0.30 0.67 - -
C10:0 Caprate 0,39 1.67 2.20 -
C11:0 Undecanoate 0.76 0.88 - -
25 Tokusoglu Ö, Ünal MK. Biomass nutrient profiles of three microalgae: Spirulina platensis, Chlorella
vulgaris, and Isochrisis galbana. J Food Sci 2003; 68:1144-1148
17
C12:0 Laurate 0.38 0.28 - -
C14:0 Myristate 8,04 4.72 - 0.38
C15:0 Pentadecanoate 0.32 0.32 0.84 -
C15:1 Pentadecanoate 3,46 6.31 2.89 -
C16:0 Palmitate 19,17 20.69 18.24 15.41
C16:1n7c Palmitoleate 5,98 1.49 1.11 1.17
C17:0 Heptadecanoate 4,70 - - -
C18:0 Stearate 9,34 0.43 - 6.24
C18:1n9tElaïdate - - - -
C18:1n9c Oleate 2,47 6.14 11.47 33.14
C18:2n6t Linolelaïdate - - - -
C18:2n6c Linoleate 13,87 19.59 21.11 9.73
C18:3n6g Linolenate 3,22 - - -
C18:3n3a Linolenate 22,34 35.26 40.29 1.93
C20:0 Arachidate 0,30 - - 0.19
C20:1n9c Gadoleate - - - -
C20:2n6 - 0.13 - -
C21:0 4,52 1.43 1.85 -
C22:0 Behenate - - - -
C20:5n3 EPA - - - 3.23
Tableau 6 : Profil des acides gras de la biomasse complète (BC) selon
différentes méthodes d’extraction et de la biomasse délipidée (Bdlip).
18
2.2 EXTRACTION
2.2.1 Conditions d’obtention des différentes fractions
2.2.1.1 Fractions protéiques
Les extraits protéiques à deux pH différents (pH 7 et pH 12) ont été obtenus à
l’échelle laboratoire de la manière suivante :
0,5 g à 1g de matière première lyophilisée sont mis en contact avec de l’eau ultrapure
(18,2 MΩ.cm) durant 1h sous agitation magnétique, soit à température ambiante, soit
en chauffant à 40°C. Au préalable et dans le cas de l’obtention d’un extrait protéique à
pH 12, l’eau ultrapure est addiotionnée de soude à 6N jusqu’à pH 12. L’ensemble subit
une centrifugation à 5000g durant 10 min pour séparer le culot de l’extrait aqueux.
Ces extraits aqueux à pH 7 et 12 sont ensuite stockés et conditionnés à -4°C avant
analyses.
2.2.1.2 Fractions polyphénoliques et polysaccharidiques
Les extraits polyphénoliques ont été obtenus à l’échelle laboratoire, en extraction en
Accelerated Solvent Extractor 100 (ASE, Dionex), qui permet de maintenir un solvant
à de hautes températures et sous de fortes pressions dans une cellule contenant de la
matière première à extraire, durant une durée d’extraction fixée. 0,5 g de matière
première et du sable de Fontainebleau sont déposés dans des cellules de 34mL en
acier inoxydable et munies de joints en PEEK®. Une par une, les cellules sont
transportées dans un four où elles sont chauffées à la température souhaitée et le
solvant est injecté à l’azote comprimé dans la cellule. Durant une durée d’extraction
statique, la température et la pression désirées sont maintenues, puis le solvant
d’extraction est évacué. L’extrait ainsi obtenu est recueilli dans un vial de collecte en
verre. Les extractions sont réalisées en triplicat. Les conditions opératoires fixées sont
données. La durée d’un cycle statique est le temps de contact du solvant avec la
matière et elle est définie par l’opérateur. Le nombre de cycles définit le nombre
d’extractions successives avec les mêmes conditions opératoires sur une même cellule
avec du solvant frais à chaque extraction. La vidange de la cellule est fixée à 100%
19
pour récupérer la totalité du solvant utilisé pour extraire. Le solvant utilisé est de
l’éthanol à 80% et de l’eau UHQ.
Température d'extraction 50-200°CTemps de chauffe de la cellule 5-9 min
Préchauffe de la cellule AucunPression d'extraction 50-200 bar
Durée d'un cycle statique 5 minNombre de cycles statiques 1 ou 5
Vidange de la cellule 100%Durée de vidange 120 secondes
Solvant Eau ou éthanol
Tableau 7: Conditions opératoires en ASE
Les extraits polysacharidiques pour analyse en GC-DIF sont obtenus après une étape
de pré-hydrolyse pour solubiliser les différents composés pariétaux avant hydrolyse
acide totale. Pour cela, 25mg de matière première lyophilisée sont mis en contact avec
250µL d’acide sulfurique (H2SO4) 26N dans un tube à hémolyse et dispersés au vortex.
Le mélange est laissé dans un bain-marie agitant à une température de 25°C pendant
30min.
2.2.2 Analyses des fractions
2.2.2.1 Teneur en protéines
La détermination des protéines hydrosolubles dans les extraits aqueux à pH 7 et pH 12
est réalisée à l’aide de la méthode de Lowry 26.
Il s’agit d’une méthode de dosage colorimétrique des protéines créée par Lowry et son
collaborateur en 1951. Cette méthode est essentiellement basée sur la méthode du
biuret. Un pré-traitement cupro-alcalin des protéines à doser est réalisé (complexation
du cuivre avec les liaisons peptidiques donnant une coloration violette absorbant la
lumière à 540 nm). Les ions Cu+ et les radicaux du Tryptophane, Tyrosine et Cystéine
réduisent le complexe acide phosphotungstique/acide phosphomolybdique (couleur
jaune) contenu dans le réactif Folin-Ciocalteau (Na2MoO4 + Na2WO4 + H3PO4),
26 Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 251
20
produisant ainsi une couleur bleue (Cu+ + (F-C)ox ---> Cu2+ + (F-C)red).
Lowry et ses collaborateurs ont rendu ce dosage plus sensible et moins tributaire de la
teneur en tyrosine et tryptophane
La méthode de Lowry permet de déterminer les concentrations en protéines comprises
entre 0,05 mg/ml et 0,1 mg/ml. Un temps d’incubation d’environ 30 min est
nécessaire pour le développement de la couleur bleue
Le protocole est le suivant :
- 0,2mL de l’extrait aqueux à pH7 ou 12 sont ajoutés dans des tubes à
spectrophotométrie
- 1mL du réactif de Lowry (sulfate de cuivre, iodure de potassium et tartrate de
sodium dans un tampon alcalin de carbonate de sodium)
- Mélange au vortex et attente de 10minutes
- Ajout de 0,1mL du réactif de Folin-Ciocalteu 1N
- Mélange au vortex et attente de 30minutes
- Lecture de l’absorbance au spectrophotomètre UV-1800 Shimadzu à 750nm
2.2.2.2 Teneur en saccharides
a. La teneur en oses neutres présents dans la biomasse algale est déterminée
par un dosage en CPG-DIF.
Pour y parvenir, une série d’étapes est nécessaire passant dans un premier temps par
l’hydrolyse des polysaccharides en monosaccharides, suivi par leur réduction et leur
dérivatisation en acétates d’alditols.
HYDROLYSE DES ECHANTILLONS
Après la pré-hydrolyse de 30 min (cf. fraction polysaccharidique), 2,7mL d’eau
ultrapure sont ajoutées pour l’hydrolyse totale et l’ensemble est mis à l’étuve à 103°C
pendant 2h (quantification de l’arabinose) et 6h (quantification rhamnose). Les
échantillons sont ainsi tripliqués pour chacun des temps d’hydrolyse (soit 6
échantillons au total).
A la fin de l’hydrolyse, les échantillons sont refroidis sous un courant d’eau froide, puis
neutralisé par ajout d’ammoniac (NH4OH) 25% à la burette jusqu’à pH7.
21
REDUCTION DES ECHANTILLONS HYDROLYSES NEUTRALISES
A 1mL d’échantillon hydrolysé neutralisé, 500µL de l’étalon interne (solution aqueuse
de 2-deoxy-D-glucose à 1g/L) et de 100µL de borohydrure de sodium à 100g/L dans
du NH4OH 25%. Les tubes sont ensuite placé au bain-marie à 40°C pendant 1h, puis
refroidis dans de la glace. L’excès de réducteur est neutralisé par 2 fois 50µL d’acide
acétique glacial.
ACETYLATION DES ECHANTILLONS REDUITS
150µL de l’échantillon réduit sont prélevés et ajouté dans un tube à hémolyse. 2mL
d’anhydride acétique, puis 200 µL de N-imadazole (catalyseur de l’acétylation) sont
ajoutés. 20min d’attente à température ambiante sont nécessaires.
EXTRACTION DES ACETATES D’ALDITOLS
5mL d’eau ultrapure sont ajoutés et 1,5mL de chloroforme vont permettre d’extraire
les acétates d’alditols. La phase aqueuse (phase supérieure) est éliminée, puis un
second lavage avec 5mL d’eau ultrapure est entrepris.
La phase organique est prélevée à l’aide d’une pipette pasteur et est stockée en
attendant l’injection en CPG-DIF.
PREPARATION DES ETALONS
Les étalons de monosaccharides (Glusose, Mammose, Galactose, Xylose, Rhamnose et
Arabinose) sont également soumis aux réactions de dérivatisation et d’acétylation)
sans subir les étapes de pré-hydrolyse et hydrolyse. La solution-mère aqueuse
comprend les 6 monosaccharides cités plus haut à 5g/L. Les solutions filles sont
comprises en 0 et 5g/L
Un étalon est cependant hydrolysé afin de déterminer le taux de dégradation estimé
après hydrolyse.
HYDROLYSE DE LA SOLUTION-MERE
2,2mL de solution-mère sont diluées dans 500 µL d’eau ultrapure et 250µL de H2SO4
26N. Les tubes à hémolyses sont placés dans l’étuve à 103°C pendant 2h et 6h
(quantification de l’arabinose et du rhamnose respectivement). A la fin de l’hydrolyse,
les tubes sont refroidis sous-courant d’eau froide, puis neutralisés par NH4OH 25%
jusqu’à pH7
REDUCTION DES ETALONS HYDROLYSES ET NON HYDROLYSES
22
A 1mL d’étalons non hydrolysé ou hydrolysé neutralisé, 500µL de l’étalon interne
(solution aqueuse de 2-deoxy-D-glucose à 1g/L) et de 100µL de borohydrure de
sodium à 100g/L dans du NH4OH 25%. Les tubes sont ensuite placé au bain-marie à
40°C pendant 1h, puis refroidis dans de la glace. L’excès de réducteur est neutralisé
par 2 fois 50µL d’acide acétique glacial.
ACETYLATION DES ETALONS REDUITS
150µL de l’étalon réduit sont prélevés et ajouté dans un tube à hémolyse. 2mL
d’anhydride acétique, puis 200 µL de N-imadazole (catalyseur de l’acétylation) sont
ajoutés. 20min d’attente à température ambiante sont nécessaires.
EXTRACTION DES ACETATES D’ALDITOLS
5mL d’eau ultrapure sont ajoutés et 1,5mL de chloroforme vont permettre d’extraire
les acétates d’alditols. La phase aqueuse (phase supérieure) est éliminée, puis un
second lavage avec 5mL d’eau ultrapure est entrepris.
La phase organique est prélevée à l’aide d’une pipette pasteur et est stockée en
attendant l’injection en CPG-DIF.
METHODE CHROMATOGRAPHIQUE
Les analyses par CPG-DIF ont été réalisées à l’aide d’un chromatographe en phase
gazeuse HP 5890 Series II.La séparation chromatographique a été réalisé à l’aide
d’une colonne Macherey Nagel Optima 1701 (15m x 0,25mm ID x 0,25 µm), pression
constante 10psi. La programmation de températures est la suivante : Four à 200°C
(5min) à 2°C/min jusqu’à 205°C, à 7°C/min jusqu’à 220°C, à 2°C/min jusqu’à 225°C
(5min). La température de l’injecteur et du détecteur DIF sont respectivement de
280°C et 300°C. 1 µL de la phase organique (chloroforme) comprenant les acétates
d’alditols extraits est injecté.
b. La teneur en amidons est également déterminée dans la matière première
algale et est déterminée après attaque enzymatique.
Plusieurs étapes vont permettre d’hydrolyser l’amidon en D-glucose par
l’intermédiaire d’une α-amylase et de l’amyloglucosidase.
Amidon + (n − 1) H 2OAmylase,Amy log lu cosidase → n(D − glu cose)
Le glucose est ensuite oxydé en acide gluconique et en péroxyde d’hydrogène par
une glucose oxydase.
23
D − glu cose + H 2O + O2Glu cose Oxidase → D − acide gluconique+ H 2O2
Le péroxyde d’hydrogène réagit avec du o-dianisidine en présence de peroxydase pour
former un produit coloré.
H2O2 + o − Dianisidine réduite Peroxidase → o − dianisidine oxydée
(sans couleur) (marron)
Le o-dianisidine oxydé réagit avec l’acide sulfurique pour former un produit coloré plus
stable.
o − Dianisidine oxydée H2SO4 → o − Dianisidine oxydée
(marron) (rose)
L’intensité de la couleur rose mesurée à 540nm est proportionnelle à la concentration
de glucose d’origine.
Les différentes étapes sont les suivantes :
PREPARATION DES ECHANTILLONS
La matière première algale peut être susceptible de posséder des quantités de glucose
et de maltodextrine libre. Il convient de les éliminer pour ne pas surexprimer la
concentration en glucose et donc la teneur en amidon.
A 50-100mg de matière première algale, 5mL d’une solution d’éthanol à 80% sont
ajoutés et laissé incuber pendant 5 min à 85°C. Le contenu du tube est mélangé, puis
5mL de la solution d’éthanol à 80% sont ajoutés à nouveau. Une centrifugation à
1000g pendant 10min est entreprise. Le surnageant est éliminé et le culot est
resuspendu dans 10mL de la solution à l’éthanol 80% pour une seconde extraction.
Une seconde centrifugation à 1000g pendant 10min est effectuée. Le surnageant est
délicatement prélevé et éliminé.
DEGESTION ENZYMATIQUE
Au culot ayant été dépourvu du glucose et maltodextrine ainsi que dans un tube sans
matière première (Témoin), 200 µL de la solution d’éthanol 80%, 3mL d’eau ultrapure
et 20 µL de la solution α-amylase (25% de propylène glycol) sont ajoutés. Le tout est
mélangé et laissé incuber pendant 5min dans un bain-marie bouillant. Les tubes sont
refroidis jusqu’à température ambiante. Le volume de chaque tube est amené à un
volume total de 10mL en ajoutant de l’eau ultrapure. Pour 1mL de chaque échantillon
ou témoin, 1mL de la solution de réactif pour l’hydrolyse de l’amidon (solution à 50
unités/mL d’amyloglucosidase d’Aspergillus niger dans 20mL d’eau ultrapure) sont
24
ajoutés. Un mélange est réalisé, puis le tout est incubé pendant 15min dans un bain-
marie à 60°C sous agitation. Les tubes sont laissés à refroidir jusqu’à température
ambiante. 1mL du mélange sont prélevés et dilués jusqu’à un volume total de 10mL
par ajout d’eau ultrapure (=Echantillon digéré).
DETERMINATION DE LA TENEUR EN GLUCOSE
Les solutions décrites dans le Tableau 8:
Réactif Blanc
standard
Standard Blanc réactif Echantillons
Eau (mL) 1,0 0,950 _ _
Glucose std * _ 0,05 _ _
Témoin digéré _ _ 1,0 _
Echantillon digéré - - - 1,0
* Solution de D-glucose standard (1,0mg/mL dans 0,1% d’acide benzoïque)
Tableau 8 : Solutions réalisées pour dosage du glucose
A T0, la réaction commence en ajoutant 2,0mL du réactif d’essai du glucose (solution :
5mg d’o-dianisidine dihydrochloride dans 0,8mL d’eau ultrapure + 500 unités de
glucose oxydase d’Aspergillus niger et 100 unités de peroxydase de raifort dans
39,2mL d’eau ultrapure) dans le premier tube, suivi d’un mélange intensif à l’aide d’un
vortex. A 60 secondes d’intervalle, les autres échantillons, blanc ou standard subissent
le même traitement. Les tubes sont laissés à incubés pédant 30min exactement à
37°C. La réaction est stoppée à 60 secondes d’intervalle par l’ajout de 2,0mL d’une
solution d’acide sulfurique 12N dans chaque tube. Le mélange est agité. La mesure de
l’absorbance pour chaque tube est réalisée à 540nm.
25
QUANTIFICATION
∆AECHANTILLON = ASTANDARD − ABLANC STANDARD
∆AECHANTILLON = AECHANTILLON − ABLANC REACTIF
% amidon=∆AECHANTILLON × 900
∆ASTANDARD× poids de l'échantillon(mg)
2.2.2.3 Dosage des polyphénols totaux
Le contenu en polyphénols d’un extrait est déterminé à l’aide d’un dosage de Folin-
Ciocalteu adapté d’une méthode de Singleton et Rossi 27. La réaction entre les
composés phénoliques et le réactif de Folin a lieu en milieu alcalin. Des volumes de
0,5 mL de réactif de Folin-Ciocalteu (VWR), 1 mL de carbonate de sodium (20%,
w/w), 1 mL d’extrait dilué et 7,5 mL d’eau distillée ont été mélangés au vortex dans
des tubes de 15 mL en pyrex. Pour chaque extrait, le mélange a été réalisé en
triplicat. Le blanc a été réalisé en mélangeant le réactif de Folin-Ciocalteu au
carbonate de sodium et à l’eau distillée sans ajout de solution contenant de composés
phénoliques. Les tubes de mélange réactionnel ont été placés dans un bain-marie à
70°C pendant 10 min puis la réaction a été stoppée en plongeant les tubes dans un
bain d’eau froide pendant 20 min. La coloration bleue du complexe tungstomolybdique
réduit du mélange réactionnel est proportionnelle à la concentration en polyphénols de
solution testée. L’absorbance des tubes a été mesurée avec un spectrophotomètre
ultraviolet (Shimadzu) à la longueur d’onde de 700 nm. Une courbe étalon a été
réalisée en utilisant l’acide gallique comme standard (5 concentrations différentes
entre 0-100 mg/L). Grâce à la loi de Beer-Lambert, la concentration en polyphénol
d’un extrait a été déterminée en rapportant l’absorbance de l’extrait sur la courbe
étalon et a été exprimée en Equivalent Acide Gallique (EAG). La teneur en polyphénols
(mg EAG/g de matière première) de l’extrait a été calculée.
2.2.2.4 Evaluation de la capacité antiradicalaire
Les capacités antiradicalaires des extraits sont évaluées vis-à-vis du radical 1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Une solution de DPPH fraîche est préparée dans de
27 V. L. Singleton, Joseph A. Rossi Jr., Am. J. Enol. Vitic 1965, 16, 3, 144-158
26
l’éthanol (Grade spectro UV) à une concentration d’environ 80 mg/L. 4mL de cette
solution est ajoutée à 1mL de solution d’extrait à différentes concentrations (4
minimum). Le mélange est agité, et placé à l’obscurité à 4°C pendant 40min. Les
absorbances à 517nm sont relevées sur un spectromètre UV-vis Shimatzu 1800. La
concentration inhibitrice à 50% du radical DPPH IC50 est calculée en fonction de
l’aborbance A aux différentes concentrations testées et de l’absorbance du tube
témoin A0 comprenant 4mL de solution de DPPH et 1mL d’éthanol pur à la place de
l’extrait, suivant la concentration pour laquelle la relation 1-A/A0=0.5 s’applique. Pour
comparaison, l’IC50 de la molécule hydrophile Trolox a été évaluée de la même
manière et est égale à 4 mg/L dans l’éthanol (15 µM).
Pour comparer les différentes fractions de microalgues, et en particulier les fractions
lipidiques, non solubles dans l’éthanol, une variante à cette méthode a été mise au
point en utilisant une solution de DPPH solubilisée dans le DMSO. Dans ces conditions,
l’IC50 du Trolox est de 19mg/L (76 µM).
2.2.3 Caractéristiques des fractions obtenues
2.2.3.1 Teneur en protéines
Méthode Norme
BC n=6 (%)
Bdlip n=6 (%)
pH 7, Tamb :
6.13 ± 0.27
pH 7 , Tamb :
1.41% ± 0.025 Protéines
hydrosolubles
Lowry et al.
1951 pH12, 40°C :
24.18 ± 0.31
pH12, Tamb :
5,35 % ± 0.14
Tableau 9 : Pourcentage de protéines hydrosolubles à différents pH et
températures sur la biomasse complète (BC) et délipidée (Bdlip). Les
résultats sont basés sur 6 réplicats.
L’extraction à pH basique permet d’extraire une proportion de protéines plus
importante que la matière soit délipidée ou non. La nature de ces protéines est pour
1.4% des protéines hydrosolubles dans la matière délipidée. Lorsque la matière n’a
pas été extraite par le chloroforme pour récupérer la fraction lipidique (voir protocole
CENER), les teneurs en protéines sont en moyenne 5 fois plus importantes.
27
2.2.3.2 Teneur en monosaccharides neutres
La teneur en monosaccharides neutres, à savoir le Rhamnose, le Galactose, le Xylose,
l’Arabinose, le Mannose et le Glucose, présents dans la biomasse algale délipidiée
(Bdlip) et déterminée par dosage par CPG-DIF sont résumés dans le Tableau 10. Il est
noté également la teneur en amidon estimée suite à une attaque enzymatique et
dosée par spectrophotométrie sur la biomasse algale délipidée (Bdlip).
Méthode
ou Norme
Bdlip (n=3)
mg/100mg MS
Rhamnose : 0,397 ± 0,138
Arabinose : 0,222 ± 0,022
Xylose : 0,069 ± 0,010
Mannose : 0,070 ± 0,008
Galactose : 0,481 ± 0,055
Oses neutres Dosage par CPG-DIF
Glucose : 0,217 ± 0,035
% Amidon Méthode α-amylase,
amyloglucosidase, 0,64% ± 0.09
Tableau 10 : Pourcentage d’amidons et quantité de monosaccharides neutres
en mg/100mg de matière sèche dans la biomasse délipidée (Bdlip)
La présence de galactose et de rhamnose, majoritaires s’explique par la teneur
importante en hémicelluloses. La distribution entre les différents mono saccharides est
dépendant des conditions de cultures28 29.
Pour l’amidon les valeurs relevées dans la littérature sont supérieures à celles
obtenues sur cette culture de Chlorella v.mais les conditions de culture influencent
beaucoup les métabolismes et notamment la privation en azote favorise le
28 TEMPLETON, D. W., M. QUINN, S. VAN WYCHEN, D. HYMAN, L. M. L. LAURENS. 2012. Separation and
quantification of microalgal carbohydrates. Journal of Chromatography A 1270: 225-234.
29 SUI, Z., Y. GIZAW, J. N. BEMILLER. 2012. Extraction of polysaccharides from a species of Chlorella.
Carbohydrate Polymers 90: 1-7.
28
métabolisme des sucres30. L’échantillon Bdlip a été obtenu dans des conditions où
l’azote était largement disponible.
2.2.3.3 Teneur en polyphénols
L’extrait éthanolique dans les conditions définies a été obtenu avec un rendement de
2.1 à 5.5 %. Le dosage de Folin-Ciocalteu sur les fractions éthanoliques donne entre
0. 9-2.2 mg EAG/g de matière sèche. Ces valeurs sont très proches (0.75-2.21 mg
EAG/g DM) de celles trouvées dans la littérature par Goiris et al.31.
2.2.3.4 Activité antiradicalaire
La présence de polyphénols laisse envisager l’action antiradicalaire des extraits
hydrophiles. Par ailleurs ces propriétés antioxydantes peuvent se retrouver aussi dans
les fractions lipidiques, dépourvues de composés phénoliques hydrophiles, mais
montrant une activité de protection des membranes, notamment avec les composés
de type caroténoïdes. Ainsi les valeurs d’activité antiradicalaires ont été mesurées en
milieu lipophile (DMSO) sur les extraits fait au cyclohexane ou chloroforme (CENER),
et en milieu protique (Méthanol) sur les extraits aqueux et éthanoliques (Tableau 11
et Tableau 12).
Extraits lipidiques IC 50 (DMSO)
Extrait lipide sur biomasse totale CENER > 0.5 g/L
Extrait lipide sur résidu CATAR Pas assez de matière
pour établir l’IC50
Trolox 19 mg/L (76 µM)
Tableau 11 : Activité antiradicalaire dans les extraits lipidiques des
biomasses complète (BC) et délipidée (Bdlip)
30 FERNANDES, B., G. DRAGONE, A. P. ABREU, P. GEADA, J. TEIXEIRA, A. VICENTE. 2012. Starch
determination in Chlorella vulgaris-a comparison between acid and enzymatic methods. Journal of Applied
Phycology 24: 1203-1208.
31 Koen Goiris, Koenraad Muylaert, Ilse Fraeye, Imogen Foubert, Jos De Brabanter, Luc De Cooman, J Appl
Phycol (2012) 24:1477-1486
29
Sur les extraits lipidiques, aucune activité quantifiable n’a été mesurée. L’extraction
CENER ayant lieu à température élevée est probablement la raison de cette absence
d’activité de piégeage du radical DPPH. Par ailleurs, la faible quantité de résidu
lipidique n’était pas suffisante pour mesurer la concentration inhibitrice à 50%.
Extraits hydrophiles IC 50 (EtOH)
Protéines pH 7 >> g/L
Protéines pH 12 0.3 g/L
Sucres hydrolysés 2h >> g/L
Sucres hydrolysés 6h 1.8 g/L
Extrait éthanolique 0.3 g/L
Trolox 4 mg/L (15 µM)
Tableau 12 : Activité antiradicalaire des extraits hydrophiles protéiques à
différents pH, éthanoliques et des sucres hyrolysés 2h et 6h
Sur les extraits hydrophiles, l’activité antiradicalaire se situe dans les fractions riches
en protéines (à pH 12) et dans l’extrait éthanolique qui contient les métabolites
secondaires, ce qui a déjà été décrit sur Chlorella Vulgaris32.
2.3 IDENTIFICATION DES VOIES DE VALORISATION DES
FRACTIONS
Les voies de valorisations mises en évidence concernent plusieurs fractions : Les
fractions protéiques, saccharidiques et polyphénoliques. Des protocoles ont été mis en
place pour extraire ces fractions. L’identification des activités liées à chacune d’elles
pourra être menée si les extraits sont produits en quantité plus grande, c'est-à-dire à
partir de plus de matière première. Ainsi le fractionnement pourra être plus précis et
les caractérisations plus aisées. La définition des voies de valorisation envisagées sera
effectuée à partir de caractérisations plus fines.
32GOIRIS, K., K. MUYLAERT, I. FRAEYE, I. FOUBERT, J. DE BRABANTER, L. DE COOMAN. 2012. Antioxidant
potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content. Journal of Applied Phycology 24:
1477-1486
3 Perspectives des prochains mois
Il faut désormais confirmer les premiers résultats d’analyses sur des échantillons
plus importants.
De manière, à valider un intérêt des polyphénols en fonction du mode de culture lié
à la stimulation de leur biosynthèse sous l’effet des UV, il est prévu d’obtenir
l’extrait éthanolique en plus grande quantité.
Pour confirmer la présence de protéines/peptides à intérêt pharmacologique
antioxydant, antiproliferative, ou ACE1 inhibiteur, un extrait protéique doit être
produit et fractionné par hydrolyse enzymatique (pepsine)33 34 35.
Finalement, l’étude du fractionnement de la biomasse délipidée devrait découler des
résultats de quantification et caractérisation à plus grande échelle. La PLE
Pressurised Liquide Extraction devrait permettre d’obtenir des extraits dans lesquels
les activités des différentes fractions protéiques, oligo-saccharidiques et
polyphénoliques, pourront être caractérisées et validées.
33 SHEIH, I. C., T. J. FANG, T.-K. WU, P.-H. LIN. 2010. Anticancer and Antioxidant Activities of the
Peptide Fraction from Algae Protein Waste. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58: 1202-1207
34 SHEIH, I. C., T.-K. WU, T. J. FANG. 2009b. Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from
algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems. Bioresource Technology 100: 3419-3425
35 SHEIH, I. C., T. J. FANG, T.-K. WU. 2009a. Isolation and characterisation of a novel angiotensin I-
converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste. Food Chemistry 115: 279-284
