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Synthèse de nouvelles quinones hétérocycliques et évaluation biologique in vitro
sur Toxoplasma gondii
Thèse de Doctorat d’universitéMuriel CUDEL COMPAIN-BATISSOU20 décembre 2007
Objectifs
Synthèse de nouvelles quinones hétérocycliques Par application des cycloadditions
de Diels-Alder 1,3-dipolaire
Evaluation biologique in vitro sur T. gondii
1ère partie: synthèse chimique
Le contexte
Notre travail s’est inscrit dans le cadre d’un travail en collaboration entre les équipes de l’EA 3741 ‘écosystème et molécules bioactives’
Ce travail s’est basé sur les travaux du laboratoire de chimie organique et du laboratoire de parasitologie avec la synthèse de dérivés p-carbazolequinones par réaction de Diels-Alder et les tests d’inhibition d’une enzyme clé du métabolisme des purines, la purine nucléoside phosphorylase de T. gondii.
Les p-carbazolequinones naturelles ont été isolées à partir de différentes plantes ou bactéries.
Nombreuses propriétés biologiques intéressantes
N
O
O
Me
R1
R2
H
R3
N
O
O
Me
N
O
O
MeH
H
N
O
O
OMe
Me
HO
H
Bismurrayaquinone A (M. koenigii)
actif contre Leishmania donovani
R1= R2= R3= H : Murrayaquinone A (M. euchristifolia)
action inotrope positive sur le ventricule du cochon de Guinée
action cytotoxique sur la lignée tumorale SK-MEL5 (impliqué dans le
mélanome et colon)
actif sur Trichomonas gallinae
Clausenaquinone A (Clausena excavata)
action inhibitrice de l'agrégation plaquettaire chez le lapin
activité cytotoxique sur des lignées de cellules tumorales
NH
O
O
Calothrixine A
(Calothrix cyanobacteria)
actif contre une souche chloroquinonorésistante de P. falciparum
activité cytotoxique sur les cellules HeLa (impliqué dans le cancer du col)
activité inhibitrice de l’ARN polymérase de l’Escherichia coli (compétition avec l'ATP)
activité proapoptotique (temps et concentration dépendante) sur les cellules cancéreuses
humaines Jurkat ( cellules lymphocytaires T).
NO
NH
O
O
N
Calothrixine B(Calothrix cyanobacteria)
Parmi les molécules synthétisées par notre laboratoire, de nombreuses molécules ont déjà été testées sur la purine nucléoside phosphorylase.
N
O
OR
X
398 R= Me; X = H201 R= Et; X = H203 R= Et; X = 2-Br399 R= Bn; X = H
N
O
OEtN
Me
Et
N
O
OEt
N
Me N
O
OEt
NH
O
N
O
OEt
N
O
H
N
O
OEt
N
OMe
N
O
OEt
N
OMe N
O
OEt
HO
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
NEt
RO
N
410 R = H411 R = Me
402
409408407
406405404403
400 401
Les ortho-carbazolequinones
En comparaison, les o-carbazolequinones ont été moins étudiées que les p-carbazolequinones .
Études de la réactivité de ces quinones particulières vis-à-vis de diènes: Carbodiènes Azadiènes
Synthèse de ces nouvelles quinones hétérocycliques par la réaction de Diels-Alder
Les ortho-carbazolequinones
N
O
O
R
1234
567
8
9N
R O
O
567
8
9
432
1
Structure ortho-carbazolequinone
carbazole-3,4-dione carbazole-1,2-dione
Les ortho-carbazolequinones naturelles ont été isolées à partir de Streptomyces.
Propriétés biologiques: inhibition de L-glutamate, propriétés antioxydantes, inhibition de la peroxydation lipidique
N
H
O
O
CH3N
H
O
O
CH3
H3CCH3
CH3
OH OH
CH3
CH3H3C
H3C
R
7 Carquinostatine-A : R = H8 Carquinostatine-B : R = OH
9 Lavanduquinocine
N
H
O
O
Alkyl
CH3
1 à 6 Carbazoquinocine
Synthèse des o-carbazolequinones
N
MeO OMe
Me
C7H15
H
OMeOMe
MeC7H15
H2N
Fe+(CO)3 BF4-
(OC)3Fe
N
O O
Me
C7H15
H
N
MeO OMe
Me
C7H15
H
14
MeCN , air 25°C , 6j
1) Me3NO , Me2CO 56°C , 4h
2) Pd/C , o-xylène 145°C , 4h
2) air , MeCN 25°C , 24h
17 (85%)
16 (76%)
15
3: Carbazoquinocine-C (65%)
1) BBr3 , CH2Cl2 -78°C à 25°C , 30 min
L’équipe de Knölker : Création des liaisons C-C et C-
N « one pot » : réaction du sel de fer tricarbonyle complexé sur une diméthoxyaniline.
Démétallation par l’oxyde de triméthylamine, suivie d’une déshydrogénation catalytique.
L’acide de Lewis tribromure de bore clive les éthers de méthyle en alcool, qui sont oxydés à l’air.
Synthèse des o-carbazolequinones
O
O
OMe
Me N
H
O
O
Me
OMe
N
O
H
OMe
Me
C7H15
OH
N
O
O
H
C7H15
Me
N
O
H
O
Me
C7H15
N
O
O
H
OMe
Me
N O
H
OMe
Me
HOC7H15
Aniline, MeOH0.3 eq Pd(OAc)22.5 eq Cu(OAc)2
AcOH , 117°C 3 à 4 j
C7H15MgCl , THF -78°C , 3h
MeOH , HBr conc.25°C , 1h
20 21 (84%)
22 (91%) 23 (55%)
24 (8%) 25 (traces)
3 (92%)
+
25°C , 1h
L’équipe de Knölker : Addition de l’amine en C-5 de la
benzoquinone. Etape-clé: cyclisation catalysée
d’une anilinoquinone par l’acétate de palladium (II). Le palladium II est réduit en palladium (0), puis réoxydé in situ par l’acétate cuivrique.
Addition nucléophile sur la carbazolequinone: obtention de la carbazolequinol.
Déprotection et déshydratation en milieu acide.
Synthèse des o-carbazolequinones
N
SO2Ph
OEt
OMOM
HC CMgBr
N
OEt
Me
OMOM
SO2Ph
N
OH
Me
(CH2)4CHMe2
H
N
Me
H
O O
(CH2)4CHMe2
(PhSeO)2O
NaOH 3M
N
CHO
SO2Ph
OEt
N
OEt
Me
OMOM
H
2829 (80%)
1)THF , t.a.
2) MOMCl , iPr2NEt CH2Cl2 , 50°C
tBuOK , tBuOH
+
30 (43%) 31 (41%)
34 (91%)
-78°C à 25°C
THF , 50°C
BBr3 , CH2Cl2
2: Carbazoquinocine-B (90%)
90°C
L’équipe de Choshi : L’addition du magnésien (bromure
d’éthynylmagnésium) sur l’indole carboxaldéhyde, suivi du traitement par le chlorométhyl méthyl éther (groupement protecteur de la fonction alcool) conduit au composé 29.
Le traitement par le tert-butanolate en présence de tert-butanol de potassium permet la cyclisation (benzo annelation).
Les groupements protecteurs de l’azote et de l’alcool sont enlevés.
L‘oxydation par l’anhydride benzenesélénique conduit à la carbazolequinone.
Synthèse des o-carbazolequinones
N
HC7H15
Me
N
H
O O
CH3
C7H15
37
(COCl)2
3 (59%)
AlCl3
Carbazoquinocine C
L’équipe de Pindur : L’étape clé : cyclisation entre 2-vinylindole et le chlorure d’oxalyle en
présence d’acide de Lewis.
Synthèse des benzocarbazole-5,6-diones
OMe
O
O
NHBOC
MeMeO
OH
N
O
O
H
OMe
Me
OMeOMe
O
O
NHBOC
MeMeO
N
O
O
MeO
Me
OMe H
THF
MeOH, H 2SO4
80%
+
45 (92%) 484746
Triton B , tBuOOH
, 3h
L’équipe d’Echavarren Hydroxylation en 3 Déprotection et cyclisation au reflux du méthanol Dérivés ortho et para en proportion égale
Synthèse des benzocarbazole-5,6-dionesO
O
OHNH2
R3
R1
R2
N
O
OR3
H
R1
R2
O
OH
ONH2
R3
R1
R2
N
O O
H
R3R1
R2
O
O
OHNO2
R3
R1
R2
+
53 54
1) H2 , PtO2 AcOEt , t.a.
2) air
AcOEt , reflux
5152
L’équipe de Kobayashi Réduction du groupement nitro par hydrogénation catalytique Cyclisation au reflux de l’acétate d’éthyle Proportion des dérivés ortho et para : variable selon le substituant R1 = R2 = OMe : proportion égale R1 = R2 = Me, 54 majoritaire
Réaction de Diels-Alder sur les o-quinones
N
O
O
H
CH3
H3C
NHAc
N
O
O
H
NHAc
CH3
CH3
N
O
O
H
NHAc
N
O
O
H
NHAc
OAc
OAc
N
O
O
H
OAc
NHAc
OCH3
CH3
N
O
O
H
H3C
NHAc
N
O
O
H
NHAc
H3CO
68
69 (81%)
70 (100%)
74 (39%)
73 (41%)71 (40%)
72 (22%)
Aucune réaction décrite pour les o-carbazolequinones
Réactions décrites pour les o-indoloquinones qui sont de structures voisines
Travaux personnels
Objectifs Réaction de Diels-Alder sur les o-
carbazolequinones: Carbodiènes Azadiènes
Stratégie Obtenir des hydroxycarbazoles Oxydation de ces hydroxycarbazoles
par le sel de Frémy Réactions de Diels-Alder
N
OH
H80a
NH
O
O
81a
N
Et
OH
N
Et
O O
8687
N
Et
NH2
84
Travaux personnels
Les hydroxyquinones Deux 2-hydroxycarbazoles:
2-hydroxycarbazole: commercial
2-hydroxy-9-méthyl-(9H)-carbazole
N
Et
NH2 H2O
N
Et
N2
HSO4
H2O, H2SO4
N
Et
OH
84 85
H2SO4, NaNO2
86 (31%)
5°C
90°C, 12h
N
OH
N
H Me
OHDMF/THF
CH3 I80%
80b
NaH /N2
80a
Un 3 hydroxycarbazole obtenu à partir du 3-aminocarbazole commercial
Travaux personnels Obtention du 3 hydroxycarbazole : autre méthode
Décrite par l’équipe de Cohen: Formation d’un sel de diazonium Formation d’un radical aryl à l’aide d’ion cuivre : Cu2O et large excès de Cu(NO3)2
Oxydation en phénol à température ambiante Pas d’amélioration du rendement Si la quantité de sel de diazonium augmente, diminution du rendement
Travaux personnels Oxydation des hydroxycarbazoles par le sel de Frémy
N
Et
OH
N
Et
O O
Sel de Frémyacétone / eau
t.a., 45 min, 54 %
86 87
N
R
OH
80a R=H80b R=Me
Sel de Frémyacétone / eau
t.a., 60 min N
R
O
O
81a R=H (64%)81b R=Me (42%)
N O
O3S
O3SSel de Frémy : Nitrodisulfonate de Potassium 2K +
Les deux quinones 81a et 81b ne posent pas de problème de solubilité.
Travaux personnels Oxydation de l’aminocarbazole par le sel de Frémy
Faible rendement pour obtenir la carbazole-3,4-dione L’oxydation des anilines disubstituées par le sel de Frémy conduit aux p-
benzoquinones avec de bon rendement Mais obtention des dérivés 92 et 93
N
Et
NH2
N
Et
NH2
O
H HN
N
R
Et
N
Et
NH2
OH
N
Et
NH
O
N
Et
NH2
O
N
N
Et
R
84
sel de Frémy
88 89
90 : R=H91 : R=OH
92 : R=H (10%)93 : R=OH (30%)
1
4
9
8
1'
4'
5'
8'
9'
+sel de Frémy
5
84 ou 88
89
Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’acétoxybutadiène
Les cycloadduits primaires n’ont pas été observés
N
H
O
O
OAcN
H
O
O
56%
81a82
+
N
Et
O
O
OAc
N
Et
O
O
+
87 94 (35%)Acétoxybutadiène
reflux, 12h
Toluène
Alumine basique
THF , reflux , 15 h
Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec le cyclopentadiène
N
Et
O
O 1) CH2Cl2, 0°C, 6h
2) CH2Cl2, Silice, 40°C, 48h N
Et
O
O
+
87 Cyclopentadiène 95 (26%)
N O
OHH
H
N O
O
H
CH2Cl2 -10°C , 1 nuit
49%81a 83
+
Cyclopentadiène
Travaux personnels
N O
O
H
83
HH
1
2 3
4
5
6
78
9
10
11
12
Réaction de cycloaddition [4+2] avec le cyclopentadiène Confirmation de la stéréochimie par RMN-1H NOE différentielle
N O
O
H
83
HH
1
2 3
4
5
6
78
9
10
11
12
Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’azadiène 96
Carbazole-3,4-diones : mélange de produits: échec Un seul produit isolé, l’aminoquinone 99
N
Et
O
O
N
NMe2
N
Et
O
O
N
Et
O
O
N
NMe2
N
Et
O
O
N
+
87 96
et/ou
99 (18%)
97 98
1) CH2Cl22) Al2O3 basique
Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’azadiène 96
Carbazole-1,2-diones : mélange de produits: échec
Solvant Température Temps Conditions
EtOH absolu Reflux 1 nuit Al2O3 basique
EtOH absolu Reflux 1 nuit Al2O3 basique N2
EtOH absolu Reflux 6 H N2/ ultra-sons
Al2O3 basique
EtOH absolu t.a 48 H Silice
THF anhydre Reflux 1 nuit Al2O3 basique
THF anhydre t.a 1 nuit Al2O3 basique
Toluène Reflux 1 nuit Al2O3 basique
Conclusion
Nous avons montré que les réactions de Diels-Alder sont possibles avec les o-carbazolequinones et les carbodiènes.
Avec les azadiènes, nous n’avons pas pu réaliser de cycloaddition, alors que nous avions pu obtenir les pyridocarbazole-5,11-diones à partir des p-carbazolequinones
La réactivité de ces o-carbazolequinones est moins importante que celle des p-carbazolequinones.
Les rendements pour obtenir ces o-carbazolequinones sont faibles.
Cycloadditions 1,3-dipolaires
R
R
O
O
R
R
CHCl3, t.a.
10h à 20 jours R
R
O
R
R
O
N
O
Ar
100
105 : R = CH3106 : R = OCH3
111 : R = CH3 (50%)112 : R = OCH3 (82%)
O
O
R
R
R
R
O
O
R
R
R
R
NO
ArO
R
R
R
R
O
N
O
Ar
105 (R = Me)106 (R = OMe)
+133
136 (R = Me) (13%)137 (R = OMe) (13%)
138 (R = Me) (13%)139 (R = OMe) (27%)
Benzène, t.a. 1 mois
Réaction de cycloaddition de p-quinones avec le dipôle oxyde de nitrile
O
O
MeO
O
O
ON
MeOAr
O
O
NO
Ar
MeO
133100
131 140 (27%)140 exclusif
+
134 (17%)Benzène, t.a.,5jCHCl3, t.a.
L’équipe de Shiraishi : p-benzoquinones polysubstituées
l’oxyde de 2,4,6-triméthylbenzonitrile
l’oxyde de 2,6-dichlorobenzonitrile Soit addition sur la C=C : dérivés
isoxazoloquinones Soit addition sur la C=O : dérivés
spiranniques
Cycloadditions 1,3-dipolaires Réaction de cycloaddition des naphtoquinones avec les oxydes de nitrile
L’équipe de Brahmeshwari
O
O
OH
O
O
ON
Ar
+5h , t.a.
145 143a : Ar = C6H5143b : Ar = p-Cl-C6H5143c : Ar = p-MeO-C6H5143d : Ar = 3,4-di-MeO-C6H5143e : Ar = p-(N,N-diMe-amino)-C6H5
Ar C N OH
Cl
Et3N, Ether
146a (80%)146b (78%)146c (75%)146d (80%)146e (82%)
O
O
R
R
Ph C N O
O
O
ON
PhR
R
1h à 24h
148a : R = OH148b : R = OMe148c : R = OAc
149a (80%)149b (90%)149c (80%)
Ether, t.a.
147
H
H
Br C N O
O
O
ON
BrR
R
151a (80%)151b (95%)151c (95%)
150
Addition exclusive sur la C=C
Obtention des cycloadduits primaires : naphtoisoxazolinequinones
Aromatisation lors de la purification sur une colonne de gel de silice
Avec l’oxyde de nitrile 150, pas de cycloadduit primaire observé
Cycloadditions 1,3-dipolaires Réaction de cycloaddition des naphtoquinones dissymétriques avec les oxydes de nitrile : obtention de deux
régioisomères
Addition exclusive sur la C=C Obtention des cycloadduits
primaires : naphtoisoxazolinequinones
Avec l’oxyde de nitrile 150, pas de cycloadduit primaire observé
Action régiosélective, proportion variable
O
O
R1
R2
O
O
ON
PhR1
R2
O
O
NO
R1
R2Ph5h à 72h
152a : R1= OH, R2= OMe152b : R1= OH, R2= NH2152c : R1= OH, R2= NHAc152d : R1= OAc, R2= NHAc
+
153a (77%)153b (56%)153c (45%)153d (9%)
154a (8%)154b (19%)154c (45%)154d (81%)
H
H
H
H
Ph C N O
Ether, t.a.
147
Br C N O150
O
O
ON
BrR1
R2
O
O
NO
R1
R2Br
1h à 24h +
155a (63%)155b (60%)155c (36%)155d (27%)
156a (27%)156b (20%)156c (44%)156d (63%)
Cycloadditions 1,3-dipolaires Réaction de cycloaddition des naphtoquinones dissymétriques avec les oxydes de nitrile
L’équipe de Behar a réalisé une cycloaddition 1,3-dipolaire régio-orientée
Utilisation d’une quinone bromée
Formation d’un seul régioisomère
O
OOMe
MeO
OMe
NHO
RCl
CH2CH2CH2
OSi(Me2)t-Bu
NEt3
O
O
ON
OMe
OMe
MeOR
O
O
NO
R
OMe
MeO
OMe
+CH2Cl2, t.a.
161a160a
+
R =162a (42%) 163a (26%)
O
O
Br
OMe
MeO
OMe
NHO
RXNEt3
CH2CH2CH2
OSBT
O
OCH2
O
O
NO
R
OMe
MeO
OMe
+CH2Cl2, t.a.
160b 161a : X = Cl, R =
161b : X = Br, R = Br
161c : X = Cl, R = CH3(CH2)4
161d : X = Cl, R =
163a (90%)163b (78%)163c (99%)163d (86%)
Cycloadditions 1,3-dipolaires Réaction de cycloaddition des p-napthoquinones avec les azotures
L’équipe d’Alonso
Synthèse de naphtotriazole diones
En fonction du solvant et de la température utilisée: Formation de naphtotriazole diones, d’aminoquinones, aminométhylène-indanediones
O
O
O
O
NN
N
Gl
N3 EtOAc
O
CH2OAc
OAc
OAc
OAc
O
CH2OBn
BnO OBn
O
O
NN
N
Gl
O
O
NHGl
O
O
CHNHGl Gl
EtOAct.a., 5j
+
toluène
+
166
168a (18%)168b (19%)
reflux, 17h+
168a (19%)168b (19%)
169a (5%)169b (traces)
170a (7%)170b (10%)
170a (18%)168b (30%) + 170b (16% )
reflux, 17h
164a164b
164a : Gl = 164b : Gl =
Cycloadditions 1,3-dipolaires Réaction de cycloaddition des p-quinones avec les azotures
L’équipe de Beneti a étudié l’effet du solvant et de la température sur la réaction de cycloaddition des azotures de p-méthoxyphényle.
L’élévation de température favorise la formation des composés ènamine, benzapine et aziridine aux dépends du triazole
A température égale, l’HMPT favorise la formation du triazole
O
O
ArN3
MeOAr
ii) HMPT, 60°C, 15h : 186(62%) + 187(3%)
i) C6H6, 60°C, 5 jours : 186(1%) + 187(46%) + 188(20%) + 189(31%)
O
O
NN
N
Ar
N
O
OAr
O
O
CHNHAr
O
O
N Ar166
+
185+ +
+186 187
188 189=
i ou ii
Cycloadditions 1,3-dipolaires
Concernant les cycloadditions avec les oxydes de nitrile: Formation à partir d’oxime Cycloaddition sur C=C ou C=O selon la nature de l’oxyde de nitrile et la quinone Sur les p-quinones dissymétriques: problème de régiosélectivité, possibilité
d’orienter la régiosélectivité avec les p-quinones bromées Concernant les cycloadditions avec les azotures
Formation de triazoline et selon les conditions de température et solvant: Obtention du triazole, ou bien formation d’ènamine, d’aminoquinone, d’aziridine, de
benzopyrine Les températures élevées nuisent à la formation du triazole Les solvants type HMPT favorisent la formation de triazole La polarité du solvant ne semble pas influencer la formation de triazole, ou d’ènamine,
…
Travaux personnels Objectifs
Réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur les p-carbazolequinones: Oxydes de nitrile Azotures
Etude de la régiochimie de ces réactions
N
OH
Et
N
O
O
Et
R C N O
N
O
O
Et
ON
N
O
O
Et
NO
R
N
O
O
Et
NN
N
R
N
O
O
Et
NN
N
R
N N N
R
R
Stratégie Obtenir l’hydroxycarbazole Oxydation de cet hydroxycarbazole par le sel de Frémy Réactions de cycloaddition 1,3-dipolaire
Travaux personnels Obtention du 4-hydroxycarbazole : deux méthodes
Méthode 1: formation de phénylhydrazinocyclohéxènone, puis synthèse indolique de Fisher conduisant à la tétrahydrocarbazolone. L’étape d’éthylation est réalisée afin d’obtenir des composés plus solubles que les
dérivés non substitués sur l’azote. Enfin, déshydrogénation à l’aide du Palladium sur charbon au reflux du diphényléther
(259°C)
NHNH2
O
O
H2O
NH
NH
O
AcOH3h, t.a.
+H2SO4 à 15%
195196 (96%) 197 (78%)
194
4.5h, reflux NH
O
C2H5I, KOH, BTEA
N
O
Et
Acétone, reflux, 0,5h
198 (78%)
Ph2O, reflux, 1h
199 (71%)
N
OH
Et
Pd-C 10%
BTEA : chlorure de benzyltriéthylammonium
Travaux personnels Obtention du 4-hydroxycarbazole : deux méthodes
Méthode 2: Commercialisation du 4-hydroxycarbazole 200 L’étape d’éthylation est réalisée afin d’obtenir des composés plus solubles que les
dérivés non substitués sur l’azote. N-éthylation directe sans protection de la fonction alcool selon la méthode décrite plus haut mise au point par l’équipe d’Albanese.
N
OH
H
N
OH
Et
200 199 (66%)
Et-I, NaH, N2
THF, DMF, t.a.
Travaux personnels
Oxydation par le sel de Frémy
N
OH
Et
Sel de Frémy
acétone-eau (1/1)N
O
Et O
199 201 (83%)
t.a.
Travaux personnels
Cl2R CH N OH
R CCl
H
N O
NaOH R CH N O
R C N O
Cl
H OH
R CH N O
Na R C N O
Na
H2O
H2O
NaCl
Anion oxime
Tautomérie
ChloroximeElimination-1,3 basocatalysée
Aldoxime
+- NaCl
+ +
R C N O
Synthèse des oxydes de nitriles : deux méthodes Méthode 1:
À partir d’aldoxime, réaction d’halogénation, suivie déshydrohalogénation en milieu basique
R CH N OH R C N O- H2
NaOCl ou NaOBr
Méthode 2: Déshydrogénation de l’aldoxime par l’hypochlorite ou l’hypobromite de sodium
Travaux personnels Synthèse des oxydes de nitriles
Par déshydrogénation au moyen d’hypochlorite de sodium dans le THF à 0°CR CH N OH
NMe
R C N O0°C
NaOCl / THF
207 : R =
208 : R =N
Me
209 : R =
210 : R =
N
O
O
Et
NO
N
O
O
Et
ON
209211
212
THF, t.a.
3 jours48%
N
O
O
Et
N
O
O
Et
ON
N
Me
N
O
O
Et
NO
N
Me
+
201
210
213
214
THF, t.a.
3 jours50%
Al2O3
Cycloaddition Obtention des deux régioisomères, en proportion égale Observation des cycloadduits primaires, qui finissent par disparaître
Travaux personnels Afin d’obtenir une régioselectivité de la réaction de cycloaddition: synthèse
de 2 et 3-bromocarbazolequinones Synthèse de la 2-bromocarbazolequinone
N
O
Et O
202201
N
O
Et O
Br
H
H
Br
2
4
1
3
N
O
Et O
H
Br
Br
H
Br2, AcOH
t.a., 20 minN
O
Et O
Br
203
H-2 est plus acide que H-3 car C-1 est moins riche en électron que C-4 H-2 s’élimine plus facilement Déshydrobromation conduisant à la 2-bromocarbazolequinone L’acide acétique doit être rigoureusement anhydride
Travaux personnels Synthèse de la 3-bromocarbazolequinone
Bromation à l’aide du N-bromosuccinimide Obtention de deux hydroxycarbazoles monobromé et dibromé (proportion 9:1) Oxydation par le sel de Frémy conduit à une seule bromocarbazolequinone
N
OH
Et
NBS, CH 3CN Sel de Frémy
t.a., 15 min
90%N
O
Et O
Br
N
OH
Et
Br
N
OH
Et Br
Br
199 204 maj. 205 min. 206 (72%)
+
Travaux personnels Cycloaddition avec les bromocarbazolequinones
Aucun adduit primaire observé Réaction totalement régiosélective
C N O
N
O
O
Et
Br
CNON
Me
N
O
O
Et
ON
N
O
O
Et
ON
N
Me
203
THF, t.a.
3 joursTHF, t.a.
3 jours
211 (48%)213 (58%)
209210 2
C N O
N
O
O
Et
BrCNON
Me
N
O
O
Et
NO
N
O
O
Et
NO
N
Me 206
THF, t.a.
3 joursTHF, t.a.
3 jours
212 (69%)214 (35%)
209210
3
Travaux personnels Détermination structurale par RMN 1H NOE
N
O
O
CH2
ON
N
MeH
H3C
H
H
H
N
O
O
CH2
NO
N
Me
H
H3C H
213 214
3'4'
5
81
1'
3' 6'
6 1
1'
H
4'
4
10
4
10
Travaux personnels Pour les composés 211 et 212 : comparaison des spectres IR avec les régioisomères 213 et 214:
211 et 213 présentent 2 bandes d’absorption à 1673 et 1658 cm-1 : bandes C=O 212 et 214 présentent 1 seule bande d’absorption à 1673 cm-1 pour 212 et à 1667 pour 214: bande C=O
N
O
O
Et
ON
N
Me
213 (58%)
N
O
O
Et
NO
N
Me214 (35%)
Deux bandes d'absorption C=O
Une seule bande d'absorption C=O
Travaux personnels
N
O
OEt
NC N O
Me
C N O
HOMOHOMOHOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,338
-1,313
Energie eV
- 6,550
- 1,614
E=4,451
E=3,463
E=4,752
E=3,251
210201
209
- 3,087
- 6,065
N
O
OEtBr
NC N O
Me
C N O
HOMOHOMOHOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,338
-1,313
Energie eV
- 6,550
- 1,614
E=4,587
E=3,251
E=4,888
E=3,039
210203
209
- 3,299
- 6,201
Théorie des orbitales frontières : étudier réactivité du dipôle et du dipolarophile par calcul des énergies de orbitales frontières HOMO et LUMO et rendre compte de la régiosélectivité des cycloadditions en utilisant les coefficients
N
O
OEt
NC N O
Me
C N O
HOMOHOMOHOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,338
-1,313
Energie eV
- 6,550
- 1,614
E=4,587
E=3,269
E=4,888
E=3,057
210206
209
- 3,281
- 6,201
Br
Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition :
calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des oxydes de nitrile 209 et 210 au niveau des atomes d’oxygène et de carbone.
Pour les oxydes de nitriles 209 et 210, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’oxygène.
En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les oxydes de nitrile 209 et 210 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 212 et 214.
N
O
O
Et
C
N
O
C
N
O
N
Me
N
O
O
EtBr N
O
O
Et
Br
201
210
3
2
209
0,419
0,272 0,288
0,426
0,185
0,221
203
3
2 0,194
0,216
206
3
2 0,1810,234
Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3.
Conclusion
Deux hypothèses : En tenant compte des coefficients orbitalaires, on devrait obtenir
majoritairement 212 et 214. En considérant que l’orientation de la cycloaddition est sous le contrôle
de l’atome de brome conformément à ce qui a été décrit dans la littérature (l’oxygène de l’oxyde de nitrile attaque le carbone bromé de la quinone), on devrait obtenir majoritairement ou exclusivement les régioisomères 211 et 213 à partir de la 2-bromoquinone 203 et les régioisomères 212 et 214 à partir de la 3-bromoquinone 206.
Nos résultats confirment clairement cette deuxième hypothèse. En effet, La sélectivité est gouvernée par la position de l’atome de brome, avec une attaque préférentielle de l’oxygène de l’oxyde de nitrile sur le carbone bromé de la quinone. Nous avons obtenu d’une manière totalement régiosélective chaque régioisomère.
Travaux personnels Synthèse des azotures : méthode décrite par Buckle
Synthèse des azotures de benzyle 217 et de 4-méthoxybenzyle 172 : par substitution nucléophile sur les halogénures correspondants 215 et 216, au moyen
de l’azoture de sodium, La réaction est réalisée à l’abri de la lumière, dans l’éthanol pendant 24 h. La solution est ensuite reprise dans l’éther éthylique, lavée à l’eau pour éliminer
l’azoture de sodium en excès, séchée et évaporée sous vide à une température inférieure à +20°C. Les azotures sont alors isolés sous forme d’une huile claire et utilisés sans purification
CH2Br NaN3
NaN3CH2ClMeO
CH2 N N N
CH2 N N NMeO
NaBr
NaCl
+
EtOH, reflux 24 h
+
+
EtOH, t.a. 24 h
+
217
172
215
216
1 3
31
R N N N R N N N R N N N
Travaux personnels Cycloaddition : obtention des deux régioisomères, en proportion 4/1 ou 3/1
Différents solvants testés: comme le toluène, l’acétate d’éthyle ou le THF, éthanol, à température amb. Pour l’azoture 217 : après 2 semaines de réaction, obtention d’un précipité orange qui est filtré : il
contient les deux régioisomères 218 et 219, séparation par chromatographie sur colonne de gel de silice. Proportions 218/219 = 4/1.
Pour l’azoture 172 : après 2 semaines de réaction, le solvant est évaporé à sec et le produit brut est repris dans l’éther éthylique pour donner un précipité orange constitué par les deux régioisomères 220 et 221, séparation par chromatographie sur colonne de gel de silice. Proportions 220/221 = 3/1.
N
O
O
Et
NN
N
218 (maj.)
219 (min.)
N
O
O
Et
NN
N
+
217 CH2 N N N
15 jours
EtOH, t.a.
68%
H2C N N NMeO
EtOH, t.a.
15 jours
221 (min.)
N
O
O
Et
NN
N
OMe
N
O
O
Et
NN
N
OMe
220 (maj.)+
172
27%N
O
O
Et
201
217
172
Travaux personnels Cycloaddition avec la 2-bromoquinone : obtention d’un seul régioisomère
La cycloaddition de la 2-bromocarbazolequinone 203 et de l’azoture de benzyle 217 ou 172 a été réalisée dans l’acétonitrile à température ambiante pendant 3 à 4 jours.
Obtention d’un précipité orange qui apparaît dans le milieu, constitué du seul régioisomère 218 ou 220. 218 est recristallisation dans l’éthanol, tandis que 220 est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice.
La cycloaddition de la 2-bromocarbazolequinone 203 avec les azotures 172 et 217 est totalement régiosélective. Dans le cas des azotures, la sélectivité est en faveur de l’isomère dans lequel l’atome N-1 de l’azoture est lié au
carbone-3 (non bromé) de la quinone.
CH2 N N N
N
O
O
EtBr
CH2 N N NMeO
N
O
O
Et
NN
N
N
O
O
Et
NN
N
OMe
203
CH3CN, t.a.
4 jours
CH3CN, t.a.
3 jours
218 (50%) 220 (43%)
217 172
2
1 2 3 2 31
3
Travaux personnels Cycloaddition avec la 3-bromoquinone : obtention des deux régioisomères
La cycloaddition est effectuée dans l’éthanol à température ambiante, et elle conduit au mélange des deux régioisomères. La régiosélectivité, dans ce cas, est en faveur des isomères 219 et 221, dans lesquels l’atome N-1 de l’azoture est lié au carbone-2 (non bromé) de la quinone.
Les proportions des régioisomères avoisinent, dans les deux réactions, le rapport 1/2, alors que les proportions des régioisomères avec la quinone non bromée avoisine le rapport 4/1 ou 3/1.
N
O
O
Et
Br
N
O
O
Et
NN
N
OMe
N
O
O
Et
NN
N
N
O
O
Et
NN
N
OMe
N
O
O
Et
NN
N
206
EtOH, t.a.
218 (min.) 219 (maj.)
217
3
15 jours
+
EtOH, t.a.
220 (min.) 221 (maj.)
172
10 jours
+
74%
48%
Travaux personnels Détermination structurale
Confirmation de la régiochimie par étude des corrélations 1H-13C HMBC, réalisée sur le couple de régioisomères 220 / 221
Pour l’isomère 220, présence d’un couplage J4 : entre les protons CH2 du groupement éthyle (4,76 ppm) et C-4 (172,86 ppm)
entre les protons CH2 du groupement p-méthoxybenzyle (5,93 ppm) et C-10 (172,74 ppm).
Pour l’isomère 221, présence d’un couplage J4: entre les protons CH2 de l’éthyle (4,69 ppm) et C-4 (170,26 ppm),
entre CH2 du groupement p-méthoxybenzyle (5,88 ppm) et C-4 (170,26 ppm),
C-10 (175,24 ppm) n’est pas corrélé.
221220
N
O
O
NN
N
OMe
N
O
O
NN
N
OMe
14
10
4
101
Travaux personnels Détermination structurale
Pour les isomères 218 et 219 : comparaison de leurs spectres RMN 13C et IR respectivement avec ceux des régioisomères 220 et 221 : analogie
Concernant RMN 13C : analogie concernant les déplacements chimiques des carbones carbonyliques C-4 et C-10 : 218 et 220 : à partir 2-bromoquinone, 219 et 221 à partir 3-bromoquinone.
Concernant les spectres IR: 218 et 220 présentent deux bandes d’absorption relatives aux deux carbonyles : 1678 et 1652 cm-1 pour 218 et 1679 et 1655 cm-1 pour 220 219 et 221, ils ne présentent qu’une seule bande C=O à 1667 cm-1 pour le premier et à 1670 cm-1 pour le second
C-4 (ppm) C-10 (ppm)
218 172,90 172,68
220 172,86 172,74
219 170,42 175,44
221 170,26 175,24
Travaux personnels Théorie des orbitales frontières :
N
O
OEt
CH2 N N N CH2 N N NMeO
HOMOHOMO
HOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,058
-0,724
Energie eV
- 6,822
- 0,827
E=5,238
E=3,735
E=5.341
E=2,971
217201
172
- 3,087
- 6,065
N
O
OEtBr
CH2 N N NMeOCH2 N N N
HOMOHOMOHOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,058
-0,724
Energie eV
- 6,822
- 0,827
E=5,374
E=3,523
E=5,477
E=2,759
203
- 3,299
- 6,201
217 172
2
CH2 N N N CH2 N N NMeON
O
OEt
Br
HOMOHOMOHOMO
LUMO
LUMO
LUMO
- 6,058
-0,724
Energie eV
- 6,822
- 0,827
E=5,374
E=3,541
E=5,477
E=2,777
217206
- 3,281
- 6,201
172
3
Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition :
calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des azotures 217 et 172 au niveau des atomes d’azote N-1 et N-3.
Pour azotures 217 et 172, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’azote N-1.
En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les azotures 217 et 172 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 218 et 220.
N
O
O
EtN
O
O
EtBr N
O
O
Et
Br
201
3
2 0,185
0,221
203
3
2 0,194
0,216
206
3
2 0,1810,234
CH2
N
OMe
N
N
CH2
N
N
N
217
0,048
0,075 0,393
0,327
172
11
3 3
Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3.
Conclusion
Deux hypothèses : En tenant compte des coefficients orbitalaires, on devrait obtenir
majoritairement 218 et 220. En considérant que l’orientation de la cycloaddition est sous le contrôle
de l’atome de brome (comme pour les cycloadditions avec les oxydes de nitrile), on devrait obtenir majoritairement ou exclusivement les régioisomères 218 et 220 à partir de la 2-bromoquinone 203 et les régioisomères 219 et 221 à partir de la 3-bromoquinone 206.
Nos résultats confirment clairement cette deuxième hypothèse. En effet, La sélectivité est gouvernée par la position de l’atome de brome, avec une attaque préférentielle de l’azote N-1sur le carbone non bromé de la quinone. Nous avons obtenu d’une manière totalement régiosélective les régioisomères 218 et 220, alors que la quinone bromée en C-3 nous a permis d’obtenir majoritairement les régioisomères 219 et 221 .
Conclusion
Nous avons obtenu par réaction de cycloaddition de Diels-Alder sur les o-
carbazolequinones, quatre produits de cycloaddition. par cycloaddition 1,3-dipolaire : quatre dérivés
isoxazolecarbazolequinones, quatre dérivés triazolecarbazolequinones des quinones tricycliques : trois o-carbazolequinones, trois p-
carbazolequinones dont deux bromées. trois hydroxycarbazoles deux dérivés dimères de type carbazole-carbazolequinone
Nous avons montré que la cycloaddition de Diels-Alder sur les o-carbazolequinones est possible avec les carbodiènes
Nous avons trouvé une méthode efficace pour obtenir des cycloadditions 1,3-dipolaires régiosélectives sur des p-carbazolequinones
2ème partie : évaluation biologique in vitro sur
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii Protozoaire parasite de l’embranchement des Apicomplexa, ubiquitaire,
responsable d’atteinte fœtale en cas d’infection chez la femme enceinte non immunisée, et d’atteintes cérébrale et oculaire principalement par réactivation des kystes chez les sujets immunodéprimés.
Développement intracellulaire obligatoire
Toxoplasma gondii Cycle cellulaire :
un hôte définitif : félidés : reproduction asexuée et sexuée Sporulation en milieu extérieur Hôtes intermédiaires : animaux homéothermes: reproduction asexuée,
enkystement dans le tissu cérébral, oculaire, musculaire.
Les médicaments
Les macrolides et apparentés Spiramycine Clarithromycine, azithromycine, roxithromycine Clindamycine
Inhibiteur de la déshydrofolate réductase Pyriméthamine Trimétoprime (un des composants du cotrimoxazole) Sulfamides
Atavoquone : hydroxynaphtoquinone
O
O
OH
Cl
230 Atavoquone
Autres molécules actives in vitro et/ou in vivo Autres antibiotiques
Doxycyline Fluoroquinolones Rifapentine Synercid
Autres inhibiteurs de la déshydrofolate réductase Piritrexime, épiroprime Trimetrexate (analogue du méthotréxate) di-amino-quinazolines, di-amino-pteridines , di-amino-tetrahydropyrimido-isoquinoline, de
di-amino-dihydrotriazines Analogues de sulfamides
Analogues de l’atovaquone Composés trioxanes : artemisinine,… Autres : pentamidine, paclitaxel, ciclosporine A, inhibiteurs de protéases Inhibiteurs du métabolisme des purines Quinones
HN
O
O
O
OCOCH3
O
O
CI 50 = 1,64 µg/ml 6,052µM CI 50 = 0,42 µg/ml 1,628µM
325 326
HN
O
O
O
OH
CI 50 = 1,56 µg/ml 6,07µM
327
HN
O
O
O
CI 50 = 1,30 µg/ml 6,103µM
Sulfadiazine CI 50 = 0,40 µg/ml 1,608µMPyriméthamine CI 50 = 0,30 µg/ml 1,101µM
328
Quinones actives in vitro
HNO
O
O
O
O
O
OH
Br
CI 50 = 2,90 µg/ml 12,663µM CI 50 = 1,28 µg/ml 5,079µM308
NH
O
O OH
CO2CH3
CI 50 = 2,47 µg/ml 8,697µM309307
O
O
CI 50 = 1,28 µg/ml 5,423µM
310
O
O
OCH3
NH
O
O
CO2CH3OCH3
CI 50 = 1,25 µg/ml 4,194µMCI 50 = 2,30 µg/ml 13,068µM
311 312
NH
O
O OH
CO2CH3OH
HN
O
O
O O
CI 50 = 2,18 µg/ml 7,569µM CI 50 = 1,20 µg/ml 5,854µM
313 314
HN
O
O
O
OH
CI 50 = 2,00 µg/ml 8,23µM
315
N
O
O
O
N
O
O
OH3CH2CO
CI 50 = 1,94 µg/ml 8,546µM CI 50 = 0,98 µg/ml 3,438µM
317 318
NH
O
O
CO2CH3OH
CI 50 = 1,00 µg/ml 3,534µM
316
HN
O
O N
O
O
O
CI 50 = 1,86 µg/ml 8,122µM CI 50 = 0,94 µg/ml 4,069µM
319 320
N
O
O
O
CI 50 = 1,80 µg/ml 7,469µM
321
HN
O
O
O
OH
Br
O
O
O
CI 50 = 1,76 µg/ml 7,242µM CI 50 = 0,87 µg/ml 3,610µM
323 324
O
O
OCH3
(H3C)2N
CI 50 = 0,92 µg/ml 3,958µM
322
Quinones ont été testés à des doses variables de 0,5 à 4 µg/ ml sur une souche virulente RH de T. gondii en 72h.
Quinones actives in vitro L’équipe de Tapia en collaboration avec
l’équipe de Fillion Les CI 50 pour l’ensemble des composés 329
à 336 pour T. gondii sont comprises entre 0,0007 et 0,0051 µM. Les CI 50 pour la pyriméthamine et la sulfadiazine sont égales à 0,0034 µM à la fois.
Concernant les tests de cytotoxicité, les CI 50 pour l’ensemble des composés 329 à 336 sont comprises entre 0,817 et 0,011 µM. Pour la pyriméthamine la CI 50 est de 0,010 µM et pour la sulfadiazine, la CI 50 est de 0,012 µM
Deux quinones 342 et 346 ont montré des activités bien supérieures aux molécules de références avec des toxicités moindres. Les CI 50 sont de 0,0007 µM pour les deux molécules 342 et 346, contre 0,0034 µM pour la sulfadiazine et 0,0034 µM pour la pyriméthamine.
naphtothiophenquinones 350 à 353 ont montré une très faible solubilité dans les solvants usuels, ne permettant pas leur évaluation biologique.
O
O
RN
OMe
OMe
R2N
R1
329 R2 = H R1 = CO2Et330 R2 = H R1 = CO2H331 R2 = H R1 = H332 R2 = CH2CH2Br R1 = H333 R2 = CH2CH2N3 R1 = H334 R2 = CH2CH2NHBoc R1 = H
335 R = CH2CH2N3336 R = CH2CH2NHBoc
N
O
NS
N
N
O
NN
S
O
O
NS
N
CH2CH2NHBocO
O
NN
S
CH2CH2NHBoc
337 338
339 340
ON
S
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
O
Br
O
O
OBr
OS
N
O
O
ON
S
O
O
OS
N
O
O
341 342 343 344 345
346 347 348
O
O
SCO2Me
349
SS
N
O
O
SN
S
O
O
R
350 R = CO2Me351 R = CHO
R
352 R = CO2Me353 R = CHO
Travaux personnels Les toxoplasmes sont mis en culture avec des cellules de lignées
monocytaires THP1. Culture cellulaire à 37°C, sous atmosphère à 5% de CO2, en milieu humide
Milieu contenant du sérum de veau fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine
Mise en œuvre des tests de cytoxicité But: déterminer si les produits à tester sont toxiques ou non pour les cellules
THP1 En cas de toxicité, les tests d’inhibition de la croissance de T. gondii ne peuvent
pas être menés à bien. Les produits sont testés à des concentrations de 5, 1, 0,5 et 0,1 µM Au bout de 72h d’incubation, la viabilité est déterminée en utilisant le réactif de
Promega : Cell Titer 96 Aqueous Non radioactive Cell proliferation assay : réaction colorimétrique, la viabilité étant proportionnelle à la quantité de formozan (coloré) formé par les enzymes déshydrogénases des cellules métaboliquement actives. Lecture de l’absorbance à 490 nm
Analyse statistique
Travaux personnels Mise en œuvre des tests de d’inhibition de la croissance
Le nombre de cellules est compté en cellule de Malassez et ajusté à 100 000 cellules/ ml pour les THP1 et 30 000 / ml pour les tachyzoïtes.
Les produits sont testés à des concentrations de 0,2 et 0,1 µM Incubation 72h à 37°C sous 5% de CO2 en milieu humide.
Le bleu trypan est ajouté aux solutions. Les cellules et tachyzoïtes vivants ne sont pas perméables et ils restent non colorés, tandis les cellules et tachyzoïtes altérés sont colorés en bleu.
Les tachyzoïtes vivants sont comptés en cellule de Malassez, et les résultats sont analysés par rapport aux puits de contrôle.
Analyse statistique
Travaux personnels Produits testés
NH
O
O81 NH
O
O82 NH
O
O83
N
O
O
87
N
O
O
94
N
O
O
95
N
O
O
ON
211
N
O
O
NO
212
N
O
O
ON
N
213
N
O
O
NO
N
214
N
O
O
NN
N
218
N
O
O
NN
N
219
N
O
O
NN
N
OMe
220
N
O
O
NN
N
OMe221
Cl
N
N
NH2
H2N
Pyriméthamine
H2N S NH
O
ON
N
Sulfadiazine
Travaux personnels Résultats CI 50 (µM) THP1 CI 50 (µM) T.gondii
81 0,769 ± 0,042 0,247 ± 0,040
82 0,232 ± 0,018 0,499 ± 0,068
83 0,794 ± 0,064 0,252 ± 0,015
87 1,419 ± 0,086 0,478 ± 0,141
94 0,216 ± 0,019 0,307 ± 0,057
95 1,054 ± 0,055 0,232 ± 0,008
211 0,236 ± 0,012 0,242 ± 0,020
212 0,239 ± 0,014 0,172 ± 0,007
213 0,592 ± 0,025 0,280 ± 0,026
214 0,398 ± 0,034 0,190 ± 0,009
218 0,286 ± 0,021 0,314 ± 0,048
219 0,247 ± 0,014 0,361 ± 0,054
220 0,296 ± 0,044 0,197 ± 0,019
221 0,221 ± 0,014 0,313 ± 0,046
Pyriméthamine 1,213 ± 0,173 0,201 ± 0,014
sulfadiazine 5,821 ± 1,022 0,205 ± 0,018
Travaux personnels Produits testés
NH
O
O81 NH
O
O82 NH
O
O83
N
O
O
87
N
O
O
94
N
O
O
95
N
O
O
ON
211
N
O
O
NO
212
N
O
O
ON
N
213
N
O
O
NO
N
214
N
O
O
NN
N
218
N
O
O
NN
N
219
N
O
O
NN
N
OMe
220
N
O
O
NN
N
OMe221
Cl
N
N
NH2
H2N
Pyriméthamine
H2N S NH
O
ON
N
Sulfadiazine
La purine nucléoside phosphorylase
L’inhibition du métabolisme des purines constitue une cible potentielle thérapeutique Les mammifères utilisent deux voies d’accès aux purines :
La synthèse de novo à partir de ribose 5-phosphate et de molécules telles que les acides aminés. La voie de sauvetage des purines où l’organisme « recycle » les bases puriques provenant principalement du catabolisme des acides nucléiques, et les transforme en fonction de ses besoins.
Les protozaires ne possèdent pas de voie d’accès de novo aux bases puriques. La voie de sauvetage des purines est donc leur seule possibilité afin de disposer des ces bases. Les nucléosides sont importés de leur hôte.
La purine nucléoside phosphorylase
Cellule hôte
Vacuole parasitophore
Cytoplasme de T. gondii
Adenine
Adenosine
AMP
Adenine
XanthineInosine
Hypoxanthine
GuanineGuanosine
Guanine
Guanosine
IMP XMP GMP
Adenosine
Inosine
Hypoxanthine
Xanthine
Adenosinedesaminase
AMP desaminase
PNP
IMP desaminase
GMP synthetase
PNP
Adenylsuccinatesynthetase
Adeninedesaminase
Adenylsuccinatelyase
Adenosinekinase Hypoxanthine, xanthine, guanine
phosphoribosyltransferase
Cellule hôte
Vacuole parasitophore
Cytoplasme de T. gondii
Adenine
Adenosine
AMP
Adenine
XanthineInosine
Hypoxanthine
GuanineGuanosine
Guanine
Guanosine
IMP XMP GMP
Adenosine
Inosine
Hypoxanthine
Xanthine
Adenosinedesaminase
AMP desaminase
PNP
IMP desaminase
GMP synthetase
PNP
Adenylsuccinatesynthetase
Adeninedesaminase
Adenylsuccinatelyase
Adenosinekinase Hypoxanthine, xanthine, guanine
phosphoribosyltransferase
La purine nucléoside phosphorylase Détermination de l’activité de plusieurs enzymes de la voie de sauvetage des purines, dans des tachyzoïtes provenant de kystes, par HPLC
Six enzymes ont été testés in vivo et in vitro, l’adenosine desaminase, la guanine desaminase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase, l’hypoxanthine xanthine guanine phosphoribosyltransférase (HXG PRT) l’adenine phosphoribosyltransferase (A PRT).
In vivo, la PNP et l’adénosine désaminase ont montré une activité importante. il existe des différences de structures entre l’enzyme des mammifères et de ce parasite. Cette enzyme est une enzyme clé du métabolisme des purines car elle intervient dans la transformation de l’inosine en hypoxanthine et de la guanine en guanosine. Sélection comme une cible potentielle pour des produits à visée antitoxoplasmique.
La purine nucléoside phosphorylase Produits déjà testés
Référence : 8-aminoguanosine Ki = 0,2 mM; 201 Ki = 0,07mM
N
O
OR
X
398 R= Me; X = H201 R= Et; X = H203 R= Et; X = 2-Br399 R= Bn; X = H
N
O
OEtN
Me
Et
N
O
OEt
N
Me N
O
OEt
NH
O
N
O
OEt
N
O
H
N
O
OEt
N
OMe
N
O
OEt
N
OMe N
O
OEt
HO
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
OEt
HO
N
Me
N
O
NEt
RO
N
410 R = H411 R = Me
402
409408407
406405404403
400 401Ki 0,28 mM Ki 0,24 mM
Ki 0,25 mM Ki 0,12 mM Ki 0,30 mM
Ki 0,11mM
Ki 0,97 mM
Ki 0,49 mM
Ki 0,10 mM
Ki 0,41 mM
Ki 0,07mMKi 0,20 mM
Ki 0,0,86 mMKi 0,84 mMKi 1,38 mMKi 0,50 mM
La purine nucléoside phosphorylase Mise en œuvre des tests d’inhibition de la PNP:
Obtention d’un échantillon biologique contenant la PNP à partir des toxoplasmes cultivés, après purification.
L’activité enzymatique est déterminée par HPLC. La phase mobile est constituée de phosphate d’ammonium NH4H2PO4 à 25mM et de méthanol, la proportion est de 95/5.
La PNP contenue dans l’échantillon et les produits testés comme inhibiteurs potentiels sont incubés en présence d’inosine et de phosphate inorganique. Détection à 254 nm de l’hypoxanthine formée, ainsi que l’inosine.
Les incubations : 30 min à 37°C dans un bain thermostaté. La molécule de référence choisie est la 8 aminoguanosine, chaque expérience
est réalisée en triplicats.
La purine nucléoside phosphorylase
Mise en œuvre des tests d’inhibition de la PNP: Problème de purification de la PNP : plus d’un an de « récolte » Problème de solubilité des produits en milieu aqueux : solubilisation dans le DMSO. La concentration choisie
correspondant à la concentration maximale pour avoir une solubilité totale, soit une concentration de 0,5µM au final.
Résultats Aucune des molécules testées n’est inhibitrice de la PNP, aux concentrations utilisées, alors qu’elles ont des
propriétés inhibitrices de la croissance de T. gondii.
Conclusion Nous avons synthétisé 23 composés, dont 7 o-carbazolequinones, 4
isoxazolecarbazolequinones, 4 triazolocarbazolequinones, 3 p-carbazolequinones tricycliques, 3 hydroxycarbazoles, 2 biscarbazoles.
Nous avons évalué 16 composés Comme inhibiteurs de la croissance de T. gondii Test de cytotoxicité Comme inhibiteurs potentiels de la purine nucléoside phosphorylase
Certains de ces composés sont actifs in vitro sur T. gondii, beaucoup de ces composés sont cytotoxiques, ce qui limite leur intérêt comme antiparasitaire
Ces produits sont peu solubles en milieu aqueux, ce qui rends l’évaluation biologique difficile
Aucun de ces produits synthétisés n’inhibe la PNP. Pour compléter l ’évaluation, il conviendrait de réaliser une évaluation in
vivo, pour les produits les moins cytotoxiques. Les molécules pourraient présenter un potentiel comme médicaments
cytotoxiques, il serait utile de tester leur effet sur plusieurs lignées cellulaires, afin de déterminer si elles sont sélectives d’une lignée.
Merci pour votre attention
