Applications de la transgenèseà l'amélioration variétale du riz

doi: 10.1684/agr.2013.0625

Pour citer cet article : Meynard D, Mieulet D, Ben Saad R, Breitler JC, Petit J, Gantet P, Hassairi A,Guiderdoni E, 2013. Applications de la transgenèse à l'amélioration variétale du riz. Cah Agric 22 :494-505. doi : 10.1684/agr.2013.0625

Tirés à part : E. Guiderdoni

RésuméDepuis l’obtention de la premiere plante transgenique de riz en 1988, de larges progres ontete accomplis pour manipuler les caracteres d’interet agronomique par ingenieriegenetique chez cette plante d’importance alimentaire, economique et culturelle majeure.Les caracteres concernes vont de la resistance aux insectes ravageurs et aux pathogenesfongiques, bacteriens et viraux a la tolerance vis-a-vis des contraintes abiotiques (toxiciteset carences minerales, temperature excessive ou basse, exces ou deficit en eau) en passantpar les qualites nutritives ou industrielles du grain. Des portions entieres de voiesmetaboliques peuvent a present etre finement manipulees, permettant par exemple laproduction de b-carotene (provitamine A) dans l’albumen du grain, qui en estnaturellement depourvu, ou l’accumulation des enzymes de la photosynthese C4 dansdes tissus foliaires precis. La production de molecules d’interet therapeutique ou industrieldans le grain a aussi ete realisee. Bien que certaines de ces innovations soient pretes a etretransferees dans le champ du riziculteur depuis plusieurs annees, les politiques publiquessont encore hesitantes a franchir le pas. Ce retard relatif a ete mis a profit pour conduire denombreuses etudes sur les impacts alimentaires et environnementaux lies a laconsommation et au deploiement de ces nouvelles cultures.

Mots cles : amelioration genetique ; qualite des produits ; riz ; stress abiotiques ; stressbiotiques ; transformation genetique.

Themes : amelioration genetique ; pathologie ; productions vegetales.

AbstractUse of genetic engineering in rice improvement

Since the first recovery of a transgenic rice plant in 1988, major progress has been made inmanipulating traits of interest through genetic engineering of this plant of highsociological, cultural and economic importance. These traits encompass resistance toinsect pests, and fungal, bacterial and viral pathogens, tolerance to abiotic constraints(mineral toxicities and deprivation, low or high temperatures, water excess or shortage)and the nutritional or industrial qualities of the grain. Last but not least, engineeringmetabolic pathways in a tissue-specific manner have led, for instance, to the accumulationof carotene in the rice endosperm as well as of C4 photosynthetic enzymes in appropriateanatomical compartments of the leaf. Other projects aim at producing molecules fortherapeutic or industrial use in the seed. Although some of these innovations have beenreadily transferable to rice farmers for several years, public policies are still hesitant. Thescientific community has taken advantage of this to study the impact on the alimentationand the environment related to the consumption or the deployment of the futureengineered crops.

Key words: abiotic stress; biotic stress; genetic engineering; plant breeding; productquality; rice.

Subjects: genetic improvement; pathology; vegetal productions.

Donaldo Meynard1

Delphine Mieulet1

Rania Ben Saad2

Jean-Christophe Breitler1

Julie Petit1

Pascal Gantet3

Afif Hassairi4

Emmanuel Guiderdoni1

1 CiradUMR AGAPTAA108/03Avenue Agropolis34398 Montpellier cedex 5France<donaldo.meynard@cirad.fr><delphine.mieulet@cirad.fr><jcbreitler@greenfeel.eu><julie.petit@cirad.fr><emmanuel.guiderdoni@cirad.fr>2 Centre de biotechnologie de SfaxRoute BP « 1177 »3018 SfaxTunisie<raniabensaad@yahoo.fr>3 Universit�e Montpellier IIInternational Joint Laboratory ``RiceFunctionnal Genomics and PlantBiotechnology'' (IRD, UM2, AGI, VAAS,USTH)Agricultural Genetics InstituteNat. Key Lab for Plant Cell BiotechnologyPham Van Dong RoadCo NhueTuliemHanoiVietnam<pascal.gantet@univ-montp2.fr>4 King Saud UniversityCollege of Food and Agricultural SciencesDepartment of Plant ProductionRoom No. AA 107P.O. Box 246011451 RiyadhArabie Saoudite<afif.hassairi@gmail.com>

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Synthèse

A pres l’obtention en 1988 despremieres plantes transgeni-ques de riz par electropora-

tion de protoplastes, le transfert degenes d’interet agronomique chez leriz a rapidement suivi et s’est depuisdiversifie tout en beneficiant d’uneamelioration constante des methodesde transgenese (Tyagi et Mohanty,2000 ; Bajaj et Mohanty, 2005). Lespremieres plantes de riz exprimantune entomotoxine de Bacillus thurin-giensis et tolerantes aux insectesforeurs des tiges et aux mineurs desfeuilles ont ainsi ete testees en labo-ratoire en 1993 (Fujimoto et al., 1993)puis au champ, quelques annees plustard (Tu et al., 2000 ; Ye et al., 2001).De 1985 a 1999, la fondation Rocke-feller a fortement appuye des projetsde transferts de genes visant unetolerance accrue aux contraintes abio-tiques (secheresse, salinite) et agres-sions biotiques (insectes foreurs,piqueurs-suceurs et defoliateurs,virus, champignons et bacteries) et al’amelioration de la qualite nutrition-nelle du grain. Le programme le plusemblematique dans cette dernierecategorie est sans doute celui visantla mise au point du riz enrichi enb-carotene, le riz dore, qui a ensuiteete appuye par la Commission euro-peenne (Ye et al., 2000).

Résistanceaux insectesravageurs

Les premiers genes d’interet a avoirete transferes dans le genome du rizsont les genes cry de la bacterieB. thuringiensis codant une d-endo-toxine toxique pour certains insectes.Ces genes ont d’abord ete introduitsdans des riz de type japonica(Fujimoto et al., 1993) puis indica(Wunn et al., 1996). Des versionssynthetiques de ces genes, presentantune preference de codon adaptee aleur expression dans les plantes desgenes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B,cry2A et cry9C, ont ete introduitesseules, en combinaison ou en asso-ciant des genes codant pour desproteines entomotoxiques ayant unautre mode d’action comme les pro-teines vip de B. thuringiensis (Chen

et al., 2010) ou des inhibiteurs deproteases ou lectines vegetaux. Lesessais au champ, realises des 1997 enChine (Ye et al., 2001), ont demontrel’efficacite de ces strategies pour laprotection du riz contre differentescategories de ravageurs (Shu et al.,2000). Leur utilisation preserve, enoutre, la diversite des insectes noncibles (High et al., 2004) tout enevitant l’epandage de pesticides tresnocifs pour la sante des riziculteurs(Huang et al., 2005). Si les strategiesd’expression des genes cry ont gene-ralement fait appel a des promoteursconstitutifs (ubiquitine du maıs) ouspecifique des tissus verts (PEP car-boxylase du maıs), une approcheoriginale a consiste a controler leurexpression par un promoteur induc-tible par la blessure (inhibiteur deproteases du maıs) (Cordero et al.,1994). Cette derniere strategie permetd’eviter une accumulation en continudans la plante et dans les partiesdestinees a la consommationhumaine, l’albumen du grain, oupouvant entrer en contact avec desinsectes non cibles, comme le pollen(Breitler et al., 2001, 2004) (figure 1).L’autre categorie de genes codant desproteines a activite entomotoxiqueayant ete introduites chez le riz estcelle que forment les genes de lecti-nes, d’albumines et d’inhibiteurs deproteases d’origine vegetale (Duanet al., 1996 ; Irie et al., 1996 ; Xuet al., 1996a ; Lee et al., 1999 ;Mochizuki et al., 1999 ; Vila et al.,2005 ; Yarasi et al., 2008). Les inhibi-teurs de proteases permettent d’empe-cher l’assimilation des acides aminesessentiels par les jeunes larves d’insec-tes, ralentissent leur developpement,et peuvent provoquer leur mort. Lepremier riz exprimant un inhibiteur deproteases teste au champ et conferantun bon niveau de protection contre lesforeurs des tiges a ete concu parintegration dans son genome du genepinII de la pomme de terre place sousle controle de son propre promoteur,qui presente l’interet d’etre inductiblepar blessure, et de l’intron d’actine1 du riz (Duan et al., 1996). Enfin,une autre strategie, recemment miseau point pour lutter contre les nema-todes ou les insectes ravageurs,consiste a faire s’exprimer dans laplante des ARN doubles brins dont ladegradation en petits ARN apresingestion par le ravageur va conduire

a l’inhibition specifique de genesessentiels a son developpement parla mise en place d’une interference del’ARN (Zha et al., 2011).

Résistanceaux pathogènes

Differentes strategies ont ete utiliseespour lutter contre les maladies fongi-ques (Magnaporthe, Rhizoctonia,Fusarium), bacteriennes (Xanthomo-nas) et virales du riz (Rice TungroVirus [RTSB et RTSV], Rice YellowMottle Virus [RYMV], Rice Stripe Virus[RSV], Rice Hoja Blanca Virus [RHBV],Rice Ragged Stunt Virus [RRSV]). Pourles maladies provoquees par lesbacteries et les champignons, lesmeilleurs niveaux de protection ontpour le moment ete ceux qui ont eteobtenus grace a des genes de resis-tance naturelle isoles a partir decertaines varietes de riz ou de sesespeces apparentees. Une meilleureconnaissance des evenements mole-culaires impliques dans les interac-tions plante-pathogene a permisd’identifier des genes cles et centrauxregulant les processus de defense.L’expression constitutive du geneAtNPR1 d’Arabidopsis chez le riz aainsi permis l’expression preventivedes genes de defense endogenesnormalement induits par l’acide sali-cylique, une hormone vegetale destress, et conferant ainsi un niveauplus eleve de resistance aux pathoge-nes fongiques et bacteriens (Quiliset al., 2008). La manipulation de lareponse hypersensible (immune) de lacellule, conduisant la plante a resisteraux maladies grace a l’accumulationde peroxyde d’oxygene et de compo-ses phenoliques a pouvoir antibio-tique, et a une modification structuralede la paroi des les premiers stades del’infection, a ete egalement exploree(Li et al., 2011). L’expression de genesderives du pathogene s’est montreeefficace pour creer des resistancescontre les virus tels que les RTSV,RTBV et le RYMV en exprimant res-pectivement une replicase impliqueedans la multiplication du genome viral(Huet et al., 1999), une proteine denucleocapside (Lentini et al., 2003) etl’ARN polymerase ARN-dependantedu virus (Pinto et al., 1999). Une autre

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strategie de lutte contre la formebacille du Tungro (RTBV) a consistea surexprimer dans la plante desfacteurs de transcription qui vontreguler l’activite du promoteur duvirus (Dai et al., 2008).Si la surexpression de certains genespeut conduire a une augmentation dela tolerance croisee aux stress bioti-ques et abiotiques (par exemple, legene OsBIRF 1 codant pour une

proteine RING-H2) (Liu et al., 2008),la surexpression d’un meme gene peutparfois conduire a des effets antago-nistes pour la sensibilite a differentstypes de stress. Ainsi, l’expression dugene d’inhibiteur de carboxypepti-dase de la pomme de terre protegele riz contre les pathogenes fongiques,mais conduit a un developpementplus important de larves de foreurs destiges (Quilis et al., 2007). L’effet de

protection contre les maladies fongi-ques et bacteriennes du gene AtNPR1,mentionne plus haut, est contreba-lance par une hypersensibilite auvirus du RYMV et aux stress abioti-ques (Quilis et al., 2008). Les plantesaccumulant la proteine de type14-3-3 regulatrice de la reponse auxstress ZmGF14-6 montrent une tole-rance accrue a la secheresse maisegalement une hypersensibilite aux

A C

0 1 3 6 8 12 24 S T+ T-

MPI MPI Ubi Ubi

T- T+ B B BBNB NB NB NB

jeune âgée

T

T

MPI MPI T- T+Ubi

D

B

MPI Ubi

Emb Emb EmbAlb Alb Alb T+ T-

E

p Ubiquitine Gène cry1B

p MPI Gène cry1B

Figure 1. Modification de la résistance du riz vis-à-vis des insectes ravageurs : expression inductible par l'attaque des larves foreuses de tiges de la pyrale Chilosuppressalis, d'un gène d'endotoxine de Bacillus thuringiensis (Breitler et al., 2000, 2001, 2004).

Figure 1. Modification of rice resistance to insect pests: expression induced by the attack of Chilo suppressalis pyral stem-boring larvae, from an endotoxic Bacillusthuringiensis genus (Breitler et al., 2000, 2001, 2004).A) Larve de pyrale dans un entre-nœud de la tige de riz causant le symptôme du cœur mort (infestation au stade tallage) ou de la panicule blanche (infestation à floraison) ; B) deuxconstruits ont �et�e r�ealis�es où une s�equence synth�etique optimis�ee du gène cry1B de B. thuringiensis codant pour une prot�eine crystal à activit�e entomopathogène a �et�e plac�ee sous lecontrôle d'un promoteur ubiquitaire (ubi1 du maïs) ou inductible par blessure (maize protease inhibitor [mpi]) ; C) la prot�eine Cry1B (flèche, ici visualis�ee sp�ecifiquement grâce à desanticorps au sein des prot�eines totales solubles) s'accumule après blessure dans le riz (haut) quel que soit l'âge du tissu foliaire (B : bless�e ; NB : non bless�e) (bas) ; D) la prot�eineCry1B est, en revanche, absente du pollen (haut) et de l'albumen (alb) et de l'embryon (emb) du grain (bas) lorsque le gène est contrôl�e par le promoteur inductible mpi ; E) les plantesaccumulant la toxine Cry1B sont r�esistantes (gauche) à la pyrale contrairement au t�emoin vari�etal (droite).

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attaques de Fusarium et de Magna-porthe (Campo et al., 2012). Ledialogue croise (cross-talk) entre lesvoies de reponse aux stress biotiqueset abiotiques, qui peut conduire a desreactions opposees et imprevues, estencore insuffisamment pris en comptedans les evaluations des plantes trans-geniques. Les analyses de transcrip-tome des plantes transgeniques quipermettent de suivre l’expressionsimultanee de l’ensemble des genesse systematisent et devraient apporterun eclairage sur l’ensemble des voiesmodifiees par la surexpression d’ungene dans la plante.

Toléranceaux contraintesabiotiques

Des tolerances accrues aux contraintesabiotiques (toxicite et carences mine-rales, exces ou deficit en eau, hautes etbasses temperatures, etc.) ont eterecherchees chez le riz comme chezles autres plantes. En premier lieu, desapproches classiques de surexpres-sion constitutive ou inductible par le

stress de genes, dont le produitconfere une tolerance aux stress parprotection des structures cellulaires oumodification du transport d’eau demineraux ou d’eau, ont ete tentees.Dans cette categorie rentrent parexemple les proteines late embryoge-nesis abundant (LEA) (Xu et al.,1996b ; Babu et al., 2004 ; Kathuriaet al., 2009), les proteines de chocthermique (HSP) (Murakami et al.,2004) ou les aquaporines (Katsuharaet al., 2003). Des genes codant pour lasynthese d’osmoprotectants comme laproline (Hur et al., 2004 ; Su et Wu,2004) et la glycine betaıne (Sakamotoet Murata, 2002 ; Kathuria et al., 2009),ou des sucres comme le trehalose(Garg et al., 2002 ; Jang et al., 2003)ont aussi ete utilises. Dans un secondtemps, des genes dont les produitssont impliques dans la perception et latransduction du signal de reponse austress ont ete identifies et utilises entransgenese : ce sont principalementdes kinases comme MAPK (Saijo et al.,2000 ; Xiong et Yang, 2003) et CPDK(Asano et al., 2011), des proteinesregulant des voies de signalisation parinteraction proteine-proteine commeles proteines SAP (Kanneganti etGupta, 2008 ; Ben Saad et al., 2012)et DIR (Gao et al., 2011) ou des

facteurs de transcription tels DREB(Dubouzet et al., 2003 ; Oh et al.,2005 ; Oh et al., 2007 ; Wang et al.,2008), AP37 (Oh et al., 2009), NAC (Huet al., 2006, 2008 ; Takasaki et al.,2010), MYB (Ma et al., 2009 ; Jeonget al., 2010), HARDY (Karaba et al.,2007), ZIP23 (Xiang et al., 2008), ERF(Quan et al., 2010) et DST (Huanget al., 2009). Ces dernieres strategiespermettent a la fois de regulerl’expression coordonnee d’un grandnombre de genes de reponse auxstress et egalement de conduire a destolerances a plusieurs contraintesabiotiques, les voies de reponse adifferents stress etant souvent commu-nes, au moins pour partie. Si la liste estlongue des publications rapportant letransfert de genes qui conferent au rizune meilleure tolerance aux stressabiotiques en conditions de labora-toire ou de serre, les exemples detolerance verifiee au champ sousdivers scenarios de stress restentencore limites : seuls les genes NAC(Hu et al., 2006 ; Jeong et al., 2010),LEA (Xiao et al., 2007) et AP37 (Ohet al., 2009) ont montre leur efficaciteen conditions naturelles. L’analyse finedes resultats a d’abord permis deconclure que la manipulation d’unseul gene, meme jouant un role central

pMPI-cry1B

T-

F G H

Figure 1. (suite) : F) larves de pyrale r�ecup�er�ees après le bio-essai : les larves d�epos�ees sur les plantes exprimant la toxine ne se sont pas d�evelopp�ees et sontmortes (haut) tandis queles larves d�epos�ees sur les plantes t�emoins ont chang�e de stade et sont vivantes (bas) ; G) les lign�ees exprimant la toxine cry1B sont totalement prot�eg�ees en conditions de champtandis que les plantes t�emoins pr�esentent les symptômes d'attaque par Chilo suppressalis (H) (C, D, F et E reproduits de Breitler et al., 2001 et Breitler et al., 2000, respectivement).

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dans la reponse a differents stressabiotiques, pourrait difficilement per-mettre une adaptation complete de laplante aux nombreux scenarios etcombinaisons de stress rencontres enconditions naturelles. Cependant, desresultats recents semblent montrerqu’un tel objectif pourrait etre atteintet cela sans penalite sur la perfor-mance de la plante lorsqu’elle estcultivee en absence de stress (Huet al., 2006 ; Karaba et al., 2007 ; Ohet al., 2009 ; Jeong et al., 2010 ; BenSaad et al., 2012). Un interet particulierest actuellement porte a l’isolement degenes de tolerance a partir de plantesextremophiles qui, en dehors de leursadaptations morphologiques et ana-

tomiques souvent remarquables, ontaussi vraisemblablement optimiseleurs mecanismes physiologiques dereponse aux stress abiotiques. Ainsi,une etude du transcriptome d’Aeluro-pus littoralis, une graminee halophyteadaptee a pousser en presence defortes concentrations en sel, a permisd’identifier le gene AlSAP codant pourune proteine possedant deux domai-nes en « doigt de zinc », A20 et AN1.L’accumulation de cette proteine dansla plante permet au riz, comme ad’autres plantes (ble dur, tabac), depoursuivre sa croissance par un main-tien de la photosynthese sous diffe-rentes contraintes abiotiques severes(Ben Saad et al., 2012) (figure 2).

Une amelioration de la tolerance auxcarences minerales, telles que lemanque d’azote et de fer, a egalementete approchee par la transgenese.Pour l’azote, l’expression d’un facteurde transcription DOF dumaıs a permisd’ameliorer significativement son assi-milation par activation des genes dephotosynthese et en modulant l’equi-libre de metabolites carbones et azotes(Kurai et al., 2011). Une autre voie aconsiste a exprimer une gene d’ala-nine aminotransferase d’orge de facontissu-specifique (Shrawat et al., 2008).Pour accroıtre l’absorption de fer,l’expression de genes impliques dansla biosynthese des siderophores (desmolecules facilitant l’assimilation et le

100 2000

mM NaCl

A B

Conditions normales

T RN5 RN2 RN4

C

T RN5 RN2 RN4

15 jours après le stress D

T RN5 RN2 RN4

8 jours après récupérationE

C

AISAP

rRNA

RN5RN2

Lignées de riz AISAP

RN4

Tp CaMV35S Gène AISAP

Figure 2. Modification de la tolérance du riz vis-à-vis des contraintes abiotiques : expression d'un gène codant pour une stress-associated protein de la graminéehalophyte C4 Aeluropus littoralis.

Figure 2. Modification of rice tolerance to abiotic constraints: expression of a gene coding for ‘‘stress-associated protein’’ of the C4 grass halophyte Aeluropuslittoralis.A) Plante des r�egions d�esertiques, A. littoralis a une croissance racinaire stimul�ee en conditions de salinisation (jusqu'à 300 mM) ; B) un ADN-T contenant la s�equence codante dugène AlSAP sous le contrôle du promoteur CaMV35 a �et�e transf�er�e chez trois lign�ees transg�eniques de riz cv. Nipponbare, RN2, RN4 et RN5. RN5 montre le niveau le plus �elev�ed'accumulation des transcritsAlSAP. C-H : L'accumulation constitutive de AlSAP permet au riz de tol�erer des stress abiotiques multiples (salinit�e, d�eficit hydrique, choc osmotique,basse temp�erature) (Ben Saad et al., 2012), nous montrons ici l'exemple du stress hydrique au travers d'un essai de d�eficit hydrique du sol contrôl�e en pots en conditions de serre,r�ealis�e sur les trois lign�ees et le t�emoin vari�etal. Dans cet essai, la fraction transpirable en eau du sol (FTSW) est amen�ee à la capacit�e au champ (FTSW= 1), puis les pots sontenvelopp�es avec du ruban adh�esif de telle manière à ce que les seules pertes en eau soient dues à la transpiration. La teneur en eau du sol est amen�ee à un niveau proche du point defl�etrissement permanent (FTSW= 0,1). Avant le stress, les lign�ees transg�eniques ont un d�eveloppement comparable au t�emoin (C). Après le stress (D), les plantes sont remises eneau et r�ecupèrent pendant une semaine (E).

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transport du fer) tels ceux codant lanicotianamine aminotransferase et lanicotianamine synthetase, a ete reali-see (Takahashi et al., 2001). Plusrecemment, le facteur de transcriptioniron deficiency 1 (IDEF1) qui se liedirectement a l’element IDE1 despromoteurs des genes induits enreponse a la carence en fer et activeleur transcription, notamment celled’un autre facteur de transcriptionOsIRO2, a ete caracterise. Des plantesde riz transgeniques surexprimant lefacteur IDEF1 presentent une tole-rance accrue a la deficience en ferqui leur permet de se developper surdes sols calcaires, normalement defa-vorables a l’absorption du fer par lesplantes (Kobayashi et al., 2007).

Améliorationde la qualiténutritionnelle du grainLes ameliorations qualitatives du grainont vise la modification de l’amidon, etdes proteines de reserve, l’augmenta-

tion ou la reduction du niveau decertains acides amines et la reductiondes proteines allergenes naturelle-ment accumulees dans le grain.L’exemple le plus emblematique dusucces de la modification de la qualitenutritive du grain de riz est celui qui aete obtenu par le transfert de genesintervenant dans la biosynthese du b-carotene ou provitamine A (Burkhardtet al., 1997), aboutissant ainsi a lacreation tres mediatisee du riz dore(golden rice). Cette strategie est des-tinee a contribuer a pallier la carenceen vitamine A, qui touche particulie-rement les populations defavoriseesdu Sud, en complement d’autresapproches comme la diversificationalimentaire et les programmes defourniture de vitamine A. Elle aconsiste a faire s’accumuler dansl’albumen du riz, qui en est depourvu,du b-carotene par transfert des genesintervenant dans sa biosynthese. Lavoie de biosynthese chez les plantesimplique l’action successive de cinqenzymes a partir du geranylgeranyldiphosphate (GGPP) : la phytoenesynthase (PSY), la phytoene desatu-rase (PDS), la carotene desaturase

(ZDS), et les lycopene b-cyclase(b-LCY) et hydrolyase (b-HYD)(figure 3). Les genes codants pources enzymes sont deja presents dans legenome du riz mais ne s’exprimentpas dans l’albumen du grain. Desetudes ont montre que la principalebarriere a l’accumulation de b-carotenedans l’albumen est l’absence d’accu-mulation des enzymes PSY et ZDS. Lepremier prototype de riz dore a doncconsiste a transferer les genes psy denarcisse et le gene crt1 de la bacterieErwinia, qui convertit directement lephytoene en lycopene et accomplitdonc la fonction des genes pds et zds.Les genes psy et crt1 ont ete placessous le controle du promoteur degluteline du riz qui confere uneexpression specifique de l’albumen,et du promoteur 35S du CaMV quiconfere une expression constitutive.Une autre experience de cotransfor-mation a associe cet ADN-T avec unautre ADN-T portant le gene b-lcy denarcisse sous le controle du promo-teur de gluteline du riz. Les resultatsont montre que l’introduction decette derniere cassette de genes n’etaitpas necessaire a l’accumulation de

F

H

T RN5 RN2 RN4

G

0

5

10

15

20

25

30

A (

μmol

/ m2 / s

)

1 0.63 0.3 0.1 1

FTSW

Taux d’assimilation du CO2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Pl

1 0.63 0.3 0.1 1

FTSW

Index de performance de la chlorophylle

Caractère Culture en conditions normales Après stress hydriqueet récupération

Témoin TémoinLignée RN5 Lignée RN5ndnd

nd

nd

nd

90,66 ± 4,16 (NS)

3,03 ± 0,33 (NS)

70,16 ± 4,79 (NS)

15,66 ± 1,52 (NS)

16,66 ± 1,15 (*)76,33 ± 4,04 (**)

1,99 ± 0,17 (*)

37,65 ± 3,46 (**)

5,66 ± 1,52 (**)

7.0 ± 1.0 (**)Hauteur (cm)

Nombrede panicules

Pois de grain(g/plante)

Pois de 100grain (g)

Nombre de talles87,3 ± 2,51

2,43 ± 0,32

62,56 ± 3,58

12,33 ± 1,52

13,33 ± 1,52

C RN5

C RN5

Figure 2. (suite) : Sous stress, les lignées transgéniques (ici illustrées par la lignée RN5) maintiennent une bonne assimilation du CO2 et l'intégrité de leur appareilphotosynthétique, comme attesté par l'index de fluorescence de la chlorophylle (F). Ces paramètres physiologiques retournent à la normale chez le riz AlSAPaprès récupération (FTSW= 1 sur l'histogramme) alors que ceux des plantes témoins restent toujours affectés. Les riz AlSAP ont poursuivi leur croissancemalgré le stress (G) et produisent 50 % de la récolte obtenue en conditions normales (H) alors que les plantes témoin ne survivent pas (B-H reproduits de BenSaad et al., 2012).

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b-carotene dans le riz, puisque lesactivites b-LCY et b-HYD etaientinduites dans l’albumen du grain deriz suite a la production de lycopene.Une accumulation de b-carotene de1,6 a 2 mg/g a ete observee dans lesgrains des meilleurs evenements detransformation, demontrant ainsi lafaisabilite de la modification (Ye et al.,2000). Il s’est agi ensuite d’augmenterl’expression du gene crt1 en utilisantune sequence synthetique optimiseepour son expression dans la plante, deremplacer le gene selectionnable deresistance aux antibiotiques, utilisepour la selection des tissus transfor-

mes, par le gene PMI codant pour laphosphomannose isomerase et celadans des varietes indica elite (IR64,MTL250) (Hoa et al., 2003). Dansces conditions, une accumulation decarotene de 0,1 a 0,9 mg/g dans lesgrains T1 et de 0,8 mg/g en moyennedans les grains T2 des lignees de rizdore indica a ete obtenue. En para-llele, la societe Syngenta parvenait aatteindre une accumulation de 6 mg/gdans les grains des evenements detransformation debarrasses de mar-queurs de selection de riz japonicatropical en utilisant le promoteur degluteline pour controler l’expression

du gene crt1 specifiquement dansl’albumen. En 2005, la societe Syn-genta publiait ainsi l’obtention d’unriz dore de seconde generation accu-mulant 31 mg/g de b-carotene, repre-sentant 84 % des carotenoıdes totaux.Ce saut quantitatif a ete obtenu parune evaluation systematique dansl’albumen de l’expression d’ADNcde differentes especes, orthologuesdu gene psy du narcisse et notammentceux du maıs et du riz (Paine et al.,2005) (figure 3). Ce taux permet decouvrir 50 % de l’apport journalierrecommande avec une ration quoti-dienne de 72 g de riz dore (un rapport

GGPPSA

GGPP

PP2x

PSY

PDS

ZDS

CRTI

phytoène

lycopène

ζ- carotène

Carotènes

Xanthophylles

α-carotèneβ-carotène

zéaxanthine lutéine

β HYD ε HYD

β/ε LCYβ LCY

OHOH

HO HO

Figure 3. Modification des qualités nutritionnelles du grain : l'exemple du riz doré enrichi en b-carotène (Burkhardt et al., 1997 ; Ye et al., 2000 ; Hoa et al.,2003 ; Paine et al., 2005 ; Barry G., International Rice Research Institute [IRRI], communication personnelle).

Figure 3.Modification of grain nutritional qualities: example of b-carotene enriched golden rice (Burkhardt et al., 1997 ; Ye et al., 2000 ; Hoa et al., 2003 ; Paine et al.,2005 ; Barry G, International Rice Research Institute [IRRI], personal communication).A) La mol�ecule pr�ecurseur de la synthèse des carot�enoïdes est le g�eranylg�eranyl diphosphate (GGPP). Les barres horizontales d�elimitent les �etapes de la voie de biosynthèse descarot�enoïdes qui ont �et�e reproduites en utilisant deux transgènes, l'un d'origine v�eg�etale et codant pour la phytoène synthase (PSY) et l'autre d'origine bact�erienne etmultifonctionnelcodant pour la b-carotène d�esaturase (Crt1), qui accomplissent la fonction des deux d�esaturases, phytoène d�esaturase (PDS) et carotène d�esaturase (ZDS). Le relais est ensuite prispar la lycopène b-cyclase (b-LCY) endogène du riz qui s'est av�er�ee induite en quantit�e suffisante pour former le b-carotène.

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de bioconversion du b-carotene envitamine A de 1:12 est utilise). Desessais de conservation (degradationdu carotene et clivage par la carote-noıde oxygenase) et des essais nutri-tionnels, notamment pour determinerla biodisponibilite (absorption) et labioefficacite (clivage enzymatique)du carotene contenu dans les grainsde riz dore, sont actuellement encours pour aboutir a une imageglobale de l’apport reel a l’organismeen vitamine A (Tang et al., 2009). Lestransgenes de riz dore de premieregeneration (gene PMI ou gene deselection elimine) ont ete introduitspar croisement dans des varieteslocalement adaptees notamment parl’International Rice Research Institute(IRRI), tandis que le meme travail esten cours de realisation avec le riz dorede seconde generation a la teneur encarotene superieure. Sur la lancee duriz dore, de grands projets internatio-naux ont ete lances, notamment autravers du Global Challenge Programde biofortification, Harvest Plus, etdes Grand Challenges for GlobalHealth de la fondation Bill andMelinda Gates, sur les especes vege-tales de grande culture du mandat descentres du Groupe consultatif pour la

recherche agronomique internatio-nale. En combinant les approchesd’evaluation de la diversite naturelleet de selection conventionnelle pources caracteres et des approches detransgenese, ces projets visent aobtenir des nouvelles varietes combi-nant des contenus en vitamines (A, E,etc.), en acides amines essentiels et enoligoelements (Fe, Zn) essentielsameliores. Les approches d’augmen-tation de l’apport en fer ont consisteen l’expression de genes intervenantdans la synthese de phytase qui inhibel’action de l’acide phytique par hydro-lyse et augmente ainsi la biodisponi-bilite du fer present dans le grain(Lucca et al., 2001 ; Hong et al., 2004).Une autre approche a vise uneexpression constitutive ou specifiquede l’albumen de genes de ferritine dusoja (Goto et al., 1999) et du pois(Lucca et al., 2001), alliee ou non avecune surexpression des genes denicotianamine synthase deja citeeplus haut (Wirth et al., 2009 ;Johnson et al., 2011 ; Lee et al., 2011).Le grain de riz a egalement ete utilisecomme support pour y exprimer desproteines recombinantes, telles que lalactoferrine (Nandi et al., 2002) ou lelysozyme (Huang et al., 2002) humain

ou pour realiser une immunotherapiepar voie orale par expression depeptides epitopes d’allergenes(Okada et al., 2003).

Améliorationde l'efficacitéphotosynthétiquedu riz : le riz C4

Les plantes, possedant une photo-synthese en C4 comme le maıs ou lesorgho, presentent une adaptationanatomique des feuilles et une dis-sociation dans l’espace des phasesphotochimique et non photochimiquede la photosynthese. Chez ces plantes,la pression partielle de CO2 atteintedans les cellules de la gaine perivas-culaire est plus de 10 fois superieure ala pression rencontree chez les plantesC3 (2 200 ppm au lieu de 200 ppm), cequi permet une photosynthese activememe lors de la fermeture partielledes stomates de ces plantes adaptees aune croissance sous des climats arides.Les enzymes phosphoenolpyruvatecarboxylase (PEPc) et pyruvate,

Psy maïs/crt1jusqu’ à 36.7

Niveaux de caroténoides (µg/g)

Non transformé Psy narcisse/crt1jusqu’ à 8.0

C CTp GLU TpSSU Crt1 Tp GLU Psy

B

Figure 3. (suite) : B) représentation schématique du construit où le promoteur du gène de la protéine de réserve du grain de riz, la glutéline (GLU), gouverne defaçon spécifique dans l'albumen du grain l'expression du gène de la b-carotène désaturase fusionnée au peptide de transit de la sucrose synthase (TpSSU) àdestination chloroplastique et du gène de la PSY, dont l'action combinée conduit à la formation de lycopène, composé rouge ; C) l'utilisation du gène de PSY dumaïs a permis un saut quantitatif dans l'accumulation du b-carotène précurseur de la vitamine A entre les riz dorés de première et seconde générations.

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orthophosphate dikinase (PPDK) dumaıs exprimees chez le riz, separe-ment ou en association, ont conduit aune amelioration de la capacite photo-synthetique associee avec une meil-leure conductance stomatique et uneconcentration interne en C02 pluselevee. Les donnees d’essai au champont montre une augmentation specta-culaire du rendement de 10 a 20 % etde 30 a 35 % chez des plantes de riztransgeniques suraccumulant lesenzymes PEPc et PPDK du maısrespectivement (Ku et al., 1999). Cesresultats encourageants n’ont cepen-dant pas ete confirmes dans une etudeplus recente (Taniguchi et al., 2008).Recemment, un programme ambi-tieux finance par la fondation Bill etMelinda Gates a reuni un reseau delaboratoires, dont l’IRRI, pour realiserl’ingenierie d’un riz C4. Le projet vise amodifier et compartimenter la machi-nerie biochimique de la photosyn-these par des strategies de sur- et sous-expression specifique dans differentstissus de la feuille tout en recherchantune convergence de differenciationanatomique avec les plantes en C4(augmentation du nombre de vais-seaux dans la feuille et diminution dunombre de files de cellules de Meso-phylle entre les veines). La recherchedes genes impliques dans le controlede ces caracteres est realisee encriblant des lignees « gain de fonc-tion » de riz (obtenues par activation-tagging) et des mutants perte defonction de sorgho (Kajala et al.,2011). Le defi est important mais desavis contrastes sont emis sur la per-tinence de developper un riz C4 : eneffet, l’augmentation previsible de lateneur en CO2 de l’atmosphere pour-rait rendre a terme les plantes C3 plusperformantes et diminuer l’ecart d’effi-cience existant avec les plantes C4.

Diffusionet acceptationdes innovationsbaséessur la transgenèseApres avoir ete parmi les premierescereales chez lesquelles des techni-ques efficaces de transformation gene-

tique ont ete mises au point et utiliseesavec succes pour transferer des genesd’interet, le riz devrait logiquementetre la prochaine plante de grandeculture chez laquelle des varietestransgeniques devraient etre diffusees(Chen et al., 2011). Des riz transgeni-ques, resistants aux insectes, et dontles qualites nutritionnelles du grainsont ameliorees, sont deja prets et sontentres dans le long processus d’eva-luation necessaire pour unemise sur lemarche. Le benefice potentiel pourl’environnement et la sante paraıtsuffisamment etabli. Depuis plus de15 ans, les cultures de coton et demaısBt ont fait la preuve de leur efficacitesur des millions d’hectares en per-mettant la reduction de l’utilisation depesticides de synthese (Lu et al., 2012).Cependant, l’acceptabilite actuelle dece type de produit par les consom-mateurs en Europe et au Japon aconsiderablement ralenti le processuspour le riz. Apres avoir ete pionnier dudeveloppement de ces technologies etdisposant de formules hybrides de rizBt efficaces et pretes a etre diffuseesdepuis dix ans, les autorites chinoisessemblent faire marche arriere face a lamontee de l’activisme dans leur payset a une anticipation de l’impact quipourrait resulter de la mise en culturede ces varietes sur les exportations desproduits derives du riz. Pour cetteraison, les premieres diffusions pour-raient etre effectuees plutot en Inde etau Bangladesh, avec notamment le rizdore enrichi en provitamine A. Cedernier, que l’on pouvait pourtantpenser a priori protege par ses viseeshumanitaires, a egalement fait l’objetde virulentes attaques des l’annoncede son obtention au debut des annees2000. Il a ete rapidement denoncecomme un gadget facilement rempla-cable par la diversification alimentaireet constituant de fait un fer de lance dulobby des industries agrochimiquespour imposer les OGM dans les paysen developpement tout en s’achetantune bonne conscience.Les resistances aux virus, obtenues pardiverses strategies et qui repondent aun besoin tres urgent vu l’impact quepeuvent avoir les maladies causees parces pathogenes certaines annees,pourraient egalement etre utiliseescomme complement aux rares sourcesde resistance naturelle au virus ou ason vecteur identifiees chez le riz.Cependant, les programmes de diffu-

sion des innovations restent la encorehesitants. Rappelons egalement leprecedent arret de la diffusion versl’Asie du Sud-Est, et notamment enThaılande, de la papaye resistante auxvirus mise au point par la recherchepublique aux Hawaı ou les culturessont ainsi protegees de facon tresefficace par cette methode, suite a unecampagne non moins efficace d’orga-nisations environnementales.Application plus discutable, des riztransgeniques tolerants aux herbicides(glufosinate d’ammonium, glypho-sate, sulfonylurees) ont egalementete mis au point, notamment pour lemarche nord-americain. Les societesobtentrices ont pour le momentrenonce a leur diffusion en raisondes problemes de separation desfilieres destinees a l’exportation enEurope. Un probleme est egalementlie au croisement possible avec laforme adventice du riz, le riz rouge,interfertile avec le riz cultive quipourrait conduire au developpementde formes resistantes (Messegueret al., 2004). Paradoxalement, lasociete BASF a developpe par muta-tion induite dans le gene de l’aceto-lactate synthase, cible des herbicidesde la classe de sulfonylurees, des riztolerants a ces herbicides qui ont etecommercialises en Europe sansaucune protestation, sous la techno-logie Clearfield. Ces riz non-OGMposent pourtant exactement lesmemes problemes que les riz tolerantsobtenus par transgenese (flux degenes, apparition de resistances chezles mauvaises herbes, etc.). La luttecontre les mauvaises herbes resteneanmoins un des problemes domi-nants de la riziculture pluvialeconduite notamment sur le continentafricain.Des riz produisant des moleculespharmaceutiques comme la lactofer-rine, puissant antiseptique du laitmaternel, ont egalement ete en phasede test. La farine de ces riz pourraitaider a lutter contre la dysenterie dunourrisson non allaite au lait maternel,notamment dans les pays en develop-pement. Les essais au champ enCalifornie ont cependant du etresuspendus du fait des craintes soule-vees par un possible flux de genes versdes cultures conventionnelles.La tolerance aux contraintes abioti-ques pourrait constituer l’objectif deselection pour lequel le recours a

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l’ingenierie genetique serait le plusacceptable pour les consommateurseuropeens. Nous avons cependant vuque la plupart de ces innovations n’ensont encore qu’au stade d’evaluationau champ, ou elles sont confrontees ade multiples scenarios de stress afin devalider leur efficacite. Toutefois,meme si ces stress peuvent varierdans leur combinaison, leur severiteou le stade de developpement de laculture ou ils surviennent, ils restentconnus, et le contournement destolerances ne peut pas resulter,comme dans le cas des interactionsbiotiques, d’une coevolution imprevi-sible du partenaire.En conclusion, nous avons vu que lesinnovations issues de l’ingenieriegenetique peuvent appuyer la selec-tion conventionnelle assistee par lagenomique chez le riz, notammentpour des caracteres ou l’objectif fixepourra etre atteint plus vite ou uni-quement par cette technologie. Lesmethodes de transgenese, quant aelles, evoluent vers une precisionaccrue des changements apportes augenome qui pourront rendre a termeles modifications obtenues plus pro-ches de celles de la recombinaisonnaturelle ou de la mutagenese. &

Remerciements

La fondation Agropolis, la Commissioneuropeenne et l’Agence nationale de larecherche (ANR) sont vivement remercieespour leur soutien aux activites de l’equipe.Les auteurs remercient Martine Bes,Nadege Lanau, Florence Artus, AuroreVernet, Murielle Portefaix, ChristianChaine, Remy Michel et Eve Lorenzinipour leur participation aux projets derecherche de l’equipe. Ils remercientNourollah Ahmadi et Brigitte Courtoispour leur relecture du manuscrit.

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