TANINS OENOLOGIQUES N° SIN : 181 (Oeno 12/2002 … · correspond à la différence de coloration entre le jaune mesuré à 420 nm et le rouge mesuré à 520 nm d’une solution de

CODEX ŒNOLOGIQUE INTERNATIONAL

Tanins œnologiques COEI-1-TANINS : 2009

F-COEI-1-TANINS 1

TANINS OENOLOGIQUES

N° SIN : 181 (Oeno 12/2002 modifiée par

Oeno 5/2008 et 6/2008, OIV-Oeno 352-2009) OIV-OENO 554-2015

1. OBJET, ORIGINE ET DOMAINE D'APPLICATION Les tanins oenologiques sont extraits soit de la noix de galle, soit d'un bois riche en tanin : châtaignier, chêne, bois exotiques, etc.... soit des pépins et de pellicules de raisins. Les tanins sont composés d'un mélange de glucosides soit de l'acide gallique (gallotanins), soit de sa dilactone, l'acide ellagique (ellagitanins), (tanins hydrolysables) ou bien d'un mélange de proanthocyanidines (tanins condensés). Les tanins sont utilisés pour faciliter la clarification des moûts et des vins. Ils ne doivent pas modifier les propriétés olfactives et la couleur des vins. 2. ETIQUETAGE La nature du solvant d'extraction (eau ou alcool), l’origine botanique ainsi que l’estimation des phénols totaux doivent figurer sur l'étiquette. 3. CARACTERES Le tanin oenologique est d'une couleur allant du blanc jaunâtre au marron rougeâtre, de saveur astringente, partiellement soluble dans l'acétate d'éthyle et soluble dans l'eau, l'éthanol et le méthanol pour les tanins condensés et insoluble dans la plupart des solvants organiques à l'exception de l'éthanol et du méthanol pour les tanins hydrolysables. 4. CARACTÈRES D'IDENTITÉ

4.1 - La solution aqueuse de tanin donne, avec les sels de fer(III), un précipité bleu noir entre pH 3 et 5. Ce précipité disparaît par addition d'une petite quantité d'acide fort.

4.2 - La solution aqueuse de tanin condensé précipite la gélatine, l'albumine du blanc d'oeuf, du sérum sanguin, etc. à pH compris entre 3 et 6. Les tanins précipitent les alcaloïdes (quinine, strychnine, etc.) entre pH 4 et 6. 5. CARACTERISATION Il est possible de caractériser l'origine botanique à l'aide de plusieurs critères : spectre d'absorption en ultraviolet, teneur en flavanols, proanthocyanidines, acide digallique, scopolétine (voir l’annexe).



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6. ESSAIS

6.1 Matières étrangères Le tanin doit être presque entièrement soluble dans l'eau et la teneur en substances insolubles inférieure à 2 p. 100, après agitation pendant 15 minutes de 10 g de tanin dans un litre d'eau.

6.2 Perte à la dessiccation Déterminée jusqu'à poids constant, sur une prise d'essai de 2 g, la perte de poids à l'étuve à 100- 105 °C, pendant 2 heures, doit être inférieure à 10 p. 100.

Toutes les limites fixées ci-dessous sont rapportées au produit sec.

6.3 Cendres Incinérer progressivement, sans dépasser 550 °C, le résidu laissé dans la détermination de la perte à la dessiccation. Le poids de cendres doit être inférieur à 4 p. 100

6.4 Préparation de la solution pour essais Reprendre les cendres de 2 g de tanin par 1 ml d'acide chlorhydrique dilué (R) et une goutte d’acide nitrique concentré (R). Chauffer sur un bain d'eau à 100 °C quelques instants pour préciser la dissolution. Transvaser dans une fiole jaugée de 50 ml en rinçant la capsule avec de l'eau distillée, et compléter au trait de jauge.

6.5 Arsenic Sur 0,25 g de tanin, rechercher l'arsenic par la méthode décrite au Chapitre II par spectrophotométrie d'absorption atomique, après destruction de la matière organique par la méthode par voie humide. La teneur en arsenic doit être inférieure à 3 mg/kg.

6.6 Fer A 10 ml de solution pour les essais préparée selon 6.4, ajouter 2 ml de solution de thiocyanate de potassium à 5 p. 100 (R) et 1 ml d'acide chlorhydrique concentré (R). La coloration obtenue ne doit pas être plus intense que celle d'un témoin préparé avec 2 ml d'une solution de sel de fer(III) à 0,010 g de fer par litre (R), 8 ml d'eau et les mêmes volumes des mêmes réactifs. En cas contraire une dilution de la solution pour essais sera réalisée. La teneur en fer doit être inférieure à 50 mg/kg, à l’exception de la teneur en fer des tanins issus du châtaignier qui doit être inférieure ou égale à



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200 mg/kg, dans ce cas, la solution pour les essais préparée selon 6.4 devra faire l’objet d’une dilution adéquate. Il est également possible de doser le fer par spectrométrie d'absorption atomique.

6.7 Plomb Sur la solution pour les essais préparée selon 6.4 doser le plomb selon la méthode figurant dans le Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des moûts par spectrophotométrie d’absorption atomique. La teneur en plomb doit être inférieure à 5 mg/kg.

6.8 Mercure Doser le mercure selon la méthode décrite au Chapitre II par spectrométrie d'absorption atomique. La teneur en mercure doit être inférieure à 1 mg/kg.

6.9 Estimation des phénols totaux Sur une solution aqueuse de tanins à 1 g/l diluée au 1/100ème, mesurer l'absorbance à 280 nm sur un parcours optique de 1 mm. La teneur en phénols totaux est donnée en équivalents acide gallique/g et transformée en p. 100 de poudre de tanin. Pour les phénols totaux, les résultats doivent être supérieurs à 65 %.

6.10 Nature des tanins 6.10.1 - Les tanins proanthocyanidiques sont estimés par la méthode aux DMACH : mélanger 5 ml de réactif (100 mg de diméthylaminocinnamaldéhyde + 10 ml d'HCl 12 M; après solubilisation compléter avec du méthanol à 100 ml) à 1 ml de solution aqueuse de tanins (1g/l). Après 10 minutes, lire l'absorbance à 640 nm sur 1 mm de parcours optique. Les résultats sont donnés en équivalents catéchine. Pour les tanins condensés, le résultat doit être supérieur à 10 mg/g. 6.10.2 - Pour estimer les ellagitanins il faut utiliser la méthode à l'acide nitreux. Mélanger à 1 ml de solution aqueuse de tanins (1 g/l), 1 ml de méthanol et 160 µl d'acide acétique à 6 p. 100 (m/v), chasser l'oxygène par barbotage d'azote durant 10 minutes, ajouter enfin 160 µl de nitrite de sodium à 6 p. 100 (m/v) suivi d'un bref barbotage d'azote (1 mn), le tube est bouché hermétiquement et la réaction se développe en 60 mn dans un bain d'eau à 30°C. L'intensité de la couleur développée est mesurée par l'absorbance à 600 nm. Les résultats sont estimés en mg/g d'équivalents castalagine (600nm: 983 g-1).

Pour les tanins hydrolysables de type ellagique, le résultat doit être supérieur à 20 mg/g.



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6.10.3 - Les tanins hydrolysables de nature gallique correspondent aux autres catégories de produits répondant négativement aux tests 6.10.1 et 6.10.2.



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6.11 Mode d'extraction 6.11.1 - Indice de solubilité IS Il exprime le pourcentage de solubilité de 5 g de tanin dans 100 ml du mélange éther diéthylique/éthanol (9/1, v/v). Pour des tanins extraits à l'eau exclusivement, le résultat doit être inférieur à 5 6.11.2 - Indice d'extractibilité IEx :

lEx = (D.0.370 nm X 2) - (D.O.350 nm + D.0.420 nm). Lorsque lEx est supérieur à 0,05, les produits sont issus d'une extraction exclusivement à l'eau.

6.12. Pouvoir Colorant

Sans préjudice aux dispositions du paragraphe 1, l’emploi de tanins œnologiques modifie plus ou moins la coloration des vins, fonction de leur pouvoir colorant propre. On doit donc définir d’une part le pouvoir colorant jaune (A420 1‰) correspondant à la coloration jaune mesurée par l’absorbance à 420 nm d’une solution d’essai de tanin œnologique à 1‰ de matières sèches (1g/l). Plus l’indice est élevé et plus sa couleur jaune influencera la couleur du vin. Et d’autre part, le pouvoir colorant rouge (A520-A4201‰). Ce dernier correspond à la différence de coloration entre le jaune mesuré à 420 nm et le rouge mesuré à 520 nm d’une solution de tanins oenologiques à 1‰; le tanin est colorant lorsque l’indice devient positif (A520 > A420). Les tanins œnologiques sont solubilisés dans un mélange éthanol/eau (50/50, v/v). Les absorbances sont mesurées sous 1 cm de trajet optique. Les mesures se font immédiatement après la mise en solution. Dans ces conditions, un tanin œnologique récent doit donner une solution limpide.

Les limites, pour qu’un tanin oenologique ne soit pas considéré comme colorant, pour ces deux indices sont de :

+ 1,5 pour le pouvoir colorant jaune (A4201‰) et

+ 0,05 pour le pouvoir colorant rouge (A520-A4201‰)

7. CONSERVATION Les tanins oenologiques doivent être conservés dans des emballages hermétiquement clos.



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ANNEXE 1

MISE EN EVIDENCE DE L’ORIGINE BOTANIQUE DES TANINS OENOLOGIQUES MATERIELS ET METHODES Principe

La reconnaissance de l’origine botanique des tanins oenologiques nécessite des observations à réaliser dans l’ordre suivant :

- 1°) Présence de tanins condensés tirés des raisins, - 2°) Présence de tanins issus de noix de galles, - 3°) Présence de tanins issus de bois exotiques, - 4°) Différenciation du tanin de chêne du tanin de châtaignier.

- Les tanins de raisins se caractérisent par une forte teneur en flavanols exprimée en (+) catéchine. - Les tanins de noix de galle possèdent des teneurs en acide digallique importantes. - Le spectre dans l’ultraviolet des tanins issus de bois exotiques présente un pic spécifique. - Les tanins de chêne sont plus riches en coumarines et plus particulièrement en scopolétine que les tanins de châtaignier.

Appareillages et conditions analytiques - Verrerie de laboratoire. - Agitateur magnétique.

- Spectrophotomètre d’absorption UV / visible double faisceau. - Cuve de 1 cm de parcours optique en verre - Cuve de 1 cm de parcours optique en quartz, - Bain d'eau à 100°C (facultatif) - Evaporateur rotatif chauffant - Système chromatographique composé (à titre d'exemple): d’une pompe à gradient pour mélanges binaires d’un injecteur muni d’une boucle de 20 µl

d’un détecteur spectrophotométrique à longueur d’onde fixe 280 nm

d’un détecteur fluorimétrique Colonne de type phase inverse (C18) diamètre des particules 5µm, dimensions de la colonne : 20 cm X 4.6 mm pour doser l’acide digallique et la scopolétine. - pH mètre.



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Réactifs et solutions étalons - para-[diméthylamino]cinnamaldéhyde

-acide chlorhydrique en solution concentrée (R) - (+) catéchine

- acide digallique - éthanol absolu - acétate d’éthyle - hydroxyde de sodium en solution concentrée (R) - méthanol - éther éthylique - acétonitrile - acide acétique - scopolétine - ombelliférone - eau distillée ou déminéralisée et ultrafiltrée. Préparation des réactifs Solution de p-[diméthylamino]cinnamaldéhyde (p-DACA) 100 mg de p-DACA sont mis en solution dans 10 ml d’acide chlorhydrique 12 M et 90 ml de méthanol. Solvants d’élution de l’acide digallique solvant A: méthanol pur

solvant B: solution d’acide perchlorique dans l’eau à pH 2,5

Solvants d’élution de la scopolétine solvant A: eau distillée contenant 3 % d’acide

acétique solvant B: acétonitrile contenant 3 % d’acide

acétique Préparation des solutions étalons Solution de (+) catéchine

Mettre en solution 10 mg de (+) catéchine dans 1 l d’eau distillée Solution d’acide digallique à 100 mg / litre d’eau distillée

Solution de scopolétine à 20 µg / litre d’eau distillée.



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Modes opératoires Mise en évidence de la présence de tanins de raisins, 2 méthodes

possibles: Dosages des flavanols totaux. 5 ml de réactif à la p-DACA sont additionnés de 1 ml de solution

aqueuse à 200mg / l de tanin. Après 10 mn, l’absorption du mélange placé dans une cuve en verre dont le trajet optique est de 10 mm est mesurée à 640 nm.

Les valeurs de l'absorbance sont ensuite rapportées à une courbe étalon obtenue à partir d’une gamme de concentrations croissantes en (+) catéchine analysée dans les mêmes conditions.

Dosage des tanins proanthocyaniques 4 ml de solution à 200 mg/l de tanin sont additionnés de 2 ml

d’eau distillée et de 6 ml d’acide chlorhydrique 12 M dans un tube à hydrolyse. Ce tube est porté à 100 °C pendant 30 mn puis refroidi dans un bain d’eau glacée.

Un second tube contenant le même mélange reste à température ambiante pendant le même temps.

Ensuite, les deux tubes reçoivent 1 ml d’éthanol puis les valeurs des deux absorbances sont mesurées à 550 nm.

La différence des 2 absorbances est multipliée par 380 pour donner la teneur en tanins proanthocyaniques.

Mise en evidence des tanins de noix de galle

20 ml de solution aqueuse de tanin à 50 mg/l sont amenés à pH 7 à l’aide d’une solution d'hydroxyde de sodium concentrée (R).

Une première série d’extractions effectuées avec 3 fois 20 ml d’acétate d’éthyle permet d’éliminer les substances neutres.

Dans un second temps, la phase aqueuse est amenée à pH 2 par addition de solution concentrée d’acide chlorhydrique (R) puis extraite par une nouvelle série de 3 extractions à l’acétate d’éthyle.

Après évaporation de l’acétate d’éthyle, le résidu est repris par 20 ml de méthanol puis analysé par chromatographie dans les conditions suivantes (à titre d'exemple) :

volume injecté: 20 µl d’extrait ou de solution standard d’acide digallique

Détection à 280 nm Composition du gradient d’élution: de 10 à 20 % de solvant A en 35 mn de 20 à 40 % de solvant A en 15 mn de 40 à 98 % de solvant A en 20 mn Débit de la phase mobile: 0,8 ml / mn.



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Mise en évidence de tanins issus de bois exotiques

Préparer une solution aqueuse de tanin telle que, placée dans une cuve en quartz de 1 cm de parcours optique, cette solution possède une absorbance mesurée à 280 nm comprise entre 1 et 1,5. Effectuer en continu sur cette solution des mesures d'absorbance comprises entre 250 et 300 nm.

Relever la présence ou l’absence d’un pic maximum d’absorption. Mise en évidence de tanins de chêne ou de châtaignier. La scopolétine contenue dans 20 ml de solution aqueuse de tanin à

5 g/l est extraite par 3 fois 20 ml d’éther éthylique. Après récupération complète et évaporation de la phase éthérée, l’extrait est repris par 50 ml d’eau puis analysé par chromatographie dans les conditions suivantes (à titre d'exemple):

volume injecté: 20 µl d’extrait ou de solution étalon de scopolétine.

détection fluorimétrique: longueur d’onde d’excitation: 340 nm, longueur d’onde d’émision: 425 nm Composition du gradient d’élution: 94 % de solvant A pendant 10 mn de 94 à 85 % en 20 mn de 82 à 67 % en 5 mn de 37 à 42 % en 5 mn. Débit de la phase mobile : 1 ml/mn CONCLUSION Un tanin est reconnu issu de raisin lorsque sa teneur en flavanols totaux, exprimée en (+) catéchine est supérieure à 50 mg/g ou sa teneur en tanins proanthocyaniques est supérieure à 0,5 mg/g. Un tanin est reconnu issu de noix de galle lorsque sa teneur en acide digallique est comprise entre 4 et 8 mg/g. Un tanin est reconnu issu de bois exotiques lorsque son spectre met en évidence un pic d’absorption entre 270 et 280 nm. Un tanin est reconnu issu de chêne lorsque sa teneur en scoplolétine est supérieure à 4 µg/g . Un tanin est reconnu issu de châtaignier lorsque sa teneur en scopolétine est égale ou inférieure à 4 µg/g et qu’il n’est pas identifié comme issu d’autre origine.



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ORIGINE BOTANIQUE

CONCLUSION

Mise en évidence de l’origine botanique des tanins par le dosage de

la teneur en flavanols totaux

L'absorbance doit être > 0,418 (D.O. du D.A.C.A.)

Si le test est positif

Il s'agit d'un tanin de raisin (voir Remarque 1)

Si le test est négatif

Effectuer le dosage de l'acide digallique

Si la concentration en acide digallique

est comprise entre 4 et 8 mg/g Il s'agit d'un tanin de noix de galle

Si la concentration en acide digallique

n'est pas comprise entre 4 et 8 mg/g

Mise en évidence des tanins de bois exotiques

par le spectre UV 250-300 nm

Si le test U.V. est positif

on obtient deux types de profils

Si le test U.V. est négatif, différenciation du

tanin de chêne ou de chataîgnier

par le dosage de la scopolétine

Si la teneur en scopolétine

< 4 µg/g

C'est un tanin de châtaignier

Si la teneur en scopolétine

> 4 µg/g

C'est un tanin de chêne

Si la teneur en acide

digallique 8 mg/g

C'est un tanin de tara

Si la teneur en acide

digallique < 8 mg/g

C'est un tanin de quebracho

(voir Remarque 2)



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Remarque 1 Les tanins de raisin sont formés d'unités flavan-3-ol qui peuvent être libérées par le clivage thiolytique des liaisons intermonomériques flavanoliques des proanthocyanidols en milieu acide et à chaud. Les monomères libérés sont alors séparés et dosés par HPLC. On peut ainsi quantifier séparément les procyanidols des prodelphinidols. Cette méthode est utilisée pour la différentiation des tanins de pellicules, de rafles et de pépins de raisin. Dans ces conditions, les tanins de quebracho ne donnent aucun pic. (Voir méthode et figure ci-dessous). Méthode de différenciations des tanins proanthocyanidiques par HPLC Définition

Mise en évidence de tanins de quebracho, de pellicules et de pépins

Matériels et méthodes

Appareillage et conditions analytiques

- Pipette droite de 1 ml graduée en 0,05 ml - Fiole jaugée de 10 ml - Système HPLC

Il est équipé d’une pompe permettant un débit constant ou programmé avec une grande précision, d’une boucle de 20 l.

Une colonne en phase inverse de type C18 dont le diamètre des particules peut être par exemple de 10 μm de diamètre : Longueur : 250 mm ; Diamètre interne: 4,6 mm.

- Détecteur UV-Visible. - Etuve - Tubes à hydrolyse de 10 ml, fermeture avec bouchons téflonnés - Filtres en esters de cellulose de 0,45 μm de diamètre de pores - Système de filtration sous vide - Pipette automatique de 1000 μl - Balance au mg Réactifs et solutions étalons

- Méthanol pour HPLC - Eau distillée - Toluène-α-thiol (CAS 100-53-8) à 99%

- Acide chlorhydrique (12M) à 37% - Acide orthophosphorique à 84



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Préparation des réactifs -Préparation des solvants pour HPLC : Solvant A : dans une fiole jaugée de 1 l, introduire 1 ml d’acide orthophosphorique et compléter la fiole avec de l’eau distillée qui sera au préalable filtrée par un système de filtration sous vide. Solvant B : dans une fiole jaugée de 1 l, introduire 1 ml d’acide orthophosphorique et compléter la fiole avec du méthanol qui sera au préalable filtré par un système de filtration sous vide. - Méthanol contenant 1,7% HCl : on introduit 140 μl d’acide chlorhydrique à l’aide d’une pipette automatique de 1000 μl dans 10 ml de méthanol. - Réactif de thioacidolyse = Solution de toluène-α-thiol à 5% : on introduit 470 μl

de toluène-α-thiol à l’aide d’une pipette automatique de 1000 μl dans 10 ml de la

solution. - Tanins œnologiques (préparations commerciales) - Solution de tanins à 1 g/l : on introduit 10 mg de tanins dans 10 ml de méthanol. Mode opératoire

On introduit 0,5 ml d’une solution de tanins dans un tube à hydrolyse et 0,5 ml du

réactif de thioacidolyse (solution de toluène-α-thiol à 5%). Le mélange est agité et

chauffé à 60°C pendant 10 mn. Le tube est refroidi et on ajoute 0,5 ml d’eau

distillée.

L’échantillon est analysé par HPLC sur une colonne C18, phase inverse. Les éluants

utilisés sont les solvants A et B. Le programme d’élution est le suivant : de 70%

(pendant 5 mn) du solvant B à 10% en 40 mn, puis de 10 à 70% (pendant 5 mn)

en 10 mn (retour aux conditions initiales). Le débit de 1ml/mn est constant durant

toute la programmation et la longueur d’onde choisie est 280 nm.

L’identification des pics et leur quantification respective sont réalisées en accord

avec les données fournies par Vivas et al. (2004)*.

Tanins de pépins, pellicules et quebracho ont des profils différents. Les pépins sont

exclusivement composés de procyanidols, sont caractérisés par un fort degré de

galloylation, une grande quantité d’épicatéchine et un faible degré de

polymérisation moyen : mDP. Les pellicules sont caractérisées par un mélange de

procyanidols et prodelphinidols, avec une prédominance de procyanidols, un faible

degré de galloylation, une quantité importante d’épicatéchine et un mDP variable.

Le quebracho ne donne aucun flavan-3-ols. On peut ainsi déterminer la composition

en tanins proanthocyanidoliques.

* N. VIVAS, M.F. NONIER, N. VIVAS de GAULEJAC, C. ABSALON, A. BERTRAND, M. MIRABEL,

Differentiation of proanthocyanidin tannins from seeds, skins and stems of grapes (Vitis Vinifera) and



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heartwood of Quebracho (Schinopsis balansae) by MALDI-TOF/MS and thioacidolysis/LC/methods »,

Analytica Chimica Acta, 2004, 513, Issue 1, 247-256.

Remarque 2 L'origine botanique du tanin identifiée comme provenant du québracho est déduite par éliminations successives. La caractérisation formelle de la présence de tanin de québracho peut être effectuée par HPLC couplée à la spectrométrie de masse (MALDI-TOF) qui montre que les constituants monomériques de ce tanin sont issus du fisetinidol et du robinetinidol qui ne possèdent pas d'hydroxyle en position 5 sur le noyau A (en d'autres termes les tanins de raisins sont formés à partir de monomères qui possèdent un noyau A trihydroxylé ( phloroglucinol) alors que les tanins de québracho sont formés à partir de monomères dont le noyau A est dihydroxylé (résorcinol).



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Fig 1 chromatogrammes obtenu par HPLC de proanthocyanidols de pellicules, pépins de raisins et Quebracho, après thiolyse.

2 3

4 5 7

8 9

R *

1

2

3 4 5 6

7

8

9

R *

Quebracho

Pellicules de raisin

Pépins de raisins

Pas de réaction avec les procyanidols

Epicatéchine -3-O-gallate

1 - Epigallocatechin 2 - Catechin 3 - Epicatechin

n 4 - 5 - Catechin benzylthioether I 6 - Epigallocatechin benzylthioether 7 - Catechin benzylthioether II 8 - Epicatechin benzylthioether 9 - Epicatechin

n - 3 - O - gallate benzylthioether

R * - Reagent residue



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ANNEXE 2

DIFFÉRENCIATION DES TANINS OENOLOGIQUES COMMERCIAUX PAR

ANALYSE CG/SM DES MONOSACCHARIDES ET DES POLYOLS 1. Introduction Selon le codex oenologique international de l'O.I.V., les tanins oenologiques devraient être extraits de noix de galle (de Quercus, tels que galles d'Alep), de Tara, également appelé Caesalpina Spinosa, du bois de chêne (quercus sp.), de pépins et pellicules de raisin (Vitis vinifera) et du bois de certains arbres tels que le quebracho (Schinopsis balansae) et le châtaignier (Castanea sp.). 2. Domaine d'application La méthode décrite permet de différencier des tanins oenologiques commerciaux de différentes origines (galles végétales, pépins et pellicules de raisin, bois de chêne, de châtaignier et de quebracho).

3. Principe

La concentration de monosaccharides (arabinose, xylose, fructose et glucose) et de polyols (arabitol, quercitol, pinitol, chiroinositol, mucoinositol, scylloinositol et mesoinositol) dans des échantillons de tanin a été déterminée par couplage chromatographie en phase gazeuse/ spectrométrie de masse (CGSM) après leur dérivatisation préalable en triméthylsilyléthers. 4. Réactif et produits Réactifs

Triméthylsilylimidazole (TMSI) pur à 97 % Triméthylchlorosilane (TMCS) Pyridine anhydre, pure à 99,5 %

Eau de grande pureté issue d'un système Milli-Q A10 Étalons

Phényle--glucoside (étalon interne) : 1 mg.mL-1 préparé dans du

méthanol à 70 % Préparation des solutions étalons (de monosaccharides et de polyols)



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Les solutions étalons de glucose, fructose, arabinose, xylose, arabitol, pinitol, myoinositol, scylloinositol, mucoinositol et chiroinositol ont été dissoutes dans un mélange méthanol :eau (30:70) à des concentrations variant entre 0,05 et 0,5 mg/mL de chaque étalon. Étant donné que le quercitol et le bornesitol ne sont pas disponibles dans le commerce, des extraits aqueux ont été préparés à partir de glands de chêne Quercus sp. et de feuilles d'Echium vulgare. Les extraits ont été concentrés par évaporation sous vide à basse température, silylés, puis injectés comme indiqué ci-dessous. La teneur en hydrates de carbone (triple détermination, RSD 5 %) est de 68 % de quercitol, 20 % de glucose et

18 % de fructose pour l'extrait de chêne, et 20 % de fructose, 33 % de glucose, 27 % de bornesitol, 2 % de mesoinositol et 19 % de saccharose pour l'extrait d'Echium. Remarque : Les solutions étalons doivent de préférence être préparées chaque jour et conservées dans un réfrigérateur avant injection. Les échantillons doivent être dérivatisés et analysés dans la même journée.

5. Échantillons Vingt-huit échantillons de différents tanins commerciaux, parmi lesquels des tanins de bois de chêne (O ; n=4), pépin de raisin (S ; n=6), pellicule de raisin (H ; n=2), galles végétales (G ; n=6), châtaignier (ch ; n=3), quebracho (Q ; n=3), gambier (GMB ; n=1) et mélanges de raisin+quebracho (GQ ; n=1), quebracho+châtaignier+galle végétale (QChG ; n=1) et châtaignier+quebracho (ChQ ; n=1), ont été achetés directement sur le marché ou fournis par des fabricants. 6. Appareillage - Hotte de laboratoire - Verrerie de laboratoire : béchers, récipients, etc. - Micropipettes - Évaporateur rotatif - Vortex - Broyeur - Centrifugeuse - Chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (DIF) - Chromatographe en phase gazeuse couplé àun détecteur à spectrométrie de masse opérant en mode impact électronique à 70 eV. Les données MS sont enregistrées de 40 à 700 m/z. - colonne en silice fondue de 25 m X 0,25 mm de diamètre intérieur X 0,25 d'épaisseur de film, enduite de méthylsilicone réticulé.



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7. Mode opératoire Procédure de dérivatisation 50 mg de tanins sont dissous dans 5 mL d'eau désionisée et filtrée à l'aide d'un papier filtre Whatman n° 1 ou équivalent. L'étalon interne est obtenu en mélangeant 1 mL d'échantillon et 1 mL de phényle--

glucoside. Le mélange est concentré par évaporation sous vide et des dérivés triméthylsilylés sont obtenus par ajout de 100 L de pyridine

anhydre, 100 L de TMSI et de 100µL de TMCS, en agitant après chaque

ajout. L'extraction des dérivés triméthylsilylés (TMS) est effectuée avec 100 µL d'hexane et 200 µL d'eau.. Analyse par chromatographie gazeuse 1µL de la couche supérieure d'hexane est injecté sur le chromatographe en phase gazeuse. L'identité de chaque composé est confirmée par comparaison de leurs temps de rétention et spectres de masse, obtenus par CGSM, avec ceux des étalons. Le profil chromatographique type de chaque origine de tanin est illustré en Figure 1.

Analyse par CG-DIF.- conditions chromatographiques Les injections sont faites en mode "splitless" Température de l'injecteur et du détecteur : 300 ºC. La température du four est maintenue à 100 ºC pendant 1 minute, programmée à 200 ºC moyennant une vitesse de chauffage de 30 ºC.min-1 et maintenue pendant 15 minutes, et finalement programmée à 270 ºC à 15 ºC min-1 et maintenue pendant 20 minutes. Le gaz vecteur est l’azote.. Analyse CGSM. conditions chromatographiques - Chromatographe

en phase gazeuse couplé à un détecteur de masse quadripolaire (HP 6890 ou similaire) fonctionnant en mode impact électronique (IE) à 70 eV. Les données SM ont été enregistrées de 40 à 700 m/z.

- Conditions chromatographiques : Les injections sont faites en mode splitless. L'injecteur est à 300 ºC et la température du four est maintenue à 100 ºC pendant 1 minute, puis programmée à 200 ºC moyennant une vitesse de chauffage de 30 ºC min-1 et maintenue pendant 15 minutes, et finalement programmée à 270 ºC à 15 ºC min-1 et



F-COEI-1-TANINS 17

maintenue pendant 20 minutes. Le gaz vecteur est de l'hélium à 1 mL min-1.

8. Calcul (Résultats)

L'analyse quantitative est effectuée à l'aide du facteur de réponse (FR) de chaque étalon par rapport au phényle-β-D-glucoside (étalon interne) sur la plage attendue. La reproductibilité de la méthode est évaluée par analyse d'un échantillon sur cinq jours différents. Néanmoins, cette méthode ne permet pas de distinguer les tanins de quebracho des tanins de pellicule de raisins. Les limites de détection (LD) et de quantification (LQ) (Tableaux 1 et 2) sont calculées pour chaque composé selon la méthode de Foley et Dorsey (1984). Des valeurs moyennes de 0,42 ng et 1,41 ng injectés ont été respectivement obtenues pour la LD et la LQ. Les concentrations des polyols et des monosaccharides dans les tanins analysés sont présentées respectivement dans les tableaux 3 et 4. Cette méthode permet de classifier les tanins selon le schéma proposé en Figure 2. Le quercitol révèle la présence de tanins de bois de chêne, tandis que le pinitol est principalement un indicateur de tanins issus de galles de tara et le bornesitol de tanins du gambier. L'absence d'arabinose et de xylose dans les tanins de galles peut également aider à la caractérisation de ces échantillons. Par conséquent, le bornesitol, le quercitol, le pinitol, l'arabinose et le xylose pourraient être utilisés pour différencier ces produits avec certitude, et pour distinguer en outre ces tanins du reste des produits analysés. Les tanins de galles et de raisin peuvent être facilement différenciés de ceux d'autres origines en raison de l'absence d'arabinose et de xylose dans leur composition en monosaccharide. En ce qui concerne les échantillons de tanin de raisin, du fructose a pu être observé dans les tanins de pépins de raisin, mais pas les tanins de pellicule de raisin. La présence de mucoinositol et de chiroinositol pourrait être utile pour distinguer les tanins de châtaignier de ceux du quebracho ou de pellicule de raisin.

9. Bibliographie Carlavilla, C., Villamiel, M., Martínez-Castro, I., Moreno-Arribas, M.V. Occurrence and significance of quercitol and other inositols in wines during oak wood aging. Am. J. Enol. Vitic. 2006, 57, 468-473



F-COEI-1-TANINS 18

Foley, J.P.; Dorsey, J.G. Clarification of the limit of detection in chromatography. Chromatographia, 1984, 18, 503-511 Sanz L., Martínez-Castro I., Moreno–Arribas, M.V. Identification of the origin of commercial enological tannins by the analysis of monosaccharides and polyalcohols. Food Chem., 2008, 111, 778-783



F-COEI-1-TANINS 19

Tableau 1. Répétabilité de la méthode de chromatographie gazeuse pour la détermination des hydrates de carbone dans les tanins (échantillon Q3).

Valeur moyenne Écart type

Xylose 0,17 0,01

Arabinose 0,43 0,03

Arabitol 0,04 0,00

Quercitol 0,00 0,00

Fructose 0,32 0,04

Glucose 0,60 0,02

Mucoinositol 0,02 0,00

Chiroinositol 0,00 0,00

Scylloinositol 0,00 0,00

Mesoinositol 0,05 0,00

Table 2. Tableau 2. Limites de détection (LD) et de quantification (LQ) de la méthode de détermination des hydrates de carbone et polyols dans les échantillons de tanins œnologiques par chromatographie gazeuse (exprimées en ng injectés)

LD (ng) LQ (ng)

Xylose 0,50 1,66

Arabinose 0,66 2,21

Arabitol 0,21 0,70

Fructose 1,11 3,70

Glucose 0,51 1,70

Mucoinositol 0,16 0,52

Chiroinositol 0,22 0,74

Scylloinositol 0,20 0,68

Mesoinositol 0,24 0,80



F-COEI-1-TANINS

20

Tableau 3. Concentration des polyols (mg/100g), tr=traces dans les tanins commerciaux

Arabitol Quercitol Pinitol Bornesitol Mucoinositol Chiroinositol Scylloinositol Mesoinositol

Bois de chêne O1 0.06 6.92 - - 0.10 0.10 0.52 0.49 O2 0.06 4.49 - - 0.11 0.11 0.57 0.55 O3 0.05 1.57 - - 0.04 0.02 0.13 0.12 O4 0.09 3.14 - - 0.14 0.17 0.17 0.30 Galles végétales G1 - - 0.73 - - - - - G2 - - 0.26 - - - - tr* G3 - 0.03 0.07 - - - 0.03 tr G4 - 0.06 0.06 - - - 0.04 - G5 - - 1.35 - - - - 0.02 G6 - - - - - - - - Pépin de raisin S1 - - - - - - tr 0.16 S2 - - - - - - tr 0.01 S3 - - - - - - 0.38 2.34 S4 - - - - - - tr 0.01 S5 - - - - - - - 0.01 S6 0.64 - - - - - tr 0.25 Pellicule de raisin H1 - - - - - - - - H2 - - - - - - - tr Châtaignier Ch1 0.08 - - - 0.14 0.55 - 0.62 Ch2 0.04 - 0.49 - 0.03 0.33 - 0.05 Ch3 0.07 - - - 0.19 0.52 - 0.49 Quebracho Q1 tr - - - - - - 0.01 Q2 0.02 0.05 0.09 - - - - tr Q3 0.03 - - - 0.02 - - 0.05 Gambier GMB 0.01 - tr 0.02 - - - 0.03 Raisin+quebracho GQ 0.10 - 0.19 - 0.02 0.06 - 0.07 Quebracho+Châtaignier+galle QChG 0.03 - 0.19 - 0.03 0.12 - 0.12 Châtaignier+quebracho ChQ 0.05 - - - 0.13 0.56 - 0.53



F-COEI-1-TANINS

21

mg/100g

Xylose Arabinose Fructose Glucose

Bois de chêne O1 0.29 1.18 - 0.22

O2 0.57 2.53 - 0.07

O3 0.37 0.85 0.12 0.58

O4 0.41 1.84 1.82 2.69

Galles végétales G1 - - 0.26 0.42

G2 - - 0.07 0.17

G3 - - 0.05 0.05

G4 - - 0.11 0.16

G5 - - 0.50 0.63

G6 - - - -

Pépin de raisin S1 - - 10.01 9.59

S2 - - 0.64 0.50

S3 - - 45.23 32.46

S4 - - 0.61 0.46

S5 0.13 - - 0.03

S6 - - 1.22 tr

Pellicule de raisin H1 - - - 0.07

H2 0.31 0.48 0.30 0.67

Châtaignier Ch1 0.50 1.46 1.15 0.78

Ch2 0.41 1.04 0.95 0.91

Ch3 0.65 1.55 0.28 0.69

Quebracho Q1 0.30 0.44 0.22 0.20

Q2 0.07 0.10 0.05 0.10

Q3 0.16 0.42 0.32 0.59

Gambier GMB 0.02 - 0.42 0.12

Raisin+quebracho GQ 0.07 0.11 0.25 0.28

Quebracho+ Châtaignier +galle

QChG 0.04 0.07 0.17 0.30

Châtaignier+quebracho ChQ 0.29 1.29 1.34 1.46

Tr=traces



F-COEI-1-TANINS

22

10 20 300

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000 4 1314

12

10

1

7

10 20 300

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000 4

9

1

70

min

A

4

1

2

7

Abundance

4

9

1

733 7

10 20 300

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000 4 1314

12

10

1

7

10 20 300

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000 4

9

1

70

min

A

4

1

2

7

Abundance

4

9

1

733 7

Abondance

6

77

8

13

5

B

6

77

8

13

5

10 20 300

10 20 300

6

77

8

13

5

10 20 30

Abundance

2000000

4000000

6000000

8000000

min

6

77

8

14

5

6

77

8

13

5

B

6

77

8

13

5

10 20 300

10 20 300

6

77

8

13

5

10 20 30

Abundance

2000000

4000000

6000000

8000000

min

6

77

8

14

5

Abondance

Figure 1. Profils chromatographiques en phase gazeuse des polyols et des hydrates de carbone présents dans des tanins commerciaux de A) bois de chêne, B) galle végétale, C) bois de châtaignier, D) pépin, de raisin, E) pellicule de raisin, F) bois de quebracho, G) gambier. 1-arabinose, 2-arabitol, 3-xylose, 4-quercitol, 5-fructose, 6-pinitol, 7-glucose, 8-acide gallique, 9 Mucoinositol, 10 Chiroinositol, 11-Bornesitol, 12- Scylloinositol, 13- Mesoinositol, 14-Phényle--D-glucoside (étalon interne).



F-COEI-1-TANINS

23

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

Chestnut

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

C

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

Chestnut

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abundance

min

C1

2

3 3

5

7

7

8

10 13

14

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

Chestnut

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

C

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min

Chestnut

1

2

3 3

5

7

7

8

10 12

13

9

10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abunda

nce

min10 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

Abundance

min

C1

2

3 3

5

7

7

8

10 13

14

9

Abondance

Seed grape

7

7

D

7

7

10 20 3010 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000 Seed grape

7

7

13

10 20 3010 20 30

Abundance

min

D

5

7

7

14Seed grape

7

7

D

7

7

10 20 3010 20 30

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000 Seed grape

7

7

13

10 20 3010 20 30

Abundance

min

D

5

7

7

14

Abondance

Figure 1. suite



F-COEI-1-TANINS 24

Figure 1. suite

min

F

10 20 30 10 20 30 10 20 30

1000000

3000000

5000000

7000000

9000000

1100000

Abundanc 14

17 7

5

1

3

3

1000000

3000000

5000000

7000000

9000000

1100000

min

AbundancF

10 20 30

14

17 7

5

1

3

3

Abondance

10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 mi10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 mi10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 mi10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

E

0 0 0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Abundanc

0 0 0

Abundanc E

7 7

14

0 0 0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Abundanc

0 0 0

Abundanc

7 7

14

mi

Abondance



F-COEI-1-TANINS 25

0

50000

1000000

1500000

2000000

Abundance G

10 2 30 10 2 30 10 2 30 10 2 30 mi

5

7 11 3

G

10 2 30 10 2 30 10 2 30 10 2 30 mi10 2 30 10 2 30 10 2 30

5 7

7 11

0

50000

1000000

1500000

2000000

Aoondance G

10 2 30 10 2 30 10 2 30 10 2 30 mi10 2 30 10 2 30 10 2 30 10 2 30 mi

1

13

5

7 11 3

G

10 2 30 10 2 30 10 2 30 10 2 30 mi10 2 30 10 2 30 10 2 30

5 7

7 11

Figure 1. suite



F-COEI-1-TANINS 26

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TANINS OENOLOGIQUES N° SIN : 181 (Oeno 12/2002 … · correspond à la différence de coloration entre le jaune mesuré à 420 nm et le rouge mesuré à 520 nm d’une solution de