Annales Pharmaceutiques Françaises (2012) 70, 271—280

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

ARTICLE ORIGINAL

Test de dépyrogénation des conteneurs en inox et enverre pour la préparation des mélanges pournutrition parentérale

Depyrogenation test regarding inox and glass containers in the preparation ofparenteral nutrition mixtures

A. Lajoiniea, P. Vasselona, M.-L. Tall a, D. Salmona,V. Bréantb, E. Dioufa, C. Pivota, F. Pirota,c,∗,1

a Service pharmaceutique, fabrication et contrôles des médicaments, plateforme FRIPHARM,pavillon X, groupement hospitalier Édouard-Herriot, place d’Arsonval, 69437 Lyon cedex 03,Franceb Service pharmaceutique, secteur médicaments, bâtiment cardiologique, groupementhospitalier Est, 59, boulevard Pinel, 69677 Bron, Francec Laboratoire de pharmacie galénique industrielle, plateforme FRIPHARM, EA 4169 « fonctionsphysiologiques et pathologiques de la barrière cutanée », faculté de pharmacie, universitéClaude-Bernard Lyon-I, 8, avenue Rockefeller, 69373 Lyon cedex 08, France

Recu le 23 mai 2012 ; accepté le 21 aout 2012Disponible sur Internet le 7 septembre 2012

MOTS CLÉSDépyrogénation ;Endotoxinesd’Escherichia coli ;Conteneurs ;Verre ;Inox ;

RésuméIntroduction. — La préparation des mélanges pour nutrition parentérale (MNP) en systèmeouvert nécessite l’emploi de conteneurs intermédiaires stériles et apyrogènes. La stérilisationdes conteneurs par la chaleur humide dans des autoclaves de grande capacité est la méthodede choix. Cependant, la stérilisation par la chaleur humide ne constitue pas une méthode dedépyrogénation. Dans notre étude, nous rapportons la validation d’une méthode de stérilisa-tion et de dépyrogénation des conteneurs par la chaleur sèche au moyen d’une étuve à chaleur

Chaleur sèche ; tournante.a stérilisation et la dépyrogénation du matériel par la chaleur sèche

Matériels et méthodes. — L Nutrition parentérale

ont été vérifiées par la réduction d’au moins trois logarithmes du taux initial d’endotoxines.Les conteneurs étaient initialement contaminés artificiellement par une solution d’endotoxinesd’Escherichia coli pendant 16 heures. Les conteneurs contaminés étaient alors placés dans une

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : fri.pharm@chu-lyon.fr (F. Pirot).

1 www.fripharm.com.

0003-4509/$ — see front matter © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.http://dx.doi.org/10.1016/j.pharma.2012.08.002

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étuve à chaleur tournante (250 ◦C) pendant une heure. À l’issue du traitement par la chaleursèche, le taux résiduel d’endotoxines dans les conteneurs était déterminé par une méthodecinétique chromogénique.Résultats. — Après traitement par la chaleur sèche, la réduction logarithmique moyenne dutaux d’endotoxines initial était respectivement, pour les conteneurs en verre et en inox, de4,78 ± 0,07 et de 4,87 ± 0,03.Discussion et conclusion. — Cette étude de validation de procédé confirme l’efficacité d’un trai-tement par la chaleur sèche tournante pour la stérilisation et la dépyrogénation de conteneursen verre et en inox. Cette technique de stérilisation et de dépyrogénation permet de répondreaux exigences de qualité microbiologique nécessaire à la préparation des MNP.© 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDSDepyrogenation;Endotoxin;Containers;Glass;Inox;Dry heat;Parenteral nutrition

SummaryIntroduction. — The preparation of parenteral nutrition mixture (PNM) in an open chamberrequires the use of intermediate containers sterile and non-pyrogenic. A sterilization of contai-ners by moist heat in large autoclaves is the suitable method. However, sterilization by moistheat is not a depyrogenation method. In our study, we report the validation of a sterilizationand depyrogenation method for containers by dry heat using a convection oven.Materials and methods. — Sterilization and depyrogenation of material by dry heat have beenaudited by the reduction of at least three logarithms of original endotoxin rate. The containerswere initially artificially contaminated with a suspension of endotoxin for 16 hours. Contamina-ted containers were placed in an oven with revolving heat at 250 ◦C for 1 hour. After treatmentwith dry heat, the residual endotoxin levels in the containers were determined by a kineticchromogenic method.Results. — After treatment with dry heat, the average log reductions of endotoxin levels wererespectively, for glass and steel containers, 4.78 ± 0.07 and 4.87 ± 0.03.Discussion and conclusion. — The present validation study confirms the effectiveness of treat-ment with dry heat for sterilization and depyrogenation of glass and steel containers. Thismethod of sterilization and depyrogenation meets the microbiological quality requirements forthe preparation of MNP.© 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

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ntroduction

es préparations pour nutrition parentérale réalisées danses pharmacies à usage intérieur doivent être réalisées selones principes des bonnes pratiques de préparations (BPP) [1].es mélanges pour nutrition parentérale (MNP) sont :

des préparations magistrales avec une compositionvariable adaptée à l’état physiopathologique du patientou ;des préparations hospitalières de composition prédéter-minée.

Les MNP sont conditionnés dans des poches ou dans desacons stériles en verre, par transfert aseptique à l’aide’automate ou par filtration stérilisante [2]. Les filtres sté-ilisants de porosité égale à 0,22 �m, ne retenant pas laotalité des endotoxines de faible masse moléculaire [3],a filtration stérilisante de MNP nécessite l’utilisation deontenants intermédiaires stériles et apyrogènes. Bien quea stérilisation par la chaleur humide (121 ◦C, 20 minutes)oit une méthode largement utilisée pour la stérilisation deatériel, celle-ci ne constitue pas une méthode de dépyro-

énation efficace.La dépyrogénation correspond à la destruction des

ndotoxines bactériennes de structure lipopolysacchari-ique issues des bactéries à Gram négatif. La chaleur

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èche est la méthode de choix pour la dépyrogénationu matériel thermorésistant comme la verrerie ou leétal [1]. Elle permet une réduction de la teneur initiale’endotoxines de 3 Log10 pour une température supérieure

200 ◦C [2,4]. Le mécanisme de destruction des endo-oxines est l’incinération. La chaleur sèche comme méthodee stérilisation est cependant de moins en moins utili-ée pour les matériaux, en raison de son coût énergétiquerès élevé, des problèmes de sécurité liés à l’utilisatione températures très élevées et au risque de carbonisa-ion de certains matériaux. Elle reste toutefois une méthodentéressante pour la stérilisation et la dépyrogénation duatériel de préparation des produits stériles lorsque ceux-

i ne peuvent être directement stérilisés dans leur récipientnal.

La stérilisation et la dépyrogénation de conteneurse grands volumes en verre ou en inox (de cinq litres

30 litres) requièrent l’acquisition de matériels adaptés une production quotidienne variable. La pharmacopéeuropéenne précise que seule une réduction d’au moins

Log10 de la concentration initiale d’endotoxines (i.e., des-ruction ≥ 99,9 % de la charge initiale) est reconnue commeualifiante pour la dépyrogénation [2]. Dans cette étude,ous détaillons un protocole de validation de stérilisation ete dépyrogénation par la chaleur sèche de conteneurs en

erre et en inox destinés à la préparation de MNP.

Dépyrogénation de conteneurs pour nutrition parentérale 273

Figure 1. Conteneurs en Pyrex® de cinq litres utilisés dans notreétude de dépyrogénation : « témoins négatifs » et « tests » (hauteurH1 = 36 cm ; diamètre D1 = 15 cm).Five-litre Pyrex® containers used in our depyrogenation study:

Figure 2. a : conteneurs en inox : conteneurs « tests » et« témoins » fermés par leur couvercle à vis. Les conteneurs en inoxont subi un lavage manuel avant la dépyrogénation, qui consistaiten deux rincages initiaux à l’eau tiède puis un lavage au RBS 35 MD®

et enfin un rincage à l’eau chaude (80 ◦C) et trois derniers rincagesà l’eau déminéralisée (hauteur avec le couvercle H2 = 62 cm ; dia-mètre D2 = 32 cm) ; b : détail du couvercle du conteneur « témoin ».Les couvercles à vis des conteneurs en inox sont composés de deuxentrées, la première permettant la mise sous azote et la secondela vidange de la cuve, et d’une soupape de sécurité. Toutes lesouvertures ont été obturées au moyen de papier aluminium avantla dépyrogénation (hauteur du couvercle H3 = 8 cm).a: inox containers: « tests » and « negative controls » sealed by ascrew-on closure. Inox containers have undergone a hand washingbefore depyrogenation, which consisted of two first soapy waterrinses follow-up of two RBS 35 MD® washing then a hot waterrinse (80 ◦C) and three last de-mineralized water rinses (inclu-ding cover height H2 = 62 cm; diameter D2 = 32 cm); b: « negativecontrol » containers cover details. Inox container screw-on closureshall comprise two entrances, the first to stake under nitrogen andthe second to tank draining, and a safety valve. All openness havebeen plugged before depyrogenation using aluminium foil (cover

« negative controls » and « tests » (height H1 = 36 cm; diameterD1 = 15 cm).

Matériels et méthodes

Conteneurs en verre et en inox

Le test de validation de la stérilisation et de la dépyrogé-nation par la chaleur sèche a été réalisé sur deux types deconteneurs en verre et en inox utilisés pour la préparationdes MNP. Le test a été répété trois fois sur trois conteneursidentiques, pour chacun des types de conteneurs testés. Lesconteneurs en verre type Pyrex® (verre borosilicaté résistantà la chaleur) (Fig. 1) sont utilisés pour réaliser le mélangeintermédiaire de solutés stériles. Ce mélange est ensuitetransféré dans des conteneurs en inox 316L (Fig. 2a) puisfiltrés (0,22 �m) sous pression d’azote (2,5 bars). Ils sont fer-més hermétiquement au moyen d’un couvercle à vis (Fig. 2b)muni d’un joint en silicone, d’une entrée pour la mise souspression d’azote et d’une sortie pour le transfert du MNP. Lecouvercle porte également une soupape de sécurité taréeentre 5 et 6 bars.

L’état de surface interne des conteneurs en inox a étédéterminé au moyen d’une caméra (Memscap®, Crolles,France), d’un logiciel de traitement d’image et d’étalonsde rugosité [5]. L’état de surface interne des conteneurs enverre n’a pu être déterminé par cette technique, comptetenu de la transparence du matériau.

Lavage et désinfection des conteneurs

Les conteneurs en verre et en inox ont été lavés etdésinfectés thermo-chimiquement en zone d’atmosphèrecontrôlée (ZAC) avant dépyrogénation. Les conteneurs enverre étaient lavés par un laveur-désinfecteur selon uncycle spécifique de 53 minutes comprenant : un lavage pen-dant sept minutes à 53 ◦C avec un détergent-désinfectant

à base d’hydroxyde de potassium et de tensioactifs (Neo-disher Septoclean®, Roth Sochiel E.U.R.L, Lauterbourg,France), une neutralisation des résidus alcalins pendantsix minutes à 60 ◦C (Neodisher Z®, Roth Sochiel E.U.R.L,

height H3 = 8 cm).

2 A. Lajoinie et al.

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Figure 3. a : extérieur de l’étuve Memmert® ULE 800. La capa-cité du four utilisé pour la dépyrogénation des conteneurs était de749 litres. Sa température théorique maximale était de 300 ◦C ; b :intérieur de l’étuve Memmert® ULE 800. L’intérieur du four com-prenait deux niveaux. Les conteneurs ont été dépyrogénés dans lesconditions les plus critiques, c’est-à-dire avec une charge maxi-male dans le four, soit deux conteneurs en inox de 30 litres ou troisconteneurs en verre de cinq litres par niveau.a: Memmert® ULE 800 oven outside. The capacity of the oven usedfor container depyrogenation was 749 litres. Its theoretical maxi-mum temperature was 300 ◦C; b: Memmert® ULE 800 oven interior.Oven interior was made up of two floors. Containers were depyro-genated in ‘‘worst case’’ conditions, i.e. oven maximum workingload, that corresponding to two 30-liter inox containers or three5-liters glass containers.

74

auterbourg, France), deux rincages à l’eau déminéraliséee trois minutes à 62 ◦C, un rincage final de 16 minutes à3 ◦C—110 ◦C, suivi par un refroidissement de trois minutes

91 ◦C. Les conteneurs en verre ont été ensuite herméti-uement obturés avec deux feuilles d’aluminium (Fig. 1).

Les conteneurs en inox non dimensionnés pour le laveur-ésinfecteur ont été lavés manuellement. Les partiesntérieures étaient lavées avec un détergent RSB 35 MD®

Chemical products R.Borghgraef S.A, Brussel, Belgique)ilué dans 600 mL d’eau à 55 ◦C pendant 15 minutes. Laolution détergente contenue à l’intérieur des conteurstait agitée manuellement puis éliminée par retournementu conteneur. Le conteneur était rincé deux fois avec de’eau déminéralisée à 55 ◦C, puis deux fois par de l’eauéminéralisée. Les couvercles des conteneurs étaient lavéséparément avec 600 mL de détergent RSB 35 MD® dansne cuve de nettoyage de 60 litres d’eau à 55 ◦C pen-ant 15 minutes. Les rincages étaient identiques à ceuxes conteneurs. Les couvercles étaient remontés sur lesonteneurs puis obturés au niveau des entrées et sortiesu couvercle au moyen de feuilles d’aluminium (Fig. 2b) et’adhésif thermosensible.

ontamination artificielle des conteneurs pares endotoxines

es endotoxines des bactéries à Gram négatif sont les lipo-olysaccharides pyrogènes les plus fréquemment retrouvésans tous les milieux. Elles sont également les plus résis-antes des pyrogènes connus actuellement, ce qui en fontes pyrogènes de choix pour les tests de validation dea dépyrogénation. L’endotoxine la plus couramment uti-isée pour les tests de validation est issue de souches’Escherichia coli. Les endotoxines utilisées pour notretude étaient extraites de souches d’E. coli O55 : B5 (Lonza®

SE, Lonza Walkersville Inc., Maryland, États-Unis).Afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement à la cha-

eur sèche pour la stérilisation et la dépyrogénation desonteneurs en verre et en inox, une solution contami-ante d’endotoxines a été obtenue par dissolution d’unyophilisat de 9,5 MUI d’endotoxines dans 19 mL d’eau apy-ogène Lonza® (solution A, 0,5 MUI/mL). La solution A étaitonservée au maximum pendant un mois à une températureomprise entre 2 ◦C et 8 ◦C dans le flacon d’origine.

La quantité minimale d’endotoxines à inoculer pour unest de dépyrogénation est de 1000 UI par conteneur [4].près agitation de la solution A pendant 15 minutes, un ali-uote (500 �L ; 0,25 MUI) prélevé à l’aide d’une seringuetérile et apyrogène (1 mL, Pentaferte, Ferrara, Italie) a étéirectement inoculé dans le fond des conteneurs en verret en inox. Cette zone de contamination correspondait auoint froid (i.e. le point critique) (Fig. 2a) [4]. L’inoculationirecte a été choisie car elle prend en compte l’influencees phénomènes d’adsorption des endotoxines à la surfaceu matériel.

Après inoculation, l’aliquote de la solution A déposéetait séché à température ambiante dans les conteneurs

bturés puis conservés à température ambiante pendant6 heures, avant d’être stérilisés et dépyrogénés. Afin’éviter toute contamination de l’intérieur des conteneurs,es conteneurs en verre étaient recouverts d’un nouveau

Dépyrogénation de conteneurs pour nutrition parentérale 275

Figure 4. Mesure de la rugosité de la surface des conteneurs en inox : micro-reliefs (à gauche) et vue en trois dimensions (à droite). Larugosité de la surface interne des conteneurs en inox a été mesurée au moyen de la caméra Memscap©, capable de mesurer six paramètresde rugosité dont le facteur Ra (�m) qui représente l’écart moyen arithmétique des profondeurs des motifs de surface. La rugosité influenceles phénomènes d’adsorption et d’agrégation des endotoxines à la surface des matériaux. La courbe de corrélation entre le Ra (GL) et leRa (�m) présentée dans l’article de Atrux-Tallau et al. permet la détermination de la rugosité de la surface interne du matériau analysé.La rugosité maximale acceptable Rmax pour le domaine pharmaceutique est de 0,8 �m. Une rugosité supérieure n’est tolérée que si leprocessus de nettoyage est validé.Roughness measurement of inox container surface: micro-features (left photo) and three-dimensional view (right photo). Internal surfaceroughness of inox containers has been measured using Memscap© camera. This camera is able to record six roughness parameters, comprisingRa factor (�m), that corresponding to arithmetical mean deviation of depth surface features. Roughness can influence endotoxin adsorptionand aggregation phenomenon onto material surfaces. Correlation graph which correlates Ra expressed in GL with Ra expressed in �m,

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featured in Atrux-Tallau et al. article, permits to assess analysed mdepth of roughness Rmax is 0.8 �m. A greater roughness would be

papier d’aluminium et les couvercles des conteneurs en inoxétaient remontés sur les conteneurs pendant toute la duréedu séchage.

Stérilisation et dépyrogénation desconteneurs à la chaleur sèche

L’étuve utilisée pour le chauffage à la chaleur sèche étaitune étuve Memmert® ULE 800 (Fisher Bioblock Scientific,Parc d’Innovation, Illkirch cedex, France) (Fig. 3a) (capacitéde 749 litres, température maximale théorique de 300 ◦C).Les charges étaient réparties sur deux niveaux (Fig. 3b), afind’assurer une bonne circulation de l’air. La charge maximalede l’étuve était de deux conteneurs en inox de 30 litres et detrois conteneurs en verre de cinq litres par niveau. L’essai dedépyrogénation a été réalisé dans les conditions de chargemaximale de l’étuve. Les joints silicones des conteneurs eninox ne pouvant supporter une température supérieure à180 ◦C étaient stérilisés, à part, à la chaleur humide (121 ◦C,20 minutes).

Une étude préalable de la température des paroisintérieures des conteneurs a été réalisée à l’aide d’un ther-momètre infrarouge d’une précision de ± 1 ◦C (TempTestr®

IR FOOD, Oakton, États-Unis). Cette étude a montré quela température à l’intérieur des conteneurs après un cycled’une heure à la température de consigne de 250 ◦C étaiten réalité de 207 ± 6 ◦C et 243 ± 12 ◦C en moyenne pourles conteneurs en inox et en verre respectivement. Enconséquence, ces mesures montrent que la températureminimale à l’intérieur des conteneurs était de 200 ◦C. Deplus, les essais de température réalisés par le service ontpermis de déterminer que le temps de préchauffage pour

atteindre une température de 250 ◦C était d’environ deuxheures.

Il n’existe pas de directive officielle indiquant desdurées de dépyrogénation pour une température donnée.

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ial internal surface roughness. In pharmaceutical field, maximumated only if wash process is valid.

a pharmacopée européenne précise qu’une températureupérieure à 220 ◦C est souvent utilisée pour la stérilisationt la dépyrogénation de la verrerie [2]. Dans une précédentetude [6], il a été montré qu’une durée d’exposition d’uneeure à 200 ◦C suffisait pour réduire de 3 Log10 le taux initial’endotoxines, conformément aux recommandations de laharmacopée européenne.

écupération des endotoxines

l’issue du traitement par la chaleur sèche, les conte-eurs étaient refroidis pendant deux heures à températurembiante. La récupération des endotoxines résiduelles

été réalisée en introduisant 0,5 L d’eau distillée sté-ile et apyrogène (eau pour irrigation Versol®, Aguettant,yon, France) dans chacun des conteneurs. Les conte-eurs étaient agités manuellement pendant une minute,uis laissés au repos pendant une heure et enfin agitése nouveau pendant une minute. Un aliquote de 1 mL’eau était prélevé dans le fond des conteneurs au moyen’une seringue stérile et apyrogène et transféré immédia-ement dans des flacons en verre borosilicaté dépyrogénéonza® (10 mL, Lonza Walkersville Inc., Maryland, États-nis).

Le dosage des endotoxines était réalisé soit immédia-ement (cf. section « dosage des endotoxines ») soit aprèsonservation des aliquotes entre 2 ◦C et 8 ◦C pendant uneériode maximale de sept jours.

onteneurs « témoins »

es conteneurs « témoins », en verre et en inox, ont été

avés, désinfectés puis contaminés artificiellement par laolution d’endotoxines A. Ces témoins positifs ont subi leême trajet simultanément à leurs conteneurs « tests » res-ectifs, à l’exception du passage à l’étuve.

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76

osage des endotoxines

a concentration en endotoxines dans les aliquotes a étééterminée par une méthode cinétique chromogénique.rièvement dans cette technique, un lysat d’amœbocytese limules (LAL) contenant une proenzyme, activée enrésence d’endotoxines, agit sur un substrat chromogèneui est alors clivé en peptide et paranitro-aniline. Cetteéthode nécessite l’incubation des échantillons à 37 ◦Cendant dix minutes. Un lecteur de plaque spectrophotomé-rique (ELx808LBS Plate Reader Lonza®, Walkersville Inc.,aryland, États-Unis) permet de déterminer l’absorptiones échantillons à une longueur d’onde de 405 nm. Laensibilité de cette méthode était de 0,005 UI/mL. Uneamme d’étalonnage du dosage spectrophotométrique a étééalisée avec cinq points de concentration compris entre,005 UI/ml et 50 UI/mL.

D’après le travail de recherche de Ronchi [3], la méthodeinétique colorimétrique est la plus sensible et la pluspécifique des méthodes actuellement connues. La sensi-ilité de cette méthode est de 0,005 UI/mL. La gamme’étalonnage est réalisée avec cinq points de concentra-ion se situant entre 0,005 et 50 UI/mL, en accord aveca pharmacopée européenne [7] qui exige un minimum de

points.Chaque échantillon est analysé en quadruplet dont

eux surchargés par 0,5 UI d’endotoxines afin de détec-er l’absence d’interférence par la détermination du tauxe recouvrement des endotoxines [7]. Après une incuba-ion de dix minutes à 37 ◦C, le réactif LAL est ajouté auxchantillons. La mesure photométrique des échantillons estnsuite automatiquement réalisée à 405 nm. La concentra-ion en endotoxine de chaque échantillon est déterminée enonction du temps de réaction par comparaison au temps deéaction de la solution standard de concentration connue enndotoxines.

Le dosage des échantillons « test » sans dilution permet-ait d’obtenir un taux de recouvrement des endotoxinesatisfaisant. Les échantillons « témoins », trop concen-rés pour être compris dans le domaine de linéarité dea méthode de dosage, ont été dilués au moyen d’eaupyrogène Lonza® au 1/200e ou au 1/400e. D’après la phar-acopée européenne [7], la dilution maximale significative

DMS) correspond à la dilution maximale tolérée à laquellea concentration en endotoxines peut être dosée de manièreable. La DMS se calcule comme suit [7] :

MS = concentration thé orique de la solution à doser�

(1)

ù � correspond à la sensibilité déclarée du test, soit,005 UI/mL.

L’inoculum déposé au fond des charges à tester étaite 500 �L de solution A (0,25 MUI). Après immersion dans00 mL d’eau, la concentration théorique de l’échantillonrélevé était de 500 UI/mL. La DMS pour les échantillons

témoins » était égale à 100 000. Les dilutions choisies poures échantillons « témoins » étaient validées d’après la phar-acopée européenne.

Les résultats du dosage des endotoxines par la méthode

inétique chromogénique sont exprimés en unités interna-ionales par ml (UI/mL), unité de référence retenue par laharmacopée européenne.

cdte

A. Lajoinie et al.

tatistiques

ompte tenu du nombre d’essais réalisés (n = 3 conteneursn inox et n = 3 conteneurs en verre), il n’a pas étéait d’hypothèse ni sur la distribution normale, ni sur’égalité des variances des concentrations d’endotoxinesans les conteneurs « témoins » et « tests ». Les comparai-ons des concentrations d’endotoxines entre les conteneurstémoins » et « tests » en verre et en inox ont été réali-ées au moyen d’un test non paramétrique de Wilcoxon deomparaison des médianes, sur des échantillons indépen-ants. Le seuil de significativité était de 5 %.

ésultats

ans cette étude, l’efficacité d’un procédé de dépyrogéna-ion de conteneurs en inox et en verre a été étudiée après unrélavage et une contamination artificielle des conteneursar des endotoxines.

La concentration des endotoxines résiduelles aprèstérilisation-dépyrogénation par la chaleur sèche dans lesonteneurs « tests » était inférieure à la sensibilité de laéthode de dosage, soit 0,005 UI/mL. La réduction de

a concentration des endotoxines entre les « tests » etes « témoins » était supérieure à 3 Log10 pour chacun desrois tests de dépyrogénation sur les conteneurs en verreTableau 1) ainsi que sur conteneurs en inox (Tableau 2).

Les valeurs de rugosité des surfaces internes (Ra) desonteneurs ont été déterminées à partir des niveaux de grisnregistrés lors d’une illumination standardisée des maté-iaux et comparés à des standards de rugosité connus (Fig. 4)8]. La valeur moyenne calculée du Ra de l’inox de qualité16L des conteneurs était de 1,35 �m.

iscussion

a préparation des MNP en système ouvert avec filtrationtérilisante implique que chacune des opérations clefs dea fabrication doit être menée individuellement de faconseptique [1]. La préparation des MNP dans le conteneurntermédiaire en verre est réalisée à partir de solutés sté-iles transférés au moyen de seringues stériles à usagenique et de verrerie stérile. Cette préparation est réali-ée en ZAC adaptée pour la préparation stérile en systèmeuvert. Nous avons donc considéré que les deux élémentses plus susceptibles d’induire une contamination du MNPtaient les conteneurs en verre au moment de la prépara-ion et les conteneurs en inox pour la mise sous pression’azote. La validation de la stérilisation et de la dépyrogé-ation de ces deux conteneurs contribue à garantir l’asepsiee l’ensemble des étapes de fabrication des MNP.

La mise au point d’un protocole de stérilisation-épyrogénation par la chaleur sèche nécessite la sélection’une température et d’une durée de cycle permettanta réduction d’au moins 3 Log10 de la concentration initiale’endotoxines. D’après les travaux de Tsujii et al. [6] sur la

inétique de destruction des endotoxines d’E. coli, le tauxe destruction des endotoxines en fonction de la tempéra-ure est caractérisé par une cinétique du second ordre. Desssais répétés à différentes températures ont montré qu’une

Dépyrogénation de conteneurs pour nutrition parentérale 277

Tableau 1 Étude de la réduction logarithmique du taux d’endotoxines en l’absence (témoins négatifs) et à l’issue (tests)d’une dépyrogénation de conteneurs en verre initialement contaminés par une solution d’endotoxines. Les donnéesrapportées correspondent au dosage des endotoxines dans l’aliquote prélevé directement au fond des conteneurs enverre au moyen d’une seringue en polypropylène de 1 mL.Logarithmic endotoxin rate reduction analysis of glass containers initially contaminated using an endotoxin solution, without (negativecontrols) and after (tests) depyrogenation. The following data correspond to endotoxin measurement in the aliquot collected directlyfrom containers’ bottom, using a 1 mL propylene syringe.

Essais CTÉMOIN (UI/mL) CTEST (UI/mL) Log (CTÉMOIN/CTEST)

# 1 285,0 < 0,005 4,75# 2 270,3 < 0,005 4,73# 3 366,2 < 0,005 4,86Moyenne ± écart-type 307,2 ± 51,6 — 4,78 ± 0,07

Tableau 2 Étude de la réduction logarithmique du taux d’endotoxines en l’absence (témoins négatifs) et à l’issue(tests) d’une dépyrogénation des conteneurs en inox initialement contaminés par une solution d’endotoxines. Les donnéesrapportées correspondent au dosage des endotoxines dans l’aliquote prélevé directement au fond des conteneurs en inoxau moyen d’une seringue en polypropylène de 1 mL.Logarithmic endotoxin rate reduction analysis of inox containers, initially contaminated using an endotoxin solution, without (negativecontrols) and after (tests) depyrogenation. The following data correspond to endotoxin measurement in the aliquot collected directlyfrom containers’ bottom, using a 1 mL propylene syringe.

Essais CTÉMOIN (UI/mL) CTEST (UI/mL) Log (CTÉMOIN/CTEST)

# 1 371,6 < 0,005 4,87# 2 410,0 < 0,005 4,91# 3 353,8 < 0,005 4,85

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udccaeLc(éfimecimpaLpcble

Moyenne ± écart-type 378,5 ± 28,7

température inférieure à 170 ◦C est insuffisante pour obtenirle taux de réduction d’endotoxines de 3 Log10 recommandépar la pharmacopée européenne [9]. Le temps nécessairepour obtenir une réduction suffisante de la concentrationd’endotoxines augmente quand la température diminue.D’après un second article du même auteur [10], une réduc-tion de 3 Log10 de la concentration initiale d’endotoxinesexige une exposition de 65,4 minutes à 190 ◦C ou seulement1,5 minutes à 250 ◦C. Le procédé classique, couramment uti-lisé dans l’industrie, est une exposition de 30 minutes à250 ◦C. Dans notre essai, nous avons montré qu’une tem-pérature de 250 ◦C affichée sur l’étuve, après un temps depréchauffage adapté, ne permettait pas d’atteindre la tem-pérature de consigne à l’intérieur des conteneurs. Il estdonc nécessaire d’adapter la durée du cycle de stérilisation-dépyrogénation à la température réelle à l’intérieur dumatériel à traiter.

Les chaleurs massiques du verre et de l’inox sont respec-tivement de 720 J·kg−1·K−1 et 480 J·kg−1·K−1 pour des poidsrespectifs de 2 kg et 10,1 kg. L’énergie nécessaire pour ame-ner la température des conteneurs de 20 ◦C (températureambiante) à 200 ◦C (température de l’étuve), correspon-dant à une augmentation de température de 180 ◦C ou453,15 K, est donc de 652,536 kJ pour le verre et 2 196,871 kJpour l’inox. La puissance de l’étuve utilisée était de4,8 kW. L’énergie nécessaire pour amener la températurede l’étuve à 200 ◦C convertie en W·s (1 J = 1 W·s) était de652,536 kW·s pour le verre et 2 196,871 kW·s. En consé-

quence, le temps nécessaire pour atteindre 200 ◦C dansles conteneurs en verre et en inox était respectivementde 136 et 458 secondes. Par conséquent, le temps pour

àfr

— 4,87 ± 0,03

tteindre la température nécessaire à la destruction desndotoxines est négligeable par rapport à la durée fixée poura dépyrogénation à la chaleur sèche.

La récupération des endotoxines résiduelles constituene étape clef dans la mise au point d’un protocolee stérilisation-dépyrogénation. Les endotoxines sont sus-eptibles de s’adsorber à la surface des matériaux. Paronséquent, la désorption des endotoxines doit être totalefin d’éviter la sous-estimation des quantités résiduelles enndotoxines après le cycle de stérilisation-dépyrogénation.a comparaison des concentrations d’endotoxines entre lesonteneurs « témoins » en verre (Tableau 1) et en inoxTableau 2) par un test non paramétrique de Wilcoxon sur deschantillons non appariés ne montre pas de différence signi-cative (p = 0,27). L’adsorption des endotoxines sur les deuxatériaux ne diffère pas significativement. L’adsorption des

ndotoxines à la surface d’un matériau est influencée par lesaractéristiques chimiques (e.g. composés hydrosolubles etnteractions ioniques) physiques (e.g. état de surface) duatériau. Le verre est connu pour adsorber les endotoxinesar combinaison d’interactions ioniques et hydrophobiquesvec les fortes charges négatives des endotoxines [11].a bibliographie concernant l’adsorption des endotoxinesar des effets chimiques à la surface de l’acier est suc-incte. Tarafa et al. [12] expliquent que les endotoxinesactériennes ont une forte affinité pour les surfaces métal-iques en raison des effets énergétiques de ces surfacest qu’une dépyrogénation conventionnelle ne peut suffire

éliminer l’ensemble des endotoxines adsorbées à la sur-ace du métal. À l’inverse, la pharmacopée européenneecommande l’utilisation de l’inox pour la composition des

2

cdpgtdtelrlcsmNrsdpaêedctlpadàtlsdetsldsaétslds

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78

analisations des circuits d’eau d’hémodialyse, en raisone son faible pouvoir d’adsorption des endotoxines. Cetteropriété semble être d’avantage due au caractère micro-éométrique de l’inox qu’à des interactions chimiques. Deuxhéories sont donc en opposition concernant l’adsorptiones endotoxines sur les surfaces en inox : les caractéris-iques chimiques du métal augmentent l’adsorption desndotoxines à sa surface mais ses propriétés physiquesimitent cette adsorption. La rugosité est une des caracté-istiques des états de surface qui influence l’absorption et’agrégation des endotoxines à la surface du matériel. Leritère le plus couramment utilisé pour caractériser la rugo-ité est le facteur Ra, exprimé en �m, qui représente l’écartoyen arithmétique des profondeurs des motifs de surface.os mesures ont permis d’estimer la valeur moyenne deugosité de l’inox 316L des conteneurs à 1,35 �m. La rugo-ité maximale acceptable pour les matériaux destinés à desomaines sensibles comme la production alimentaire ou laharmacie est de 0,8 �m (European Hygienic Engineeringnd Design Group). Une rugosité supérieure peut cependanttre tolérée si le procédé de nettoyage est suffisammentfficace pour éliminer les substances logées dans les sillonse surface. On peut penser que l’usure de la surface desonteneurs, la formation de microfissures et les exposi-ions répétées à de fortes chaleurs sont responsables de’augmentation de la rugosité de la surface. La méthode pro-osée par Tarafa et al. [12] pour récupérer les endotoxinesdsorbées sur les surfaces métalliques est la solubilisatione celles-ci au moyen d’un mélange à base de CO2 comprimé

température ambiante, d’eau et de surfactant. Les résul-ats de cet essai montrent que la projection de ce mélange àa surface du métal, avec une pression et pendant une duréeuffisante, permet de récupérer l’ensemble des endotoxinesétectables sur les surfaces métalliques testées. La misen place de cette méthode comme moyen de dépyrogéna-ion ou en complément d’une dépyrogénation par la chaleurèche est une perspective intéressante dans le domaine dea production des préparations injectables, dont les normese stérilité sont de plus et plus exigeantes. Cette méthodeimple et peu coûteuse semble également présenter desvantages économiques par rapport à l’utilisation d’unetuve à convection dont les temps de préchauffage sontrès longs. Enfin, une étude de l’efficacité de cette méthodeur les surfaces en verre, également connues pour adsorberes endotoxines, pourrait permettre d’étendre l’applicatione ce procédé à l’ensemble du matériel de préparation desolutions injectables.

Le risque d’adsorption des endotoxines au cours de’essai de stérilisation-dépyrogénation existe égalementendant leur transfert au moyen des seringues en plas-iques à partir des flacons Lonza® jusqu’à l’intérieur desonteneurs. L’adsorption des endotoxines sur les seringuesonduirait à une diminution de la quantité d’endotoxinesnoculées au fond des conteneurs et donc à une sur-stimation du rapport logarithmique entre concentrationnitiale théorique et concentration résiduelle mesuréesprès stérilisation-dépyrogénation. De précédents travauxur l’adsorption des endotoxines par les matières plastiquesnt montré que certains types de plastiques sont capables

’adsorber une quantité non négligeable d’endotoxines [13].es mécanismes à l’origine de cette adsorption sont desnteractions hydrophobes et ioniques entre le plastique et

rem

A. Lajoinie et al.

a structure lipopolysaccharidique de l’endotoxine bacté-ienne. La seconde hypothèse présentée dans cet articlest la libération de composés hydrosolubles par le plastiqueans la solution à doser. Ces composés solubles seraientesponsables de l’altération du lipide A entraînant du dimi-ution de la capacité de l’endotoxine à répondre au testhromogénique LAL. Les seringues utilisées pour le prélève-ent de 500 �L de solution mère A et de l’échantillon de

a solution d’immersion à doser étaient des seringues tuber-uliniques de 1 mL dont le cylindre était en polypropylène.e précédents résultats ont montré que le polypropylènedsorbe davantage les endotoxines que le polystyrène oue verre borosilicaté [13]. Afin d’étudier l’adsorption desndotoxines sur les seringues en polypropylène au momentu prélèvement de l’échantillon à doser dans la solution’immersion, un second mode de prélèvement était testéur les conteneurs en verre « témoin ». Après le premier pré-èvement à la seringue (Tableau 1), la solution d’immersiontait versée directement dans les tubes apyrogènes Lonza®

Tableau 3). Les concentrations des endotoxines pour leseux méthodes de prélèvement ont été comparées afin deéterminer si l’utilisation d’une seringue en polypropylèneour le prélèvement de la solution d’immersion influait sura concentration en endotoxines dosées. La comparaisones concentrations en endotoxines dans les conteneurs enerre « témoin » pour les deux méthodes de prélèvement,vec et sans seringue en polypropylène, au moyen d’un teston paramétrique de Wilcoxon pour des échantillons appa-iés ne montrait pas de différence significative (p = 0,2).’utilisation d’une seringue en polypropylène pour le prélè-ement de l’échantillon à doser dans la solution d’immersion’influe pas sur le résultat du dosage. On peut penser quee bref passage de la solution dans le cylindre de la seringuee permet pas aux endotoxines de s’absorber à la surfaceu polypropylène. Le prélèvement par une seringue stérileirectement dans le fond du conteneur par un manipulateurortant une combinaison départiculée et des gants stériles

été retenu pour notre essai car elle limitait le risque deontamination de la solution d’immersion. La solution pré-evée est transférée le plus rapidement possible dans lesacons apyrogènes Lonza® en verre borosilicaté.

L’absorption des endotoxines à la surface du matérielestiné à la préparation des solutions injectables entraîneeux questions : les endotoxines adsorbées et non récupé-ées par la technique d’immersion sont-elles inactivées para dépyrogénation et sont-elles, une fois adsorbées à la sur-ace du contenant, susceptibles d’être relarguées dans leélange binaire ? Les solutions capables de solubiliser les

ndotoxines adsorbées à la surface des matériaux possèdentes propriétés détergentes ou contiennent des surfactants.n peut donc penser que les endotoxines adsorbées à laurface des conteneurs en verre et en inox ne sont paselarguées dans le mélange binaire. Une comparaison de lauantité d’endotoxines adsorbées à la surface des conte-ants et dans les mélanges binaires permettrait d’évaluere phénomène de relargage des endotoxines. Actuellement,ucune étude n’a été publiée sur l’efficacité de la dépyro-énation sur les endotoxines adsorbées.

Moesby et al. abordent dans leur étude la notion de

estriction des tests de validation de dépyrogénation auxndotoxines des bactéries à Gram négatif [14]. En effet,ême si les endotoxines des bactéries à Gram négatif sont

Dépyrogénation de conteneurs pour nutrition parentérale 279

Tableau 3 Étude de la réduction logarithmique du taux d’endotoxines en l’absence (témoins négatifs) et à l’issue (tests)d’une dépyrogénation des conteneurs en verre initialement contaminés par une solution d’endotoxines, sans utilisationde seringue en propylène. Afin d’étudier l’influence de l’adsorption des endotoxines dans les seringues en polypropylènesur la concentration en endotoxines, une seconde série d’échantillons de la solution d’immersion des conteneurs en verrea été obtenue en versant directement un aliquote de la solution dans un flacon Lonza®. Un test non paramétrique deWilcoxon sur les conteneurs témoins, avec et sans prélèvement par une seringue en polypropylène, a montré que ladifférence des concentrations en endotoxine n’était pas significativement différente (p = 0,2).Logarithmic endotoxin rate reduction analysis of glass containers initially contaminated using an endotoxin solution, without (negativecontrols) and after (tests) depyrogenation, without the use of propylene syringe. To consider the influence of propylene syringe endo-toxin adsorption on endotoxin concentration, a second wave of glass containers immersion solution was obtained by directly pouringan aliquot of the solution in a Lonza® flask. The Wilcoxon nonparametric test, that compared negative control containers with andwithout using a propylene syringe, showed no significant difference in endotoxin concentrations (P = 0.2).

Essais CTÉMOIN (UI/mL) CTEST (UI/mL) Log (CTÉMOIN/CTEST)

# 1 504,0 < 0,005 4,75# 2 468,9 < 0,005 4,73# 3 418,8 < 0,005 4,86

dpcdàiLc

D

Lr

R

Moyenne ± écart-type 463,9 ± 42,8

les plus courantes, il existe d’autres composés issus debactéries à Gram positif ou négatif capable d’induire uneffet pyrogène toxique pour le patient. Il est admis pourles tests de dépyrogénation que les endotoxines des bacté-ries à Gram négatif sont les plus résistantes à la chaleur etpar conséquent les plus représentatives. Toujours d’aprèsMoesby et al., il n’existe aucun rapport concernant la résis-tance thermique des composés pyrogènes des bactéries àGram positif ou des endospores pouvant conforter la théorieque les endotoxines soient les pyrogènes les plus thermoré-sistants. L’absence de données concernant les substancespyrogènes des bactéries à Gram positif est imputable àl’absence d’une méthode alternative : un test des pyrogènessur les lapins, très coûteux et difficile à mettre en œuvreen routine. Les méthodes actuelles de dosage des endo-toxines réalisables en routine à base de lysat d’amebocytede limule ne détectent ni les composés pyrogènes des bacté-ries à Gram positif ni les endospores. Les travaux de Moesbyet al. sur la résistance thermique de ces composés montrentque les températures recommandées par la pharmacopéeeuropéenne pour la dépyrogénation des matériaux thermo-résistants sont insuffisantes pour réduire de 3 Log10 l’activitépyrogène des composés des bactéries à Gram positif et desendospores, quelle que soit la durée de la dépyrogénation[7]. La cinétique de destruction des pyrogènes des bactériesà Gram positif et des endospores par la chaleur sèche semblesuivre, comme celle des endotoxines, un ordre du seconddegré. La stérilisation par la chaleur humide est aussi ineffi-cace sur les pyrogènes des bactéries à Gram négatif et sur lesendospores que sur les endotoxines. Ces résultats montrentqu’il est indispensable d’étudier la thermorésistance de cescomposés pyrogènes pour améliorer l’assurance qualité desproduits pharmaceutiques injectables.

Conclusion

L’efficacité de la dépyrogénation des conteneurs en verre

de cinq litres et des conteneurs en inox de 30 litres utiliséspour la fabrication des MNP, par une chaleur sèche de 200 ◦Cpendant une heure, a été vérifiée par une réduction de3 Log10 de la concentration initiale en endotoxines. L’unité

— 4,96 ± 0,04

e fabrication des poches pour nutrition parentérale de laharmacie a donc validé l’asepsie du processus de fabri-ation. La validation de la dépyrogénation des conteneurse gros volume worst case permet d’appliquer la méthode

l’ensemble du matériel en verre et en inox de volumesnférieurs à ceux des conteneurs utilisés pour la validation.a dépyrogénation des charges de plus petit volume imposeependant le respect des charges maximales du four.

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

éférences

[1] Afssaps. Bonnes pratiques de préparation. France : bureau dela politique documentaire et des systèmes d’information docu-mentaires, 14, avenue Duquesne, 75350 Paris ; 2007.

[2] Pharmacopée-Européenne. Textes généraux sur la microbio-logie. In: E.D.Q.M., editor. Pharmacopée-Européenne. 7 edNördlingen (Allemagne): Druckerei C. H Beck; 2008. p. 561—82.

[3] Ronchi C. Mesure de la présence et validation de l’éliminationdes endotoxines dans les préparations parentérales hospita-lières [travail de recherche]. Suisse: Université de Genève;2009.

[4] Commission SFSTP. P.M., Bourbon P, Doizon O, Formet M,Garcia JM, Husson D, et al. Qualification des fours et tun-nels de stérilisation et dépyrogénation. Stp Pharma Prat2008;18(4):296—332.

[5] Atrux-Tallau N, Huynh NT, Gardette L, Pailler-Mattei C,Zahouani H, Viviant E, et al. Effects of physical and chemi-cal treatments upon biophysical properties and micro-relief ofhuman skin. Arch Dermatol Res 2008;300(5):243—51.

[6] Tsuji K, Harrison SJ. Dry-heat destruction of lipopolysaccha-ride: dry-heat destruction kinetics. Appl Environ Microbiol1978;36(5):710—4.

[7] Essais des endotoxines bactériennes. In: EDQM, editor.

Pharmacopée-Européenne. 7 ed. Nördlingen (Allemagne): Dru-ckerei C. H Beck ; 2008. p. 193—200.

[8] Zegbeh H, Pirot F, Quessada T, Durand T, Vételé F, Rose A, et al.Exactitude, précision et rapidité de fabrication des poches de

2

[

[

[

[

80

mélanges nutritifs parentéraux : comparaison de techniquesautomatisée et manuelle. Ann Pharm Fr 2011;69(1):38—44.

[9] Textes généraux sur la microbiologie. In: EDQM, editor.Pharmacopée-Européenne. 7 ed. Nördlingen (Allemagne) : Dru-ckerei C. H Beck ; 2008. p. 561—82.

10] Tsuji K, Lewis AR. Dry-heat destruction of lipopolysaccharide:

mathematical approach to process evaluation. Appl EnvironMicrobiol 1978;36(5):715—9.

11] Dawson M, Roslansky P. Glitches with glass. Lal Update1991;9(2):1—3.

[

A. Lajoinie et al.

12] Tarafa PJ, Jiménez A, Zhang J, Matthews MA. Compressed car-bon dioxide (CO2) for decontamination of biomaterials andtissue scaffolds. J Supercrit Fluids 2010;53(1—3):192—9.

13] Roslansky PF, Dawson ME, Novitsky TJ. Plastics, endotoxins,and the Limulus amebocyte lysate test. J Parenter Sci Technol1991;45(2):83—7.

14] Moesby L, Hansen EW, Christensen JD, Høyer CH, Juhl GL,Olsen HB. Dry and moist heat sterilisation cannot inactivatepyrogenicity of Gram positive microorganisms. Eur J Pharm Sci2005;26(3—4):318—23.