Tests sérologiques et autres tests biologiques

S. De Martino CNR des Borrelia, CHU de Strasbourg

Quel serait le test parfait pour le diagnostic de la borréliose de Lyme ?

• confirme ou exclu la suspicion clinique

• offre des VPP et VPN élevées

• fournit une information sur le type d’infection (active, chronique, passée)

• offre une standardisation des résultats

• offre une bonne comparabilité entre différents essais et laboratoires

• a des indications diagnostiques et règles d’interprétation précises

Limites des tests sérologiques de routine pour le diagnostic des borrelioses de Lyme

Difficultés d’interprétation

• Persistance immunologique (infection chronique, post lyme syndrome)

• Manque de standardisation des tests

• Manque de marqueur d’activité de l’infection à Borrelia burgdorferi sensu lato (Bbsl)

Standardisation / comparabilité inter-essais inter-laboratoires• Contrôles de qualité externes répétés (4 par an fournis par le CNR)

• Comparaison des résultats inter-laboratoires : 150-200 participants nationaux

• Comparaison des résultats inter-essais : 14 trousses EIA, 5 trousses immunoempreinte

• Au total

• bonne spécificité des analyses réalisées par les participants aux CQE

• près de 10 % de faux négatifs, en IgG et IgM

• faux négatifs en IgM sur sérums proche du seuil de détection (non lié à un réactif en particulier)

• faux négatifs en IgG liés à une trousse de diagnostic rapide (signalement à l’ANSM via la société organisatrice des CQE)

données CNR Borrelia 2013

Données CNR Borrrelia

Les tests sérologiques

• Méthodes de détection indirecte d’aide au diagnostic lors de suspicion de borréliose de Lyme

• IFA

• ELISA, CLIA

• Immunoblot (western blot, antigènes natifs, protéines recombinantes)

• Tests multiplex

• Tests rapides

Sérologie en 2 temps : pourquoi ?1) Technique de dépistage (ELISA ++, IFA ±) : but = avoir une sensibilité « maximale », au « détriment » de la spécificité

• ELISA, normes minimales recommandées (http://www.eucalb.com) Spécificité minimale dépistage : 90% ‘‘Cut-off ’’ établi sur ≥ 100 échantillons (donneurs indemnes) Spécificité : évaluation / population locale -> VPP ++ Sensibilité : évaluation / cas confirmés de borréliose

• Si ELISA (+) ou (±) 2) technique de confirmation (immuno-empreinte) but = avoir une spécificité « maximale »

• Western-Blot permet de confirmer le profil d’anticorps immunoréactifs spécifiques • l’interprétation du profil complet permet de distinguer les réactions croisées fréquentes

(observable pour chaque antigène) induites par d’autres agents infectieux ou pathologies

dysimmunitaires (IgM) • Immunoempreinte normes minimales recommandées (http://www.eucalb.com) • spécificité de 95% • Interprétation selon le type et le nombre d’Ag immunoréactifs • Manque de standardisation : à valider par chaque laboratoire

• Interprétation selon :

✓les données publiées dans la littérature ++ ✓l'observation des profils de différentes populations de sérums de patients cliniquement bien définis

Sérologie en 2 temps : pourquoi ?

Place actuelle de l’immunoblot dans la sérologie de la borréliose de Lyme

• Tests basés sur mélange d’antigènes (natifs, purifiés, recombinants)

• Etude profil d’AC spécifiques (interprétation+++)

• Richesse du profil des AC évolue : phase précoce < phase tardive

• Résultats EIA + WB informations substantielles pour l’interprétation

• Attention aux faux positifs en IgM

• Manque de standardisation, chronophage, coûteux

Exemple d’immunoblots de sérums de borréliose de Lyme http://www.eucalb.com Dr Janet Robertson

• Méta-analyse de la littérature 16 articles / 581 (1990-2012)

• Etudes prospectives ou rétrospectives évaluant les caractéristiques (sensibilité, spécificité) des techniques d’EIA et de Western-blot dans le sérodiagnostic de la borréliose de Lyme chez des patients suspects d'être malades

• De façon globale et toutes études confondues

• Se EIA (dépistage+++) > Se Western-blot

• Spé Western-blot ≥ Spé EIA

• Pour le EM : Se Western-blot > Se EIA

• La méthode actuelle en deux étapes semble donc être adaptée à une démarche la plus à même de diagnostiquer les vrais positifs en éliminant les faux positifs.

Thèse d’exercice Dr. Marie Rohr, Strasbourg 2013

Place actuelle de l’immunoblot dans la sérologie de la borréliose de Lyme

Analyses en deux temps• 1) Dépistage EIA IgG/M

• négatif en cas de contact récent, contrôle à 1 mois

• équivoque

• positif

• 2) confirmation (WB/Ig G/M)

• positif Sérologie positive

• équivoque en cas de contact récent, contrôle à 1 mois

• négatif

Résultats sérologiques en fonction du stade clinique

• Sérologie positive ≠ infection active (maladie évolutive) ➢ Sérologie positive indique uniquement un contact avec Bbsl (Stanek G, Lancet 2012)

➢ Suivi sur 5 ans de sujets infectés asymptomatiques par Borrelia : 95 à 98 % ne développent rien en rapport avec Borrelia (Gern L, 2006)

➢ N’induit pas la mise en place d’une antibiothérapie

séropositivité IgM vs IgG

Sympt. précocelocale

disséminée20->50 % 70->90 %

prévalence des IgM au début prévalence des IgG ensuite

Sympt. tardivedisséminée >95-100 % seules les IgG ont une valeur diagnostique

pas de valeur des IgM *

* présence d’IgM ≠ d’infection active (argument contre infection tardive), parfois observés dans les ACA (10-15 %)

Neuroborreliose

• Importance de la symptomatologie clinique : définition des cas

• Importance des paramètres biologiques associés dans le LCR : pléiocytose, synthèse intrathécale Ig totales

• Sérologie concomitante dans le sérum et le LCR

• Synthèse intrathécale spécifique : Se 75-95%, spé 97% Blanc F. et al Neurologie, 2007, Oshmann P. et al. neurologie 1998

• Autre paramètre plus récemment proposé : CXCL13

Valeur du CXCL13 dans les neuroborrélioses• Chimiokine d’interêt dans les neuroborrélioses, d’étude plus récente :

• Production précoce (microglie, macrophages, cellules dendritiques) en cas d’invasion du SNC par les spirochètes

• Lymphocyte-B chimioattractante permettant la production intrathécale d’AC • Produite lors de lymphomes, maladies auto-immunes, autres infections…

✓Ljostad U, et al. CSF B-lymphocyte chemoattractant (CXCL13) in the early diagnosis of acute Lyme neu- roborreliosis. J Neurol 2008. ✓Rupprecht TA, et al. Borrelia garinii induces CXCL13 production in human monocytes through Toll-like receptor 2. Infect Immun 2007. ✓Rupprecht TA, et al. Cytokine CXCL13: a possible early CSF marker for neuroborreliosis. Nervenarzt 2006. ✓Rupprecht TA, et al. The chemokine CXCL13 (BLC): a putative diagnostic marker for neuroborreliosis. Neurology 2005. ✓Senel M, et al. The chemokine CXCL13 in acute neuroborreliosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010.

• CXCL13 : se 88 %, spé 89 % Leypoldt F et la. JAMAN 2015, van burgel JCM 2011

• Normalisation après 4 mois : 82% Ljostad U. J neural 2007

• Marqueur d’activité adéquat pour le contrôle thérapeutique

• A associer aux tests sérologiques

CXCL13 en routine Rupprecht et al. Neurologe 2014

• Etude sur 179 patients consécutifs présentant une suspicion de neuroborréliose • Réalisation complémentaire du dosage de CXCL13 dans le LCR

• 15 cas certains (CXCL13 élevé) • 3 cas possibles (CXCL13 élevé) • 161 autres diagnostics dont 2 CXCL13 élevé (Lymphome, LLC)

• Se 100 % (87 % : pléiocytose + SIT augmentée) • Spé 99% (dans ce cadre d’utilisation comme paramètre complémentaire) • VPN 100%

• à noter : 2 NB avec CXCL13 élevé sans pléiocytose initiale (pléiocytose objectivée dans le LCR lors de la PL de contrôle qqs jours plus tard)

nouvelles stratégies• C6 ELISA proposé aux USA

• Spécificité 98,9% (99,5% EIA+WB)

• Wormser GP et al. diag microbial infect dis. 2013

• Etudes comparatives Marvin S. et al., Br.J Biomed. Sci 2014

• C6 vs EIA+VlsE : Se 68% vs 76,3% (p<0.05)

• 2 EIA (WC+C6) vs EIA-VlsE+WB : Se 54,3% vs 44,4% (p>0,05)

• Stratégie 2 EIAs intéressant (automatisation totale) vs EIA+WB lors de forte suspicion clinique

• EIA+WB pour indications spéciales (discordances EIA, clinique complexe)

Sensibilité C6 EIA+WB

NB 88,6 77,3

LA 98,3 95,6

‘‘avancées technologiques’’• CLIA associant des antigènes ‘’2 en 1’’

• Tests multiplex : étude d’antigènes choisis et de différentes classes d’Ig (EIA+WB)

• Augmentation des données : difficultés d’interprétation…

• Nécessité de créer un algorithme diagnostique (Dessau R et al. J Med Microbien 2015)

• Recherche de marqueurs d’activité via analyse bioinformatique complexe (Porwancher RB Clin Vacc Immun 2011)

Méthodes diagnostiques non recommandées• Détection directe de Bbsl dans tiques : pas fiable, couteux, inutile

• Données CNR allemand (Dr. V. Fingerle, 2015) Etude sur 2 ans :

• Tiques détachées de patients : détection de Bbsl par PCR • Victimes de piqûres de tiques contrôlée pour la borréliose de Lyme (3 mois à 2.5 ans)

• Pas d’autre manifestation chez les participants suivis pendant 6 à 30 mois

144 Ixodes ricinus

116 tiques négatives

2 EM (1/58)

28 (19,4%) positives en Bbsl

1 EM 1/28

Taux d’infection par Borrelia en Europe : 3 – 26%

Piqûre par une tique infectée

D’après P. Aschmann et coll., 1999

Maladie 5%

Guérison spontanée

Manifestations disséminées

Guérison sous traitement

Manifestations chroniques

92%

< 0,5%

84%

14%

2%

Infection localisée (EM)

Infection avortée Séroconversion simple

95%

8%

99%

Guérison

< 0,5%

Stage I

Stage II

Stage III

(H. Fahrer et al., 1998)

Méthodes diagnostiques non recommandées• Détection de formes « kystiques » de Bbsl : absence de preuve

• Détection de Bbsl dans le sang …

Observations de ‘’Borrelia’’ ??? en microscopie à fond noir

(Dr. V. Fingerle, 2015)

(L. Zilliox, CNR Borrelia, Strasbourg, 2014)

Borrelia de fièvre récurrente MGG en microscopie optique

Méthodes diagnostiques non recommandées• Tests rapides : mauvaise se et spé

• LTT test de transformation lymphocytaire : test non validé pour son utilisation clinique (Ram B. Dessau et al. 2014)

A propos de l’étude : von Baehr V et al. The lymphocyte transformation test for borrelia detects active Lyme borreliosis and verifies effective antibiotic treatment. Open Neurol J 2012.

• absence de définition claire des critères d’inclusion et de définition des population de patients

• variabilité du seuil positif de l’index de stimulation des lymphocytes,

• biais de sélection ou manque de spécificité pour le LTT ou la sérologie à laquelle le test est comparé…

Indications de la détection directe• Culture : manifestations cutanées, articulaires, neurologiques aiguës, autres

• PCR : manifestations articulaires, cutanées, neurologiques aiguës, autres

• absence de standardisation

• contamination croisées, faux positifs et négatifs peuvent arriver

• l’interprétation des résultats nécessitent des renseignements cliniques

• les résultats de PCR ne sont pas des marqueurs d’activité ni de suivi thérapeutique

• tests à réaliser dans des laboratoires spécialisés

méthodes de détection directe

• Stanek et al. CMI 2010

• Ruzic-Sabljic CMI 2013

• différentes méthodes/réactifs

• absence de standardisation

PCR Culture

peau 40-70 % 40-70 %

sang (très variable) 10 % 1-50 %

LCR 20 % 10-30 %

liquide/biopsie synoviale 70 % 1 %

Prélèvements en fonction du stade clinique

Manifestations cliniques Détection directe SérologieLocales

EM Biopsie si atypique (cult. PCR)Disséminées

EMM Biopsie (cult. PCR) SérumLymphocyte borrélien Biopsie (cult. PCR) Sérum

Neuroborréliose LCR (PCR) Sérum et LCRArthrite de Lyme Biopsie/liquide synov. (cult. PCR) SérumCardite de Lyme (Biopsie cult. PCR) Sérum

Borréliose ophtalmique Humeur aqueuse, LCR (PCR) SérumTardives

ACA Biopsie (cult. PCR) Sérum

Pré-requis de la réalisation de tests sérologiques pour le diagnostic de borréliose de Lyme

• Utilisation de tests dont les performances sont bien établies (publications internationales)

• Seulement en cas de suspicion clinique

• Pas d’indication en cas de piqûre de tique

• Pas d’indication selon la ‘’demande’' du patient

• En cas de séropositivité : cicatrice sérologique ? Persistance d’IgM non spécifiques ?

Points nécessaires pour une interprétation correcte des résultats sérologiques

• Informations cliniques des patients bénéficiant d’une sérologie (pas de sérologie sans anamnèse et signes cliniques évocateurs)

• Prendre en compte la séroprévalence dans la population locale

• Traitement précoce : absence de séroconversion (EM, PF)

• Persistance des AC spé pendant des mois/années après une infection guérie

• Pas de suivi sérologique recommandé

• Le résultat sérologique n’est pas un marqueur d’efficacité thérapeutique

en conclusion, actuellement• La sérologie reste la méthode diagnostique de choix en routine

• Autres stratégies envisagées

• A interpréter selon un faisceau d’arguments anamnestiques, cliniques et biologiques

• Utiliser les méthodes fiables correctement évaluées en clinique

• Attention aux faux négatifs en début d’infection

• La qualité des trousses est fonction des Ag utilisés (hétérogénéité en Europe, manque de standardisation)

• Pas de marqueur d’activité actuellement

• Pas de suivi sérologique recommandé

• La sérologie seule ne permet pas de décider de la mise en place d’un traitement